Name: Półilościowe wykrywanie zależnej od RNA aktywności polimerazy RNA ludzkiego białka odwrotnej transkryptazy telomerazy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Poznaj metodę wykrywania aktywności RdRP ludzkiego białka TERT w komórkach HeLa. Ta technika umożliwia badanie roli RNA w biologii komórki i odkrywanie nowych funkcji telomerazy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez Projekt Rozwoju Innowacyjnych Badań nad Rakiem (P-DIRECT) (15cm0106102h0002, K.M.) oraz Projekt Badań nad Rakiem i Ewolucją Terapeutyczną (P-CREATE) (16cm01061150001, K.M.) z Japońskiej Agencji Badań i Rozwoju Medycznego, AMED; Fundację Naukową Takeda (Y.M.); Stypendium Funduszu Badań nad Rakiem im. Księżniczki Takamatsu (13-24520, Y.M.); oraz JSPS KAKENHI Grant Number JP16K07133 (Y.M.).

1. Konfiguracja odczynnika
<ol>
	<li>Odczynniki używane do synchronizacji komórek
	<ol>
		<li>Aby wytworzyć zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierającą 2,5 mM tymidyny, rozpuść 30,28 mg tymidyny na 1 ml wody klasy hodowli tkankowej, aby przygotować 125 mM tymidyny. Przefiltrować roztwór za pomocą strzykawkowego modułu filtrującego 0,22 μm. Dodać 1 ml świeżo przygotowanej 125 mM tymidyny na 50 ml DMEM uzupełnionego 10% (obj. / obj.) płodowej surowicy bydlęcej (FBS).</li>
		<li>Aby wytworzyć DMEM zawierający 0,1 μg/ml nokodazolu, należy rozpuścić nokodazol w dimetylosulfotlenku (DMSO) w celu przygotowania 5 μg/μl nokodazolu. Dodać 1 μl 5 μg/μl nokodazolu na 50 ml DMEM uzupełnionego 10% (vol/vol) FBS.</li>
		<li>Aby wytworzyć DMEM zawierający 0.002% (vol/vol) DMSO, dodaj 1 μL DMSO na 50 mL DMEM uzupełnionego 10% (vol/vol) FBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odczynniki stosowane do oznaczania IP-RdRP
	<ol>
		<li>Przygotować bufor do lizy A: 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 0,5% (vol/vol) Nonidet P-40 (NP-40). Przechowywać odczynnik w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować 5x bufor octanowy: 50 mM kwasu 2-[4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo]etanosulfonowego (HEPES)-KOH (pH 7,8), 500 mM octanu potasu i 20 mM MgCl2. Przechowywać odczynnik w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przygotuj bufor do płukania 1: 1x bufor octanowy, 10% (obj. / obj.) glicerol, 0,1% (obj. / obj.) Triton X-100 i 0,06x koktajl inhibitorów proteazy, wolny od kwasu etylenodiamerytooctowego (EDTA). Przygotuj bufor do płukania 1 w dniu użycia lub dzień przed użyciem. Przechowywać odczynnik w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwór AGC: 1x bufor octanowy, 10% (obj./obj.) glicerol i 0,02% (wag./obj.) 3-[(3-cholamidopropylo)dimetyloamonio]-1-propanosulfonian (CHAPS). Przechowywać odczynnik w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Aby wytworzyć roztwór AGC zawierający 2 mM CaCl2, dodaj 100 μl 1 M CaCl2 na 50 ml roztworu AGC. Przechowywać odczynnik w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Aby wytworzyć roztwór AGC zawierający 3 mM glikolu etylenowego bis (eteru b-aminoetylowego)-N,N,N',N'-kwasu tetraoctowego (EGTA), należy dodać 375 μl 0,4 M EGTA (pH 7,5) na 50 ml roztworu AGC. Przechowywać odczynnik w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotuj bufor do płukania 2: 1x bufor octanowy i 0,02% (wag./obj.) CHAPS. Przechowywać odczynnik w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwór HMD: 0,2 M HEPES-KOH (pH 7,8), 40 mM MgCl2 i 2 mM ditiotreitol (DTT). Przechowywać odczynnik w temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: Roztwór gogli należy odnowić co najmniej za trzy miesiące.</li>
		<li>Przygotuj 2x bufor proteinazy K: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM EDTA i 1% (wag./obj.) dodecylosiarczanu sodu (SDS). Przechowywać odczynnik w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotować 2x bufor ładujący: 95% (vol/vol) formamid, 20 mM EDTA i 1% (wt/vol) Orange G. Przechowywać odczynnik w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek HeLa
UWAGA: Przygotuj komórki HeLa zsynchronizowane w fazie mitotycznej (manipulowane) lub dzielące się asynchronicznie (niemanipulowane). Hodować komórki w obecności 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
<ol>
	<li>Synchronizacja komórek HeLa w mitozie
	<ol>
		<li>Płytka 1 x 106 komórek HeLa z 10 ml DMEM uzupełnionymi 10% (vol/vol) FBS w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm.</li>
		<li>Dwa dni po posiewie zastąp pożywkę 10 ml DMEM zawierającym 2,5 mM tymidyny i 10% (obj./obj.) FBS. Hodować komórki przez 24 godziny.</li>
		<li>Przemyć komórki trzykrotnie 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (-) i wyhodować komórki 10 ml DMEM zawierającego 10% (obj. / obj.) FBS przez 6 godzin.</li>
		<li>Zastąp pożywkę 10 ml DMEM zawierającym 0,1 μg/ml nokodazolu i 10% (obj./obj.) FBS i hoduj komórki przez 14 godzin.</li>
		<li>Delikatnie wstrząśnij szalką hodowlaną i odzyskaj supernatant zawierający oderwane komórki mitotyczne. Policz liczbę komórek do testu IP-RdRP.</li>
		<li>Odwirować próbkę o masie 490 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. 
		UWAGA: Osad komórkowy można przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie niezmodyfikowanych komórek HeLa
	<ol>
		<li>Płytka 1 x 106 komórek HeLa z 10 ml DMEM uzupełnionymi 10% (vol/vol) FBS w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm.</li>
		<li>Dwa dni po posiewie zastąp pożywkę 10 ml DMEM zawierającym 10% (vol/vol) FBS. Hodować komórki przez 30 godzin.</li>
		<li>Zastąp pożywkę 10 ml DMEM zawierającym 0,002% (vol/vol) DMSO i 10% (vol/vol) FBS i hoduj komórki przez 14 godzin.</li>
		<li>Zebrać komórki przez trypsynizację przy użyciu 0,7 ml trypsyny (2,5 g/l) zawierającej 1 mM EDTA. Policz liczbę komórek do testu IP-RdRP.</li>
		<li>Odwirować próbkę o masie 490 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. 
		UWAGA: Osad komórkowy można przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test IP-RdRP
<ol>
	<li>Preparat z białka A-agarozy
	<ol>
		<li>Przenieść 1 ml (objętość złoża 500 μl) żywicy powinowactwa do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Dodaj 800 μl buforu do lizy A do kulek i dobrze wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę. Wirować przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Powtórz ten krok dwa razy (łącznie trzy prania).</li>
		<li>Dodać 800 μl buforu do lizy A do kulek, dobrze wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę. Obracać probówkę przez noc (lub przez co najmniej 4 godziny) w temperaturze 4 °C na wytrząsarce obrotowej.</li>
		<li>Odwirować probówkę o sile 800 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Dodaj 500 μl buforu do lizy A do kulek i dobrze wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę. Przechowywać koraliki w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie lizatu komórkowego
	<ol>
		<li>(Opcjonalnie) Jeśli komórki zostaną zamrożone w kroku 2, umieść i rozmroź zamrożone komórki na lodzie, aż staną się luźne.</li>
		<li>Umyj komórki raz 10 ml PBS (-). Odwirować próbkę o sile 1,450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić sklarowany nad osadem.</li>
		<li>Lizować komórki lodowatym buforem do lizy A (1 ml buforu A do lizy na 1 x 107 komórek) przez delikatne pipetowanie.</li>
		<li>Sonikować próbkę w probówce o pojemności 1,5 ml w następujących warunkach; ustawić amplifikację sonikatora na 25% i sonikować przez 10 s.</li>
		<li>Odwirować próbkę o masie 20 400 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zebrać supernatant. Przenieść po 1 ml każdego supernatantu do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. 
		UWAGA: Wszystkie procedury należy wykonywać w warunkach wolnych od RNaz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunoprecypitacja
	<ol>
		<li>Wstępnie oczyścić lizat z etapu 3.2.6, dodając 40 μl (objętość kulki 20 μl) wstępnie umytych kulek białkowych A-agarozy na 1 ml lizatu. Dobrze wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę i obracać próbkę przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odwirować próbkę o masie 13 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C i odzyskać supernatant.</li>
		<li>Do wstępnie oczyszczonego lizatu dodać 40 μl (objętość złoża 20 μl) wstępnie umytych kulek białkowych A-agarozy i 10 μg przeciwciała anty-ludzkiego TERT (klon: 10E9-2)8. Dobrze wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę i obracać próbkę w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Odwirować próbkę o sile 3 300 x g przez 0,5 minuty w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.</li>
		<li>Przemyć kulki buforem do przemywania 1: dodać 1 ml buforu do płukania 1 do kulek, dobrze wymieszać przez odwrócenie probówki i obracać próbkę przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odwirować próbkę o masie 3 300 x g przez 0,5 minuty w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Powtórz ten krok jeszcze trzy razy.</li>
		<li>Przemyć kulki raz roztworem AGC zawierającym 2 mM CaCl2: dodać 1 ml roztworu AGC zawierającego 2 mM CaCl2 do kulek, dobrze wymieszać przez odwrócenie probówki i obracać próbkę przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odwirować próbkę przy 3,300 x g przez 0,5 minuty w temperaturze 4 °C, i usunąć supernatant.</li>
		<li>Potraktuj kulki nukleazą mikrokokową (MNazą): przygotuj mieszaninę reakcyjną MNazy opisaną w Tabeli 1. Zawiesić kulki w 60 μl mieszaniny reakcyjnej MNazy przez delikatne pipetowanie. Delikatnie wstrząsnąć próbką (20 do 25 obr./min) na stole obrotowym wytrząsarki umieszczonej w inkubatorze typu Peltiera przez 15 minut w temperaturze 25 °C. 
		UWAGA: Bardzo ważne jest, aby używać falistego wytrząsarki i ściśle przestrzegać ograniczenia prędkości na tym etapie. Inne rodzaje wytrząsarek, takie jak miksery obrotowe, nie są zalecane.</li>
		<li>Odwirować próbkę o sile 3 300 x g przez 0,5 minuty w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.</li>
		<li>Przemyć kulki dwukrotnie roztworem AGC zawierającym 3 mM EGTA: dodać 1 ml roztworu AGC zawierającego 3 mM EGTA do kulek, dobrze wymieszać przez odwrócenie probówki i obracać próbkę przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odwirować próbkę w temperaturze 3,300 x g przez 0,5 minuty w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Powtórz ten krok raz.</li>
		<li>Przepłukać kulki raz buforem do płukania 2: dodać 1 ml buforu płuczącego 2 do kulek, dobrze wymieszać przez odwrócenie probówki i obracać próbkę przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odwirować próbkę o sile 3,300 x g przez 0,5 minuty w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Trzymaj koraliki na lodzie podczas ustawiania reakcji RdRP. 
		UWAGA: Wszystkie procedury należy wykonywać w warunkach wolnych od RNaz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Reakcja RdRP
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną RdRP w nowej probówce, jak opisano w Tabeli 2.</li>
		<li>Dodać 6 μl [α-32P]UTP (3 000 Ci/mmol) do mieszaniny i dobrze wymieszać pipetując. 
		UWAGA: [α-32P]ATP, [α-32P]CTP lub [α-32P]GTP mogą być użyte do reakcji zamiast [α-32P]UTP.</li>
		<li>Dodać 1 μl matrycy RNA (1 μg/μl) do mieszaniny i dobrze wymieszać pipetując. 
		UWAGA: Aby ustalić test RdRP, zalecana jest następująca matryca RNA: 5'-GGGAUCAUGUGUGUCCUAUAUAUACAUUUAAACCCA-3' 9.</li>
		<li>Zawiesić kulki z 20 μl mieszaniny reakcyjnej RdRP z kroku 3.4.3 przez pipetowanie.</li>
		<li>Delikatnie wstrząsnąć próbką (20-25 obr./min) na stole obrotowym wytrząsarki umieszczonej w inkubatorze z ogniwem Peltiera przez 2 godziny w temperaturze 32 °C.</li>
		<li>Do mieszaniny reakcyjnej dodać 5,4 μl proteinazy K (20 mg/ml) i 45,4 μl buforu 2x proteinazy K. Wymieszać przez pipetowanie i wstrząsnąć (20-25 obr./min) próbką na stole obrotowym umieszczonym w inkubatorze typu Peltiera przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Do próbki dodać 109,2 μl wody wolnej od RNaz.</li>
		<li>Do próbki dodać 200 μl kwaśnego chloroformu fenolowego. Dobrze wymieszać za pomocą wiru, a następnie odwirować próbkę o masie 21 100 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś fazę wodną do nowej probówki. Powtórz ten krok raz.</li>
		<li>Do fazy wodnej dodać 20 μl 3 M octanu sodu (pH = 5,2), 4 μl nośnika strącającego i 250 μl etanolu. Dobrze wstrząsnąć probówką w celu wymieszania, a następnie odwirować próbkę o stężeniu 21,100 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Przepłukać osad 300 μl zimnego etanolu o stężeniu 70% (obj./obj.) przechowywanego w temperaturze -20 °C. Odwirować próbkę przy 21 100 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wyrzucić supernatant i wysuszyć pelety na powietrzu. 
		UWAGA: Wszystkie procedury należy wykonywać w warunkach wolnych od RNaz. 
		UWAGA: Granulat z kroku 3.4.11 można przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 2 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie RNazy
	<ol>
		<li>Zawiesić osad z kroku 3.4.11 w 20 μl wody wolnej od RNaz.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną RNazy w nowej probówce, jak opisano w Tabeli 3.</li>
		<li>Dodać 180 μl mieszaniny reakcyjnej RNazy do próbki i inkubować probówkę przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodać 2,3 μl 10% (obj./obj.) SDS do próbki i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodać 2 μl proteinazy K (20 mg/ml) do próbki i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Do próbki dodać 205 μl kwaśnego chloroformu fenolowego. Dobrze wymieszać przez wirowanie, a następnie odwirować próbkę o masie 21 100 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś fazę wodną do nowej probówki.</li>
		<li>Do fazy wodnej dodać 20 μl 3 M octanu sodu (pH 5,2), 4 μl nośnika strącającego i 250 μl etanolu. Dobrze wstrząsnąć probówką w celu wymieszania, a następnie odwirować próbkę o stężeniu 21,100 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Przepłukać osad 300 μl zimnego etanolu o stężeniu 70% (obj./obj.) przechowywanego w temperaturze -20 °C. Odwirować próbkę przy 21 100 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wyrzucić supernatant i wysuszyć pelety na powietrzu. 
		UWAGA: Osad z kroku 3.5.9 można przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 2 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektroforeza żelowa i autoradiografia
	<ol>
		<li>Zawiesić próbkę w 20 μl wody wolnej od RNaz.</li>
		<li>Dodać 20 μL buforu załadowczego 2x.</li>
		<li>Gotować próbkę przez 10 minut w temperaturze 95 °C. Próbkę rozdrobnić na lodzie.</li>
		<li>Uruchom żel. W przypadku, gdy rozmiar szablonu wynosi 34 nts (patrz również krok 3.4.3), do elektroforezy żelu żelowego denaturującego stosuje się 7 M żelu poliakryloamidowego z mocznikiem.</li>
		<li>Wysuszyć żel suszarką do żelu.</li>
		<li>Naświetlić film wysuszonym żelem w kasecie rentgenowskiej z ekranem intensyfikującym w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Martinez, P., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+and+extra-telomeric+roles+for+telomerase+and+the+telomere-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins.</a> Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).</li>
<li>Nakamura, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+catalytic+subunit+homologs+from+fission+yeast+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human.</a> Science. 277 (5328), 955-959 (1997).</li>
<li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).</li>
<li>Salgado, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+an+RNAi+polymerase+links+RNA+silencing+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription.</a> PLoS Biol. 4 (12), e434(2006).</li>
<li>Castel, S. E., Martienssen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+the+nucleus%3A+roles+for+small+RNAs+in+transcription%2C+epigenetics+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond.</a> Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).</li>
<li>Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Moazed, D., Grewal, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-dependent+RNA+polymerase+is+an+essential+component+of+a+self-enforcing+loop+coupling+heterochromatin+assembly+to+siRNA+production%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 152-157 (2005).</li>
<li>Maida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-dependent+RNA+polymerase+formed+by+TERT+and+the+RMRP+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA.</a> Nature. 461 (7261), 230-235 (2009).</li>
<li>Maida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+telomerase+reverse+transcriptase+in+heterochromatin+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance.</a> Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).</li>
<li>Maida, Y., Yasukawa, M., Masutomi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+RNA+Synthesis+by+RNA-Dependent+RNA+Polymerase+Activity+of+Telomerase+Reverse+Transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase.</a> Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).</li>
<li>Okamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+tumor+initiating+cells+of+defined+genetic+composition+by+nucleostemin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).</li>
<li>van Dijk, A. A., Makeyev, E. V., Bamford, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+viral+RNA-dependent+RNA+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization.</a> J Gen Virol. 85 (Pt 5), 1077-1093 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Test IP-RdRP jest czułą metodą wykrywania aktywności RdRP ludzkiego TERT. Białko TERT ulega silnej ekspresji w mitotycznych komórkach HeLa, w których TERT tworzy kompleks RdRP 8,9,10. Sugeruje to, że mitotyczne komórki HeLa są optymalnym materiałem do wykrywania aktywności RdRP. W opisanym powyżej protokole mitotyczne i niezsynchronizowane komórki HeLa są uwzględnione odpowiednio jako pozytywny i negatywny przykład. Jak pokazano na rysunku 1A, produkty testowe RdRP z zalecanej matrycy RNA w mitotycznych komórkach HeLa wykazują szerokie sygnały radioaktywne od 20 do 30 nt. Oprócz komórek HeLa przeprowadziliśmy test z różnymi typami linii komórkowych i stwierdziliśmy, że wzór sygnału można zmienić w różnych typach komórek9: niektóre wykazują silny sygnał tylko około 30 nt, niektóre wykazują podobny wzór z komórkami HeLa. Przeprowadziliśmy również test z matrycami RNA innymi niż matryca 34 nt8, krótkimi i długimi (~300 nt) RNA o różnych sekwencjach i z powodzeniem uzyskaliśmy produkty RdRP z tych matryc, chociaż mogą istnieć pewne preferencje. W pierwszym badaniu zalecamy jednak użycie komórek HeLa w fazie mitotycznej i matrycy RNA 34 nt. RdRP mogą generować dwuniciowy RNA zarówno w sposób zależny od startera, jak i niezależny od startera11. Informowaliśmy, że TERT zachowuje tę właściwość jako ludzki RdRP 7,9; TERT syntetyzuje dsRNA z matrycy RNA o strukturze 3'-krotnej poprzez mechanizm wstecznegogruntowania 7. W przypadku matrycy RNA 34 nt TERT syntetyzuje nici komplementarne bez użycia starterów9. Aby specyficznie wykryć produkty RdRP syntetyzowane w sposób niezależny od starterów, tj. produkty RNA syntetyzowane de novo, [α-32 P]NTP można zastąpić [γ-32P]NTP w reakcji RdRP9.
Leczenie MNazy kompleksów immunologicznych TERT na kulkach jest krytycznym krokiem do osiągnięcia pożądanych rezultatów. Jeśli leczenie MNazą jest wykonywane zbyt długo lub z intensywnym wstrząsaniem, produkty RdRP zostaną znacznie zmniejszone. Aby uniknąć takich problemów, zdecydowanie zalecamy ścisłe przestrzeganie protokołu. Rozwiązanie HMD to kolejny kluczowy czynnik sukcesu. Jeśli stwierdzisz, że sygnały są bardzo słabe, wymień roztwór HMD na nowo przygotowany.
W całym protokole należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć zanieczyszczenia RNazą. Zabieg rybonukleazy powinien być wykonywany przy użyciu dedykowanego sprzętu. Po manipulacji rybonukleazą należy natychmiast wyrzucić końcówki i rurki z RNazą, wyeliminować RNazę specjalistycznym roztworem (np. RNase Quiet) i zmienić gajki.
TERT oddziałuje nie tylko z Terc , ale także z wieloma rodzajami endogennych RNA, a my opisaliśmy część z nich7. Modyfikacja w teście IP-RdRP, taka jak test IP-RdRP bez leczenia MNazą, zapewni pełną listę endogennych matryc RNA dla aktywności RdRP związanej z TERT oraz przewodnik bioinformatyczny dotyczący ich cech sekwencji. Z powodzeniem zastosowaliśmy ten protokół do lizatu tkankowego. Ponieważ TERT ulega ekspresji w różnych tkankach normalnych i nowotworowych, test ten może być przydatny do zbadania niekanonicznej funkcji enzymatycznej TERT u człowieka.

Ludzka odwrotna transkryptaza telomerazy (TERT) jest dobrze znana jako katalityczna podjednostka telomerazy i wydłuża telomery za pomocą składnika telomerazy RNA (TERC), specyficznego szablonu RNA1. Chociaż TERT polimeryzuje telomerowe DNA jako składnik telomerazy, analizy strukturalne i filogenetyczne wskazują, że TERT jest ściśle związany z wirusowymi polimerazami RNA zależnymi od RNA (RdRP), a także wirusową odwrotną transkryptazą i dzieli domeny z tymi polimerazami2,3,4. RdRP jest enzymem, który generuje komplementarną nić RNA do matrycy RNA. Enzym jest kodowany nie tylko w wirusach, ale także w organizmach modelowych, takich jak rośliny, drożdże i robaki, a synteza dwuniciowego RNA przez RdRP przyczynia się do transkrypcyjnego i potranskrypcyjnego wyciszenia genów w tych organizmach5,6. Chociaż od dłuższego czasu brakowało ludzkiego RdRP, znaleźliśmy aktywność RdRP w ludzkim TERT w 20097.
Najpierw potwierdziliśmy aktywność RdRP TERT za pomocą rekombinowanego białka7, a następnie ustaliliśmy czuły test in vitro do wykrywania aktywności RdRP endogennego TERT8. Tutaj pokazujemy test RdRP in vitro (test IP-RdRP) dla endogennego TERT. Metoda ta rozpoczyna się od immunoprecypitacji (IP) endogennego TERT, a następnie następuje reakcja RdRP in vitro, w której radioaktywne rybonukleotydy są włączane do powstających nici RNA.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>CORNING</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina penicyliny i streptomycyny</td><td>roztwór nacalai tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kwasu trypsyna-etylenodiamentetraoctowego (EDTA)</td><td>nacalai tesque</td><td>32777-44</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS(-))</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>Tymidyna</td><td>nacalai tesque</td><td>07147-61</td><td></td></tr><tr><td>Nokodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>nacalai tesque</td><td>08904-85</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>nacalai tesque</td><td>31333-45</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan</td><td>nacalai tesque</td><td>35434-21</td><td></td></tr><tr><td>Kwas</td> <td>solnynacalai tesque</td><td>18321-05</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 (NP-40)</td><td>nacalai tesque</td><td>25223-04</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protein A Plus Agarose</td><td>Thermo scientific</td><td>22812</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 2-[4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo]etanosulfonowy (HEPES)</td><td>nacalai tesque</td><td>17514-15</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Wako</td><td>168-21815</td><td></td></tr><tr><td>Potas octan</td><td>nacalai tesque</td><td>28405-05</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny (MgCl2&bull; 6H2O)</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>nacalai tesque</td><td>17045-65</td><td></td></tr><tr><td>Eter oktylofenylowy polioksyetylenowy(10) (Triton X-100)</td><td>Wako</td><td>169-21105</td><td></td></tr><tr><td>cKompletny, wolny od EDTA</td><td>Roche Applied Science</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2&bull; 2H2O)</td><td>nacalai tesque</td><td>06731-05</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaza mikrokokkowa (MNaza)</td><td>Takara Bio</td><td>2910A</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy bis (eter b-aminoetylowy)-N,N,N',N'-tetraoctowy kwas (EGTA)</td><td>nacalai tesque</td><td>15214-92</td><td></td></tr><tr><td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimetyloamonio]-1-propanosulfonian (CHAPS)</td><td>nacalai tesque</td><td>07957-64</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>nacalai tesque</td><td>14128-91</td><td></td></tr><tr><td>rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM każdy</td><td>Promega</td><td>E6000</td><td></td></tr><tr><td>[a-32P]UTP (3,000 Ci/mmol)</td><td>PerkinElmer</td><td>NEG507H</td><td>Użyj świeżego RI do testu</td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy</td><td>TOYOBO</td><td>SIN-201</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Takara</td><td>9033</td><td></td></tr><tr><td>Kwas-fenol:Chloroform, pH 4,5 ( z IAA, 125:24:1)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>3 M Octan sodu</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-90081</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (99.5)</td><td>nacalai tesque</td><td>14713-95</td><td></td></tr><tr><td>Dr. GenTLE Precipitation Carrier</td><td>Takara Bio</td><td>9094</td><td></td></tr><tr><td>RNase One Rybonukleaza</td><td>Promega</td><td>M4265</td><td></td></tr><tr><td>Dodecyl siarczan sodu (SDS)</td><td>nacalai tesque</td><td>02873-75</td><td></td></tr><tr><td>Formamid, dejonizowany</td><td>nacalai tesque</td><td>16345-65</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy Sól disodowa dwuwodna (EDTA)</td><td>nacalai tesque</td><td>15130-95</td><td></td></tr><tr><td>Pomarańczowy G</td><td>Nacalai tesque</td><td>25401-22</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>, np. ASTEC</td><td>SCA-325DRS</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>, np. TOMY</td><td>EX-135</td><td>Dla kroku B)</td></tr> <tr><td>Wirówka z mikrochłodzeniem</td><td>, np. KUBOTA</td><td>3740</td><td>Dla kroku 6.2</td></tr><tr><td>Sonikator</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td>Ustaw mikrokońcówkę (#4422) na sonikatorze, dla kroku 6.4</td></tr><tr><td>Wirówka z mikrochłodzeniem</td><td>, np. TOMY</td><td>MX-305</td><td>Dla kroku 6.5</td></tr><tr><td>Inkubator z chłodzeniem</td><td>, np. Panasonic</td><td>MIR-154-PJ</td><td>Ustaw wytrząsarkę obrotową w środku</td></tr><tr><td>Wytrząsarka obrotowa</td><td>, np.</td> inkubator z chłodzeniem TAITEC <td>RT-5</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>np. TAITEC</td><td>BR-43FL</td><td>Zestaw wytrząsarki " MINI FALA" wewnątrz, dla kroku 7.7</td></tr><tr><td>MINI WAVE</td><td>AS ONE</td><td>WEV-03</td><td>Wytrząsarka do stopni 7.7, 8.5 i 8.6</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>np. TAITEC</td><td>HB-80</td><td>Ustaw wytrząsarkę " MINI FALA" wewnątrz, dla kroku 8.5 i 8.6</td></tr><tr><td>Inkubator blokowy</td><td>, np. ASTEC</td><td>BI-516S</td><td></td></tr></tbody></table>

półilościowe wykrywanie zależnej od rna aktywności polimerazy rna ludzkiego białka odwrotnej transkryptazy telomerazy

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Odwrotna transkryptaza ludzkiej telomerazy (TERT) jest podjednostką katalityczną telomerazy i wydłuża telomery poprzez aktywność polimerazy DNA zależną od RNA. Chociaż TERT jest nazywana odwrotną transkryptazą, analizy strukturalne i filogenetyczne TERT pokazują, że TERT należy do prawoskrętnych polimeraz i odnosi się do wirusowych polimeraz RNA zależnych od RNA (RdRP), a także wirusowej odwrotnej transkryptazy. Po pierwsze, zidentyfikowaliśmy aktywność RdRP ludzkiego TERT, która generuje komplementarne RNA do matrycowego niekodującego RNA i przyczynia się do wyciszania RNA w komórkach nowotworowych. Aby przeanalizować tę niekanoniczną aktywność enzymatyczną, opracowaliśmy test RdRP z rekombinowanym TERT w 2009 roku, a następnie ustaliliśmy test RdRP in vitro dla endogennego TERT. W niniejszym manuskrypcie opisujemy tę drugą metodę. Krótko mówiąc, kompleksy immunologiczne TERT są izolowane z komórek i inkubowane z matrycowymi RNA i rNTP, w tym radioaktywnym rNTP dla reakcji RdRP. Aby wyeliminować jednoniciowe RNA, produkty reakcji są traktowane RNazą I, a produkty końcowe są analizowane za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Produkty znakowane radioaktywnie RdRP można wykryć za pomocą autoradiografii po nocnej ekspozycji.

Przy zastosowaniu zalecanego matrycowego RNA, radioaktywne produkty RdRP obserwuje się w zakresie od 20 do 30 nukleotydów (nt) specyficznie w komórkach HeLa w fazie mitotycznej po ekspozycji nocnej (Rysunek 1A). Zazwyczaj intensywność sygnału produktów RdRP wykazuje dwa piki, które znajdują się w okolicach 25 nt i 30 nt, co jest zgodne z rozkładem wielkości produktów potwierdzonym metodą sekwencjonowania nowej generacji9. W przeciwieństwie do komórek mitotycznych, komórki HeLa bez synchronizacji wykazują niemal całkowity brak radioaktywnych produktów o wielkości 20–30 nt. Owalne sygnały, znajdujące się poniżej 20 nt we wszystkich próbkach, stanowią niespecyficzne dryfty.
W przypadku uzyskania jedynie produktu o długości ~30 nt ze słabym sygnałem w komórkach HeLa w fazie mitozy, wskazuje to na nieprawidłowy przebieg reakcji RdRP. Na przykład, jeśli traktowanie MNazą zostanie przeprowadzone w sposób niedbały lub niewłaściwy, intensywność sygnału w komórkach HeLa w fazie mitozy znacznie spada (Rysunek 1B). Reakcja RdRP przeprowadzona ze starym roztworem HMD również prowadzi do zmniejszenia ilości produktów (Rysunek 1C).
<img alt="Wyniki elektroforezy, porównujące wpływ DMSO/nocodazolu na integralność RNA; widoczna drabinka nt." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57021/57021fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1Reprezentatywne produkty RdRP endogennej TERT w mitoticznych komórkach HeLa. (A) Trzy reprezentatywne wyniki analizy IP-RdRP w komórkach HeLa traktowanych nocodazolem (manipulowane) lub DMSO (niemanipulowane). Jako matrycę wykorzystano syntetyczne chemicznie RNA o długości 34 nukleotydów. (B) Analiza IP-RdRP w mitotycznych komórkach HeLa przeprowadzona z niewłaściwą obróbką MNazą. (C) Analiza IP-RdRP w mitotycznych komórkach HeLa przeprowadzona z użyciem świeżego lub starego roztworu HMD. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57021/57021fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Odczynniki</td >
			<td >Objętość</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Nukleaza mikrokokkowa, 20 U/µL</td >
			<td >1 µL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Bufor do nukleazy mikrokokkowej, 10x</td >
			<td >8 µL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Woda wolna od RNaz</td >
			<td >51 µL</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Skład mieszaniny reakcyjnej MNase.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynniki</td>
			<td>Tom </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS, 0,07% (m/v) </td>
			<td>6 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roztwór HMD</td>
			<td>2 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rATP, 80 mM</td>
			<td>0.5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rGTP, 8 mM</td>
			<td>1 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rUTP, 0,4 mM</td>
			<td>1 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCTP, 8 mM</td>
			<td>1 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inhibitor RNazy, 40 U/µL</td>
			<td>0.5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>woda wolna od RNaz</td>
			<td>1 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Składniki mieszaniny reakcyjnej RdRP.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynniki</td>
			<td>Tom </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rybonukleaza RNase ONE, 10 U/µL</td>
			<td>0.2 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor reakcyjny, 10x</td>
			<td>20 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>woda wolna od RNaz</td>
			<td>159.8 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Składniki mieszaniny reakcyjnej rybonukleazy.

Ludzka odwrotna transkryptaza telomerazy (TERT) syntetyzuje nie tylko telomeryczne DNA, ale także dwuniciowe RNA poprzez aktywność polimerazy RNA zależnej od RNA. W tym miejscu opisujemy nowo opracowany test do wykrywania zależnej od RNA aktywności polimerazy RNA endogennego TERT.

Półilościowe wykrywanie zależnej od RNA aktywności polimerazy RNA ludzkiego białka odwrotnej transkryptazy telomerazy

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii RNA, takie jak: Jakie jest biologiczne znaczenie RdRP lub TERT w komórkach ludzkich? Główną zaletą tej techniki jest to, że test ten jest uznawany za pierwszą czułą metodę wykrywania ludzkiej aktywności RdRP wyrażonej w komórkach. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania komórek HeLa zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Umyj komórki raz 10 mililitrami PBS. Następnie odwirować próbkę przy 1450-krotności grawitacji przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić supernatant. Użyj jednego mililitra lodowatego buforu do lizy A na 10 milionów komórek, aby zlizować komórki przez delikatne pipetowanie.Sonikować próbkę w 1,5-mililitrowej probówce przy amplifikacji sonikatora 25% przez 10 sekund. Po sonikacji odwirować próbkę pod ciśnieniem 20, 400 razy większym niż grawitacja przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant i przenieść po jednym mililitrze supernatantu do 1,5-mililitrowych probówek wirówek.Wstępnie oczyść lizat, dodając 40 mikrolitrów wstępnie umytych kulek białkowych A-agarozy na jeden mililitr lizatu. Dobrze wymieszaj, kilkakrotnie odwracając rurkę. Następnie obracaj próbkę przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odwirować próbkę w temperaturze 13 000 razy większej od grawitacji przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odzyskać supernatant. Następnie dodaj 40 mikrolitrów wstępnie umytych kulek białka A-agarozy i 10 mikrogramów przeciwciała anty-ludzkiego TERT do wstępnie oczyszczonego lizatu. Dobrze wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę i obracaj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.Po odwirowaniu w temperaturze 3 300 razy większej niż grawitacja przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza, usunąć supernatant. Następnie umyj koraliki za pomocą Wash Buffer One. Dodaj jeden mililitr Wash Buffer One do kulek i dobrze wymieszaj, odwracając rurkę.Następnie obracaj próbkę przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odwirować próbkę pod ciśnieniem 3 300 razy większym niż grawitacja przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant i powtórzyć ten krok jeszcze trzy razy.Po przepłukaniu roztworem AGC zgodnie z opisem w protokole tekstowym, potraktuj kulki nukleazą mikrokokową, ponownie zawieszając je w 60 mikrolitrach mieszaniny reakcyjnej nukleazy mikrokokowej przez delikatne pipetowanie. Następnie delikatnie wstrząsnąć próbką na stole obrotowym wytrząsarki umieszczonej w inkubatorze typu Peltiera przez 15 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu próbki w temperaturze 3 300 razy większej niż grawitacja przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza, usunąć supernatant.Na koniec umyj kulki dwukrotnie roztworem AGC zawierającym trzy milimolowe EGTA i przemyj koraliki raz buforem do płukania dwa, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przygotować mieszaninę reakcyjną RdRP w nowej probówce zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodać sześć mikrolitrów trifosforanu urydyny znakowanego na grupie alfa-fosforanowej za pomocą kreski P 32 do mieszaniny reakcyjnej i dobrze wymieszać przez pipetowanie.Następnie dodaj jeden mikrolitr matrycowego RNA do mieszaniny i dobrze wymieszaj. Ponownie zawiesić kulki z 20 mikrolitrami powstałej mieszaniny reakcyjnej RdRP. Następnie delikatnie wstrząsnąć próbką na stole obrotowym wytrząsarki umieszczonej w inkubatorze typu Peltiera przez dwie godziny w temperaturze 32 stopni Celsjusza.Po inkubacji dodać 5,4 mikrolitra 20 miligramów na mililitr proteinazy K i 45,4 mikrolitrów buforu 2X proteinazy K do mieszaniny reakcyjnej. Wymieszać pipetując i wstrząsnąć próbką w inkubatorze typu Peltiera przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po dodaniu do próbki 109,2 mikrolitrów wody wolnej od RNaz dodać 200 mikrolitrów kwaśnego chloroformu fenolowego.Dobrze wymieszać przez wir przed odwirowaniem próbki przy 21, 100-krotności grawitacji przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Przenieś fazę wodną do nowej probówki. Powtórz ten krok raz.Następnie do fazy wodnej dodaj 20 mikrolitrów trzech molowych octanu sodu o pH 5,2, cztery mikrolitry nośnika wytrącania i 250 mikrolitrów etanolu. Dobrze wstrząśnij probówką w celu wymieszania. Odwirować próbkę w temperaturze 21, 100 razy większej niż grawitacja przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić supernatant.Następnie umyj granulat 300 mikrolitrami zimnego etanolu o zawartości 70% objętości na objętość przechowywanego w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Odwirować próbkę pod ciśnieniem 21, 100 razy większym niż grawitacja przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant i wysuszyć osad na powietrzu.Zawiesić osad w 20 mikrolitrach wody wolnej od RNaz. Przygotować mieszaninę reakcyjną RNazy w nowej probówce zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodać 180 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej RNazy do próbki.Następnie inkubuj probówkę przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodać 2,3 mikrolitra SDS o objętości 10% objętości do próbki i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj do próbki dwa mikrolitry po 20 miligramów na mililitr proteinazy K i inkubuj przez kolejne 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Teraz dodaj 205 mikrolitrów kwaśnego fenolu-chloroformu do próbki. Po wymieszaniu i odwirowaniu jak poprzednio, przenieś fazę wodną do nowej probówki. Dodać trzy molowe octan sodu, nośnik strącania i etanol do fazy wodnej, a następnie wymieszać, odwirować i przepłukać osad, jak wykonano wcześniej.Przedstawiono tutaj trzy reprezentatywne wyniki testu IP-RdRP w komórkach HeLa traktowanych nokodazolem lub DMSO dla komórek niezmanipulowanych. Jako matrycę wykorzystano chemicznie zsyntetyzowany 34-nukleotydowy RNA. Po całonocnej ekspozycji produkty RdRP można zaobserwować od 20 do 30 nukleotydów, szczególnie w komórkach HeLa w fazie mitotycznej.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykryć aktywność RdRP ludzkiego TERT.

semi-quantitative-detection-rna-dependent-rna-polymerase-activity

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Próby wyizolowania podjednostki katalitycznej telomerazy, TERT, w ilościach wystarczających do badań strukturalnych, przez ponad dekadę przynosiły ograniczone rezultaty. W niniejszej pracy przedstawiamy metody izolacji rekombinowanej białka TERT z Tribolium castaneum (TcTERT) oraz rekonstrukcji aktywnego kompleksu rybonukleoproteinowego (RNP) telomerazy T. castaneum in vitro.

In vitro Rekonstytucja aktywnej telomerazy T. castaneum

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Opisana jest dokładna, krótka, wyrafinowana i tania metoda, która ocenia długość telomerów w wielu tkankach i gatunkach za pomocą qRT-PCR. Ponadto opiszemy prosty test do oceny aktywności telomerazy jako uzupełniający test szkieletowy dla długości telomerów.

długość telomerów i aktywność telomerazy; Yin i Yang starzenia się komórek

Telomeraza ulega ekspresji w mózgu noworodka, a także w różnych obszarach mózgu dorosłego. Przedstawiamy nietoksyczny, oszczędzający czas test TRAP do analizy aktywności telomerazy w różnych obszarach mózgu myszy i wykrywania różnic w aktywności telomerazy między mózgami myszy płci męskiej i żeńskiej.

Aktywność telomerazy w różnych regionach mózgu myszy: test nieradioaktywnej amplifikacji powtórzeń telomerazy (TRAP)

Ten protokół diagnozuje wirusa Tilapia Lake (TiLV) w tkankach tilapii za pomocą metodologii RT-PCR. Cała metoda jest opisana od rozwarstwienia tkanek do całkowitej ekstrakcji RNA, a następnie syntezy cDNA i wykrywania TiLV za pomocą konwencjonalnego PCR lub ilościowego PCR przy użyciu dsDNA wiążącego fluorescencyjny barwnik wiążący.

Wykrywanie wirusa Tilapia Lake za pomocą konwencjonalnego RT-PCR i SYBR Green RT-qPCR

Udało nam się przekształcić standardowy test protokołu wielokrotnej amplifikacji telomerów (TRAP) do zastosowania w kropelkowych reakcjach łańcuchowych polimerazy cyfrowej. Ten nowy test, nazwany ddTRAP, jest bardziej czuły i ilościowy, co pozwala na lepsze wykrywanie i analizę statystyczną aktywności telomerazy w różnych komórkach ludzkich.

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptacja protokołu amplifikacji powtórzeń telomerów do kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy

Tutaj opisany jest test in vitro bez przeciwciał do bezpośredniej analizy aktywności metylotransferazy na syntetycznym lub transkrybowanym in vitro RNA.

Test bez przeciwciał do analizy aktywności metylotransferazy RNA

Tutaj prezentujemy zoptymalizowaną metodę in vitro do odkrywania, ilościowego i walidacji interaktorów białkowych specyficznych sekwencji RNA, przy użyciu całkowitego ekstraktu białkowego z komórek ludzkich, kulek streptawidyny pokrytych biotynylowanym RNA oraz analizy spektrometrii mas.

Zoptymalizowana ilościowa analiza typu pull-down białek wiążących RNA przy użyciu krótkiego biotynylowanego RNA

Tutaj szczegółowo opisujemy protokół ilościowego oznaczania długości telomerów za pomocą nieradioaktywnej detekcji chemiluminescencyjnej, koncentrując się na optymalizacji różnych parametrów wydajności zestawu do oznaczania długości telomerów TAGGG, takich jak ilości i stężenia w próbce.

Optymalizacja parametrów wydajnościowych testu długości telomerów TAGGG

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru względnej długości telomerów (TL) za pomocą monochromatycznego multipleksowego ilościowego testu łańcuchowego polimerazy (MMqPCR). Test MMqPCR jest powtarzalną, wydajną i opłacalną metodą pomiaru TL z ludzkiego DNA w badaniach populacyjnych.

Monochromatyczny multipleksowy ilościowy pomiar długości telomerów PCR

Poznaj metodę wykrywania aktywności RdRP ludzkiego białka TERT w komórkach HeLa. Ta technika umożliwia badanie roli RNA w biologii komórki i odkrywanie nowych funkcji telomerazy.

Półilościowe wykrywanie zależnej od RNA aktywności polimerazy RNA ludzkiego białka odwrotnej transkryptazy telomerazy

Przeglądaj więcej filmów