Name: długość telomerów i aktywność telomerazy; Yin i Yang starzenia się komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Poznaj metodę oceny długości telomerów i aktywności telomerazy przy użyciu qRT-PCR w różnych tkankach i gatunkach. Technika ta pozwala badać dynamikę telomerów oraz jej wpływ na starzenie się komórek i choroby związane z wiekiem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Protokół długości telomerów19
1. Izolacja DNA
Większość metod izolacji DNA może być użyta. Nasze laboratorium preferuje zestaw Qiagen DNeasy (#69506) do źródeł krwi. W zależności od źródła DNA, takiego jak policzek lub inne źródła, można zastosować inną metodę izolacji.
2. Elementarze
Wszystkie startery są rozcieńczane do stężenia 100pmole/μl w wodzie klasy PCR i przechowywane w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będą potrzebne. Zapasy robocze podkładów są świeże i przechowywane w temperaturze 20 °C przez krótki okres czasu (kilka miesięcy). Standardowe startery zastosowano dla telomerów i β-Globiny, SCG, jak opisano w O'Callaghan i wsp. 20.
Sekwencje podkładów: 
Telo 1: 5'-CGGTTTGTTTGGGTGTGTGTGTGTT-TGGGTTTGGGTT-3'
Telo 2: 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTCTCTCTCTCTCT-ACCCT-3' 
SCG 1: 5'-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3' 
SCG 2: 5'-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3'
Uwaga: Startery są rozcieńczane do stężenia roboczego 10pmol/μl, przed dodaniem do mieszaniny reakcyjnej.
3. Seryjne rozcieńczanie genomowego DNA
Seryjne rozcieńczenia genomowego DNA dla Telo i Single Copy Gene (SCG) są tworzone w celu wygenerowania standardowej krzywej wartości Ct dla testu. Wykorzystany genomowy DNA wyekstrahowano z limfocytów z próbek krwi. Rozcieńczenia te tworzy się przez rozcieńczenie DNA metodą PCR klasy H20 do każdego stężenia o współczynnik 1,68, aby uzyskać dwa zestawy seryjnych rozcieńczeń przy użyciu tego samego genomowego DNA. Stężenia wyjściowe zostały zoptymalizowane w oparciu o metody prób i błędów i mogą wymagać dostosowania w przypadku korzystania z różnych odczynników, instrumentów, DNA innych gatunków, typów komórek i użytego SCG.
Uwaga: Seryjne rozcieńczanie za pomocą genomowego DNA odbywa się poprzez delikatne mieszanie i odczekanie co najmniej 15 minut do jednej godziny przed pobraniem DNA do następnego rozcieńczenia. Każde rozcieńczenie wymaga czasu na dysocjację genomowego DNA. W przypadku długotrwałego przechowywania, podwielokrotne rozcieńczenia seryjnie na paski PCR do przechowywania w temperaturze -80 °C. Każdy pasek PCR jest rozmrażany i używany raz, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania, które mogą uszkodzić DNA.
4. Konfiguracja reakcji dla RT-PCR
Używany instrument: Cykler świetlny Roche480
Odczynnik: Roche Light cycler sybr-green
Rozcieńczyć próbki testowe DNA do końcowego stężenia 10 ng/μl. Badamy stężenie za pomocą Nanodrop lub Qubit. Następnie rozcieńczamy DNA od 10 ng / μl do końcowych 5 ng / μl. Nie badamy ponownie stężenia.
Składniki reakcji:
<obramowanie tabeli="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td fo:width="1.5in">TELO</td>
 <td fo:width="1.5in">1x</td>
 <td fo:width=".25in" rowspan="6"> </td>
 <td fo:width="1.5in">SCG</td>
 <td fo:width="1.5in">1x</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>H20</td>
 <td>6 μl</td>
 <td>Klasa H20</td>
 <td>6 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Telo 1</td>
 <td>0,2 μl</td>
 <td>SCG 1 (Sekcja Schorzenia 1</td>)
 <td>0,6 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Telo 2</td>
 <td>1,8 μl</td>
 <td>SCG 2 (Sekcja Szkolenia 2</td>)
 <td>1,4 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mieszanka Rxn</td>
 <td>10 μl</td>
 <td>Mieszanka Rxn</td>
 <td>10 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rozcieńczenie DNA lub rozcieńczenie seryjne</td>
 <td>2 μl</td>
 <td>Rozcieńczenie DNA lub rozcieńczenie seryjne</td>
 <td>2 μl</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Uwaga: Master Mix jest wytwarzany bez DNA i z nadmiarem od 5% do 10%.
Zarówno Telo, jak i SCG są uruchamiane razem na tej samej płycie za pomocą następującego programu. W celu przeprowadzenia badania precyzji należy przeprowadzić co najmniej trzy powtórzenia każdej próbki i kontroli. Różnice w stosowanych podkładach mogą mieć wpływ na wyniki. Nasz protokół został zoptymalizowany do działania w następujący sposób na Roche480 Light Cycler i naszych podkładach.
Początkowa denaturacja 
10 min denaturacja 95 °C 
Jazda na rowerze 
95 °C 10 s Hold 
60 °C 5 s Hold 
72 °C 11 sek. wstrzymanie i pojedyncza akwizycja 
W razie potrzeby powtórz od 45 do 55 razy
2. Protokół ilościowego wykrywania telomerazy (QTD) (oparty na zestawie QTD firmy Allied Biotech, Inc. Kat. Nie. MT3012)
Przygotowanie ekstraktu
<ol>
 <li>Komórki lub tkanka peletowa.</li>
 <li>Umyj raz 1x PBS.</li>
 <li>Ponownie zasyp i usuń 1x PBS.*</li>
 <li>Zawiesić osad komórkowy w 200 μl 1 x bufor do lizy na każde 105-10 6 komórek lub 40-100 mg tkanki.</li>
 <li>Inkubować na lodzie przez 30 minut.</li>
 <li>Odwirowywać próbkę w temperaturze 12 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Przenieść 160 μl supernatantu do świeżej probówki i oznaczyć stężenie białka.</li>
 <li>Pozostałą ilość ekstraktu podsycić i szybko zamrozić na suchym lodzie/etanolu, przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
*W tym stanie, telomeraza w zamrożonych komórkach lub tkankach jest stabilna przez co najmniej rok. Po rozmrożeniu do użycia należy natychmiast ponownie zawiesić komórki w 1 x bufor do lizy.
2.1. Kontrole testowe
Kontrola inaktywacji termicznej: Dla każdej próbki, poddaj obróbce cieplnej dodatkowy ekstrakt kontrolny poprzez inkubację w temperaturze 85 °C przez 10 minut przed testem aktywności telomerazy.
Standardowa krzywa dla szablonu kontrolnego TSR: Wykonaj ilościowy PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu rozcieńczeń TSR, oligonukleotydu o sekwencji podobnej do starterów telomerów dołączonych do zestawu, aby wygenerować krzywą standardową.
<ol>
 <li>Przygotować seryjne rozcieńczenia 1:5 podstawowego stężenia TSR (0,5 amol/μl) z buforem do lizy</li>
 <li>Przeprowadzić test wzorcowy wykrywania telomerazy, używając 1 μl każdego rozcieńczenia TSR, łącznie ze stężeniem podstawowym. Rozcieńczenia te można przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 tygodnie.</li>
</ol>
2.2. Test aktywności telomerazy przy użyciu QTD Real-Time PCR
<ol>
 <li>Do każdej próbki należy dodać następujące składniki do probówki do PCR lub cienkościennej płytki do PCR (całkowita objętość 25,0 μl):
 <ul>
 <li>12,5 μl 2 x premiks QTD</li>
 <li>1,0 μl ekstraktu komórkowego lub tkankowego</li>
 <li>11,5 μl wody kwalifikowanej do PCR</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Dokładnie wymieszaj</li>
 <li>Zaprogramuj systemy wykrywania PCR w czasie rzeczywistym zgodnie z poniższym programem: 
 - 25 °C przez 20 min (reakcja telomerazy) 
 - 95 °C przez 10 min (etap początkowej aktywacji PCR) 
 35-40 cykli: 
 - 95 °C przez 30 sekund (denaturacja) 
 - 60 °C przez 30 sekund (wyżarzanie) 
 - 72 °C przez 30 sekund (przedłużenie)</li>
 <li>Umieść probówki PCR w termocyklerze i uruchom program cykliczny.</li>
 <li>Zbierz cykl progowy lub wartośćCT po zakończeniu cykli. Cykl progowy to cykl, w którym po raz pierwszy wykrywa się statystycznie istotny wzrost ΔRn.</li>
</ol>
2.3. Analiza danych
<ol>
 <li>Wygeneruj krzywą wzorcową na podstawie odczytówCT i porównaj aktywność telomerazy.</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Długość telomerów stanowi unikalny marker komórkowy do badania zestresowanej i starzejącej się komórki oraz oferuje wgląd w mechanizmy starzenia. Ponieważ po raz pierwszy zasugerowano jego rolę w starzeniu się, przeprowadzono wiele badań dotyczących długości telomerów z wiekiem, długowiecznością, chorobami związanymi z wiekiem, nowotworami i stresem. Przez dziesięciolecia złotym standardem pomiarów długości telomerów była analiza końcowych fragmentów restrykcyjnych przy użyciu hybrydyzacji południowej. Jednak ostatnio ro...

Telomery to powtarzające się sekwencje heksameru DNA (TTAGGG) znajdujące się na końcach chromosomów. W każdej replikacji komórki te końce chromosomów są skracane. Jeśli staną się zbyt krótkie, chromosomy mogą ulegać fuzjom końców telomerów, nieprawidłowej rekombinacji i degradacji. Tak więc utrzymanie wystarczającej długości telomerów odgrywa ważną rolę w stabilności chromosomów i ochronie komórek 38. Utrzymanie długości telomerów ma również kluczowe znaczenie dla genów znajdujących się w pobliżu końców chromosomów, ponieważ replikacja DNA nie może trwać do samego końca chromosomów 1-2. W związku z tym zapobieganie skracaniu telomerów może poprawić stabilność komórek.
Liczne badania wykazały, że długość telomerów jest skorelowana z długowiecznością organizmu i stanem chorobowym, np. w przypadku raka 3-4, cukrzycy 5 i choroby układu krążenia 6,7. Ponadto skrócone telomery są związane z nadmiernym stresem lub niezdrowym stylem życia 8, być może poprzez promowanie przedwczesnego starzenia się i śmierci komórek 9. Z drugiej strony, niektóre badania wykazały, że nie ma znaczącej różnicy między długością i długowiecznością telomerów a chorobą związaną z wiekiem 39, 40, 41.
Jednym z wrodzonych mechanizmów ochrony komórki przed skracaniem telomerów jest aktywacja jej własnego enzymu odwrotnej transkryptazy telomerazy (TERT). Enzym ten i jego podjednostka, telomeraza RNA (TERC), niekodujący RNA, wykorzystują telomer jako matrycę do dodawania powtórzeń telomerów do końców chromosomów 10. Chociaż aktywność telomerazy jest nieobecna w kilku typach komórek, a inne mechanizmy są zaangażowane w utrzymanie długości telomerów, zwiększona aktywność telomerazy jest skorelowana ze zwiększoną długością telomerów. Aktywacja telomerazy została uznana za jeden z mechanizmów, dzięki którym komórki reagują na uszkodzenia i stres oraz unikają przedwczesnego starzenia się i śmierci. Na przykład dłuższe telomery wykazano w populacji Żydów aszkenazyjskich o wyjątkowej długości życia 11, wykazano, że mutacje w TERC lub TERT przyczyniają się do śmiertelnej choroby 12, a epigenetyczna regulacja telomerazy ma wpływ na choroby związane z wiekiem 13. Od czasu jego odkrycia, długość telomerów została zaproponowana jako biomarker stanu zdrowia w różnych modelach zwierzęcych, a także u ludzi, ale te wczesne badania były trudne do szerokiego powtórzenia, ponieważ zastosowana metoda była żmudna, długa i kosztowna. W 2002 r., a następnie w 2009 r., Cawthon zaproponował i zademonstrował nowy, dokładny, szybki i prosty protokół oparty na PCR do oceny długości telomerów i dalszego badania jego roli w różnych aspektach biologii komórki, starzenia się i chorób 19.
Wybór właściwej metody pomiaru telomerów do badania jest niezbędny. Obecnie istnieją różne metody pomiaru długości telomerów, z których każda ma swoje zalety i wady. Tradycyjnie, długość telomerów mierzy się za pomocą analizy Southern Blot końcowych fragmentów restrykcyjnych (TRF), która obejmuje: a. trawienie DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych, które nie tną powtórzeń telomerowych w celu uzyskania TRF, b. Southern Blot tych TRF odbywa się poprzez określenie średniej długości TRF za pomocą sondy telomerowej 14, 37. Chociaż metoda ta jest bardzo dokładna z małym współczynnikiem zmienności, jest miarą bezpośrednią i może być korzystna do pomiaru rozkładu długości, analiza TRF jest kosztowna, pracochłonna i wymaga co najmniej 3 μg DNA. Metoda ta jest również niewrażliwa na krótkie telomery, a określenie długości może być zakłócone przez subtelomerowe DNA, które może być wykryte przez sondę dzięki sekwencjom podobnym do (TTAGGG)n, które zawierają 15, 42.
Inną bardzo dokładną metodą pomiaru długości telomerów jest Analiza Długości Wydłużenia Pojedynczego Telomeru (STELA), metoda oparta na PCR pojedynczej cząsteczki, która wymaga tylko niewielkiej ilości DNA. W tej metodzie startery są wytwarzane w celu rozpoznania nawisu bogatego w G na końcu chromosomów i związania się z unikalną sekwencją subtelomerową na jednym chromosomie, która amplifikuje telomer określonego chromosomu. Powstałe w ten sposób wzmocnienie jest następnie wizualizowane przez Southern Blot. Ta metoda ma tę zaletę, że jest bardzo dokładna i jest w stanie wykryć krótkie telomery odstające 16. Niestety, ponieważ nie wszystkie chromosomy mają końcówki bogate w G i użyteczną sekwencję subtelomerową, długość telomerów można zmierzyć tylko na określonych chromosomach, a pomiary te mogą nie reprezentować długości wszystkich telomerów w komórce 15.
Inną metodą, która była praktykowana, jest użycie sond peptydowych kwasów nukleinowych (PNA) do wykrywania długości telomerów. Ilościowa hybrydyzacja kwiatostanu in situ (Q-FISH) pozwala nam na wizualizację telomerów podczas metafazy, gdzie barwienie telomerów sondą PNA proporcjonalnie do ich wielkości pozwala na porównanie telomerów między określonymi chromosomami. Chociaż metoda ta może być również stosowana w przypadku komórek w interfazie, tutaj nie można wykryć długości telomerów dla odrębnych chromosomów, co wprowadza ograniczenie przy pomiarze długości telomerów w starzejących się lub rzadko dzielących się komórkach 17. Zamiast tego Flow FISH wykorzystuje cytometrię przepływową i jest obecnie najbardziej czułą metodą pomiaru długości telomerów komórek krwi w warunkach klinicznych, ale wymaga wysoko wykwalifikowanych techników 18.
Obecnie, standardowa metoda pomiaru średniej długości telomerów w naszym laboratorium wykorzystuje precyzję, czułość i łatwość ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Metoda ta umożliwiła pomiar długości telomerów dzięki opracowaniu nowych starterów, które pozwalają uniknąć syntezy produktów pochodnych dimerów starterów, które w przeciwnym razie zostałyby wytworzone w standardowym teście ze względu na powtarzalność telomerów. W tym teście pomiar długości telomerów jest reprezentowany przez stosunek T / S, liczbę powtórzeń telomerów do liczby genów z pojedynczą kopią. Ponieważ istnieje bezpośrednia proporcjonalna zależność między długością telomerów a liczbą znakowanych starterów telomerów wiążących się z DNA podczas początkowych etapów PCR, stosunek T / S jest wprost proporcjonalny do długości telomerów. Stosunek T / S mierzy się, porównując różnicę w Ct, liczbie cyklu ułamkowego, przy której skumulowany kwiatostan próbki przekracza próg, który jest kilka odchyleń standardowych powyżej pierwotnego kwitnienia, między próbkami ze starterami telomerów a starterami SCG 19. Metoda ta była krytykowana za pośredni pomiar długości telomerów, co może prowadzić do niedokładnych pomiarów, na przykład w przypadku duplikacji chromosomów lub wariacji liczby kopii 15. Ponadto porównanie między badaniami jest często trudne, ale standardowe oligomery zostały opracowane do pomiaru bezwzględnej długości telomerów 20. Metoda ta została dodatkowo ulepszona przez firmę Cawthon, przy użyciu monochromatycznego multipleksowego testu qPCR. W tym teście PCR przeprowadzano w niższych temperaturach przez pierwsze kilka cykli, aby uniknąć wiązania starter-dimer, a telomer i gen kontrolny analizowano w tej samej probówce PCR, aby jeszcze bardziej uniknąć błędu. Uzyskane pomiary długości telomerów silnie korelowały z długością telomerów mierzoną za pomocą analizy Southern blot TRF i miały wyższą dokładność 15, 19, 36. W tej chwili qRT-PCR jest jedyną dostępną wygodną metodą do badania dużych rozmiarów próbek i wymaga tylko niewielkiej ilości DNA do przeprowadzenia. Kluczową częścią tej metody są kompleksowe środki kontroli jakości, dzięki czemu, gdy zostanie wykonana prawidłowo, metoda ta może dostarczyć cennych informacji porównawczych na temat długości telomerów. Ponadto metoda ta została zaadaptowana do stosowania poza leukocytami do pomiaru długości telomerów w różnych tkankach 42.
Dodatkowo, aby lepiej zrozumieć biologię stojącą za utrzymaniem długości telomerów i interakcjami między dwoma przeciwstawnymi efektami (tj. skracaniem telomerów podczas replikacji i wydłużaniem przez enzym telomerazy), dołączyliśmy do metody długości telomerów dodatkowy test, który mierzy aktywność telomerazy.
W tym celu użyliśmy protokołu wielokrotnej amplifikacji telomerów, testu in vitro. Krótko mówiąc, zlizowane, zakonserwowane, enzymatycznie aktywne komórki zsyntetyzowały powtórzenia telomerowe na substracie oligonukleotydowym za pomocą telomerazy, a produkty amplifikowano za pomocą PCR w obecności SYBR Green. Wyniki zostały następnie przeanalizowane, porównując wartości progowe Ct próbki i kontroli. Ponieważ telomeraza jest enzymem wrażliwym na ciepło, przy każdej próbce 21 przeprowadza się dodatkową kontrolę poddaną obróbce cieplnej 21.
Podczas gdy pomiar długości telomerów może dostarczyć cennych informacji na temat możliwej roli długości telomerów w patofizjologii starzenia się i chorób, długość telomerów nie jest właściwością statyczną i potrzeba więcej informacji, aby zrozumieć funkcję telomerów. Badania aktywności telomerazy mogą dostarczyć informacji o mechanizmach regulacji długości telomerów. Na przykład kontrolowana aktywacja telomerazy może utrzymać długość telomerów i proliferację komórek, ale niekontrolowana aktywacja telomerazy może spowodować raka. Te dwie niedrogie i proste metody w połączeniu dostarczyły nam nie tylko silniejszych dowodów na związek między długością telomerów a stabilnością komórek, ale także dalszego wglądu w możliwe mechanizmy skracania i odzyskiwania telomerów. Dzięki tym metodom mamy nadzieję dokładniej wyjaśnić reakcję komórki na starzenie się i różne stany proliferacji komórek, a ostatecznym celem jest lepsze zrozumienie głównych mechanizmów biologii komórki.

<table><tbody><tr><td>Ilościowe wykrywanie telomerazy </td><td>Allied Biotech</td><td>MT3012</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNeasy Kit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master, Gotowa do użycia mieszanka reakcyjna gorącego startu do PCR w czasie rzeczywistym na bazie SYBR Green I przy użyciu LightCycler 480 Instrument</td><td>Roche Diagnostics</td><td>4707516</td><td></td></tr></tbody></table>

długość telomerów i aktywność telomerazy; yin i yang starzenia się komórek

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Telomery to powtarzające się sekwencje DNA na końcach chromosomów, które są zróżnicowane pod względem długości, a u ludzi mogą osiągnąć długość 15 000 par zasad. Telomer służy jako bioprotekcyjny mechanizm ścierania chromosomów przy każdym podziale komórki. Po pewnym czasie telomery stają się zbyt krótkie, aby umożliwić replikację, proces, który może prowadzić do niestabilności chromosomów lub śmierci komórki. Długość telomerów jest regulowana przez dwa przeciwstawne mechanizmy: ścieranie i wydłużanie. Wyczerpanie następuje, gdy każda komórka się dzieli. Natomiast wydłużenie jest częściowo modulowane przez enzym telomerazę, który dodaje powtarzające się sekwencje na końcach chromosomów. W ten sposób telomeraza może odwrócić mechanizm starzenia się i odmłodzić żywotność komórek. Są to kluczowe elementy w utrzymaniu życia komórkowego i są wykorzystywane do oceny starzenia się komórek. W tym manuskrypcie opiszemy dokładną, krótką, wyrafinowaną i tanią metodę oceny długości telomerów w wielu tkankach i gatunkach. Metoda ta wykorzystuje dwa kluczowe elementy: tandemowe powtórzenia sekwencji telomerów i czułość qRT-PCR do wykrywania różnicowej liczby kopii badanych próbek. Ponadto opiszemy prosty test do oceny aktywności telomerazy jako uzupełniający test szkieletowy dla długości telomerów.

Przykład analizy długości telomerów metodą qRT-PCR przedstawiono na Rysunku 1. Na panelu w lewym górnym rogu próbki oznaczone kolorem czerwonym i zielonym reprezentują rozmieszczenie badanych osób na płytce 96-dołkowej. Na panelu w prawym górnym rogu przedstawiono krzywą amplifikacji. Każdy badany jest analizowany za pomocą dwóch testów (telomeru i genu pojedynczej kopii), które są wykonywane w trzech powtórzeniach. Ze względu na różną liczbę kopii DNA uzyskanych w dwóch testach u wybranych osób, liczba ...

Opisana jest dokładna, krótka, wyrafinowana i tania metoda, która ocenia długość telomerów w wielu tkankach i gatunkach za pomocą qRT-PCR. Ponadto opiszemy prosty test do oceny aktywności telomerazy jako uzupełniający test szkieletowy dla długości telomerów.

długość telomerów i aktywność telomerazy; Yin i Yang starzenia się komórek

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie krótkiej, dokładnej i taniej metody oceny długości telomerów oraz aktywności telomerazy w wielu tkankach i gatunkach. Jest to realizowane poprzez wstępną izolację DNA genomowego w celu oznaczenia długości telomerów za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Drugim krokiem jest izolacja i lizowanie komórek z tej samej tkanki w buforze zachowującym funkcję telomerazy oraz ilościowy pomiar aktywności telomerazy przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym.Ostatecznie, zarówno określanie długości telomerów, jak i wykrywanie aktywności telomerazy są wykorzystywane do badania zależności między długością telomerów a starzeniem się komórek, możliwych mechanizmów skracania telomerów oraz odpowiedzi regeneracyjnych na starzenie się i stany proliferacji komórek. Po raz pierwszy zapoznałem się z tymi metodami, gdy szukałem szybkiego i łatwego sposobu na pomiar długości telomerów oraz aktywności telomerazy. Zastosowanie tej techniki rozciąga się na diagnostykę chorób związanych z wiekiem oraz przedwczesną śmierć, ponieważ dostarcza ona informacji o stanie komórek, co odzwierciedla kondycję organów i ogólną formę organizmu.Procedurę tę zaprezentuje pan Ur Bogo, technik w moim laboratorium. Aby rozpocząć procedurę, należy wyizolować DNA z krwi badanego, używając zestawu Qiagen DNE, opracowanego specjalnie dla próbek krwi w ostatnim etapie. DNA należy eluować w wodzie klasy PCR, a następnie zmierzyć jego stężenie za pomocą spektrofotometru.Następnie przygotuj zapasy starterów PCR zgodnie z opisem OC Callahan i wsp. dla genu pojedynczej kopii lub kontroli SCG oraz dla telomerów, rozcieńczając je do stężenia 100 picomoles per microliter. Podczas rehydratacji starterów, używając wody jakości PCR, przygotuj rozcieńczenia seryjne wyizolowanego DNA. Rozpocznij od rozcieńczenia zapasu DNA wodą jakości PCR do maksymalnego stężenia 6,1 nanograms per microliter dla reakcji telomerowych oraz 1,8 nanograms per microliter.W przypadku reakcji SCG należy odczekać co najmniej 15 minut przed przygotowaniem kolejnego rozcieńczenia. Po upływie 15 minut należy przygotować następne rozcieńczenie zgodnie z przedstawioną tutaj tabelą. Czynność tę należy powtórzyć dla każdego wymienionego rozcieńczenia.Następnie przygotuj reakcje PCR w standardowej płytce do PCR. Każdą próbkę, wraz z kontrolami SCG, analizuje się w trzech powtórzeniach. Najpierw dodaj 6 µL wody do PCR do każdej studni, a następnie dodaj 10 µL mieszaniny reakcyjnej z cyber green.Następnie należy dodać startery w ilościach wskazanych tutaj do odpowiednich dołków. Dalej, należy przeprowadzić dziesięciokrotne rozcieńczenie alikwotu każdego ze starterów zapasowych w wodzie klasy PCR, aby uzyskać stężenie końcowe 10 picomoles per microliter. Na koniec należy dodać dwa microliters seryjnie rozcieńczonego DNA do odpowiednich dołków i przykryć płytkę przylepną folią plastikową, aby uszczelnić zawartość.Następnie umieść płytkę w urządzeniu do real-time PCR. Potem przygotuj program w cyklerym Roche LightCycler 480, rozpoczynając od etapu denaturacji trwającego 10 minut w 95 °C, a następnie wykonaj cykle: 95 °C przez 10 sekund, 60 °C przez 5 sekund i 72 °C przez 11 sekund.Przez łącznie 50 cykli wykonuj pomiary z użyciem barwnika cyber green po każdym cyklu. Następnie uruchom program po zakończeniu pracy termocyklera. Wyznacz linię CT na początku krzywej wykładniczej i zapisz wartości cykli z momentu, w którym każda z próbek przekroczy linię progu.Następnie oblicz stosunek liczb cykli pomiędzy próbkami telomerów a próbkami genu pojedynczej kopii. Ponieważ telomer posiada wiele regionów, które ulegają amplifikacji w każdym cyklu, wartości CT dla telomerów będą mniejsze niż dla pojedynczej kopii genu, co zaowocuje stosunkiem mniejszym niż jeden. Na koniec oblicz długość telomerów w oparciu o prace Terry Etal, zgodnie z którymi jeden telomer na jednostkę stosunku pojedynczej kopii genu odpowiada średniej długości telomeru wynoszącej 4 270.Pomiary aktywności telomerazy w parach zasad leukocytów wykonuje się przy użyciu zestawu do ilościowego wykrywania telomerazy firmy Allied Biotech. Aby rozpocząć pomiary, należy zebrać od 10⁵ do 10⁶ komórek krwi obwodowej i wypłukać je w PBS. Następnie należy je odwirować z prędkością 500 ×g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Potem osad resuspenduje się w 200 µL 1x buforu lizującego z zestawu do analizy i inkubuje na lodzie przez 30 minut.Po inkubacji odwiruj próbki z prędkością 12 000 ×g przez 30 minut w temperaturze 4°C. Aby oddzielić pozostałości komórkowe, przenieś 160 µL otrzymanego supernatantu do nowej probówki, a pozostałą część supernatantu zamroź gwałtownie w kąpieli z etanolem i suchym lodem przed przechowywaniem w temperaturze -80°C do późniejszego użycia. Następnie określ stężenie białka w supernatancie za pomocą standardowego testu BCA.Dla każdej pobranej próbki oblicz ilość białka wymaganą do analizy, opierając się na zakresie roboczym zestawu do oznaczania telomerazy. Następnie, ponieważ telomeraza jest enzymem wrażliwym na ciepło, przeprowadź inaktywację termiczną połowy każdej próbki w celu uzyskania kontroli negatywnej poprzez inkubację w 85 °C przez 10 minut. W kolejnym kroku przygotuj ilościową krzywą wzorcową poprzez rozcieńczanie szeregowe roztworu zapasu.Oligonukleotydy TSR rozcieńcza się pięciokrotnie (rozcieńczenie 1:5) przy użyciu buforu do lizy. Oligonukleotydy TSR mają sekwencję identyczną z primerami telomerowymi i posiadają znane stężenie. Następnie przygotuj master mix składający się z 12,5 µL 2x premiksu do ilościowego wykrywania telomerazy oraz 11,5 µL wody klasy PCR na każdą próbkę, a następnie wymieszaj.Następnie pipetujemy 24 µL master mixu do każdej używanej probówki. Po rozdzieleniu master mixu, do dołków dodaje się 1 µL każdej matrycy, będącej standardem, próbką poddaną aktywacji termicznej lub próbką zwykłą. Następnie płytkę uszczelnia się plastikową folią przylepną i miesza próbki za pomocą wortexa.Następnie należy umieścić je w systemie do detekcji PCR w czasie rzeczywistym. Skonfigurować program PCR tak, aby rozpoczął się od etapu w 25 °C przez 20 minut. W tym czasie zajdzie reakcja telomerazy.Następnie przeprowadź wstępną aktywację PCR w temperaturze 95 °C przez 10 minut. Następnie wykonaj 40 cykli: 95 °C przez 30 sekund, 60 °C przez 30 sekund oraz 72 °C przez 30 sekund, aby amplifikować matryce telomerowe dodane podczas 20 minut w temperaturze 25 °C.Na koniec uruchom program i zbierz wartości cyklu progowego dla każdej próbki. Następnie wygeneruj krzywą wzorcową na podstawie wartości CT i wykorzystaj ją do obliczenia aktywności telomerazy w analizowanych próbkach.Oto wyniki realtime PCR u 65-letniego badanego. Gen telomeru, reprezentowany przez jasnoczerwone linie, osiąga krzywą wykładniczą po około 27 cyklach. Drugi zestaw linii reprezentuje amplifikację genu jednokopiowego, który występuje w genomie tylko w jednym egzemplarzu, a zatem posiada mniej kopii niż próbki telomerów reprezentowane przez czerwone linie.Ponadto pojedyncza kopia genu osiąga krzywą wykładniczą po około 31 cyklach. Brązowe linie przedstawiają krzywą wzorcową dla 33 próbek, opartą na seryjnym rozcieńczeniu znanych stężeń próbek. Przedstawiono tutaj krzywą wzorcową logarytmu stężenia w funkcji wartości progowych.Linia prosta potwierdza, że rozcieńczenia seryjne zostały dokładnie odmierzone i naniesione. Wyniki analizy real-time PCR są następnie wykorzystywane do oszacowania długości telomerów. Jedna jednostka stosunku liczby kopii telomerów do pojedynczej kopii genu odpowiada średniej długości telomerów wynoszącej 4 270 par zasad w leukocytach; na podstawie tych danych otrzymano stosunek 0,87, co przekłada się na średnio 3 715 par zasad i stanowi długość pośrednią dla osoby w tym wieku.Wykorzystując wyniki ilościowych analiz qPCR, można wyjaśnić związek między aktywnością telomerów a stosunkiem liczby kopii telomerów do pojedynczego genu. Wykres ten pokazuje silną korelację między oboma badaniami. Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie starzenia się do eksploracji starzenia komórkowego w organizmach modelowych, grupach demograficznych pacjentów oraz układach organów.

telomere-length-telomerase-activity-yin-yang-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Długość Telomerów i Aktywność Telomerazy; Yin i Yang Starzenia Komórkowego

Telomeraza ulega ekspresji w mózgu noworodka, a także w różnych obszarach mózgu dorosłego. Przedstawiamy nietoksyczny, oszczędzający czas test TRAP do analizy aktywności telomerazy w różnych obszarach mózgu myszy i wykrywania różnic w aktywności telomerazy między mózgami myszy płci męskiej i żeńskiej.

Aktywność telomerazy w różnych regionach mózgu myszy: test nieradioaktywnej amplifikacji powtórzeń telomerazy (TRAP)

Telomery i telomeraza odgrywają istotną rolę w procesie starzenia się i nowotworzenia. Celem tego protokołu jest pokazanie, w jaki sposób wygenerować dwa mysie indukowane allele knock-in telomerazy i jak je wykorzystać w badaniach nad degeneracją/regeneracją tkanek i rakiem.

Wykorzystanie mysich indukowanych alleli telomerazy w badaniach nad degeneracją/regeneracją tkanek i rakiem

W tym artykule omówiono szczegółowy protokół do ilościowego określania długości telomerów za pomocą zmodyfikowanej analizy fragmentów restrykcyjnych na końcu, który zapewnia szybki i efektywny bezpośredni pomiar długości telomerów. Technika ta może być stosowana do różnych źródeł komórkowych DNA w celu ilościowego określenia długości telomerów.

Zmodyfikowana analiza końcowych fragmentów restrykcyjnych do ilościowego określania długości telomerów za pomocą hybrydyzacji w żelu

Tutaj szczegółowo opisujemy protokół ilościowego oznaczania długości telomerów za pomocą nieradioaktywnej detekcji chemiluminescencyjnej, koncentrując się na optymalizacji różnych parametrów wydajności zestawu do oznaczania długości telomerów TAGGG, takich jak ilości i stężenia w próbce.

Optymalizacja parametrów wydajnościowych testu długości telomerów TAGGG

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru względnej długości telomerów (TL) za pomocą monochromatycznego multipleksowego ilościowego testu łańcuchowego polimerazy (MMqPCR). Test MMqPCR jest powtarzalną, wydajną i opłacalną metodą pomiaru TL z ludzkiego DNA w badaniach populacyjnych.

Monochromatyczny multipleksowy ilościowy pomiar długości telomerów PCR

Próby wyizolowania podjednostki katalitycznej telomerazy, TERT, w ilościach wystarczających do badań strukturalnych, przez ponad dekadę przynosiły ograniczone rezultaty. W niniejszej pracy przedstawiamy metody izolacji rekombinowanej białka TERT z Tribolium castaneum (TcTERT) oraz rekonstrukcji aktywnego kompleksu rybonukleoproteinowego (RNP) telomerazy T. castaneum in vitro.

In vitro Rekonstytucja aktywnej telomerazy T. castaneum

Opracowaliśmy protokół indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z użyciem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów serca oraz funkcjonalnych kardiomiocytów do regeneracji układu sercowo-naczyniowego.

Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

System ECIS/Taxis to zautomatyzowany test w czasie rzeczywistym, który służy do pomiaru chemotaksji komórkowej. W tym teście komórki przemieszczają się pod warstwą agarozy, aby dotrzeć do elektrody docelowej. Ruch komórkowy jest mierzony poprzez pojawienie się oporu dla prądu AC 0.

Pomiar chemotaksji komórkowej za pomocą systemu ECIS/Taxis

Opisano powszechnie stosowane, wysoce dostępne metody badania migracji komórek i inwazji in vitro. Pierwszą metodą jest test zamykania ran komórkowych, który mierzy ruchliwość komórek. Drugą metodą jest test migracji i inwazji transwell, który ocenia zdolność komórek do chemotakcji i inwazyjności.

Metody in vitro Testy migracji i inwazji komórek

Metylacja DNA jest w stanie utrzymać stabilny poziom ekspresji genów, a także pozwala na dynamiczne zmiany w ekspresji genów w odpowiedzi na różne bodźce. Szczegółowo opisujemy techniki, które pozwalają na badanie specyficznych dla genów zmian w metylacji DNA i wpływu tych zmian na ekspresję genów.

Korelacja zmian metylacji DNA specyficznych dla genu z ekspresją i aktywnością transkrypcyjną astrocytarnego KCNJ10 (Kir4.1)

Poznaj metodę oceny długości telomerów i aktywności telomerazy przy użyciu qRT-PCR w różnych tkankach i gatunkach. Technika ta pozwala badać dynamikę telomerów oraz jej wpływ na starzenie się komórek i choroby związane z wiekiem.

długość telomerów i aktywność telomerazy; Yin i Yang starzenia się komórek

Przeglądaj więcej filmów