Synteza wolframianu sodu i mikrokapsułek molibdenianu sodu poprzez bakteryjne wydalanie minerałów

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zademonstrowanie nowych procedur wytwarzania pustych sferycznych struktur z materiałów tlenkowych przy użyciu bakterii Gram-ujemnych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie bionanomateriałów, pokazując, w jaki sposób nanograniczny materiał tlenku metalu w mikrokapsułkach może być formowany za pomocą bakterii. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest przyjazna dla środowiska i ma potencjał do masowej produkcji.

Odważ osiem gramów bulionu LB Lennox w proszku i umieść go w 500-mililitrowej butelce laboratoryjnej z 400 mililitrami wody. Następnie dodaj magnetyczny teflonowy pręt mieszający i mieszaj zawartość przez 20 minut. Mocno zakręć bulion i autoklawuj zawartość w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Poczekaj, aż roztwór ostygnie do temperatury pokojowej, a następnie za pomocą pipety podziel 12,5 mililitra bulionu na osiem 15-mililitrowych probówek wirówkowych. Pozostałą ilość bulionu przelej do trzech 100-mililitrowych butelek laboratoryjnych, szczelnie zakręć trzy butelki i przechowuj je w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Następnie odzyskaj kriokonserwowany zapas glonów Shewanella z magazynu.

Następnie w komorze bezpieczeństwa biologicznego użyj szpatułki ze stali nierdzewnej, aby usunąć jeden mililitr zamrożonego materiału z rurki do przechowywania i umieść go w jednej z 12,5 mililitrowych porcji zawierających bulion LB Lennox. Umieść próbkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj kulturę przez 24 godziny. Następnie przygotuj płytki agarowe.

Rozpuść dwie tabletki bulionu LB Lennox z agarem w 100-mililitrowej butelce zawierającej 100 mililitrów wody. Użyj mieszadła, aby mieszać zawartość przez 20 minut, a następnie mocno ją przykręć. Po autoklawie podwielokrotność 20 mililitrów do każdej z czterech szalek Petriego.

Poczekaj, aż roztwór ostygnie do temperatury pokojowej w okapie. A następnie przykryj talerze. Oznacz trzy butelki przygotowane ze 100 mililitrami bulionu LB Lennox numerem jeden, numer dwa i numer trzy.

Odpipetować 0,1 mililitra powstałej kultury bakteryjnej do pierwszej butelki. Zakręć butelkę i obracaj nią ręcznie przez minutę, aby uzyskać jednorodny roztwór. Następnie odpipetuj 0,1 mililitra z butelki numer jeden do butelki numer dwa.

Ponownie zakręć butelkę i kołysz nią ręcznie przez minutę. Ostatnie rozcieńczenie wykonać pipetując 0,1 mililitra z butelki numer dwa do butelki numer trzy. Zakręć butelkę i potrząsaj nią ręcznie przez minutę.

A następnie odpipetować 20 mikrolitrów roztworu na każdą z czterech szalek Petriego. Następnie umieść cztery autoklawowane szklane koraliki o średnicy trzech milimetrów w każdej z szalek Petriego. Zamknij pokrywki szalek Petriego i potrząsaj nimi ręcznie przez minutę.

Po zakończeniu odwróć szalki Petriego do góry nogami i inkubuj płytki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Za pomocą szpatułki ze stali nierdzewnej wybierz powstałe bakterie monoklonalne z czterech szalek Petriego i umieść je w pozostałych siedmiu probówkach zawierających 12,5 mililitra bulionu LB Lennox. Pozostaw probówki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 24 godziny, a następnie wybierz tę, która ma największe rozproszenie światła, stosując wizualną metodę kolorymetryczną.

Umieść 10 gramów bulionu LB Lennox, 10 gramów chlorku sodu i 10 gramów glukozy w 500-mililitrowej butelce laboratoryjnej. Następnie dodaj wodę, aż objętość osiągnie 450 mililitrów. Dodaj teflonowy mieszadło i mieszaj przez 20 minut.

Po wymieszaniu qutoclavuj ten roztwór w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie odmierz 16,5 grama dwuwodnego wolframianu sodu i umieść go w 100-mililitrowej butelce. Dodaj wodę, aż objętość osiągnie 50 mililitrów.

Dodaj teflonową mieszadło i mieszaj roztwór przez 20 minut. Stężenie rozpuszczalnika wolframianu sodu powinno być wysokie, aby zapewnić kulisty kształt mikrokapsułki, ale nie za wysokie, aby zabić bakterie. Po autoklawie przefiltruj roztwór przez filtr z włókna szklanego z porami o wielkości jednego mikrona, aby uzyskać filtrat.

Wlej filtrat ręcznie do 450 mililitrowej butelki z bulionem LB Lennox zawierającym glukozę i sól. Następnie podziel otrzymany roztwór na 10, 50 mililitrowe probówki wirówkowe. Pobrać kulturę zawierającą bakterie monoklonalne i dodać 50 mikrolitrów do każdej z 10, 50 mililitrowych probówek wirówkowych zawierających pożywkę wolframianową sodu.

Inkubuj 10 probówek w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 120 godzin. Po inkubacji umieść każdą z probówek w ultrasonikatorze i poddaj komórki sonikacji z częstotliwością 20 kiloherców o mocy 150 watów przez jedną godzinę. Odwirować probówki.

A następnie usuń klarowny płyn za pomocą pipety. Następnie dodaj wodę. A następnie poddać sonikacji i odwirować probówki jeszcze raz.

Po drugim odcentrowaniu usunąć klarowny płyn z probówek za pomocą pipety. Następnie dodaj 35 mililitrów 99,8% etanolu i ponownie wykonaj ultradźwięki próbek. Opłucz minerały, odwirowując je, dodając alkohol i ponownie sonikując próbkę.

Następnie usunąć przezroczysty płyn z probówek za pomocą pipety i natychmiast zakryć probówki, nie wysuszając próbki. To zdjęcie SEM pokazuje złamaną, pustą skorupę wykonaną z wolframianu sodu, który został wydalony przez algi Shewanella przy użyciu glukozy jako źródła węgla. Granulki o średnicy około 40 do 60 nanometrów zwisają na zewnątrz skorupy.

Sama skorupa wykonana jest z granulek o średnicy około 22 nanometrów. Oddalając się, można zobaczyć stosunek długości do średnicy tych pustych muszli. Te kuliste muszle mają stosunek długości do średnicy jeden do jednego i zostały uzyskane przy użyciu wysokiego stężenia oksydanionów metali większego niż 100 milimolów w pożywce hodowlanej.

Zmniejszając stężenie oksyjanionów w pożywce hodowlanej do około 20 milimolów, bakterie wytwarzają otoczki wolframianowe sodu o stosunku długości do średnicy wynoszącym trzy do jednego. Po jej opracowaniu, technika ta pomaga badaczom w dziedzinie bionanotechnologii zbadać możliwość wytworzenia mikrostruktury, takiej jak mikrokapsułka materiału tlenku metalu, za pomocą bakterii Gram-ujemnych.