długość telomerów i aktywność telomerazy; Yin i Yang starzenia się komórek

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie krótkiej, dokładnej i taniej metody oceny długości telomerów i aktywności telomerów w wielu tkankach i gatunkach. Osiąga się to poprzez wyizolowanie genomowego DNA w celu określenia długości telomerów za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Drugim krokiem jest wyizolowanie i umieszczenie komórek tej samej tkanki w buforze, który zachowuje funkcję telomerazy, oraz ilościowy pomiar telomerazy za pomocą PCR w czasie rzeczywistym.

Ostatecznie zarówno określanie długości telomerów, jak i wykrywanie aktywności telomerazy są wykorzystywane do znalezienia zależności między długością telomerów a starzeniem się komórek, możliwych mechanizmów skracania telomerów i odzyskiwania odpowiedzi na starzenie się i stany proliferacji komórek. Po raz pierwszy zetknąłem się z tą metodą, gdy szukałem szybkiego i łatwego sposobu na zmierzenie długości omu i aktywności omery. Implikacja tej techniki przedłużającej w kierunku diagnozy chorób związanych z wiekiem i przedwczesnej śmierci, ponieważ raport o stanie komórek, który odbija się na stanie narządów i ogólnym kształcie ciała.

Demonstracją tej procedury będzie Pan Ur Bogo, technik z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, wyizoluj DNA z krwi pacjenta za pomocą zestawu Qiagen DNE, opracowanego specjalnie dla źródeł krwi na ostatnim etapie. Eluować DNA w wodzie klasy PCR i zmierzyć stężenie za pomocą spektrofotometru.

Następnie przygotuj podstawowe startery PCR, jak opisano przez OC Callahan i wsp., dla pojedynczej kopii genu lub kontroli SCG oraz dla telomerów, rozcieńczając je do 100 pikoboli na mikrolitr. Używając wody klasy PCR, podczas gdy startery się nawadniają, przygotuj seryjne rozcieńczenia wyizolowanego DNA. Zacznij od rozcieńczenia podstawowego DNA wodą klasy PCR do najwyższego stężenia 6,1 nanograma na mikrolitr w przypadku reakcji telomerowych i 1,8 nanograma na mikrolitr

W przypadku reakcji SCG pozostaw rozcieńczenie na co najmniej 15 minut przed przejściem do następnego. Po 15 minutach przygotuj kolejne rozcieńczenie zgodnie z poniższą tabelą. Powtórzyć tę czynność dla każdego podanego rozcieńczenia.

Następnie ustaw reakcje PCR na standardowej płytce PCR. Każda próbka wraz z kontrolkami SCG jest uruchamiana w trzech egzemplarzach. Najpierw dodaj sześć mikrolitrów wody klasy PCR do każdej studzienki, a następnie dodaj 10 mikrolitrów mieszaniny reakcji cyber green.

Następnie dodaj startery w ilościach pokazanych tutaj do odpowiednich dołków. Następnie należy dodatkowo rozcieńczyć podwielokrotność każdego z podstawowych starterów dziesięciokrotnie wodą klasy PCR, tak aby końcowe stężenie wynosiło 10 pikomoli na mikrolitr. Na koniec dodaj dwa mikrolitry seryjnie rozcieńczonego DNA do odpowiednich dołków i przykryj płytkę samoprzylepnym arkuszem z tworzywa sztucznego, aby uszczelnić zawartość.

Następnie umieść płytkę w maszynie do PCR w czasie rzeczywistym. Następnie przygotuj program na cyklerze Roche four 80 light, zaczynając od 10-minutowej denaturacji. Poruszaj się w temperaturze 95 stopni Celsjusza, a następnie zmieniaj temperaturę 95 stopni Celsjusza przez 10 sekund, 60 stopni Celsjusza przez pięć sekund i 72 stopnie Celsjusza przez 11 sekund.

W sumie 50 cykli wykonuj pomiary cyber green po każdym cyklu. Następnie rozpocznij program po zakończeniu pracy termocyklera. Ustaw linię CT na początku krzywej wykładniczej i zapisz wartości cyklu od momentu, gdy każda próbka przekroczy linię progową.

Następnie oblicz stosunek numerów cykli między telomerami a próbkami pojedynczej kopii genu. Ponieważ telomer ma wiele regionów, które będą się amplifikować w każdym cyklu, wartości CT telomerów będą mniejsze niż liczba kopii pojedynczego genu, co spowoduje stosunek mniejszy niż jeden. Na koniec oblicz długość telomerów na podstawie pracy Terry'ego Ethala, gdzie jeden telomer na jednostkę racji kopii genu odpowiada średniej długości telomerów wynoszącej 4 270.

Pary zasad w leukocytach wykonują pomiary aktywności telomerazy za pomocą ilościowego wykrywania telomerazy z pokrewnej biotechnologii, aby rozpocząć pomiary, zebrać od 10 do piątej do 10 do szóstej komórki krwi obwodowej i przepłukać je w PBS. Następnie granuluj je w temperaturze 500 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawieś osad w 200 mikrolitrach jednego buforu do lizy x z zestawu testowego i inkubuj na lodzie przez 30 minut.

Po inkubacji odwirować próbki w temperaturze 12 000 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby osadzać resztki komórek, przenieś 160 mikrolitrów powstałego supernatantu do świeżej probówki i flashuj, zamroź pozostały supernatant w kąpieli etanolowej i suchego lodu przed przechowywaniem go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do wielokrotnego użycia. Następnie należy określić stężenie białka w supernatancie za pomocą standardowego testu BCA.

Dla każdej pobranej próbki należy obliczyć ilość białka potrzebną do testu w oparciu o zakres roboczy zestawu telomerazy. Następnie, ponieważ telomeraza jest enzymem wrażliwym na ciepło, należy inaktywować termicznie połowę każdej próbki do wykorzystania jako kontrola ujemna przez inkubację w temperaturze 85 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie należy przygotować krzywą wzorca ilościowego, seryjnie rozcieńczając zapas.

Oligonukleotydy TSR rozcieńczają roztwór podstawowy pięć razy w rozcieńczeniu od jednego do pięciu przy użyciu buforu do lizy. Oligonukleotydy TSR mają identyczną sekwencję jak startery telomerów i mają znane stężenie. Następnie przygotuj mieszankę główną składającą się z 12,5 mikrolitra dwóch x ilościowego premiksu do wykrywania telomerazy i 11,5 mikrolitra wody klasy PCR na próbkę i mieszankę.

Następnie odpipetować 24 mikrolitry mieszanki wzorcowej do każdej używanej probówki. Po dozowaniu mieszanki wzorcowej dodać do studzienek jeden mikrolitr każdej matrycy składającej się z wzorca, próbki cieplnej i aktywowanej lub zwykłej próbki. Następnie uszczelnij płytkę samoprzylepnym arkuszem z tworzywa sztucznego i wymieszaj próbki przez wirowanie.

Następnie umieść je w systemie wykrywania PCR w czasie rzeczywistym. Ustaw program PCR tak, aby rozpoczynał się w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 20 minut. W tym czasie zajdzie reakcja telomerazy.

Następnie w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby uzyskać początkowy etap aktywacji PCR. Następnie wykonaj 40 cykli w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 30 sekund, 60 stopni Celsjusza przez 30 sekund i 72 stopni Celsjusza przez 30 sekund. Aby wzmocnić szablony telomerów dodane w ciągu 20 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Na koniec uruchom program i zbierz wartości progowe cyklu dla każdej próbki. Następnie wygeneruj krzywą wzorcową przy użyciu wartości CT i użyj jej do obliczenia aktywności telomerazy. W pokazanych próbkach.

Oto wyniki PCR w czasie rzeczywistym 65-letniego pacjenta. Gen telomerów reprezentowany przez jaskrawoczerwone linie osiąga swoją krzywą wykładniczą po około 27 cyklach. Drugi zestaw linii reprezentuje amplifikację genu z pojedynczą kopią, która ma tylko jedną kopię w genomie, a zatem ma mniej kopii niż próbki telomerów reprezentowane przez czerwone linie.

Ponadto gen z pojedynczą kopią osiąga krzywą wykładniczą po około 31 cyklach. Brązowe linie reprezentują krzywą wzorcową 33 opartą na szeregowym rozcieńczaniu znanych stężeń próbki. Krzywa standardowa dla logarytmu stężeń w funkcji wartości progowych jest pokazana tutaj.

Linia prosta potwierdza, że rozcieńczenie szeregowe zostało dokładnie zmierzone i załadowane. Wyniki analizy PCR w czasie rzeczywistym są następnie wykorzystywane do oszacowania długości telomerów. Jedna jednostka współczynnika kopiowania telomerów do pojedynczego genu jest równoważna średniej długości telomerów wynoszącej 4 270 par zasad w leukocytach i z tych danych daje stosunek 0,87, co daje średnią 3,715 par zasad i długość pośrednią dla kogoś w tym wieku.

Korzystając z wyników ilościowych testów PCR w czasie rzeczywistym, można wyjaśnić związek między aktywnością telomerów a stosunkiem telomerów do kopii pojedynczego genu. Ten wykres pokazuje silny związek między tymi dwoma testami po jego opracowaniu. Technika ta utorowała znaczenie naukowcom zajmującym się starzeniem się w dziedzinie starzenia się w celu zbadania starzenia się komórek w organizmach modalnych, danych demograficznych pacjentów i układach narządów.