Pobieranie i przetwarzanie tkanki tłuszczowej myszy do analizy RNA

Celem tego artykułu jest przedstawienie krok po kroku procedury pobierania różnych białych tkanek tłuszczowych od myszy, przetwarzania próbek tłuszczu i ekstrakcji RNA.

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie odpowiedniego pobrania próbek z magazynów białej tkanki tłuszczowej od różnych myszy oraz wyizolowanie dużej ilości dobrej jakości RNA z tkanki. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu metabolizmu, biochemii i biologii molekularnej, które dotyczą na przykład ekspresji genów w tkance tłuszczowej myszy poddanych działaniu substancji lub zmodyfikowanych genetycznie. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wyizolowanie dużych ilości dobrej jakości RNA z tkanki tłuszczowej, która zazwyczaj ma niską zawartość RNA.

Procedurę zademonstruje Emilie Pepin, asystentka naukowa z mojego laboratorium. Po eutanazji myszy przeciąć skórę nad kresą białą zgodnie z protokołem tekstowym, a następnie wykonać dwa nacięcia o długości około dwóch centymetrów od środka klatki piersiowej w kierunku prawego ramienia i blisko narządów płciowych nad prawą kończyną tylną. Rozciągnij jeden róg otwartej skóry i użyj igły o rozmiarze 22, aby przypiąć go do opuszki.

Następnie przypnij drugi róg. Za pomocą nożyczek chirurgicznych przyłożonych do skóry tak płasko, jak to możliwe, przeprowadź wycięcie podskórnej tkanki tłuszczowej w jamie brzusznej lub SCF, a następnie przenieś ją na wstępnie przycięty kawałek folii aluminiowej. Powtórz sekcję dla lewej strony zwierzęcia.

Następnie wyciągnij zarówno lewe, jak i prawe zebrane poduszeczki tłuszczowe w folii aluminiowej i użyj ciekłego azotu do zamrożenia próbki. Aby uzyskać dostęp do trzewnej tkanki tłuszczowej, przetnij mięsień brzucha wzdłuż kresy białej. Następnie wykonaj nacięcie w mięśniach brzucha od genitaliów w kierunku grzbietu myszy po obu stronach.

Tłuszcz wokół narządów rozrodczych to tłuszcz okołogonadalny lub PGF. Odłącz lewe i prawe poduszeczki tłuszczowe od najądrza, jąder i przewodu nawiedzo-nawiedzionego i przenieś je na wstępnie oznaczoną folię aluminiową. Następnie zamrozić próbkę w ciekłym azocie.

Zaczynając od lewej strony, odsłoń nerki, przesuwając jelito od jamy brzusznej na prawą stronę. Tkanka tłuszczowa widoczna tutaj otaczająca nerki i nadnercza to tłuszcz okołonerkowy lub PRF. Wyizoluj i usuń nadnercza przed pobraniem PRF.

Może to być uciążliwe, ponieważ są one nieco bardziej różowe niż tkanka tłuszczowa. Teraz odizoluj PRF od tylnej ściany mięśniowej i przetnij moczowód, tętnicę nerkową i żyłę, która oddziela PRF i nerkę od reszty ciała. Następnie wyizoluj PRF od nerki, przecinając i usuwając torebkę nerkową.

Po wyizolowaniu prawego PRF przenieś próbkę na folię aluminiową z tkanką z lewej strony i użyj ciekłego azotu do zamrożenia próbek. Schłodzić 1,5-mililitrowe stożkowe rurki bez RNaz, moździerz i tłuczek oraz szpatułkę w ciekłym azocie zgodnie z protokołem tekstowym. Umieść próbkę tkanki tłuszczowej w moździerzu, a następnie użyj kilku warstw brązowego papieru, aby podnieść tłuczek z ciekłego azotu i dopasować go do moździerza.

Trzymając tłuczek z papierem, użyj młotka, aby raz lub dwa razy uderzyć w górną część tłuczka. Następnie zmielić próbkę ruchem obrotowym, aż do uzyskania drobnego proszku. Następnie wyjmij tłuczek, wyjmij szpatułkę z ciekłego azotu i użyj jej do przeniesienia próbki do odpowiedniej, wstępnie schłodzonej stożkowej probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Od czasu do czasu zanurzaj szpatułkę z powrotem w ciekłym azocie, aby zapobiec stopieniu się próbki. Trzymaj również stożkową rurkę na suchym lodzie, aby zapobiec rozmrożeniu próbki. Napełnij stożkową probówkę do około 2/3 pojemności zmieloną próbką, aby uzyskać odpowiednią wydajność RNA.

Następnie należy przygotować pozostałe próbki zgodnie z protokołem tekstowym. Pod kapturem chemicznym i w fartuchu laboratoryjnym, rękawicach i okularach ochronnych usuń zmieloną próbkę z ciekłego azotu. Powoli otwórz probówkę i dodaj 500 mikrolitrów roztworu fenolu.

Zamknij pokrywę probówki i wiruj z maksymalną prędkością przez około pięć sekund, a następnie powoli i ostrożnie otwórz rurkę, aby uwolnić ciśnienie azotu. Słychać dźwięk powietrza wydobywającego się z rury. Odpipetować dodatkowe 500 mikrolitrów roztworu fenolu do probówki.

Następnie wiruj i powoli otwieraj jak poprzednio. Wirować próbkę, aż do całkowitego rozpuszczenia. Następnie otwórz rurkę, aby uwolnić ciśnienie przed przetworzeniem dodatkowych próbek.

Po przetworzeniu wszystkich próbek należy je krótko zawirować z maksymalną prędkością i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Odwirować probówki w temperaturze 12 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Następnie przywróć probówki do temperatury pokojowej.

Aby uniknąć zanieczyszczenia, dla każdej próbki należy użyć pipety P1000 z końcówką z filtrem, aby wyizolować jak najwięcej RNA ze środkowej różowej warstwy poprzez przekłucie fazy lipidowej w pobliżu boku probówki. Dozuj RNA do nowych stożkowych probówek bez dotykania boków probówek, aby zapobiec przenoszeniu lipidów obecnych na zewnątrz końcówki. Dodać 200 mikrolitrów czystego chloroformu do każdej próbki i mieszać probówki przez odwrócenie przez 15 sekund.

Następnie, po inkubacji próbek w temperaturze pokojowej przez 10 minut, odwirować probówki w temperaturze 12 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut i doprowadzić probówki z powrotem do temperatury pokojowej. Do każdej próbki należy użyć pipety P1000 i końcówek z filtrem, aby przenieść jak najwięcej wodnej przezroczystej fazy górnej zawierającej RNA do drugiego zestawu odpowiednich stożkowych probówek. Następnie dodaj 500 mikrolitrów 100% izopropanolu do każdej próbki i mieszaj probówki przez odwrócenie przez 15 sekund.

Następnie inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Odwiruj probówki w temperaturze 12 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut przed przywróceniem probówek do temperatury pokojowej. Wyrzuć izopropanol, wylewając go z każdej probówki.

Teraz dodaj jeden mililitr 75% etanolu do każdej próbki i krótko wiruj probówki z maksymalną prędkością. Następnie odwirować próbki w temperaturze 7 500 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Po odwirowaniu próbek i doprowadzeniu ich do temperatury pokojowej wyrzuć 75% etanol, odwracając każdą probówkę i zapalając uderzając nią o brązowy papier, aby usunąć resztki etanolu.

Pozostaw pokrywkę otwartą i wysusz granulkę RNA na powietrzu przez około 15 do 20 minut. Po ocenie wielkości granulek RNA dodaj od 10 do 25 mikrolitrów wody wolnej od RNaz do każdej próbki. Próbki należy inkubować w bloku grzewczym w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Następnie krótko przekręć rurki w wiry. Próbki należy inkubować w tym samym bloku grzewczym przez dodatkowe pięć minut. Następnie szybko odwiruj wszystkie próbki i natychmiast umieść je na lodzie.

Przeprowadzić RT-PCR w celu ekspresji genów w tkance tłuszczowej zgodnie z protokołem tekstowym. Zgodnie z oczekiwaniami, myszy na diecie wysokotłuszczowej miały zwiększoną masę ciała i przyrost masy ciała w porównaniu z rodzeństwem z miotu na normalnej diecie. Obserwacjom tym towarzyszył ponad dwukrotny wzrost masy ciała PGF, PRF i SCF u otyłych myszy w porównaniu z myszami na normalnej diecie.

Poniższa tabela pokazuje, że dla każdej białej tkanki tłuszczowej izolacja RNA za pomocą roztworu fenolu dała próbki z OD260 nad OD280 około 2,0, który jest uważany za czysty dla RNA. Jak widać na tym wykresie słupkowym, dane PCR w czasie rzeczywistym wykazały, że ekspresja mRNA leptyny była znacznie wyższa w PGF, PRF i SCF otyłych myszy w porównaniu z tymi na normalnej diecie. Różnice zaobserwowane w ekspresji mRNA leptyny nie były spowodowane zmiennością s16, genu referencyjnego używanego do normalizacji wyników między dwiema grupami myszy, ponieważ wartości CT nie uległy zmianie.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby podczas procedury ekstrakcji RNaz pracować w środowisku wolnym od RNaz. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak amplifikacja PCR w czasie rzeczywistym, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak modyfikacje ekspresji genów.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się metabolizmem do zbadania modulacji tkanki tłuszczowej związanej z otyłością i cukrzycą u gryzoni. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować różne poduszeczki tłuszczowe i izolować z nich RNA. Nie zapominaj, że praca z roztworem fenolu może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie fartucha laboratoryjnego i rękawiczek.