Funkcjonalizacja powierzchni nanocząstek wirusa zapalenia wątroby typu E przy użyciu metod koniugacji chemicznej

Ogólnym celem chemicznej funkcjonalizacji powierzchni nanocząstek HEV jest zapewnienie powtarzalnego i spójnego podejścia do koniugacji ukierunkowania cząsteczek immunogennych, terapeutycznych i diagnostycznych na powierzchnię nanocząstek HEV w celach diagnostycznych i leczniczych. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie nanomedycyny, takie jak to, w jaki sposób można monitorować ulepszone ukierunkowanie na raka i dystrybucję nanoterapii. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest wysoce powtarzalna, wydajna i znacznie łatwiejsza do osiągnięcia w porównaniu z generowaną inżynierią genetyczną.

Procedury zademonstrują Michelle Nguyen i Ivan Ruiz, asystenci naukowi z naszego laboratorium. Rozpocznij ten protokół od produkcji i oczyszczania nanocząstek wirusa zapalenia wątroby typu E zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Rozcieńczyć próbki nanocząstek HEV do ilości od 0,5 do dwóch miligramów na mililitr za pomocą 10-milimolowego MES, pH 6,2 do obrazowania TEM.

Jonizuj siatki pokryte węglem za pomocą 40-miliamperowego wyładowania jarzeniowego przez 30 sekund, aby uzyskać hydrofilową powierzchnię węgla. Hydrofilowa powierzchnia węglowa siatek może wytrzymać tylko 30 minut po zabiegu wyładowania jarzeniowego. Po jonizacji przytrzymaj siatkę i pęsetę i dodaj dwa mikrolitry próbki nanocząstek HEV do siatki.

Po 15 do 30 sekundach osusz siatkę bibułą filtracyjną. Następnie natychmiast umyj siatkę podwójnie destylowaną wodą i ponownie osusz bibułą filtracyjną. Natychmiast dodaj dwa mikrolitry dwuprocentowego octanu uranylu do siatki.

Po 15 sekundach osusz siatkę bibułą filtracyjną. Wysuszyć siatki próbek, umieszczając je na noc w osuszaczu elektronicznym. W zależności od próbki, kriogeniczna mikroskopia elektronowa lub cryo-EM mogą być niezbędne do wizualizacji i charakterystyki struktury.

Przenieś siatkę do TEM i obraz w powiększeniu od 10 do 80 K. Nanocząstki HEV pojawiają się w TEM jako puste białka dwudziestościenne o średnicy około 27 nanometrów ze względu na brak wirusowego RNA. Aby przeprowadzić jednoetapową koniugację nanocząstek HEV i biotyny sprzężonej z maleimidem, należy najpierw zastosować nanocząstki HEV do mini jednostek dializy.

Dializuj nanocząstki w stosunku do 0,01 molowego PBS o pH 7,4 w temperaturze pokojowej przez godzinę zgodnie z protokołem producenta. Po dializie przenieś nanocząstki HEV do 1,5 mililitrowych probówek i zmierz stężenie białka na 280 nanometrach za pomocą spektrofotometru. Wymieszaj nanocząstki w ilości jednego miligrama na mililitr z równą ilością 100 mikromolowych biotyny maleimidowej i 0,01 molowego PBS o pH 7,4, aby uzyskać stosunek od jednego do pięciu molowych.

Po przeagnięciu przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza należy usunąć niezwiązaną biotynę maleimidową za pomocą procedury wirowej kolumny odsalającej zgodnie z protokołem producenta. Analizuj próbki za pomocą standardowej strony SDS redukcyjnej. Korzystając ze standardowych procedur, przygotuj chemiluminescencyjny Western blot przy użyciu streptawidyny sprzężonej z HRP i przechwyć sygnał chemiluminescencyjny za pomocą kliszy rentgenowskiej.

Aby przeprowadzić dwuetapową koniugację liganda specyficznego dla komórek raka piersi, LXY30, z cysteiną wystawioną na powierzchnię na nanocząstkach HEV, najpierw nałóż nanocząstki na mini jednostki dializ i dializuj z 0,01 molowym PBS pH 7,4 w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Następnie przenieś nanocząstki HEV do 1,5 mililitrowych probówek i zmierz stężenie białka na poziomie 280 nanometrów za pomocą spektrofotometru. Następnie połącz 650 mikromolowy azydek maleimidu i 650 mikromolowy alkinek LXY30 z 200 mikromolowym siarczanem miedzi i jednym milimolowym kwasem askorbinowym.

W ten sposób powstaje LXY 30 połączony z maleimidem w 650 mikromolach. Inkubować mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia wymieszaj nanocząstki HEV z jednym miligramem na mililitr z około 10% objętością LXY 30 połączonego z maleimidem, aby uzyskać stosunek molowy od jednego do trzech.

Reaguj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ze względu na stosunkowo wysokie stężenie maleimidu LXY 30, końcowe stężenia reagentów, takich jak siarczan miedzi, są zmniejszane około 10 razy po zmieszaniu. Aby uniknąć ich uszkodzenia przez nanocząstki wirusa zapalenia wątroby typu E, inną opcją jest metoda bez wkładu miedzi.

Usunąć niezwiązany maleimid click LXY 30 za pomocą wirowej kolumny odsalającej zgodnie z protokołem producenta. Utrzymuj nanocząstki HEV połączone LXY 30 w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić jednoetapową koniugację nanocząstek LXY 30 HEV i znacznika fluorescencyjnego Cy5.5, najpierw wymieszaj nanocząstki połączone LXY 30 z jednym miligramem na mililitr z równą objętością znacznika fluorescencyjnego Cy5.5, aby uzyskać stosunek molowy od jednego do pięciu.

Po przedziałaniu mieszaniny przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, należy usunąć niezwiązany Cy5.5 NHS za pomocą procedury wirowej kolumny odsalającej zgodnie z protokołem producenta. Utrzymuj nanocząstki HEV połączone z LXY 30 Cy5.5 w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Podjęto próbę dwóch metod funkcjonalizacji LXY 30 nanocząstek HEV do celowania w komórki nowotworowe.

Kiedy nanocząstki HEV 573C zostały najpierw związane z azydkiem maleimidu, a następnie reakcją chemiczną kliknięcia z alkinem LXY 30, nanocząstki HEV 573C wydawały się rozpadać pod obserwacją TEM. Jednak początkowa reakcja chemiczna między alkinem LXY 30 a azydkiem maleimidu w celu utworzenia LXY 30 sprzężonego z maleimidem, a następnie koniugacja w celu wsparcia zmodyfikowanych nanocząstek HEV nie wpłynęła na jego strukturę, a nanocząstki HEV 573C pozostały nienaruszone. Nanocząstki HEV połączone z LXY 30 i Cy5.5 zastosowano do hodowli komórek raka piersi i obserwowano za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Obrazy fluorescencji w bliskiej podczerwieni za pomocą mikroskopii konfokalnej wskazują, że nanocząstki HEV połączone z LXY 30 Cy5.5 miały wyższe powinowactwo wiązania do zwiększonej internalizacji w komórkach raka piersi MDA MB 231 w porównaniu z nanocząstkami HEV sprzężonymi z Cy5.5. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku badania multimodalnych cząsteczek celujących i terapeutycznych, które pozwalają na dokładne celowanie i diagnozowanie guza bez powodowania uszkodzeń normalnych komórek. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w raka i celowanie w guz poprzez chemiczną modulację powierzchni, może być stosowana do wczesnej diagnostyki raka, badań przesiewowych i leczenia pod kontrolą obrazowania.