Półilościowe wykrywanie zależnej od RNA aktywności polimerazy RNA ludzkiego białka odwrotnej transkryptazy telomerazy

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii RNA, takie jak: Jakie jest biologiczne znaczenie RdRP lub TERT w komórkach ludzkich? Główną zaletą tej techniki jest to, że test ten jest uznawany za pierwszą czułą metodę wykrywania ludzkiej aktywności RdRP wyrażonej w komórkach. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania komórek HeLa zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Umyj komórki raz 10 mililitrami PBS. Następnie odwirować próbkę przy 1450-krotności grawitacji przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić supernatant. Użyj jednego mililitra lodowatego buforu do lizy A na 10 milionów komórek, aby zlizować komórki przez delikatne pipetowanie.

Sonikować próbkę w 1,5-mililitrowej probówce przy amplifikacji sonikatora 25% przez 10 sekund. Po sonikacji odwirować próbkę pod ciśnieniem 20, 400 razy większym niż grawitacja przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant i przenieść po jednym mililitrze supernatantu do 1,5-mililitrowych probówek wirówek.

Wstępnie oczyść lizat, dodając 40 mikrolitrów wstępnie umytych kulek białkowych A-agarozy na jeden mililitr lizatu. Dobrze wymieszaj, kilkakrotnie odwracając rurkę. Następnie obracaj próbkę przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odwirować próbkę w temperaturze 13 000 razy większej od grawitacji przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odzyskać supernatant. Następnie dodaj 40 mikrolitrów wstępnie umytych kulek białka A-agarozy i 10 mikrogramów przeciwciała anty-ludzkiego TERT do wstępnie oczyszczonego lizatu. Dobrze wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę i obracaj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Po odwirowaniu w temperaturze 3 300 razy większej niż grawitacja przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza, usunąć supernatant. Następnie umyj koraliki za pomocą Wash Buffer One. Dodaj jeden mililitr Wash Buffer One do kulek i dobrze wymieszaj, odwracając rurkę.

Następnie obracaj próbkę przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odwirować próbkę pod ciśnieniem 3 300 razy większym niż grawitacja przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant i powtórzyć ten krok jeszcze trzy razy.

Po przepłukaniu roztworem AGC zgodnie z opisem w protokole tekstowym, potraktuj kulki nukleazą mikrokokową, ponownie zawieszając je w 60 mikrolitrach mieszaniny reakcyjnej nukleazy mikrokokowej przez delikatne pipetowanie. Następnie delikatnie wstrząsnąć próbką na stole obrotowym wytrząsarki umieszczonej w inkubatorze typu Peltiera przez 15 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu próbki w temperaturze 3 300 razy większej niż grawitacja przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza, usunąć supernatant.

Na koniec umyj kulki dwukrotnie roztworem AGC zawierającym trzy milimolowe EGTA i przemyj koraliki raz buforem do płukania dwa, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przygotować mieszaninę reakcyjną RdRP w nowej probówce zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodać sześć mikrolitrów trifosforanu urydyny znakowanego na grupie alfa-fosforanowej za pomocą kreski P 32 do mieszaniny reakcyjnej i dobrze wymieszać przez pipetowanie.

Następnie dodaj jeden mikrolitr matrycowego RNA do mieszaniny i dobrze wymieszaj. Ponownie zawiesić kulki z 20 mikrolitrami powstałej mieszaniny reakcyjnej RdRP. Następnie delikatnie wstrząsnąć próbką na stole obrotowym wytrząsarki umieszczonej w inkubatorze typu Peltiera przez dwie godziny w temperaturze 32 stopni Celsjusza.

Po inkubacji dodać 5,4 mikrolitra 20 miligramów na mililitr proteinazy K i 45,4 mikrolitrów buforu 2X proteinazy K do mieszaniny reakcyjnej. Wymieszać pipetując i wstrząsnąć próbką w inkubatorze typu Peltiera przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po dodaniu do próbki 109,2 mikrolitrów wody wolnej od RNaz dodać 200 mikrolitrów kwaśnego chloroformu fenolowego.

Dobrze wymieszać przez wir przed odwirowaniem próbki przy 21, 100-krotności grawitacji przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Przenieś fazę wodną do nowej probówki. Powtórz ten krok raz.

Następnie do fazy wodnej dodaj 20 mikrolitrów trzech molowych octanu sodu o pH 5,2, cztery mikrolitry nośnika wytrącania i 250 mikrolitrów etanolu. Dobrze wstrząśnij probówką w celu wymieszania. Odwirować próbkę w temperaturze 21, 100 razy większej niż grawitacja przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić supernatant.

Następnie umyj granulat 300 mikrolitrami zimnego etanolu o zawartości 70% objętości na objętość przechowywanego w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Odwirować próbkę pod ciśnieniem 21, 100 razy większym niż grawitacja przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant i wysuszyć osad na powietrzu.

Zawiesić osad w 20 mikrolitrach wody wolnej od RNaz. Przygotować mieszaninę reakcyjną RNazy w nowej probówce zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodać 180 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej RNazy do próbki.

Następnie inkubuj probówkę przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodać 2,3 mikrolitra SDS o objętości 10% objętości do próbki i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj do próbki dwa mikrolitry po 20 miligramów na mililitr proteinazy K i inkubuj przez kolejne 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Teraz dodaj 205 mikrolitrów kwaśnego fenolu-chloroformu do próbki. Po wymieszaniu i odwirowaniu jak poprzednio, przenieś fazę wodną do nowej probówki. Dodać trzy molowe octan sodu, nośnik strącania i etanol do fazy wodnej, a następnie wymieszać, odwirować i przepłukać osad, jak wykonano wcześniej.

Przedstawiono tutaj trzy reprezentatywne wyniki testu IP-RdRP w komórkach HeLa traktowanych nokodazolem lub DMSO dla komórek niezmanipulowanych. Jako matrycę wykorzystano chemicznie zsyntetyzowany 34-nukleotydowy RNA. Po całonocnej ekspozycji produkty RdRP można zaobserwować od 20 do 30 nukleotydów, szczególnie w komórkach HeLa w fazie mitotycznej.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykryć aktywność RdRP ludzkiego TERT.