Name: Zoptymalizowana ilościowa analiza typu pull-down białek wiążących RNA przy użyciu krótkiego biotynylowanego RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę pull-down RNA do identyfikacji białek wiążących RNA z komórek HEK 293T przy użyciu spektrometrii masowej. Łagodne warunki lizy zachowują kompleksy białkowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować grupie badawczej prof. Tartaglii i dr Cuomo za zaoferowane wsparcie. E.Z. otrzymała dofinansowanie ze stypendium MINDED programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji w ramach umowy grantowej Marie Skłodowska-Curie nr 754490.

1. Ogólne metody i materiał
<ol>
	<li>Przygotować odpowiednią pożywkę dla wybranej hodowli komórek ssaków i przed użyciem podgrzać ją w temperaturze 37 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Przygotuj wymagany materiał z wyprzedzeniem, zgodnie z opisem w Tabeli materiałów. Autoklaw wyrobów szklanych, wyrobów z tworzyw sztucznych i zapasów buforowych.</li>
	<li>Przygotować zgodnie z opisem w tabeli 1. Dostosuj pH roztworów podstawowych za pomocą stężonego HCl lub NaOH przed rozcieńczeniem składników do ich końcowych objętości.</li>
</ol>
2. Przygotowanie linii komórkowej ssaków
<ol>
	<li>Hoduj komórki HEK 293T w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 μg/ml roztworu penicyliny/streptomycyny. Inkubować je w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze wyposażonym w 5% CO2 . Rutynowo dziel komórki.</li>
	<li>Przed odłączeniem przepłucz komórki roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) w takiej ilości, aby pokryć powierzchnię uprawy.</li>
	<li>Usuń PBS i dodaj ultracienką warstwę roztworu trypsyny-EDTA.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze wyposażonym w 5% CO2 przez 5 minut lub do momentu odłączenia komórek (pod mikroskopem powinny wyglądać na rozproszone).</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór trypsyny-EDTA dziesięciokrotnie, dodając cały DMEM, aby go dezaktywować i policzyć komórki.</li>
	<li>Płytka 1,5 x 105 komórek/ml na płytkach 6-dołkowych, biorąc pod uwagę dwie studzienki / stan do przetestowania.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 48 godzin w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2, 
	UWAGA: Zapoznaj się z instrukcjami producenta, aby dowiedzieć się, jaki rodzaj pożywki i suplementu jest odpowiedni dla linii komórkowej. Również ilość i czas inkubacji trypsyny-EDTA zależą od linii komórkowej. Niektóre typy komórek rosną szybciej/wolniej niż to, co zostało zgłoszone w tym protokole; Dlatego należy wcześniej przetestować stężenie siewu.</li>
</ol>
3. Całkowite zbiory białka
<ol>
	<li>Usuń pożywkę z dołków, w których rosną komórki.</li>
	<li>Umyj każdą studzienkę z płytek 6-dołkowych 1 ml PBS.</li>
	<li>Wyrzuć PBS.</li>
	<li>Przesunąć płytki na lodzie i albo przejść do kroku 3.5, albo zamrozić suche płytki w temperaturze -80 °C, aby ułatwić lizę.</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu do lizy do każdej studzienki.</li>
	<li>Użyj skrobaka do komórek, aby odłączyć i rozbić komórki.</li>
	<li>Przenieś ekstrakt komórkowy pochodzący z dwóch studzienek do tej samej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Umieść probówkę z ekstraktem białkowym na lodzie na 30 minut.</li>
	<li>Odwirować lizaty komórkowe przy 17 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść każdy supernatant do wstępnie schłodzonej probówki. 
	UWAGA: Zaleca się łącznie 106-10 7 komórek dla każdego stanu PD. Liza komórek i zbieranie białka powinny być przeprowadzane za pomocą lodowatych. Inhibitory proteazy należy dodać do buforu do lizy, aby zapobiec degradacji białek.</li>
</ol>
4. Oznaczanie stężenia białka
<ol>
	<li>Przygotować odczynnik Bradford, zgodnie ze wskazaniami producenta, rozcieńczając go pięciokrotnie wdH2O.</li>
	<li>Rozprowadzić 1 ml odczynnika w kuwecie o średnicy 1 cm, dodać 1 μl próbki i wymieszać przez odwrócenie.</li>
	<li>Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 5-10 minut.</li>
	<li>Odczytać absorbancję przy 595 nm.</li>
	<li>Obliczyć objętość ekstraktu białkowego odpowiadającą 1,5 mg białek i doprowadzić wszystkie próbki do końcowej objętości 600 μl za pomocą buforu do lizy.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać na lodzie do czasu użycia. 
	UWAGA: Można zastosować dowolną inną metodę oznaczania stężenia białka, zgodnie z zaleceniami dotyczącymi kompatybilności buforu. W każdym przypadku bufor do lizy powinien być używany jako ślepa próba. Wiele odczynników nie jest kompatybilnych z ditiotreitolem (DTT). Zaleca się dodawanie DTT lub innych środków redukujących dopiero po ilościowym określeniu białka (DTT do końcowego stężenia 1 mM).</li>
</ol>
5. Przygotowanie koralików
<ol>
	<li>Wymieszaj kulki w buforze do przechowywania, przesuwając rurkę.</li>
	<li>Obliczyć 100 μl pożywki/próbki zawiesiny i umieścić objętość w stojaku magnetycznym.</li>
	<li>Pranie koralików
	<ol>
		<li>Usuń roztwór do przechowywania i umyj kulki, dodając 1 ml buforu/probówki do lizy i odwróć ją ręcznie.</li>
		<li>Wyjmij bufor za pomocą stojaka magnetycznego.</li>
		<li>Powtórz krok prania.</li>
		<li>Dodać objętość buforu do lizy równą początkowej objętości pożywki szlamowej, wymieszać, przesuwając probówkę i równomiernie dozować pożywkę do tylu probówek o pojemności 1,5 ml, ile jest próbek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blokowanie ściegów
	<ol>
		<li>Usunąć bufor za pomocą stojaka magnetycznego i dodać 600 μl 0,25 mg/ml roztworu tRNA drożdży przygotowanego w buforze do lizy.</li>
		<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na obracającym się kole.</li>
		<li>Usuń roztwór tRNA za pomocą stojaka magnetycznego.</li>
		<li>Dodać 600 μl buforu do lizy i przemyć, mieszając ręcznie.</li>
		<li>Powtórz etap mycia i wyrzuć bufor.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Ładowanie koralików
<ol>
	<li>Przygotować 200 μg oligonukleotydu RNA w 600 μl buforu do lizy dla każdej probówki zawierającej początkowe 100 μl pożywki zawiesinowej (teraz zablokowane kulki).</li>
	<li>Dodaj oligo do koralików i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, obracając się.</li>
	<li>Usuń roztwór, dodaj 600 μl buforu do lizy i umyj kulki dwukrotnie, obracając probówki przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzuć buffer. 
	UWAGA: Nigdy nie wiruj koralików, ale zamiast tego przesuwaj. O ile nie jest to konieczne, należy ograniczyć liczbę etapów pipetowania. Jeśli to możliwe, używaj pociętych końcówek o pojemności 1 ml. Ilość zawiesiny perełek/próbki zależy od zdolności wiązania kulek i wyjściowej ilości wszystkich białek. Jeśli przewiduje się, że oligonugo RNA ma znaczną ilość struktury drugorzędowej, zalecamy najpierw denaturację go w temperaturze 80 °C przez 10 minut, a następnie powolne schładzanie w temperaturze pokojowej lub ponowne składanie przez inkubację w temperaturze 30 °C przez 1 godzinę. Sugeruje się odzyskanie oligonugo RNA po załadowaniu kulkami i określenie pozostałego stężenia, w celu optymalizacji ilości wymaganej do obciążenia i oceny możliwości ponownego wykorzystania RNA.</li>
</ol>
7. Wiązanie białek na koralikach
UWAGA: Od teraz, jeśli to możliwe, wykonuj kroki w temperaturze 4 °C.
<ol>
	<li>Weź 5% objętość z 600 μl roztworu białkowego i zachowaj go jako INPUT (IN) do dalszej analizy (1,5 mg białek rozpuszcza się w 600 μL, więc 5% odpowiada 30 μL i 75 μg białek).</li>
	<li>Dodaj pozostałą mieszankę białkową do każdej tubki załadowanych kulek i pozostaw na noc do powolnego obracania w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
8. Mycie spoiw niespecyficznych
<ol>
	<li>Usuń niezwiązaną frakcję za pomocą stojaka magnetycznego. Zaoszczędź 5% objętości i oznacz ją jako FLOWTHROUGH (FT) (niezwiązana objętość wynosi ok. 600 μL, więc ponownie zachowaj 30 μL do dalszej analizy).</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu myjącego 1 do kulek i pozostawić na 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzuć bufor.</li>
	<li>Powtórz kroki 8.2 i 8.3.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu myjącego 2 do kulek i pozostawić na 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant.</li>
</ol>
9. Elucja specyficznych spoiw
<ol>
	<li>Dodać 100 μl buforu elucyjnego 1 lub buforu elucyjnego 2 do kulek.</li>
	<li>Wymieszać ręcznie, trzepiąc i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieścić probówki w termomikserze i energicznie wstrząsać przez 5 minut w temperaturze 95 °C.</li>
	<li>Umieść probówkę w stojaku magnetycznym i zbierz eluowaną frakcję do czystej probówki.</li>
	<li>Szybko odkręć kulki za pomocą wirówki stołowej, aby zmaksymalizować odzysk eluatu.</li>
	<li>Zaoszczędź 5% całkowitej objętości ELUATU (EL) do dalszych analiz (całkowita objętość wynosi 100 μL, więc oddziel 5 μL do innej probówki).</li>
	<li>W razie potrzeby stężenie białka można oznaczyć jak w sekcji 4, stosując bufor elucyjny jako ślepą próbę. 
	UWAGA: Zaleca się powstrzymanie się od dodawania DTT do buforu elucyjnego do czasu określenia stężenia białka. Jeśli oznaczanie ilościowe białka nie jest wymagane lub jeśli dostępne są zestawy do oznaczania ilościowego białek kompatybilne z czynnikiem redukującym, do buforu elucyjnego można dodać 1 mM DTT od samego początku. W tym protokole badano zarówno bufor elucyjny 1 (zawierający 1 M NaCl), jak i bufor elucyjny 2 (zawierający 2 M NaCl). Nie zaobserwowano różnicy w wydajności elucji białka docelowego przy zwiększonej sile jonowej, ale zaleca się przetestowanie obu warunków przed ustaleniem najodpowiedniejszego buforu. Jeżeli wysoka zawartość soli w buforze elucyjnym stanowi ograniczenie dla dalszej analizy, bardzo mała ilość detergentów w buforze elucyjnym pozwala na wymianę buforową. Alternatywnie eluat można rozcieńczyć, aby osiągnąć pożądane stężenie soli.</li>
</ol>
10. Identyfikacja spoiw białkowych za pomocą spektrometrii mas
<ol>
	<li>Wytrącanie acetonu
	<ol>
		<li>Zagęścić eluowane białka, rozcieńczając je czterokrotnie w zimnym (-20 °C) acetonie.</li>
		<li>Przeprowadzić wir i inkubować probówkę w temperaturze -20 °C przez noc.</li>
		<li>Wirować z prędkością 17 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Delikatnie usunąć sklarowany osad i pozostawić aceton do odparowania, aż do całkowitego wyschnięcia osadu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawienie białek w roztworze
	<ol>
		<li>Rozpuścić osad białkowy, dodając 50 μl buforu denaturacyjnego.</li>
		<li>Dodać DTT do końcowego stężenia 5 mM, umożliwiając redukcję białka przez 30 minut w temperaturze 55 °C.</li>
		<li>Schłodzić próbki w temperaturze pokojowej i przeprowadzić reakcję alkilacji białek, dodając jodoacetamid (IAA) w stężeniu 10 mM przez 15 minut.</li>
		<li>Roztrawić białka przy użyciu odpowiedniego enzymu (trypsyna, LysC) i inkubować próbki przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zatrzymaj trawienie, dodając 1 μl 10% kwasu trifluorooctowego (TFA).</li>
		<li>Oczyść i skoncentruj peptydy na niestandardowej mikrokolumnie C18 z odwróconą fazą, jak opisano wcześniej19.</li>
		<li>Peptydy elute z końcówki C18 za pomocą buforu B.</li>
		<li>Usunąć składnik organiczny za pomocą wirówki próżniowej i ponownie zawiesić peptydy w 5 μl 0,1% kwasu mrówkowego do dalszej analizy. 
		UWAGA: Alternatywnie, trawienie białek można przeprowadzić "na kulkach" natychmiast po umyciu niespecyficznych spoiw (kroki 8.1-8.6), co przyspiesza działanie protokołu. Zaleca się jednak przetestowanie skuteczności enzymu działającego "na kulkach" unieruchomionych białek w porównaniu ze standardowym trawieniem w roztworze, w celu zagwarantowania optymalnego pokrycia eksperymentalnych sekwencji białek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas w tandemie (LC-MS/MS)
	<ol>
		<li>Podłączyć kolumnę analityczną (faza stacjonarna C18) i utrzymywać ją w temperaturze 45 °C podczas pracy.</li>
		<li>Podłączyć kolumnę do wylotu sześcioportowego zaworu obrotowego pompy LC za pomocą kapilarnego złącza doszczelnego (20 μm x 550 mm) w konfiguracji jednokolumnowej.</li>
		<li>Dostosuj ustawienia LC w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Załadować peptydy pod kontrolowanym ciśnieniem (980 barów) do buforu A.</li>
			<li>Zastosuj gradient buforu B 5%-20% przy 300 nL/min przez 59 minut, a następnie gradient bufora B 20%-30% w ciągu 15 minut i gradient bufora B 30%-65% przez 5 minut.</li>
			<li>Dodać etap płukania, zwiększając stężenie buforu B do 95% w ciągu 5 minut oraz 5-minutowy etap izokratyczny przy 95% buforze B.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Używaj spektrometru mas w trybie akwizycji zależnej od danych (DDA), aby automatycznie przełączać się między zdarzeniami MS i MSMS.</li>
		<li>Zdefiniuj liczbę pętli równą 15 przy użyciu wartości docelowej automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC) wynoszącej 3 x 106 i 1 x 105 odpowiednio dla zdarzeń MS i MSMS.</li>
		<li>Ustaw maksymalny dozwolony czas akumulacji jonów na 20 ms dla MS o rozdzielczości 60 K i 100 ms dla MSMS o rozdzielczości 15 K.</li>
		<li>Przeprowadzić eksperyment fragmentacji o wysokiej dysocjacji zderzeń (HCD) przy użyciu znormalizowanej energii zderzenia wynoszącej 28% z dynamicznym czasem wykluczenia wynoszącym 20 s.</li>
		<li>Obsługuj parametry źródła w następujący sposób: 
		Napięcie natrysku: 1,7 kV 
		Napięcie kapilary: 275 °C 
		Nie stosuje się ani osłony, ani gazu pomocniczego 
		UWAGA: W tym protokole analiza spektrometrii mas (MS) ultra-wysokosprawnej chromatografii cieczowej (UHPLC) została specjalnie przeprowadzona przy użyciu konfiguracji LC z pojedynczą kolumną, sprzężoną z hybrydowym potrójnym kwadrupolowym instrumentem orbitrapowym (Tabela materiałów). Można stosować inne systemy LCMS, ale zalecana jest adaptacja parametrów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>analiza danych
	<ol>
		<li>Użyj przycisku Załaduj, aby zaimportować pliki RAW.</li>
		<li>Zdefiniuj nazwy eksperymentów, klikając przycisk Ustaw eksperyment</li>.
		<li>Wprowadź sekcję parametrów specyficznych dla grupy, aby określić wszystkie parametry związane z identyfikacją: 
		Enzym używany do trawienia: Trypsyna / P 
		Brakujące dekolty: do trzech 
		Poprawiono modyfikację: Carbamidomethylation 
		Zmienna modyfikacja: N-acetyl (białko), utlenianie (M)</li>
		<li>Przekaż zaktualizowany plik FASTA, dostępny w publicznych bazach danych, takich jak UniprotKB.</li>
		<li>Określ poprawne reguły analizy zgodnie ze źródłem wybranej bazy danych.</li>
		<li>Zdefiniuj wartość współczynnika fałszywych odkryć (FDR) = 1 zarówno dla białek, jak i peptydów.</li>
		<li>Dodaj opcję kwantyfikacji bez etykiety (LFQ) na karcie Kwantyfikacja bez etykiety.</li>
		<li>Utrzymuj minimalny współczynnik LFQ na poziomie dwóch. 
		UWAGA: W tym miejscu opisujemy analizę danych za pomocą MaxQuant24 i Perseus software25 w celu przeprowadzenia kwantyfikacji białek i późniejszej analizy statystycznej. Analizę danych można jednak przeprowadzić za pomocą dowolnej innej dostępnej na rynku lub bezpłatnej metody bioinformatycznej. FDR jest szacowany przy użyciu podejścia opartego na bazie danych typu target-decoy26. Wskaźnik FDR peptydów i białek równy 0,01 oznacza, że oczekuje się, że zidentyfikowane peptydy i białka będą zawierać 1% wyników fałszywie dodatnich.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>analiza statystyczna
	<ol>
		<li>Załaduj plik proteingroups.txt, aby przeprowadzić analizę statystyczną na poziomie białka.</li>
		<li>Zdefiniuj wartości LFQ jako kolumny główne.</li>
		<li>Usuń "odwrócenie" i "zanieczyszczenia", filtrując wiersze na podstawie kolumny kategorii.</li>
		<li>Użyj wierszy adnotacji kategorii, aby pogrupować różne warunki eksperymentalne.</li>
		<li>Zmniejsz macierz danych, wybierając liczbę prawidłowych wartości w każdej z wcześniej zdefiniowanych grup.</li>
		<li>Wybierz test statystyczny, który lepiej odpowiada warunkom eksperymentalnym (tj. test t, test dla wielu prób ANOVA).</li>
		<li>Określ punkt odcięcia dla istotnych wskazówek za pomocą obliczeń opartych na FDR. Zazwyczaj zarówno 0,01, jak i 0,05 są akceptowane jako progi dla skorygowanej wartości p.</li>
		<li>Wizualizacja wyników analiz różnicowych w oparciu o statystyki testu t przy użyciu reprezentacji wykresu wulkanu.</li>
		<li>Wyeksportuj końcową macierz w formacie .txt w celu dalszej edycji tabeli wyników końcowych. 
		UWAGA: Folder konfiguracyjny zawiera plik FASTA z białkami, takimi jak keratyny, które są uważane za powszechne zanieczyszczenia w globalnych eksperymentach proteomicznych, które są oznaczone znakiem + w tabeli wyjściowej. W niniejszym badaniu, przy dwóch warunkach próby, do analizy statystycznej stosuje się test t.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
11. Walidacja wyników przez western blot
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki
	<ol>
		<li>Dodać odpowiednią objętość 4x bufora ładującego próbkę do każdej podwielokrotności IN, FT i EL.</li>
		<li>Gotować próbki przez 5 minut w temperaturze 95°C.</li>
		<li>Szybkie wirowanie w celu odzyskania odparowanej próbki z górnej części probówek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SDS-PAGE i transfer żelu
	<ol>
		<li>Załaduj próbki na 4%-12% denaturujący żel poliakrylamidowy.</li>
		<li>Uruchom żel z buforem działającym MES SDS przez 1,5 godziny przy napięciu 120 V.</li>
		<li>Przenieś żel na membranę nitrocelulozową za pomocą półsuchej kasety transferowej, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Zalecamy 10-minutowy transfer przy napięciu 15 V.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Detekcja immunologiczna
	<ol>
		<li>Zablokuj błonę 10% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając.</li>
		<li>Dodać przeciwciało pierwszorzędowe przygotowane w 5% BSA do TBST, zgodnie z instrukcjami producenta. Pozostawić na noc w temperaturze 4 °C lub na 1 godzinę w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem.</li>
		<li>Umyj membranę trzykrotnie TBST, za każdym razem przez 5 minut.</li>
		<li>Dodać przeciwciało drugorzędowe przygotowane w TBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej pod wpływem mieszania.</li>
		<li>Umyj membranę trzykrotnie TBST, za każdym razem przez 5 minut.</li>
		<li>Wizualizacja wyników za pomocą blot imager. 
		UWAGA: Do wykrywania TDP-43, znanego spoiwa naszego RNA, użyto rekombinowanego króliczego przeciwciała monoklonalnego i pozostawiono z błoną na noc w temperaturze 4 °C. Jako przeciwciało drugorzędowe zastosowano peroksydazę chrzanową IgG (HRP) przeciwko królikowi, ale działało również przeciwciało fluorescencyjne drugorzędowe. Aby uwidocznić przeciwciała na błonie, błonę inkubowano z substratem Clarity Western ECL przez 1 minutę, a następnie obrazowano za pomocą systemu obrazowania ChemiDoc.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gebauer, F., Schwarzl, T., Valcárcel, J., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+human+genetic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in human genetic disease.</a> Nature Reviews Genetics. 22 (3), 185-198 (2021).</li>
<li>Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brave+new+world+of+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A brave new world of RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Cooper, T. A., Wan, L., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA and disease.</a> Cell. 136 (4), 777-793 (2009).</li>
<li>Qin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in tumor progression.</a> Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 90(2020).</li>
<li>Nussbacher, J. K., Tabet, R., Yeo, G. W., Lagier-Tourenne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+RNA+metabolism+in+neurological+diseases+and+emerging+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of RNA metabolism in neurological diseases and emerging therapeutic interventions.</a> Neuron. 102 (2), 294-320 (2019).</li>
<li>Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+understanding+RNA-mediated+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Towards understanding RNA-mediated neurological disorders.</a> Journal of Genetics and Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).</li>
<li>Maziuk, B., Ballance, H. I., Wolozin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+RNA+binding+protein+aggregation+in+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of RNA binding protein aggregation in neurodegenerative disorders.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 89(2017).</li>
<li>Zielinski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+ribonucleoprotein-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (5), 1557-1562 (2006).</li>
<li>Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-protein+interactions%3A+Central+players+in+coordination+of+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">RNA-protein interactions: Central players in coordination of regulatory networks.</a> BioEssays. 43 (2), 2000118(2021).</li>
<li>Weidmann, C. A., Mustoe, A. M., Jariwala, P. B., Calabrese, J. M., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+RNA-protein+networks+with+RNP-MaP+defines+functional+hubs+on+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Analysis of RNA-protein networks with RNP-MaP defines functional hubs on RNA.</a> Nature Biotechnology. 39 (3), 347-356 (2021).</li>
<li>Graindorge, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-cell+identification+and+measurement+of+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">In-cell identification and measurement of RNA-protein interactions.</a> Nature Communications. 10 (1), 5317(2019).</li>
<li>Ule, J., Hwang, H. W., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+cross-linking+and+immunoprecipitation+%28CLIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The future of cross-linking and immunoprecipitation (CLIP).</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (8), 032243(2018).</li>
<li>Ascano, M., Hafner, M., Cekan, P., Gerstberger, S., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+RNA-protein+interaction+networks+using+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+RNA%22%5BJournal%5D)">Identification of RNA-protein interaction networks using PAR-CLIP.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (2), 159-177 (2012).</li>
<li>McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+comprehensive+experimental+identification+of+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions.</a> Genome Biology. 15 (1), 203(2014).</li>
<li>Sugimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CLIP+and+iCLIP+methods+for+nucleotide-resolution+studies+of+protein-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of CLIP and iCLIP methods for nucleotide-resolution studies of protein-RNA interactions.</a> Genome Biology. 13 (8), (2012).</li>
<li>Bayat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SELEX+methods+on+the+road+to+protein+targeting+with+nucleic+acid+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">SELEX methods on the road to protein targeting with nucleic acid aptamers.</a> Biochimie. 154, 132-155 (2018).</li>
<li>Armaos, A., Colantoni, A., Proietti, G., Rupert, J., Tartaglia, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CatRAPID+omics+v2.0%3A+Going+deeper+and+wider+in+the+prediction+of+protein-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CatRAPID omics v2.0: Going deeper and wider in the prediction of protein-RNA interactions.</a> Nucleic Acids Research. 49, 72-79 (2021).</li>
<li>Agostini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CatRAPID+omics%3A+A+web+server+for+large-scale+prediction+of+protein-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CatRAPID omics: A web server for large-scale prediction of protein-RNA interactions.</a> Bioinformatics. 29 (22), 2928-2930 (2013).</li>
<li>Zacco, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+TDP-43+condensation+using+an+in+silico+designed+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Probing TDP-43 condensation using an in silico designed aptamer.</a> Nature Communications. 13 (1), 3306(2022).</li>
<li>Leppek, K., Stoecklin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+streptavidin-binding+RNA+aptamer+for+purification+of+ribonucleoprotein+complexes+identifies+novel+ARE-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins.</a> Nucleic Acids Research. 42 (2), 13(2014).</li>
<li>Zhang, Y., Lai, B. S., Juhas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+aptamer+discovery+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Recent advances in aptamer discovery and applications.</a> Molecules. 24 (5), 941(2019).</li>
<li>UniProt Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniProt%3A+the+Universal+Protein+Knowledgebase+in+2023%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">UniProt: the Universal Protein Knowledgebase in 2023.</a> Nucleic Acids Research. 51, 523-531 (2023).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li>
<li>Bellucci, M., Agostini, F., Masin, M., Tartaglia, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+protein+associations+with+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Predicting protein associations with long noncoding RNAs.</a> Nature Methods. 8 (6), 444-445 (2011).</li>
<li>Gallo-Oller, G., Ordoñez, R., Dotor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+background+subtraction+method+for+Western+blot+densitometry+band+quantification+through+image+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A new background subtraction method for Western blot densitometry band quantification through image analysis software.</a> Journal of Immunological Methods. 457, 1-5 (2018).</li>
<li>Weissinger, R., Heinold, L., Akram, S., Jansen, R. P., Hermesh, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+proximity+labeling%3A+A+new+detection+tool+for+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">RNA proximity labeling: A new detection tool for RNA-protein interactions.</a> Molecules. 26 (8), 2270(2021).</li>
<li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin%2C+avidin%2C+and+other+biotin-binding+proteins%3A+Uses+for+protein+labeling%2C+detection%2C+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li>
<li>Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O'Donoghue, M. B., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+DNA+aptamers+using+cell-SELEX%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Development of DNA aptamers using cell-SELEX.</a> Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Praca ta przedstawia optymalizację protokołu PD przeprowadzonego z biotynylowanymi oligonukleotydami RNA w celu wychwycenia ich interaktorów białkowych. Opisany tutaj protokół jest prosty do wykonania, wymaga niewielkiej ilości materiału i daje wysoce wiarygodne wyniki. Co ważne, najbardziej nowatorskie aspekty tego protokołu polegają na użyciu przynęty RNA zaprojektowanej w pełni in silico i specyficznej dla docelowego białka oraz elucji wszystkich białek związanych z przynętą RNA poprzez bezpośrednie zakłócenie ich interakcji z roztworem o wysokiej zawartości soli, a nie poprzez dysocjację streptawidyny od biotyny za pomocą detergentu i obróbki w wysokiej temperaturze.
Protokół ten wykorzystuje siłę wiązania między biotyną a streptawidyną29,30. Zgodnie z wybranymi kulkami streptawidyny, obciążenie biotynylowanym RNA musi zostać przetestowane i określone ilościowo przed kontynuowaniem. Ponadto trójwymiarowe fałdowanie RNA może wpływać na wydajność ładowania kulek, ponieważ może ograniczać ekspozycję biotyny na streptawidynę. Blokowanie kulek za pomocą niebiotynylowanego tRNA poprawia czystość wyników poprzez ograniczenie niespecyficznych interakcji z kulkami. Bufor ładujący i bufor elucyjny muszą być wybrane w zależności od dalszych zastosowań. W tym przypadku zaproponowano bardzo łagodne warunki, odpowiednie dla większości zastosowań i opracowane w celu zachowania potencjalnych kompleksów białkowych. Metoda ta jest jednak wysoce elastyczna; użytkownik może wybrać dowolną linię komórkową i dowolny rozmiar RNA, a także może zdecydować się na powtórzenie protokołu po złożeniu / rozwinięciu RNA, aby określić wpływ struktury na właściwości wiązania.
Innym oryginalnym aspektem tego protokołu jest wykorzystanie narzędzi predykcyjnych in silico w celu zapewnienia poprawności wyników20. Wiedza z wyprzedzeniem, które białka powinny zostać zidentyfikowane jako interaktory interesującego RNA, daje bezprecedensową przewagę w walidacji technicznych aspektów protokołu. Na przykład, korzystając z prostej analizy WB, możliwe jest zweryfikowanie obecności znanego docelowego białka w próbkach pochodzących z różnych etapów protokołu przed przystąpieniem do analizy MS, która wymaga specjalistycznego oprzyrządowania i jest bardziej kosztowna. Ponadto niedawno doniesiono o metodzie wykorzystania catRAPID20, wewnętrznego algorytmu przewidywania białka-RNA, do zaprojektowania de novo RNA specyficznego dla białka docelowego. Do niedawna jedynym dostępnym sposobem projektowania aptamerów DNA/RNA dla białka docelowego było podejście SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment)31. Metoda in silico pozwala na znacznie szybsze i tańsze projektowanie aptamerów RNA.
Główne ograniczenia tej metody związane są z koniecznością pracy w i narzędziach wolnych od nukleaz. Ponadto, jeżeli uważa się za konieczne potwierdzenie in vitro wiązania między RNA zaprojektowanym de novo a białkiem docelowym przed PD, białko musi zostać wyprodukowane i oczyszczone, a wiązanie określone za pomocą metod biofizycznych. Jest to ograniczenie, które jest wspólne z produkcją przeciwciał monoklonalnych.
Pomimo tych drobnych problemów, wiarygodne metody mapowania interakcji RNA-białko, takie jak ta przedstawiona tutaj, mogą przybliżyć naukowców do odkrycia sieci makromolekularnych i złożonych głównych aktorów wielu mechanizmów fizjologicznych i patologicznych, takich jak te związane z rakiem, kardiomiopatiami, cukrzycą, infekcjami mikrobiologicznymi oraz zaburzeniami genetycznymi i neurodegeneracyjnymi.

Białka wiążące RNA (RBP) okazały się kluczowymi graczami w transkrypcyjnej i potranskrypcyjnej regulacji genów, ponieważ biorą udział w procesach takich jak splicing mRNA, lokalizacja komórkowa RNA, translacja, modyfikacja i degradacja1,2,3. Takie interakcje między dwiema makrocząsteczkami są wysoce skoordynowane, precyzyjnie zrównoważone i niezbędne do tworzenia węzłów funkcjonalnych i przetwórczych. Różnice lub rozregulowania w obrębie tych węzłów mogą potencjalnie zakłócić precyzyjnie regulowane sieci białko-RNA i są coraz częściej związane z różnymi chorobami ludzkimi, w tym rakiem4,5 i zaburzeniami neurodegeneracyjnymi6,7,8. Interakcje między cząsteczkami RNA a ich partnerami wiążącymi białka mogą być albo stabilne i łatwe do walidacji eksperymentalnej, albo wysoce dynamiczne, przejściowe i trudniejsze do scharakteryzowania.
W ostatnich latach podjęto intensywne wysiłki w celu zrozumienia tych interakcji. Wśród najbardziej uznanych metod, testy ściągania białek (PD) są prawdopodobnie najbardziej cenionymi i powszechnie stosowanymi podejściami do rozwikłania głównych graczy tworzących kompleksy rybonukleoproteinowe (RNP) i inne sieci interakcji białko-RNA3,9,10. PD obejmują szeroki wachlarz technik informacyjnych, takich jak immunoprecypitacja RNA (RIP)11,12 lub białka (CLIP)13,14 interesującego go. Niektóre z tych protokołów RNA-PD wykorzystują znane RNA jako przynętę dla białek15, najczęściej wykorzystując znaczniki o wysokim powinowactwie, takie jak biotyna. W tym przypadku partnerzy interakcji biotynylowanego RNA mogą być wykryci poprzez zakotwiczenie RNA na kulkach pokrytych streptawidyną, co umożliwia skuteczną izolację RNP. Głównymi ograniczeniami tych podejść jest zwykle konstrukcja biotynylowanych sond i testowanie ich zdolności do wiązania białek docelowych. W tym celu przydatne może być oparcie się na opublikowanych danych CLIP interesującego białka, jeśli są dostępne, ponieważ ujawniają one z dużą precyzją krótkie regiony RNA, które odpowiadają pikom interakcji z docelowym białkiem13,16. Te same regiony mogą być wykorzystane do opracowania sond dla PD. Alternatywną metodą projektowania takich przynęt RNA może być systematyczna ewolucja ligandów przez wykładnicze wzbogacanie (SELEX)17, które umożliwiają projektowanie aptamerów poprzez selekcję in vitro, zaczynając od obszernej randomizowanej biblioteki i poprzez serię cykli optymalizacyjnych sterowanych PCR. Jednak SELEX jest złożony i czasochłonny, a końcowe wyniki w dużym stopniu zależą od początkowej biblioteki. Aby wybrać przynętę RNA do użycia w przedstawionym tutaj protokole, zastosowano jeszcze inne podejście, polegające na użyciu przynęty RNA zaprojektowanej de novo za pomocą mocy obliczeniowej algorytmu catRAPID, który przewiduje preferencyjne wiązanie danego białka w stosunku do określonych sekwencji RNA18,19,20.
Przedstawiony tutaj protokół jest wersją RNA-PD zoptymalizowaną do elucji określonych partnerów białkowych w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, bez użycia detergentów, środków denaturujących lub wysokich temperatur. Opiera się na nano-superparamagnetycznych kulkach kowalencyjnie pokrytych wysoce oczyszczoną streptawidyną i zastosowaniu specyficznego biotynylowanego RNA zaprojektowanego in silico jako przynęty. Protokół ten zapewnia szybką i wydajną metodę izolowania partnerów wiążących biotynylowane cząsteczki RNA w warunkach natywnych, oferując potencjał dla szerokiego zakresu dalszych zastosowań. Do przetestowania tego protokołu użyto 10-nukleotydowej jednoniciowej sekwencji aptamerowej RNA, wcześniej zaprojektowanej do wiązania białka TAR DNA wiążącego białko 43 (TDP-43) z wysokim powinowactwem i swoistością20. Począwszy od lizatów komórkowych HEK 293T, interakcje biotynylowanego aptameru RNA zidentyfikowano za pomocą analizy spektrometrii mas wykonanej na próbkach odłączonych od przynęty RNA przy użyciu buforu hipertonicznego. Analiza ta potwierdziła pomyślną identyfikację i kwantyfikację TDP-43 jako preferowanego spoiwa.
Ten protokół umożliwia udaną identyfikację interaktorów białkowych przy użyciu tylko krótkiego, zsyntetyzowanego in vitro oligonukleotydu RNA. Co więcej, zastosowanie zaprojektowanych in silico aptamerów RNA jako sond PD21,22 gwarantuje specyficzność dla celów przy znacznie obniżonych kosztach.

<table><tbody><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10861-554</td><td>OGNIWA</td></tr><tr><td>Skrobaki do komórek</td><td>BIOSIGMA&nbsp;</td><td>10153</td><td>KOMÓRKI</td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Zmodyfikowany Orzeł i liczba pierwsza; s Średni&nbsp; (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientfic</td><td>11995065</td><td>CELLS</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, inaktywowana termicznie, Brazylia</td><td>Thermo Fisher Scientfic</td><td>10500064</td><td>CELLS</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS, Waltham, MA)</td><td>Thermo Fisher Scientfic</td><td>14190169</td><td>CELLS</td></tr><tr><td>Trypsyna (0,25%), czerwień fenolowa</td><td>Thermo Fisher Scientfic</td><td>15050065</td><td>CELLS</td></tr><tr><td>Anty-królik IgG chrzan peroksydaza (HRP)</td><td>Cellsignal</td><td>7070</td><td>PD</td></tr><tr><td>Biotynylowane RNA</td><td>Eurofins</td><td>Niestandardowe oligonukleotydy RNA</td><td>PD</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td>PD</td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrat, 500 ml</td><td>Biorad</td><td>1705061</td><td>PD</td></tr><tr><td>cKompletny, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Merck - Sigma Aldrich</td><td>5056489001</td><td>PD</td></tr><tr><td>NuPAGE 4 do 12%, Bis-Tris, 1,0 mm, Mini żel białkowy, 10-dołkowy</td><td>Invitrogen</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>PD Rekombinowane przeciwciało anty-TDP43</td><td>Abcam</td><td>ab109535</td><td>PD</td></tr><tr><td>Kwas rybonukleinowy, transfer z drożdży piekarskich (S.&nbsp; cerevisiae)</td><td>Merck - Sigma Aldrich</td><td>R5636-1ML</td><td>PD</td></tr><tr><td>Streptavidin Mag Sepharose</td><td>Merck - Sigma Aldrich</td><td>GE28-9857-99</td><td>PD</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo RTA Mini 0,2 i mikro; m Zestaw transferowy PVDF</td><td>Biorad</td><td>1704272</td><td>PD</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Thermo Fisher Scientfic</td><td>022928.K2</td><td></td></tr><tr><td>MS C18 wkład</td><td>Thermo Fisher Scientfic</td><td>13-110-018</td><td>MS</td></tr><tr><td>Dithiothreitol&nbsp; (umowa o unikaniu podwójnego opodatkowania)</td><td>Kolumny HPLC Thermo Fisher Scientfic</td><td>20290</td><td>MS</td></tr><tr><td>EASY-Spray</td><td>Thermo Scientific</td><td>ES902</td><td>MS</td></tr><tr><td>jodoacetamid (IAA)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich S.r.l.</td><td>I6125</td><td>MS</td></tr><tr><td>Lys-C/Trypsin</td><td>Promega</td><td>V5073</td><td>MS</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA)</td><td>Thermo Fisher Scientfic</td><td>28904</td><td>MS</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Thermo Fisher Scientfic</td><td>J75826. A7</td><td>MS</td></tr><<tr><td>strong>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc system obrazowania</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>CELLS</td></tr><tr><td>Dyna Mag -2 , Stojak magnetyczny</td><td>Inkubator C0</td><<td></td>sub>2 z płaszczem wodnym Invitrogen <td></td> CELLS CELLS Forma</tr> Series <tr><td>3</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>PD</td></tr><tr><td>PROTEAN II XI CELL, zasilacz do aplikacji PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>PD</td></tr><tr><td>Koło obrotowe, rotator SB3</td><td>Stuart</td><td></td><td>PD</td></tr><tr><td>Zestaw do kąpieli wodnej pod kątem 37 stopni; System</td> elektroforezy C <td>VWR</td><td></td><td>PD</td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>MS</td></tr><tr><td>Easy-nLC 1200 UHPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS</td>Q exactive Spektrometr masowy Thermo Scientific <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>MS</td></tr><<tr><td>strong>Software</td><td>Version</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>2.0.3.0</td><td></td><td>MS</td></tr><tr><td>Perseus</td><td>1.6.14.0</td><td></td><td>MS</td></tr></tbody></table>

zoptymalizowana ilościowa analiza typu pull-down białek wiążących rna przy użyciu krótkiego biotynylowanego rna

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Interakcje białko-RNA regulują ekspresję genów i funkcje komórkowe na poziomie transkrypcyjnym i potranskrypcyjnym. Z tego powodu identyfikacja partnerów wiążących interesujące nas RNA pozostaje bardzo ważna dla odkrycia mechanizmów stojących za wieloma procesami komórkowymi. Jednak cząsteczki RNA mogą wchodzić przejściowo i dynamicznie w interakcje z niektórymi białkami wiążącymi RNA (RBP), zwłaszcza z białkami niekanonicznymi. W związku z tym bardzo potrzebne są ulepszone metody izolowania i identyfikowania takich RBP.
Aby skutecznie i ilościowo zidentyfikować białkowych partnerów znanej sekwencji RNA, opracowaliśmy metodę opartą na ściąganiu i charakterystyce wszystkich oddziałujących białek, zaczynając od całkowitego ekstraktu białkowego z komórki. Zoptymalizowaliśmy ściąganie białka za pomocą biotynylowanego RNA wstępnie załadowanego na kulki pokryte streptawidyną. Jako dowód słuszności koncepcji zastosowaliśmy krótką sekwencję RNA, o której wiadomo, że wiąże białko TDP-43 związane z neurodegeneracją i negatywną kontrolę o innym składzie nukleotydów, ale tej samej długości. Po zablokowaniu kulek drożdżowym tRNA, załadowaliśmy biotynylowane sekwencje RNA na kulki streptawidyny i inkubowaliśmy je z całkowitym ekstraktem białkowym z komórek HEK 293T. Po inkubacji i kilku etapach mycia w celu usunięcia niespecyficznych spoiw, eluowaliśmy oddziałujące białka roztworem o wysokiej zawartości soli, kompatybilnym z najczęściej stosowanymi odczynnikami do oznaczania ilościowego białek oraz z przygotowaniem próbki do spektrometrii mas. Określiliśmy ilościowo wzbogacenie TDP-43 w pull-down wykonanym ze znanym spoiwem RNA w porównaniu z kontrolą ujemną za pomocą spektrometrii mas. Użyliśmy tej samej techniki do zweryfikowania selektywnych oddziaływań innych białek, które obliczeniowo przewidywano jako unikalne spoiwa naszego RNA będącego przedmiotem zainteresowania lub naszej kontroli. Na koniec zwalidowaliśmy protokół za pomocą western blot poprzez wykrycie TDP-43 za pomocą odpowiedniego przeciwciała. 
Ten protokół pozwoli na badanie białkowych partnerów interesującego RNA w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, pomagając odkryć unikalne i nieprzewidywalne interakcje białko-RNA.

Aby zweryfikować poprawność proponowanego protokołu, zaprezentowane tutaj eksperymenty PD przeprowadzono z wykorzystaniem biotynilowanego aptameru RNA, zaprojektowanego in silico w celu specyficznego wiązania TDP-4320. Ten RNA wiąże swój białkowy cel z wysokim powinowactwem (Kd = 90 nM)20. W niniejszej pracy ten RNA o sekwencji 5'-CGGUGUUGCU-3' określany jest nazwą „+RNA”. Jako kontrolę negatywną wykorzystano sekwencję odwrotnie komplementarną do +RNA, nazwaną tutaj „-RNA”. Jej sekwencja to 5'-AGCAACACCG-3'. -RNA wykazuje znacznie niższe powinowactwo wiązania do TDP-43 (Kd = 1.5 µM)19. Na potrzeby opisanego tutaj protokołu oligonukleotydy RNA zakupiono w formie sprzężonej z cząsteczką biotyny, aby umożliwić ich wiązanie z kulkami streptawidynowymi. +RNA zakupiono z biotyną-TEG na końcu 3', która zawiera 15-atomowy łącznik z trietylenoglikolu pomiędzy biotyną a grupą fosforanową kwasu nukleinowego; -RNA posiadał natomiast biotynę na końcu 5', sprzężoną z kwasem nukleinowym via łącznik amino-C6. Jeżeli jednak projekt przynęty RNA jest odporny i o ile nie występuje interferencja strukturalna lub chemiczna pomiędzy łącznikiem a RNA, można zastosować inne pozycje koniugacji biotyny oraz inne długości łączników.
Znajomość tożsamości głównego białka, które powinno być związane z sondą +RNA po procesie PD, umożliwiła walidację protokołu poprzez identyfikację TDP-43 w eluate, z wykorzystaniem zarówno spektrometrii mas (MS), jak i western blotu (WB) (Rysunek 1).
Analizę MS przeprowadzono na czterech powtórzeniach PD wykonanych z użyciem +RNA lub -RNA (Rysunek 2). Identyfikacja interaktomów +RNA i -RNA wykracza poza zakres niniejszego protokołu, jednak przedstawiono niektóre wyniki potwierdzające dokładność procedury. Warto zauważyć, że naniesienie istotnie wzbogaconych białek na wykres wulkaniczny (volcano plot) wykazało, że całkowita zawartość białek oraz białka wzbogacone elucyjne z +RNA były znacznie wyższe niż te odzyskane z -RNA (Rysunek 2). Oznacza to, że mimo tej samej długości i struktury (liniowej), +RNA może tworzyć większą liczbę specyficznych oddziaływań, które są utrzymywane aż do etapu elucji w wysokim stężeniu soli. Prawdopodobnie -RNA tworzy natomiast większą liczbę niespecyficznych kontaktów, które są przerywane podczas etapów przemywania. Zgodnie z oczekiwaniami, TDP-43 został zidentyfikowany jako unikalny interaktor +RNA20; średnia kwantyfikacja bez znakowania (LFQ) dla czterech powtórzeń PD wykonanych z +RNA wynosi 31,96 ± 0,56, podczas gdy białko to nie zostało zidentyfikowane wśród interaktorów -RNA. Ponadto, spośród wszystkich unikalnych interaktorów +RNA, TDP-43 okazał się białkiem o największym stopniu wzbogacenia.
W celu dalszej walidacji protokołu wykorzystano opracowany wewnętrznie algorytm catRAPID18,19 do obliczeniowego przewidywania, które inne białka będą wiązać specyficznie +RNA lub -RNA. W szczególności, za pomocą funkcji „interaction propensity” algorytmu catRAPID, zdefiniowanej w naszej poprzedniej pracy27, obliczono wskaźniki interakcji +RNA i -RNA z białkami tworzącymi ludzki proteom. Wśród białek ocenionych z wysoką pewnością przewidziano, że HNRNPH3 będzie wiązać selektywnie +RNA (wskaźnik interakcji z +RNA = 1,01; wskaźnik interakcji z -RNA = 0,21), a PCBP2 będzie oddziaływać specyficznie z -RNA (wskaźnik interakcji z +RNA = -0,5; wskaźnik interakcji z -RNA = 0,31) (Rysunek 3A). Ponadto przewidziano, że białko RBM41 będzie wykazywać niespecyficzne powinowactwo do obu oligonukleotydów RNA (wskaźnik interakcji z +RNA = 0,4; wskaźnik interakcji z -RNA = 0,39) (Rysunek 3A). Analiza MS rzeczywiście potwierdziła obecność HNRNPH3 i PCBP2 odpowiednio w PD dla +RNA i -RNA, natomiast stwierdzono, że RBM41 oddziałuje z obydwoma (Rysunek 3B).
Metodę WB wykorzystano do wykrycia obecności TDP-43 w celu dalszego potwierdzenia wyników oraz podczas optymalizacji protokołu (Rycina 4). W opisanym tutaj postępowaniu pobrano różne próbki na różnych etapach. Próbka wejściowa (IN) składała się z białek całkowitych rozcieńczonych w buforze do lizy. Frakcję przepływową (FT) otrzymano po całonocnej inkubacji białek całkowitych z paciorkami streptawidyny uprzednio powleczonymi biotynilowanym RNA, co reprezentowało frakcję białek, które nie związały się z RNA. Ostatecznie eluat (EL) zawierał wszystkie białka, które specyficznie rozpoznały badane RNA, ponieważ między etapem FT a EL trzy kroki płukania roztworem 150 mM soli i 0,1% triton-X powinny usunąć najsłabsze oddziaływania.
Dla każdej powtórki taką samą ilość (5% v/v) frakcji IN, FT i EL poddano równoległej analizie metodą SDS-PAGE i zabarwiono przeciwciałem anty-TDP-43 (Rycina 4). W przypadku +RNA prążek TDP-43 zaobserwowano w IN oraz w EL, co wskazuje, że białko obecne od początku w całkowitym ekstrakcie białkowym jest zatrzymywane przez +RNA podczas etapów płukania i eluowane dopiero na końcu za pomocą buforu o wysokim stężeniu soli. TDP-43 było również obecne w IN dla -RNA, jednak prążek odpowiadający temu białku jest widoczny także w FT, co wskazuje, że to RNA nie wiąże TDP-43. Brak prążka TDP-43 w EL potwierdza ten wynik.
Podczas optymalizacji protokołu badano elucję białek specyficznie związanych z sekwencjami RNA, wykorzystując zarówno bufor elucyjny zawierający 1 M NaCl (EB1), jak i bufor elucyjny z 2 M NaCl (EB2) (Rysunek 4). Eluaty otrzymane przy użyciu obu buforów EB porównano za pomocą SDS-PAGE, a następnie przeprowadzono blotting z użyciem przeciwciała anty-TDP-43. Uzyskane obrazy przeanalizowano programem ImageJ28, aby określić ilościowo różnice w ilości TDP-43 eluowanego przez oba bufory. Ogólnie nie zaobserwowano istotnych różnic i wyciągnięto wniosek, że w tych testach stężenie soli 1 M jest wystarczające do przerwania nawet najsilniejszych oddziaływań białko-RNA.
Ogólnie rzecz biorąc, przedstawione tutaj wyniki MS i WBs wykazują, że protokół ten jest wydajny w specyficznym wychwytywaniu białek oddziałujących z danym RNA i umożliwia elucję w buforach kompatybilnych z dalszymi analizami.
<img alt="Schemat analizy interaktomu RNA; przedstawiono wiązanie białek, przemywanie, elucję, dane MS i WB." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64923/64923fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat procedury eksperymentalnej zastosowanej w proponowanym protokole. (A) Biotynilowany oligonukleotyd RNA jest przygotowywany w buforze do lizy w odpowiednim stężeniu. (B) Magnetyczne kulki streptawidynowe są przemywane, blokowane za pomocą tRNA drożdży i obciążane biotynilowanym RNA. (C) Do mieszaniny kulek i RNA dodaje się całkowity ekstrakt białkowy otrzymany z hodowlanych linii komórkowych ssaków. (D) Przeprowadza się wielokrotne przemywanie w celu usunięcia nieswoistych oddziaływań. (E) Swoiste białka oddziałujące są oddzielane od RNA za pomocą roztworu hipertonicznego. (F) Tożsamość interaktorów jest ujawniana za pomocą spektrometrii mas, a wybrane przypadki są walidowane za pomocą western blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64923/64923fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Przebieg analizy spektrometrycznej: przygotowanie próbek, analiza LC-MS, przetwarzanie peptydów, analiza danych z wykorzystaniem wykresu wulkanicznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64923/64923fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2Strategia analityczna dla bezetykietowej kwantyfikacji białek metodą MS. (AEluowane białka wytrąca się w zimnym acetonie przez noc. Następnie białka poddaje się denaturacji i przeprowadza trawienie w roztworze. Peptydy proteolityczne są zagęszczane i odsalane.B) Peptydy są analizowane poprzez LC-MS/MS z zastosowaniem „metody shotgun”. (CPrzetwarzanie i analiza danych surowych są wykonywane odpowiednio przy użyciu oprogramowania MaxQuant i Perseus.D) Białka o statystycznie istotnym wzbogaceniu przedstawiono na wykresie wulkanicznym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64923/64923fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ilustracji.</a>
<img alt="Wykres słupkowy przewidywanej skłonności do wiązania oraz tabela danych LFQ dla białek: HNRNPH3, PCBP2, RBM41." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64923/64923fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Korelacja między przewidywaną skłonnością do interakcji a interakcjami +RNA i -RNA określonymi eksperymentalnie. (A) Wyniki interakcji catRAPID w odniesieniu do HNRNPH3, PCBP2 i RBM41, wskazujące na preferencyjne wiązanie +RNA przez HNRNPH3 i -RNA przez PCBP2, podczas gdy w przypadku RBM41 przewiduje się nieselektywne wiązanie obu sekwencji RNA. (B) Średnie wartości kwantyfikacji bezznakowej (LFQ) wyznaczone za pomocą analizy spektrometrii mas z wyciągów (pull-downs) przeprowadzonych z użyciem +RNA i -RNA. Analiza potwierdza, że HNRNPH3 wiąże wyłącznie +RNA, PCBP2 wiąże wyłącznie -RNA, a RBM41 wiąże oba w równym stopniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64923/64923fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Żel SDS-PAGE; wynik oczyszczania białka; prążki TDP-43 przy 43kDa; analiza elektroforetyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64923/64923fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Walidacja metodą Western blot obecności/braku TDP-43 wśród interaktorów wybranych sekwencji RNA. Membrana WB została poddana działaniu przeciwciała anty-TDP-43. IN = input; FT = flow-through; EL (EB1) = elucja z użyciem buforu elucyjnego 1; EL (EB2) = elucja z użyciem buforu elucyjnego 2; znak „+” oznacza próbki pochodzące z pull-down wykonanego z +RNA; znak „-” oznacza próbki pochodzące z pull-down wykonanego z -RNA; ścieżka 1 zawiera drabinę białkową. TDP-43 zostało wskazane strzałką. WB wskazuje, że TDP-43 znajduje się wśród interaktorów +RNA, ale nie wśród interaktorów -RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64923/64923fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">Nazwa buforu</td>
			<td colspan="3">Skład</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">10x bufor do transferu</td>
			<td colspan="3">250 mM tris, 1.92 M glicyny, 1% SDS, 20% metanolu. Rozcieńczyć 10-krotnie przed użyciem</td>
			<td rowspan="9">PD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">20X bufor do elektroforezy MES SDS</td>
			<td colspan="3">1 M MES, 1 M tris, 2% SDS, 20 mM EDTA. Dostosować pH do 7.3. Rozcieńczyć 20-krotnie przed użyciem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">4x bufor do nakładania próbek</td>
			<td colspan="3">0.25 M Tris (zasada), 0.28 M SDS, 40% glicerolu, 20% 2-merkaptoetanolu, 4 mg/ml błękitu bromofenolowego</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Bufor elucyjny 1</td>
			<td colspan="3">20 mM fosforanu pH 7.5, 1 M NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 1 mM DTT (dodać po kwantyfikacji)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Bufor elucyjny 2</td>
			<td colspan="3">20 mM fosforanu pH 7.5, 2 M NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 1 mM DTT (dodać po kwantyfikacji)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Bufor do lizy</td>
			<td colspan="3">10 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 1 mM DTT oraz inhibitory proteaz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Bufor solny Tris z Tween-20</td>
			<td colspan="3">1 M Tris-HCl pH 7.4, 3 M NaCl, 2.0% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Bufor piorący 1</td>
			<td colspan="3">10 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.1% Triton TM X-100, 1 mM DTT oraz inhibitory proteaz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Bufor piorący 2</td>
			<td colspan="3">25 mM Hepes pH 8, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 1 mM DTT oraz inhibitory proteaz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Bufor A</td>
			<td colspan="3">0.1% kwasu mrówkowego</td>
			<td rowspan="3">MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Bufor B</td>
			<td colspan="3">60% acetonitrylu, 0.1% kwasu mrówkowego</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Bufor do denaturacji</td>
			<td colspan="3">8M mocznika, 50 mM Tris-HCl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Bufor PD i MS. Nazwy i skład buforów stosowanych w eksperymentach pull-down (PD) lub w analizie spektrometrią mas (MS).

Tutaj prezentujemy zoptymalizowaną metodę in vitro do odkrywania, ilościowego i walidacji interaktorów białkowych specyficznych sekwencji RNA, przy użyciu całkowitego ekstraktu białkowego z komórek ludzkich, kulek streptawidyny pokrytych biotynylowanym RNA oraz analizy spektrometrii mas.

Zoptymalizowana ilościowa analiza typu pull-down białek wiążących RNA przy użyciu krótkiego biotynylowanego RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

Protokół ten umożliwia identyfikację partnerów wiążących białka znanej sekwencji RNA poprzez pobranie ich z ekstraktu komórkowego za pomocą biotynylowanych oligonukleotydów RNA. W porównaniu z metodami, które wymagają detergentów lub wysokich temperatur w celu odłączenia białek od RNA, protokoły te wykorzystują zamiast tego bardzo łagodne warunki, które pozwalają również zachować potencjalne kompleksy białkowe. Procedurę zademonstruje Jakob Rupert, doktorant pod moim kierunkiem.Rozpocznij całkowite zbieranie białka od usunięcia pożywki z dołków płytki komórkowej HEK 293T i umyj studzienki sześciu płytek dołkowych jednym mililitrem PBS. Wyrzucić PBS i przenieść płytki do lodu, przed dodaniem 200 mikrolitrów buforu do lizy do każdej studzienki. Odłącz i rozbij komórki za pomocą skrobaka do komórek przed przeniesieniem ekstraktu komórkowego pochodzącego z dwóch studzienek do tej samej 1,5 mililitrowej probówki.Po 30 minutach inkubacji na lodzie i odwirowaniu przenieść supernatant do wstępnie schłodzonej probówki. Następnie oblicz objętość ekstraktu białkowego odpowiadającą 1,5 miligrama białka. Następnie doprowadzić wszystkie próbki do końcowej objętości 600 mikrolitrów za pomocą buforu do lizy.Próbki należy przechowywać na lodzie do czasu użycia. Aby przygotować koraliki, wymieszaj je w buforze do przechowywania, przesuwając rurkę. Po obliczeniu 100 mikrolitrów podłoża gnojowicy na próbkę, należy umieścić obliczoną objętość gnojowicy w stojaku magnetycznym.Aby umyć kulki, usuń roztwór do przechowywania i umyj kulki, dodając jeden mililitr buforu do lizy i odwracając go ręcznie. Następnie wyjmij bufor za pomocą stojaka magnetycznego i powtórz krok mycia. Do kulek dodaj objętość buforu do lizy równą początkowej objętości pożywki zawiesinowej i wymieszaj ją, przesuwając probówkę przed równomiernym dozowaniem pożywki do tylu 1,5 mililitrowych probówek, ile próbek.W celu zablokowania kulek usuń bufor za pomocą stojaka magnetycznego i dodaj 600 mikrolitrów po 0,25 miligrama na mililitr roztworu TRNA drożdży przygotowanego w buforze do lizy. Inkubuj go przez godzinę w temperaturze pokojowej na obracającym się kole. Usuń roztwór TRNA za pomocą stojaka magnetycznego przed dodaniem 600 mikrolitrów buforu do lizy i umyj go, mieszając ręcznie.Powtórz etap mycia i wyrzuć bufor. Dla każdej probówki zawierającej początkowe 100 mikrolitrów pożywki zawiesinowej należy przygotować 200 mikrogramów oligonukleotydu RNA w 600 mikrolitrach buforu do lizy. Dodaj oligo do koralików i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej, obracając się.Usuń roztwór z kulek i przemyj dwukrotnie 600 mikrolitrami buforu do lizy, obracając probówki przez pięć minut każda w temperaturze pokojowej. Odrzuć bufor. W przypadku wiązania białek na kulkach należy oddzielić 5% lub 30 mikrolitrów objętości od roztworu białkowego o objętości 600 mikrolitrów i zachować go jako dane wejściowe lub IN do dalszej analizy.Dodaj pozostałą mieszankę białkową do każdej probówki załadowanych kulek i inkubuj z powolnymi obrotami przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń niezwiązaną frakcję białkową z kulek za pomocą stojaka magnetycznego. Zaoszczędź 5% lub 30 mikrolitrów jego objętości i oznacz go jako przepływowy lub FT. Dodaj jeden mililitr buforu myjącego 1 do kulek i obracaj go przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Wyrzuć bufor i powtórz to pranie jeden raz. Dodaj jeden mililitr buforu do płukania 2 do kulek. A po inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze przez pięć minut wyrzuć supernatant.W celu elucji specyficznych spoiw dodać 100 mikrolitrów buforu elucyjnego 1 do kulek. Po ręcznym wymieszaniu przez strzepkiwanie inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Umieść probówki w mikserze termicznym i energicznie potrząsaj przez pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza.Następnie umieść probówkę w stojaku magnetycznym i zbierz wymywaną frakcję do czystej probówki. Po zakończeniu szybko odkręć kulki za pomocą wirówki stołowej, aby zmaksymalizować odzysk eluatu. I zaoszczędź 5% lub pięć mikrolitrów całkowitej objętości eluatu lub EL do dalszych analiz.Wymyte białka zidentyfikowano za pomocą spektrometrii mas. Wykreślenie znacznie wzbogaconych białek na wykresie wulkanicznym ujawniło, że całkowita zawartość białka i wzbogaconych białek wymytych z RNA była znacznie wyższa niż RNA, co sugeruje, że RNA może ustanowić większą liczbę specyficznych interakcji. Jako przykłady zgodności między przewidywanymi i uzyskanymi wynikami, wyniki interakcji dla plus RNA i minus RNA z białkami ludzkiego proteomu wykazały, że przewiduje się, że HNRNPH3 będzie selektywnie wiązać plus RNA, a PCBP2 będzie oddziaływać specyficznie z RNA.Ponadto przewidywano, że białko RBM41 będzie promiskuityczne dla obu oligonukleotydów RNA. Analiza spektroskopii mas próbek do testów ściągania białek potwierdziła obecność HNRNPH3 w RNA i PCBP2 w ujemnym RNA. Podczas gdy stwierdzono, że RBM41 wchodzi w interakcje z obydwoma.Western blot został użyty do wykrycia obecności TDP-43 w wynikach i krokach optymalizacji protokołu. W RNA TDP-43 zaobserwowano w próbce wejściowej i eluacie, co wskazuje na jego obecność od samego początku. TDP-43 został zatrzymany przez RNA podczas etapów płukania i został wymyty na końcu za pomocą buforu o wysokiej zawartości soli.Mapując interakcje białkowego RNA, metoda ta może ujawnić sieci makromolekularne stojące za wieloma szlakami fizjologicznymi. Na przykład regulacja transkrypcji lub mechanizmy patologiczne, w tym rak i neurodegeneracja.

an-optimized-quantitative-pull-down-analysis-rna-binding-proteins

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Transkrypty RNA podlegają rozległej regulacji potranskrypcyjnej, w której pośredniczy wiele trans-działających białek wiążących RNA (RBP). W tym miejscu przedstawiamy uogólnioną metodę precyzyjnej identyfikacji w skali całego transkryptomu miejsc wiązania RNA RBP.

PAR-CliP - metoda identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących RNA w całym transkryptomie

Ten film demonstruje test in vitro do ekstrakcji RNA w celu identyfikacji białek wiążących RNA (RBP), które oddziałują z sekwencjami elementów bogatych w adenylan-urydylan (ARE) w mRNA. Docelowe RBP z lizatu komórkowego miesza się z sondą RNA w celu utworzenia kompleksów RNA-białko. Kompleksy izoluje się poprzez oczyszczanie powinowactwa z wykorzystaniem powinowactwa znacznika destiobiotyny sondy RNA do kulki magnetycznej znakowanej streptawidyną.

Test ściągania białka RNA w celu wyizolowania białek wiążących RNA poprzez ekstrakcję powinowactwa

Protokół pull-down RNA jest tutaj zoptymalizowany do wykrywania interakcji między białkami wiążącymi RNA (RBP) a niekodującymi i kodującymi RNA. Fragment RNA z receptora androgenowego (AR) został wykorzystany jako przykład, aby zademonstrować, jak odzyskać jego RBP z listanu pierwotnych brązowych adipocytów.

Wykrywanie białek wiążących RNA metodą in vitro RNA pull-down w hodowli adipocytów

Interakcje RNA-białko leżą u podstaw wielu procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę in vivo do izolowania specyficznego RNA i identyfikowania nowych białek, które są z nim związane. Może to rzucić nowe światło na to, w jaki sposób RNA są regulowane w komórce.

Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Opisujemy protokół do identyfikacji białek wiążących RNA i mapowania ich regionów wiążących RNA w żywych komórkach za pomocą fotosieciowania za pośrednictwem UV i spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do identyfikacji regionów wiążących RNA w oparciu o spektrometrię mas

Ta metoda ściągania RNA pozwala na identyfikację celów RNA długiego niekodującego RNA (lncRNA). Opierając się na hybrydyzacji domowej roboty, zaprojektowanych antysensownych sond oligonukleotydowych DNA specyficznych dla tego lncRNA w odpowiednio utrwalonej tkance lub linii komórkowej, skutecznie umożliwia wychwycenie wszystkich celów RNA lncRNA.

Procedura ściągania RNA w celu identyfikacji celów RNA długiego niekodującego RNA

Przedstawiono szczegółowy protokół stosowania strategii CARIC (ang. click chemistry-assisted RNA-interactome capture) do identyfikacji białek wiążących się zarówno z kodującymi, jak i niekodującymi RNA.

Wychwytywanie i identyfikacja białek wiążących RNA za pomocą strategii wychwytywania interaktomu RNA wspomaganej chemią kliknięcia (CARIC)

Kompleksy RNA/białkowe oczyszczone przy użyciu strategii botyna-streptawidyna są eluowane do roztworu w warunkach denaturacji w formie nieodpowiedniej do dalszego oczyszczania i analizy funkcjonalnej. Tutaj opisujemy modyfikację tej strategii, która wykorzystuje fotorozszczepialny łącznik w RNA i delikatny etap elucji UV, dając natywne i w pełni funkcjonalne kompleksy RNA / białko.

Jednoetapowe oczyszczanie kompleksów makromolekularnych za pomocą RNA przyłączonego do biotyny i łącznika fotorozszczepialnego

W tej metodzie, określamy ilościowo powinowactwo wiązania białek wiążących RNA (RBP) do pokrewnych i niepokrewnych miejsc wiązania za pomocą prostego, żywego, reporterowego testu w komórkach bakteryjnych. Test opiera się na represji genu reporterowego.

Test do ilościowego określania wiązania białka-RNA u bakterii

Tutaj prezentujemy zmodyfikowany protokół CLIP-seq o nazwie FbioCLIP-seq z tandemowym oczyszczaniem FLAG-biotyna w celu określenia celów RNA białek wiążących RNA (RBP) w komórkach ssaków.

Profilowanie interakcji białko-RNA w całym transkryptomie poprzez sieciowanie krzyżowe i immunoprecypitację za pośrednictwem tandemowego oczyszczania FLAG-biotyna

Poznaj zoptymalizowaną metodę pull-down RNA do identyfikacji białek wiążących RNA z komórek HEK 293T przy użyciu spektrometrii masowej. Łagodne warunki lizy zachowują kompleksy białkowe.

Zoptymalizowana ilościowa analiza typu pull-down białek wiążących RNA przy użyciu krótkiego biotynylowanego RNA

Przeglądaj więcej filmów