Name: Pobieranie i przetwarzanie tkanki tłuszczowej myszy do analizy RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Naucz się pobierać tkankę tłuszczową myszy i izolować wysokiej jakości RNA do analizy ekspresji genów. Ta metoda jest kluczowa dla badań metabolicznych i biologii molekularnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Diabetes Canada.

<ol><li>Guh, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incidence+of+co-morbidities+related+to+obesity+and+overweight%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Public+Health%22%5BJournal%5D)">The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis.</a> BMC. Public Health. 9, 88(2009).</li>
<li>Wronska, A., Kmiec, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biochemical+characteristics+of+various+white+adipose+tissue+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots.</a> Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).</li>
<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+function+and+physiological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).</li>
<li>Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+sample+collection+and+processing+for+molecular+epidemiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies.</a> Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).</li>
<li>Ibrahim, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+and+visceral+adipose+tissue%3A+structural+and+functional+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Obes+Rev%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences.</a> Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).</li>
<li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization%2C+identification%2C+and+excision+of+murine+adipose+depots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Localization, identification, and excision of murine adipose depots.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/246759856_RNA_Isolation_from_Adipose_Tissue_An_Optimized_Procedure_for_High_RNA_Yield_and_Integrity">RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity.</a> Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).</li>
<li>Cirera, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+method+for+isolation+of+total+RNA+from+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue.</a> BMC Res Notes. 6, 472(2013).</li>
<li>Tan, S. C., Yiap, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA%2C+RNA%2C+and+protein+extraction%3A+the+past+and+the+present%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present.</a> J Biomed Biotechnol. 2009, 574398(2009).</li>
<li>Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+commercially-available+automated+and+manual+extraction+kits+for+the+isolation+of+total+RNA+from+small+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples.</a> BMC Biotechnol. 14, 94(2014).</li>
<li>Tan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+prorenin%2Frenin+receptor+on+the+development+of+obesity+and+associated+cardiometabolic+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver.+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors.</a> Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).</li>
<li>Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+RT-qPCR-Publishing+data+that+conform+to+the+MIQE+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines.</a> Methods. 50 (4), 1-5 (2010).</li>
<li>Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+gel%3A+a+simple+agarose+gel+for+analyzing+RNA+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality.</a> Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).</li>
<li>Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+increases+in+circulating+prorenin+are+not+associated+with+renal+or+cardiac+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies.</a> Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).</li>
<li>Dusaulcy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-specific+disruption+of+autotaxin+enhances+nutritional+fattening+and+reduces+plasma+lysophosphatidic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid.</a> J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).</li>
<li>Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipokines%3A+a+link+between+obesity+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease.</a> J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).</li>
<li>Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+RT-quantitative+PCR%3A+firsthand+observations+of+implementation+of+minimum+information+for+the+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments+%28MIQE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE).</a> J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).</li>
<li>Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+solubilization+of+proteins+after+TRIzol+extraction+of+RNA+and+DNA+from+patient+material+following+prolonged+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage.</a> Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Po karmieniu dietą HF stwierdzono, że otyłe myszy mają zwiększoną masę ciała i białej tkanki tłuszczowej w porównaniu z myszami karmionymi dietą N. RNA wyekstrahowane przy użyciu roztworu fenolu otrzymało próbki o dobrej czystości. Leptyna jest adipokiną wytwarzaną głównie przez tkankę tłuszczową i wiadomo, że koreluje dodatnio z masą tłuszczową16. Zgodnie z oczekiwaniami, ekspresja mRNA leptyny wzrosła u otyłych myszy wraz z ich masą tłuszczową.
Ta metoda składa się z ...

Otyłość to ogólnoświatowa epidemia, która może prowadzić do powikłań, takich jak cukrzyca typu 21. Otyłe i genetycznie modyfikowane modele zwierzęce są często wykorzystywane do badań nad otyłością i związanymi z nią powikłaniami. Tradycyjnie, biała tkanka tłuszczowa jest znana jako komora magazynująca nadmiar energii i składa się głównie z lipidów, podczas gdy brązowa tkanka tłuszczowa przekształca energię w ciepło2,3. Tkanka tłuszczowa jest dynamiczna i rozszerza się i kurczy w zależności od wielu czynników, takich jak przyjmowanie pokarmu i aktywność fizyczna. W związku z tym, aby określić czynniki przyczyniające się do tych zmian, wymagane jest odpowiednie pobieranie i obchodzenie się z tkanką tłuszczową4.
Wśród białych tkanek tłuszczowych ogólnie przyjmuje się, że podskórne i trzewne magazyny tłuszczu mają różne właściwości, takie jak anatomiczna lokalizacja i funkcja2,5. W związku z tym, aby uniknąć sprzecznych wyników lub dużej zmienności, należy zwrócić uwagę na unikanie zanieczyszczenia krzyżowego między tymi różnymi magazynami tłuszczu podczas zbierania poduszek tłuszczowych.
Ponadto, istnieją trzy główne wyzwania związane z izolacją RNA lub białka z białej tkanki tłuszczowej myszy. Po pierwsze, zbieranie poduszeczek tłuszczowych u otyłych myszy nie jest łatwym zadaniem, ponieważ granica oddzielająca różne magazyny białego tłuszczu nie zawsze jest wyraźna, w przeciwieństwie do innych narządów, takich jak nerki i serce6. Po drugie, ze względu na wysoką zawartość lipidów w tkance tłuszczowej, podczas izolacji RNA lub białka, warstwa lipidów unosi się na wierzchu i uniemożliwia bezpośredni dostęp do próbki. Po trzecie, w przeciwieństwie do brązowej tkanki tłuszczowej lub innych tkanek, biała tkanka tłuszczowa ma znacznie niższą zawartość RNA i białka, co jest głównym problemem w przypadku korzystania z młodych myszy, myszy karmionych normalną dietą (N) i myszy, które powinny mieć niską masę tłuszczową (tj. modele KO, leczenie lekami, trening fizyczny itp.)7,8.
Dlatego wybór odpowiedniej metody izolacji RNA z tkanki tłuszczowej jest kluczowy. Alternatywnymi metodami ekstrakcji fenolu/chloroformu są zestawy komercyjne. Zazwyczaj opierają się one na początkowym etapie ekstrakcji fenolu, po którym następuje oczyszczanie RNA na kolumnie9. Jednak zestawy te są zazwyczaj droższe i dają próbki o niższej wydajności, podczas gdy jakość RNA może być zmienna, ale jest mniej czasochłonna. Jednak jedną z największych zalet opisanej tutaj ekstrakcji roztworem fenolu/chloroformem jest możliwość wyizolowania RNA, DNA i białka z jednej próbki10. Ponieważ poduszeczki tłuszczowe myszy są zwykle małe i dają niewielką ilość RNA i białek (szczególnie w szczupłych modelach mysich), protokoły te maksymalizują dane, które można uzyskać z małej próbki.
Celem tego artykułu jest szczegółowe opisanie metody zapewniającej odpowiednie pobranie próbek z trzech magazynów białej tkanki tłuszczowej myszy, jak również ilość i jakość izolacji RNA. RNA uzyskane zgodnie z tym protokołem można wykorzystać do wykonywania testów PCR w czasie rzeczywistym. Protokół ten nie jest przeznaczony do izolacji RNA z hodowanych pierwszorzędowych adipocytów.

<table><tbody><tr><td>1 mL seringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X TE roztwór (10 mM Tris-HCl i 1 mM EDTA&bull; Na2. pH 8,0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igły</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 G Igły</td><td></td><td></td><td></td>26 G</tr><tr><td>75% Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewacz blokowy (sucha kąpiel)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432-500mL</td><td></td></tr><tr><td>dATP&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0141</td><td></td></tr><tr><td>dCTP&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0151</td><td></td></tr><tr><td>dGTP&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0161</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I (1 U/&mikro; l)&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>dTTP&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0171</td><td></td></tr><tr><td>Faststart Uniwersalny SYBR zielony Master (Rox)</td><td>Roche</td><td>4913922001</td><td></td></tr><tr><td>Faststart uniwersalny SYBR zielony mistrz (Rox) barwnik fluorescencyjny&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4913914001</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki</td><td></td><td></td><td></td>z filtrem</tr><tr><td>Kleszcze&nbsp;</td><td>Instrumentarium</td><td>HB275</td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hammer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dieta dla gryzoni o wysokiej zawartości tłuszczu</td><td>Bio-Serv, Frenchtown, NJ</td><td>F3282</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol&nbsp;</td><td>Laboratoire MAT</td><td>IH-0101</td><td></td></tr><tr><td>Leptynowy starter do PCR do przodu (5'-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leptynowy starter do odwrotnego PCR (5'-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płynny azot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxima Odwrotna transkryptaza (enzym i 5x bufor)</td><td>Thermo scientific</td><td>EP0742</td><td></td></tr><tr><td>Woda nanoczysta (określana jako woda ultraczysta)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rękawice</td><td></td><td></td><td></td>do badań nitrylowych</tr><tr><td>Rękawice</td><td></td><td></td><td></td>nitrylowe</tr><tr><td>Normalna dieta gryzoni</td><td>Harlan Laboratories, Madison, WI</td><td>Harlan 2018</td><td></td></tr><tr><td>Pikuler P1000 Pikuler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20 Pirowerk</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>roztwór fenolu (TRIzol)&nbsp;</td><td>Ambion Life Technologies</td><td>15598018</td><td></td></tr><tr><td>Wstępnie zidentyfikowana folia</td><td></td><td></td><td></td>aluminiowa</tr><tr><td>Kuweta</td><td></td><td></td><td></td>spektrofotometru kwarcowego</tr><tr><td>Stojak na paski</td><td></td><td></td><td></td>probówek do PCR</tr><tr><td>Stojaki na paski</td><td></td><td></td><td></td>probówek RT-PCR</tr><tr><td>Losowe heksamery&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>58875</td><td></td></tr><tr><td>System genowy rotora do PCR w czasie rzeczywistym&nbsp;</td><td>Corbett research</td><td>RG-3000 Rotor-Gene Termocykler</td><td></td></tr><tr>Wirówka <td></td><td></td><td></td><td>stołowa z chłodzeniem</td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy RiboLock&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>Probówki eppendorfa 1,5 ml bez RNaz Probówki</td><td></td><td></td><td></td></tr> z <tr><td>nakrętką 1,5 ml bez RNaz Paski</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>probówek do PCR (0,2 ml) i nakrętki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woda bez RNaz&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna RT-PCR</td><td>Qiagen</td><td>Rotor-Gene Corbett 3000</td><td></td></tr><tr><td>Paski probówki RT-PCR (0,1 ml) i nakrętki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S16 starter do PCR do przodu (5'-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S16 odwrócony starter PCR (5' ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 3100 pro</td><td></td></tr><tr><td>Moździerz i tłuczek</td><td></td><td></td><td></td>ze stali nierdzewnej</tr><tr><td>Podkładki chirurgiczne</td><td>Domowa płyta piankowa owinięta w jednorazowy chłonny podkład</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne&nbsp;</td><td>Intrumentarium</td><td>130.450.11</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termocykler&nbsp;</td><td>Biometra</td><td>Thermocycler</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik</td><td></td><td></td><td></td>wirowy</tr><tr><td>Szpatułka do ważenia</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pobieranie i przetwarzanie tkanki tłuszczowej myszy do analizy rna

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

W porównaniu do innych tkanek, biała tkanka tłuszczowa ma znacznie mniejszą zawartość RNA i białka do dalszych zastosowań, takich jak PCR w czasie rzeczywistym i Western Blot, ponieważ zawiera głównie lipidy. Izolacja RNA z próbek tkanki tłuszczowej jest również trudna, ponieważ wymagane są dodatkowe kroki, aby uniknąć tych lipidów. W tym miejscu przedstawiamy procedurę pobierania trzech anatomicznie różnych białych tkanek tłuszczowych od myszy, w celu przetworzenia tych próbek i przeprowadzenia izolacji RNA. Dalej opisujemy syntezę cDNA i eksperymenty z ekspresją genów za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Opisany poniżej protokół pozwala na zmniejszenie zanieczyszczenia sierści i krwi zwierzęcia na poduszeczkach tłuszczowych, a także zanieczyszczenia krzyżowego między różnymi poduszeczkami tłuszczowymi podczas pobierania tkanek. Został również zoptymalizowany w celu zapewnienia odpowiedniej ilości i jakości wyekstrahowanego RNA. Protokół ten może być szeroko stosowany do dowolnego modelu mysiego, w którym próbki tkanki tłuszczowej są wymagane do rutynowych eksperymentów, takich jak PCR w czasie rzeczywistym, ale nie jest przeznaczony do izolacji z hodowli komórek pierwotnych adipocytów.

Po przeprowadzeniu procedury sekcji pobrano i zważono trzy rodzaje białej tkanki tłuszczowej od myszy z dwóch grup (myszy karmione dietą N oraz dietą HF). Zgodnie z oczekiwaniami, myszy na diecie HF wykazały zwiększoną końcową masę ciała oraz większy przyrost masy w porównaniu do rówieśników na diecie N (Tabela 1). Obserwacjom tym towarzyszył ponad dwukrotny wzrost masy PGF, PRF i SCF u myszy otyłych w porównaniu do myszy na diecie N.
<p class="jove_content" fo:keep-t...

Celem tego artykułu jest przedstawienie krok po kroku procedury pobierania różnych białych tkanek tłuszczowych od myszy, przetwarzania próbek tłuszczu i ekstrakcji RNA.

Pobieranie i przetwarzanie tkanki tłuszczowej myszy do analizy RNA

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie odpowiedniego pobrania próbek z magazynów białej tkanki tłuszczowej od różnych myszy oraz wyizolowanie dużej ilości dobrej jakości RNA z tkanki. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu metabolizmu, biochemii i biologii molekularnej, które dotyczą na przykład ekspresji genów w tkance tłuszczowej myszy poddanych działaniu substancji lub zmodyfikowanych genetycznie. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wyizolowanie dużych ilości dobrej jakości RNA z tkanki tłuszczowej, która zazwyczaj ma niską zawartość RNA.Procedurę zademonstruje Emilie Pepin, asystentka naukowa z mojego laboratorium. Po eutanazji myszy przeciąć skórę nad kresą białą zgodnie z protokołem tekstowym, a następnie wykonać dwa nacięcia o długości około dwóch centymetrów od środka klatki piersiowej w kierunku prawego ramienia i blisko narządów płciowych nad prawą kończyną tylną. Rozciągnij jeden róg otwartej skóry i użyj igły o rozmiarze 22, aby przypiąć go do opuszki.Następnie przypnij drugi róg. Za pomocą nożyczek chirurgicznych przyłożonych do skóry tak płasko, jak to możliwe, przeprowadź wycięcie podskórnej tkanki tłuszczowej w jamie brzusznej lub SCF, a następnie przenieś ją na wstępnie przycięty kawałek folii aluminiowej. Powtórz sekcję dla lewej strony zwierzęcia.Następnie wyciągnij zarówno lewe, jak i prawe zebrane poduszeczki tłuszczowe w folii aluminiowej i użyj ciekłego azotu do zamrożenia próbki. Aby uzyskać dostęp do trzewnej tkanki tłuszczowej, przetnij mięsień brzucha wzdłuż kresy białej. Następnie wykonaj nacięcie w mięśniach brzucha od genitaliów w kierunku grzbietu myszy po obu stronach.Tłuszcz wokół narządów rozrodczych to tłuszcz okołogonadalny lub PGF. Odłącz lewe i prawe poduszeczki tłuszczowe od najądrza, jąder i przewodu nawiedzo-nawiedzionego i przenieś je na wstępnie oznaczoną folię aluminiową. Następnie zamrozić próbkę w ciekłym azocie.Zaczynając od lewej strony, odsłoń nerki, przesuwając jelito od jamy brzusznej na prawą stronę. Tkanka tłuszczowa widoczna tutaj otaczająca nerki i nadnercza to tłuszcz okołonerkowy lub PRF. Wyizoluj i usuń nadnercza przed pobraniem PRF.Może to być uciążliwe, ponieważ są one nieco bardziej różowe niż tkanka tłuszczowa. Teraz odizoluj PRF od tylnej ściany mięśniowej i przetnij moczowód, tętnicę nerkową i żyłę, która oddziela PRF i nerkę od reszty ciała. Następnie wyizoluj PRF od nerki, przecinając i usuwając torebkę nerkową.Po wyizolowaniu prawego PRF przenieś próbkę na folię aluminiową z tkanką z lewej strony i użyj ciekłego azotu do zamrożenia próbek. Schłodzić 1,5-mililitrowe stożkowe rurki bez RNaz, moździerz i tłuczek oraz szpatułkę w ciekłym azocie zgodnie z protokołem tekstowym. Umieść próbkę tkanki tłuszczowej w moździerzu, a następnie użyj kilku warstw brązowego papieru, aby podnieść tłuczek z ciekłego azotu i dopasować go do moździerza.Trzymając tłuczek z papierem, użyj młotka, aby raz lub dwa razy uderzyć w górną część tłuczka. Następnie zmielić próbkę ruchem obrotowym, aż do uzyskania drobnego proszku. Następnie wyjmij tłuczek, wyjmij szpatułkę z ciekłego azotu i użyj jej do przeniesienia próbki do odpowiedniej, wstępnie schłodzonej stożkowej probówki o pojemności 1,5 mililitra.Od czasu do czasu zanurzaj szpatułkę z powrotem w ciekłym azocie, aby zapobiec stopieniu się próbki. Trzymaj również stożkową rurkę na suchym lodzie, aby zapobiec rozmrożeniu próbki. Napełnij stożkową probówkę do około 2/3 pojemności zmieloną próbką, aby uzyskać odpowiednią wydajność RNA.Następnie należy przygotować pozostałe próbki zgodnie z protokołem tekstowym. Pod kapturem chemicznym i w fartuchu laboratoryjnym, rękawicach i okularach ochronnych usuń zmieloną próbkę z ciekłego azotu. Powoli otwórz probówkę i dodaj 500 mikrolitrów roztworu fenolu.Zamknij pokrywę probówki i wiruj z maksymalną prędkością przez około pięć sekund, a następnie powoli i ostrożnie otwórz rurkę, aby uwolnić ciśnienie azotu. Słychać dźwięk powietrza wydobywającego się z rury. Odpipetować dodatkowe 500 mikrolitrów roztworu fenolu do probówki.Następnie wiruj i powoli otwieraj jak poprzednio. Wirować próbkę, aż do całkowitego rozpuszczenia. Następnie otwórz rurkę, aby uwolnić ciśnienie przed przetworzeniem dodatkowych próbek.Po przetworzeniu wszystkich próbek należy je krótko zawirować z maksymalną prędkością i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Odwirować probówki w temperaturze 12 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Następnie przywróć probówki do temperatury pokojowej.Aby uniknąć zanieczyszczenia, dla każdej próbki należy użyć pipety P1000 z końcówką z filtrem, aby wyizolować jak najwięcej RNA ze środkowej różowej warstwy poprzez przekłucie fazy lipidowej w pobliżu boku probówki. Dozuj RNA do nowych stożkowych probówek bez dotykania boków probówek, aby zapobiec przenoszeniu lipidów obecnych na zewnątrz końcówki. Dodać 200 mikrolitrów czystego chloroformu do każdej próbki i mieszać probówki przez odwrócenie przez 15 sekund.Następnie, po inkubacji próbek w temperaturze pokojowej przez 10 minut, odwirować probówki w temperaturze 12 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut i doprowadzić probówki z powrotem do temperatury pokojowej. Do każdej próbki należy użyć pipety P1000 i końcówek z filtrem, aby przenieść jak najwięcej wodnej przezroczystej fazy górnej zawierającej RNA do drugiego zestawu odpowiednich stożkowych probówek. Następnie dodaj 500 mikrolitrów 100% izopropanolu do każdej próbki i mieszaj probówki przez odwrócenie przez 15 sekund.Następnie inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Odwiruj probówki w temperaturze 12 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut przed przywróceniem probówek do temperatury pokojowej. Wyrzuć izopropanol, wylewając go z każdej probówki.Teraz dodaj jeden mililitr 75% etanolu do każdej próbki i krótko wiruj probówki z maksymalną prędkością. Następnie odwirować próbki w temperaturze 7 500 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Po odwirowaniu próbek i doprowadzeniu ich do temperatury pokojowej wyrzuć 75% etanol, odwracając każdą probówkę i zapalając uderzając nią o brązowy papier, aby usunąć resztki etanolu.Pozostaw pokrywkę otwartą i wysusz granulkę RNA na powietrzu przez około 15 do 20 minut. Po ocenie wielkości granulek RNA dodaj od 10 do 25 mikrolitrów wody wolnej od RNaz do każdej próbki. Próbki należy inkubować w bloku grzewczym w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez pięć minut.Następnie krótko przekręć rurki w wiry. Próbki należy inkubować w tym samym bloku grzewczym przez dodatkowe pięć minut. Następnie szybko odwiruj wszystkie próbki i natychmiast umieść je na lodzie.Przeprowadzić RT-PCR w celu ekspresji genów w tkance tłuszczowej zgodnie z protokołem tekstowym. Zgodnie z oczekiwaniami, myszy na diecie wysokotłuszczowej miały zwiększoną masę ciała i przyrost masy ciała w porównaniu z rodzeństwem z miotu na normalnej diecie. Obserwacjom tym towarzyszył ponad dwukrotny wzrost masy ciała PGF, PRF i SCF u otyłych myszy w porównaniu z myszami na normalnej diecie.Poniższa tabela pokazuje, że dla każdej białej tkanki tłuszczowej izolacja RNA za pomocą roztworu fenolu dała próbki z OD260 nad OD280 około 2,0, który jest uważany za czysty dla RNA. Jak widać na tym wykresie słupkowym, dane PCR w czasie rzeczywistym wykazały, że ekspresja mRNA leptyny była znacznie wyższa w PGF, PRF i SCF otyłych myszy w porównaniu z tymi na normalnej diecie. Różnice zaobserwowane w ekspresji mRNA leptyny nie były spowodowane zmiennością s16, genu referencyjnego używanego do normalizacji wyników między dwiema grupami myszy, ponieważ wartości CT nie uległy zmianie.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby podczas procedury ekstrakcji RNaz pracować w środowisku wolnym od RNaz. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak amplifikacja PCR w czasie rzeczywistym, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak modyfikacje ekspresji genów.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się metabolizmem do zbadania modulacji tkanki tłuszczowej związanej z otyłością i cukrzycą u gryzoni. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować różne poduszeczki tłuszczowe i izolować z nich RNA. Nie zapominaj, że praca z roztworem fenolu może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie fartucha laboratoryjnego i rękawiczek.

mouse-adipose-tissue-collection-and-processing-for-rna-analysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy procedurę izolowania RNA o wysokiej integralności z bogatej w rybonukleazy trzustki myszy.

Izolacja RNA z trzustki myszy: tkanka bogata w rybonukleazę

Kolejne kriosekcje są zbierane, aby umożliwić zastosowania histologiczne i wzbogacenie RNA do pomiarów ekspresji genów przy użyciu sąsiednich regionów z pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy. Wysokiej jakości RNA uzyskuje się z 20 - 30 mg zbiorczych kriosekcji, a pomiary są bezpośrednio porównywane między aplikacjami.

Kriosekcja sąsiadujących ze sobą obszarów pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy w celu ekspresji genów i analiz histologicznych

Tutaj opisujemy protokół powtarzalnej mikrodysekcji laserowej (LCM) do izolowania siatki beleczkowej (TM) do dalszej analizy RNA. Możliwość analizowania zmian w ekspresji genów w TM pomoże w zrozumieniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw chorób oczu związanych z TM.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji siatki beleczkowej o wysokiej czystości z oczu myszy do analizy ekspresji genów

Protokół mikrodysekcji laserowej (LCM) został opracowany w celu uzyskania wystarczającej ilości wysokiej jakości RNA do analizy ekspresji genów w komórkach kostnych. Obecne badanie koncentruje się na mysich odcinkach kości udowej. Jednak opisany tutaj protokół LCM może być wykorzystany do badania ekspresji genów w komórkach dowolnej tkanki twardej.

Protokół mikrodysekcji z wychwytem laserowym, który zapewnia wysokiej jakości RNA ze świeżo zamrożonych kości myszy

Metoda rozdrabniania kriogenicznego do przetwarzania mysich łap za pomocą młyna zamrażającego ciekły azot została opracowana w celu poprawy wydajności i jakości RNA lub białka ekstrahowanego z tkanek i umożliwienia analizy profili molekularnych związanych z reakcjami zapalnymi.

Protokół krio-proszkowania do przetwarzania łap myszy w celu oceny molekularnych szlaków zapalenia tkanek w modelu zapalenia stawów wywołanego kolagenem

Ta procedura opisuje zbieranie dyskretnie zamrożonych obszarów mózgu w celu uzyskania wysokiej jakości białka i RNA przy użyciu tanich i powszechnie dostępnych narzędzi.

Gromadzenie zamrożonych obszarów mózgu gryzoni do dalszych analiz

Ta publikacja opisuje protokół izolacji jąder z dojrzałych adipocytów, oczyszczania przez sortowanie aktywowane fluorescencją oraz transkryptomiki na poziomie pojedynczej komórki.

Izolacja jąder tkanki tłuszczowej do zastosowań genomicznych pojedynczych komórek

Ten protokół zapewnia efektywną metodę trawienia kolagenazy do izolacji żywotnych adipocytów i komórek frakcji naczyniowej zrębu - SVF z ludzkiego tłuszczu trzewnego w jednym procesie, w tym metodologię uzyskiwania wysokiej jakości RNA z adipocytów i fenotypyfikację makrofagów SVF poprzez barwienie wielu markerów związanych z błoną do analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja żywotnych adipocytów i frakcji naczyniowej zrębu z ludzkiej trzewnej tkanki tłuszczowej nadającej się do analizy RNA i fenotypowania makrofagów

Tutaj oferujemy praktyczną procedurę preparowania i przeprowadzania analiz histologicznych oraz analiz ekspresji genów mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej.

Rozwarstwienie, przetwarzanie histologiczne i analiza ekspresji genów mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej

Protokół ten opisuje metodę izolowania RNA z określonych histologicznych obszarów tkanki wątroby myszy z unieruchomioną o Optymalnej Temperaturze Cięcia z zastosowaniem złożonego tkanki wątroby za pomocą mikrosekcji laserowej, umożliwiającej ukierunkowaną analizę ekspresji genów w dalszej fazie.

Mikroskop laserowego przechwytywania tkanki wątroby myszy utrwalonej paraformaldehydem do analizy RNA

Naucz się pobierać tkankę tłuszczową myszy i izolować wysokiej jakości RNA do analizy ekspresji genów. Ta metoda jest kluczowa dla badań metabolicznych i biologii molekularnej.

Pobieranie i przetwarzanie tkanki tłuszczowej myszy do analizy RNA

Przeglądaj więcej filmów