Zoptymalizowana ilościowa analiza typu pull-down białek wiążących RNA przy użyciu krótkiego biotynylowanego RNA

Protokół ten umożliwia identyfikację partnerów wiążących białka znanej sekwencji RNA poprzez pobranie ich z ekstraktu komórkowego za pomocą biotynylowanych oligonukleotydów RNA. W porównaniu z metodami, które wymagają detergentów lub wysokich temperatur w celu odłączenia białek od RNA, protokoły te wykorzystują zamiast tego bardzo łagodne warunki, które pozwalają również zachować potencjalne kompleksy białkowe. Procedurę zademonstruje Jakob Rupert, doktorant pod moim kierunkiem.

Rozpocznij całkowite zbieranie białka od usunięcia pożywki z dołków płytki komórkowej HEK 293T i umyj studzienki sześciu płytek dołkowych jednym mililitrem PBS. Wyrzucić PBS i przenieść płytki do lodu, przed dodaniem 200 mikrolitrów buforu do lizy do każdej studzienki. Odłącz i rozbij komórki za pomocą skrobaka do komórek przed przeniesieniem ekstraktu komórkowego pochodzącego z dwóch studzienek do tej samej 1,5 mililitrowej probówki.

Po 30 minutach inkubacji na lodzie i odwirowaniu przenieść supernatant do wstępnie schłodzonej probówki. Następnie oblicz objętość ekstraktu białkowego odpowiadającą 1,5 miligrama białka. Następnie doprowadzić wszystkie próbki do końcowej objętości 600 mikrolitrów za pomocą buforu do lizy.

Próbki należy przechowywać na lodzie do czasu użycia. Aby przygotować koraliki, wymieszaj je w buforze do przechowywania, przesuwając rurkę. Po obliczeniu 100 mikrolitrów podłoża gnojowicy na próbkę, należy umieścić obliczoną objętość gnojowicy w stojaku magnetycznym.

Aby umyć kulki, usuń roztwór do przechowywania i umyj kulki, dodając jeden mililitr buforu do lizy i odwracając go ręcznie. Następnie wyjmij bufor za pomocą stojaka magnetycznego i powtórz krok mycia. Do kulek dodaj objętość buforu do lizy równą początkowej objętości pożywki zawiesinowej i wymieszaj ją, przesuwając probówkę przed równomiernym dozowaniem pożywki do tylu 1,5 mililitrowych probówek, ile próbek.

W celu zablokowania kulek usuń bufor za pomocą stojaka magnetycznego i dodaj 600 mikrolitrów po 0,25 miligrama na mililitr roztworu TRNA drożdży przygotowanego w buforze do lizy. Inkubuj go przez godzinę w temperaturze pokojowej na obracającym się kole. Usuń roztwór TRNA za pomocą stojaka magnetycznego przed dodaniem 600 mikrolitrów buforu do lizy i umyj go, mieszając ręcznie.

Powtórz etap mycia i wyrzuć bufor. Dla każdej probówki zawierającej początkowe 100 mikrolitrów pożywki zawiesinowej należy przygotować 200 mikrogramów oligonukleotydu RNA w 600 mikrolitrach buforu do lizy. Dodaj oligo do koralików i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej, obracając się.

Usuń roztwór z kulek i przemyj dwukrotnie 600 mikrolitrami buforu do lizy, obracając probówki przez pięć minut każda w temperaturze pokojowej. Odrzuć bufor. W przypadku wiązania białek na kulkach należy oddzielić 5% lub 30 mikrolitrów objętości od roztworu białkowego o objętości 600 mikrolitrów i zachować go jako dane wejściowe lub IN do dalszej analizy.

Dodaj pozostałą mieszankę białkową do każdej probówki załadowanych kulek i inkubuj z powolnymi obrotami przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń niezwiązaną frakcję białkową z kulek za pomocą stojaka magnetycznego. Zaoszczędź 5% lub 30 mikrolitrów jego objętości i oznacz go jako przepływowy lub FT. Dodaj jeden mililitr buforu myjącego 1 do kulek i obracaj go przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Wyrzuć bufor i powtórz to pranie jeden raz. Dodaj jeden mililitr buforu do płukania 2 do kulek. A po inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze przez pięć minut wyrzuć supernatant.

W celu elucji specyficznych spoiw dodać 100 mikrolitrów buforu elucyjnego 1 do kulek. Po ręcznym wymieszaniu przez strzepkiwanie inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Umieść probówki w mikserze termicznym i energicznie potrząsaj przez pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza.

Następnie umieść probówkę w stojaku magnetycznym i zbierz wymywaną frakcję do czystej probówki. Po zakończeniu szybko odkręć kulki za pomocą wirówki stołowej, aby zmaksymalizować odzysk eluatu. I zaoszczędź 5% lub pięć mikrolitrów całkowitej objętości eluatu lub EL do dalszych analiz.

Wymyte białka zidentyfikowano za pomocą spektrometrii mas. Wykreślenie znacznie wzbogaconych białek na wykresie wulkanicznym ujawniło, że całkowita zawartość białka i wzbogaconych białek wymytych z RNA była znacznie wyższa niż RNA, co sugeruje, że RNA może ustanowić większą liczbę specyficznych interakcji. Jako przykłady zgodności między przewidywanymi i uzyskanymi wynikami, wyniki interakcji dla plus RNA i minus RNA z białkami ludzkiego proteomu wykazały, że przewiduje się, że HNRNPH3 będzie selektywnie wiązać plus RNA, a PCBP2 będzie oddziaływać specyficznie z RNA.

Ponadto przewidywano, że białko RBM41 będzie promiskuityczne dla obu oligonukleotydów RNA. Analiza spektroskopii mas próbek do testów ściągania białek potwierdziła obecność HNRNPH3 w RNA i PCBP2 w ujemnym RNA. Podczas gdy stwierdzono, że RBM41 wchodzi w interakcje z obydwoma.

Western blot został użyty do wykrycia obecności TDP-43 w wynikach i krokach optymalizacji protokołu. W RNA TDP-43 zaobserwowano w próbce wejściowej i eluacie, co wskazuje na jego obecność od samego początku. TDP-43 został zatrzymany przez RNA podczas etapów płukania i został wymyty na końcu za pomocą buforu o wysokiej zawartości soli.

Mapując interakcje białkowego RNA, metoda ta może ujawnić sieci makromolekularne stojące za wieloma szlakami fizjologicznymi. Na przykład regulacja transkrypcji lub mechanizmy patologiczne, w tym rak i neurodegeneracja.