Name: Analiza kinetyczna waskulogenezy określa ilościowo dynamikę waskulogenezy i angiogenezy in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Poznaj metodę kinetycznej analizy waskulogenezy in vitro z wykorzystaniem mikroskopii kontrastu fazowego i dedykowanego oprogramowania. Technika umożliwia ilościową ocenę potencjału waskulogennego różnych typów komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Lucy Miller, Leanne Hernandez, Dr. Davidowi Haasowi, Brittany Yeley (Indiana University School of Medicine), Dr. Karen Pollok, Julie Mund, Matthew Repass i Emily Sims (Angio BioCore w Indiana University Simon Cancer Center) za doskonałą pomoc techniczną w pozyskiwaniu próbek ECFC. Autorzy dziękują również doktorom Maureen A. Harrington, Edwardowi F. Srourowi, Richardowi N. Dayowi, Mervinowi C. Yoderowi i Matthiasowi A. Claussowi (Indiana University School of Medicine) za dyskusję naukową, a także Janice Walls (Indiana University School of Medicine) za wsparcie administracyjne. Wszystkie obrazowania zostały wykonane w Indiana Center for Biological Microscopy, Indiana University School of Medicine. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health (R01 HL094725, P30 CA82709 i U10 HD063094) oraz Riley Children's Foundation. Dodatkowo, publikacja ta była możliwa dzięki częściowemu wsparciu ze strony Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach Award # T32 HL007910.

<ol><li>Risau, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9109485">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li>
<li>Tung, J. J., Tattersall, I. W., Kitajewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tips%2C+stalks%2C+tubes%3A+notch-mediated+cell+fate+determination+and+mechanisms+of+tubulogenesis+during+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Med%22%5BJournal%5D)">Tips, stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis.</a> CSH Med. 2 (2), 006601(2012).</li>
<li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298(2011).</li>
<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in health and disease.</a> Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).</li>
<li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+angiogenesis%3A+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).</li>
<li>Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+Functional+Characterization+of+Endothelial+Colony+Forming+Cells+Derived+from+Human+Umbilical+Cord+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
<li>Simons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-of-the-Art+Methods+for+Evaluation+of+Angiogenesis+and+Tissue+Vascularization%3A+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularization: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circ Res. 116 (11), 99-132 (2015).</li>
<li>Crabtree, B., Subramanian, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+endothelial+cells+on+Matrigel+and+development+of+a+method+for+a+rapid+and+reproducible+in+vitro+angiogenesis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev-An%22%5BJournal%5D)">Behavior of endothelial cells on Matrigel and development of a method for a rapid and reproducible in vitro angiogenesis assay.</a> In Vitro Cell Dev-An. 43 (2), 87-94 (2007).</li>
<li>Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+methods+for+quantifying+angiogenesis+in+the+Matrigel+assay+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C-Me%22%5BJournal%5D)">A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro.</a> Tissue Eng Part C-Me. 17 (9), 895-906 (2011).</li>
<li>Allier, C. P., et al. <a target="_blank" href="https://www.spiedigitallibrary.org/conference-proceedings-of-spie/8947/1/Video-lensfree-microscopy-of-2D-and-3D-culture-of-cells/10.1117/12.2038098.pdf">Video lensfree microscopy of 2D and 3D culture of cells.</a> SPIE BiOS. 8947, 89471(2014).</li>
<li>Wang, Y., Chen, Q., Zhang, Z., Jiang, F., Meng, X., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-10+overexpression+improves+the+function+of+endothelial+progenitor+cells+stimulated+with+TNF-%CE%B1+through+the+activation+of+the+STAT3+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin-10 overexpression improves the function of endothelial progenitor cells stimulated with TNF-α through the activation of the STAT3 signaling pathway.</a> Int J Mol Med. 35 (2), 471-477 (2015).</li>
<li>Ingram, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+hyperglycemia+or+a+diabetic+intrauterine+environment+reduces+neonatal+endothelial+colony-forming+cell+numbers+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">In vitro hyperglycemia or a diabetic intrauterine environment reduces neonatal endothelial colony-forming cell numbers and function.</a> Diabetes. 57 (3), 724-731 (2008).</li>
<li>Blue, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gestational+diabetes+induces+alterations+in+the+function+of+neonatal+endothelial+colony-forming+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Gestational diabetes induces alterations in the function of neonatal endothelial colony-forming cells.</a> Pediatr Res. 75 (2), 266-272 (2014).</li>
<li>Carpentier, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarpentier%2C+G+%22ImageJ+contribution%3A+Angiogenesis+Analyzer%22">ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer</a>. , (2012).</li>
<li>WimTube. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.wimasis.com/en/products/13/WinTube">https://www.wimasis.com/en/products/13/WinTube</a> (2012).</li>
<li>Varberg, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analyses+of+vasculogenesis+inform+mechanistic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Cell+Ph%22%5BJournal%5D)">Kinetic analyses of vasculogenesis inform mechanistic studies.</a> Am J Physiol-Cell Ph. , (2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Met%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Met. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., Fernández-González, R., Muñoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+reconstruction+of+histological+sections%3A+Application+to+mammary+gland+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Techniq%22%5BJournal%5D)">3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue.</a> Microsc Res Techniq. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li>
<li>Ingram, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).</li>
<li>Mead, L. E., Prater, D., Yoder, M. C., Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+endothelial+progenitor+cells+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of endothelial progenitor cells from human blood.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 2, Unit 2C.1 (2008).</li>
<li>Yoder, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

KAV umożliwia ocenę dużych zbiorów danych z wieloma punktami czasowymi Tradycyjnie, kwantyfikacja unaczynienia in vitro składała się z jednego lub kilku pomiarów punktu czasowego. To statyczne podejście jest po prostu niewystarczające do uchwycenia i ilościowego określenia dynamicznego i złożonego procesu. W związku z tym opracowano tę nowatorską metodę, aby umożliwić skuteczną analizę kinetyki tworzenia sieci w celu uzyskania wglądu w potencjalne mechanizmy molekularne zaangażowane w dynamiczny proces waskulogenezy. Wydajność i automatyzacja są ważnymi elementami w rozwoju nowatorskich technik generowania i analizowania dużych ilości danych obrazowych. KAV został opracowany specjalnie do analizy dużych stosów obrazów składających się z setek obrazów w celu skrócenia czasu i pracy wymaganego do wyciągnięcia biologicznie znaczących wniosków z zestawów danych poklatkowych. Co ważne, KAV przeprowadza przetwarzanie obrazów i generowanie danych w ciągu kilku sekund w przypadku małych (mniej niż 100 obrazów) stosów obrazów i minut w przypadku większych (powyżej 100 obrazów) stosów obrazów, co skutkuje niezrównaną wydajnością. Dodatkowo, organizacja danych w arkuszach kalkulacyjnych według czasu i mierzonych parametrów umożliwia szybkie generowanie prezentacji graficznej i analizy statystycznej.
Wyzwania związane z skutecznym zastosowaniem tego podejścia Chociaż test ten obejmuje ulepszenia zarówno w zakresie akwizycji, jak i analizy obrazu, pewne wyzwania mogą utrudnić pomyślne wdrożenie. Cztery główne przeszkody to stabilność wilgotności, precyzja czasu od galwanizacji do akwizycji obrazu, niezawodność oprogramowania i sprzętu oraz zarządzanie dużymi zestawami danych generowanych dla każdego eksperymentu. Stabilne obrazowanie żywych komórek przez kilka godzin może być wyzwaniem. W szczególności wymagane jest odpowiednie i stałe nawilżanie komór obrazowania. W tym teście stosuje się szkiełka do angiogenezy, które są przeznaczone do równoległego wykonywania testów angiogenezy opartych na matrycy. Ich niewielka objętość, około 50 μl, sprawia, że parowanie i kondensacja są istotne w przypadku przedłużonych warunków hodowli. Aby zwalczyć ten eksperymentalny problem, konieczne jest użycie inkubatora, który reguluje wilgotność. Jednak może być również konieczne rozszerzenie tej regulacji, jeśli z czasem dojdzie do nadmiernego wysuszenia komory obrazowania. Odkryliśmy, że najprostszym podejściem do zwiększenia wilgotności jest zwiększenie powierzchni wody w komorze. Aby osiągnąć ten cel, nasz protokół sugeruje następujące trzy źródła wody: drugą zjeżdżalnię komorową wypełnioną wodą, w której mierzona jest również temperatura inkubatora, wodę w obszarze otaczającym studnie na zjeżdżalniach oraz zwilżoną bibułę filtracyjną lub chusteczki. I odwrotnie, kondensacja występuje, gdy temperatura powietrza w pomieszczeniu schładza dno zjeżdżalni, a wilgoć wewnątrz komory skrapla się na zjeżdżalniach i studzienkach. To powikłanie może prowadzić do rozcieńczenia podłoża komórkowego i efektu soczewkowania, który zakłóca kontrast fazowy. W badaniach tych kondensacja została zminimalizowana poprzez zastosowanie ogrzanego powietrza (39-42 °C) na dnie szkiełka.
Kluczową kwestią w każdym badaniu poklatkowym jest spójność między rozpoczęciem eksperymentu a obrazowaniem. Czas, w którym rozpoczyna się obrazowanie, ma kluczowe znaczenie dla interpretacji dalszych zdarzeń. Aby zapewnić precyzję czasową tego testu, czas między początkowym posiewem a pierwszym zobrazowanym punktem czasowym powinien być ściśle kontrolowany. W praktyce ten "martwy czas" można zminimalizować, ale co ważniejsze, musi on być spójny, aby umożliwić porównywanie eksperymentów w różnych dniach. Na przykład w tym protokole spodziewamy się czasu martwego wynoszącego około 30 minut. Może to być ułatwione dzięki bliskości urządzeń do przygotowania i obrazowania eksperymentalnego.
To, co na pierwszy rzut oka może wydawać się prozaicznymi szczegółami, jest ważne dla stabilności oprogramowania, sprzętu i zarządzania danymi. Oprogramowanie i powiązane sterowniki sprzętowe, środowisko sieciowe i automatyczne aktualizacje oprogramowania mają wpływ na stabilność oprogramowania. Warto przetestować ten protokół w "próbie na sucho", aby zidentyfikować wąskie gardła i potencjalne źródła problemów w akwizycji obrazu; Na przykład sprawdź, czy nie ma zawodnej konfiguracji Live Cell, niezawodności sceny, migawki i kamery oraz instytucjonalnych zasad informatycznych dotyczących automatycznych aktualizacji systemu operacyjnego i oprogramowania.
Zarządzanie danymi jest stałym problemem każdego eksperymentu obrazowego, który generuje setki lub tysiące obrazów. Na szczęście komercyjne oprogramowanie często sprawdza dostępne miejsce przed rozpoczęciem eksperymentu z obrazowaniem. Jednak test ten obejmuje również przetwarzanie i analizę obrazu po przechwyceniu, co może zwiększyć obciążenie miejsca na dysku twardym i zakłócać eksperymenty obrazowe, jeśli dostępna przestrzeń jest ograniczona. Co więcej, nie można zagwarantować bezpieczeństwa i stabilności komputera, nawet w przypadku rozwiązań sprzętowych, takich jak nadmiarowa tablica identycznych dysków. W związku z tym konieczna jest strategia zarządzania danymi w celu zapewnienia miejsca na dyskach twardych komputera na trwające eksperymenty oraz solidna zdalna archiwizacja, na przykład z wykorzystaniem instytucjonalnych zasobów archiwizacyjnych.
Strategie maksymalizacji jakości obrazu Chociaż zdolność KAV do dokładnego odróżniania ECFC od tła matrycy jest solidna, czułość testu zależy od jakości obrazu. Na przykład, jeśli obraz ma niski kontrast, oprogramowanie wykryje sieci komórkowe z mniejszą dokładnością (rysunek 2B). Na jakość kontrastu fazowego ma wpływ kilka czynników, w tym ustawienia mikroskopu używanego do akwizycji obrazu, ładowanie matrycy i pożywki zawiesinowej komórek podczas przygotowywania testu oraz utrzymanie poziomu pożywek w studzienkach przez cały okres obrazowania. Aby zoptymalizować kontrast fazowy dla tych testów, dokonano drobnych korekt wyrównania pierścienia fazowego w mikroskopie w celu poprawy kontrastu. Ponadto przygotowanie próbki zostało rygorystycznie przetestowane, aby zapewnić równomierne i spójne ładowanie nośników. Jeśli ilość matrycy i/lub mediów załadowanych do studzienek jest poniżej lub powyżej optymalnego zakresu, może powstać menisk prowadzący do zmiany kontrastu fazowego. Wreszcie, ze względu na małą objętość cieczy w studniach, bardzo ważne jest utrzymanie poziomu mediów poprzez zminimalizowanie parowania i kondensacji, jak wspomniano powyżej. Ogólnie rzecz biorąc, optymalizacja testów ma kluczowe znaczenie dla generowania wysokiej jakości obrazów kontrastowych do analizy.
Oprócz jakości kontrastu fazowego, na wyniki testu mogą również wpływać inne czynniki, w tym zanieczyszczenie podłoża, niedoskonałości matrycy oraz cząstki lub zanieczyszczenia w matrycy lub pożywce. Zanieczyszczenie jest zagrożeniem związanym z tym testem, ponieważ obejmuje ono obrazowanie żywych komórek przez kilka godzin w komorze mikroskopowej. Aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia, matryca i zawiesiny komórek są ładowane na szkiełko w sterylnym kapturze. Ponadto każda próbka jest zwykle platerowana lub potrójna na potrzeby eksperymentu, aby zminimalizować ryzyko utraty danych z powodu nieprzewidzianych problemów, takich jak zanieczyszczenia lub cząstki zakłócające analizę.
Heterogeniczność próbek napędza potrzebę zwiększenia czułości testu Heterogeniczność została zaobserwowana i opisana w poprzednich badaniach ECFC narażonych na GDM13. Spekuluje się, że wysoki poziom niejednorodności funkcji komórek obserwowany w tych próbkach można przypisać kilku czynnikom, w tym ciężkości choroby matki, czasowi trwania choroby i stylowi leczenia stosowanemu do regulacji poziomu glukozy we krwi. Co ważne, to analityczne podejście pozwala uchwycić dynamiczny zakres unaczynienia ECFC, dzięki czemu możliwe jest zidentyfikowanie różnic fenotypowych wynikających z niejednorodności funkcjonalnej w próbkach pochodzących z ciąż w ciąży z cukrzycą ciążową. Ogólnie rzecz biorąc, wykorzystanie pierwotnych próbek pacjentów, takich jak te użyte w tych badaniach, może wprowadzić większą zmienność w porównaniu z linią komórkową. Ponieważ większy nacisk kładzie się na badania translacyjne obejmujące wiele pierwotnych próbek zwierzęcych lub ludzkich o zmienności funkcjonalnej, czułość testu ma zasadnicze znaczenie dla wykrywania i wyprowadzania biologicznie znaczących pomiarów i wniosków. W związku z tym rozwój podejść takich jak KAV poprawi ilość i jakość danych generowanych przez testy unaczynienia i angiogenezy in vitro , aby umożliwić bardziej wiarygodne obserwacje i wnioski. Co więcej, dane te ułatwią przyszłe badania podstawowych mechanizmów molekularnych, które przyczyniają się do zmiany waskulogenezy ECFC po wewnątrzmacicznym narażeniu na GDM.
Przyszłe zastosowania tego podejścia Chociaż metoda ta została zastosowana do oceny unaczynienia ECFC płodu in vitro w tych badaniach, potencjalne zastosowania tego podejścia są liczne. Technikę tę można łatwo zastosować do badania dowolnej populacji komórek, która uczestniczy w procesach waskulogenezy lub angiogenezy. W szczególności można go wykorzystać do badania pojedynczych populacji komórek, jak wykazano w tym badaniu, ale można go również zastosować do systemów kohodowli. W przyszłości korzystne byłoby rozszerzenie tego podejścia poza dwuwymiarowy test in vitro w celu oceny modeli trójwymiarowych (3D). Chociaż obecna wersja KAV byłaby niewystarczająca do ilościowego określenia danych obrazowania 3D, podobnie zaprojektowane poklatkowe, wieloparametryczne podejście analityczne przeznaczone specjalnie dla modeli 3D lub in vivo dostarczyłoby informacji, czy obserwacje wykonane w dwuwymiarowym in vitro są reprezentatywne dla funkcji komórki w bardziej istotnych biologicznie warunkach.

Zdolność komórek progenitorowych śródbłonka do przechodzenia waskulogenezy, czyli tworzenia naczyń de novo, jest kluczowa w tworzeniu embrionalnej unaczynienia podczas rozwoju1. Dodatkowo, dalsze tworzenie naczyń krwionośnych i dojrzewanie wcześniej istniejących naczyń, które jest znane jako angiogeneza, jest również kluczowym procesem w rozwoju i życiu poporodowym, aby utrzymać przepływ krwi i homeostazę w całym ciele2. Każdy narząd w ciele jest zależny od układu naczyniowego w zakresie dostarczania tlenu i składników odżywczych oraz usuwania odpadów3. Jeśli homeostaza naczyń krwionośnych nie jest zachowana, tak że tworzenie i naprawa naczyń krwionośnych jest albo niewystarczająca, albo w nadmiarze, mogą wystąpić choroby naczyniowe4. Dlatego tworzenie i adaptacja naczyń krwionośnych są powszechnie badane, ponieważ są niezbędne w utrzymaniu zdrowia narządów i biorą udział w rozwoju wielu stanów patologicznych.
Ze względu na zwiększone zrozumienie udziału układu naczyniowego w rozwoju, jak również w manifestacji i progresji choroby, opracowano testy do modelowania waskulogenezy i angiogenezy in vitro i in vivo5,6,7. Modelowanie tworzenia naczyń polega na posiewaniu komórek naczyniowych, takich jak komórki śródbłonka, w macierzy błony podstawnej, która wspomaga organizację komórek i tworzenie sieci naczyń8,9,10. Zazwyczaj, po całonocnej inkubacji, obrazy sieci komórkowych są przechwytywane w jednym punkcie czasowym, co skutkuje niewielką liczbą obrazów do analizy11,12,13. W związku z tym podejścia analityczne zostały w dużej mierze opracowane i zoptymalizowane pod kątem ocen pojedynczych punktów czasowych10,14. Jednak analizy statyczne są po prostu niewystarczające do uchwycenia dynamicznego procesu formowania się naczyń i dostarczają ograniczonego wglądu w potencjalne mechanizmy związane z tym procesem. Chociaż zwiększenie częstotliwości obrazowania prawdopodobnie dostarczyłoby danych niezbędnych do identyfikacji kinetyki formacji, zastosowanie wcześniej opracowanych analiz do podejścia do obrazowania wielu punktów czasowych byłoby nieefektywne i pracochłonne14. Dodatkowo, pomimo rozwoju komercyjnie dostępnych analiz, opłata za obraz sprawia, że opcja ta jest zbyt kosztowna w przypadku badań kinetycznych, w których generowane są tysiące obrazów15. W związku z tym w tej dziedzinie istnieje zapotrzebowanie na usprawnione i wydajne podejście do wychwytywania i ilościowego określania unaczynienia in vitro, w tym możliwość analizy dużych zestawów obrazów generowanych przez poklatkową mikroskopię żywych komórek.
Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano nowe podejście, którego celem było rozszerzenie obrazowania pojedynczego punktu czasowego, aby umożliwić dynamiczną ocenę waskulogenezy za pomocą obrazów pozyskiwanych co 15 minut16. Dzięki uchwyceniu wielu punktów czasowych w ciągu kilku godzin, podejście to zapewnia bardziej szczegółowy obraz procesu waskulogenezy, a także wgląd w potencjalne mechanizmy przyczyniające się do tworzenia i utrzymywania sieci naczyń krwionośnych. Oprócz poprawy częstotliwości i jakości pozyskiwania obrazów, podejście to obejmuje nowatorskie oprogramowanie w postaci wtyczki typu plug-in17. Oprogramowanie, określane jako Analiza Kinetyczna Waskulogenezy (KAV), jest usprawnioną aplikacją, która obejmuje przetwarzanie i analizę obrazów specjalnie dla dużych zestawów obrazów generowanych z akwizycji wielu punktów czasowych. KAV analizuje obrazy kontrastu fazowego poprzez segmentację obrazu, a następnie szkieletyzację18. Dziesięć parametrów struktury sieci jest określanych ilościowo przez KAV, w tym: rozgałęzienia, sieci zamknięte, węzły, obszary sieci, struktury sieciowe, węzły trójgałęziowe, węzły czterogałęziowe, całkowita długość rozgałęzienia, średnia długość gałęzi i stosunek gałęzi do węzłów (patrz schemat w <silna klasa="xfig">Rysunek 1)16. Zastosowanie podejścia KAV obejmuje nowy, obliczony fenotyp waskulogenezy in vitro, określany jako stosunek gałęzi do węzłów. Nasze ostatnie prace wykazały, że stosunek ten wskazuje na łączność sieciową i może być związany z innymi procesami komórkowymi zaangażowanymi w tworzenie sieci, takimi jak motility16.
Chociaż waskulogeneza komórek tworzących kolonię śródbłonka płodu (ECFC) została oceniona w tych badaniach, to podejście do pozyskiwania i analizy obrazów może być łatwo zastosowane do oceny dowolnych typów komórek, które przechodzą waskulogenezę lub angiogenezę. Ponadto podejście to można wykorzystać do identyfikacji zmienionej funkcji naczyń krwionośnych wynikających z różnych stanów patologicznych, takich jak cukrzyca ciążowa, jak wykazano w tych badaniach. Co więcej, metodę tę można zaadaptować do oceny tworzenia i rozgałęziania się sieci, które są ważne dla innych procesów istotnych z biologicznego punktu widzenia. W związku z tym potencjalny wpływ zastosowania tego nowatorskiego podejścia do unikalnych systemów biologicznych nie został jeszcze określony.

<table><tbody><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych 100 mm</td><td>Fisher</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki stożkowe</td><td>Fisher</td><td>1495949B</td><td></td></tr><tr><td>Angiogeneza 15-dołkowe mikropreparaty</td><td>Ibidi</td><td>81506</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Fisher (Corning)</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>EGM2 Medium</td><td>Lonza</td><td>CC3162</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>PSA Antymiocytarny, antybiotyk</td><td>Fisher</td><td>MT30004C1</td><td>Dodano 5 ml na 500 ml butelki pożywki EGM2.</td></tr><tr><td>0,5% trypsyny/0,53 nM EDTA w HBSS</td><td>Fisher (Corning)</td><td>MT25052CI</td><td></td></tr><tr><td>Type 1 Collagen</td><td>Fisher (Corning)</td><td>354226</td><td>100 mg płynu, zakres stężeń 3-4 mg/mL. Rozcieńczyć w 20 nM kwasie octowym w ddH2O do użycia w końcowym stężeniu 0,05 mg/ml.</td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Fisher</td><td>A38-212</td><td>Stosowany w roztworze kolagenu typu 1 w końcowym stężeniu 20 nM.</td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko komorowe</td><td>Ibidi</td><td>80296</td><td>Szkiełko to można napełnić wodą destylowaną, aby utrzymać wilgotność w komorze obrazowania.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Fisher (Gibco)</td><td>20012027</td><td>1x roztwór, pH 7,2</td></tr><tr><td></td><td>Mikroskop Instrumenty firmy Nikon</td><td>MEA53100 i MEF55030</td><td>Zmotoryzowany TiE, w tym pierścień fazowy Ph1 do kontrastu fazowego z obiektywnym</td></tr><tr><td>Stage</td><td>Wcześniejsze instrumenty</td><td>ProScan II</td><td>Można stosować inne OKOlab i Nikon Elements Stopień kompatybilny z AR</td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Instrumenty Nikon 93178</td><td></td><td>CFI Plan Fluor DL 10X</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-42U</td><td>ORCA Flash 4.0LT</td></tr><tr><td>Stage</td><td>Blower Precyzyjne sterowanie</td><td>Nie dotyczy</td><td>Ten produkt został wycofany, alternatywy obejmują Smart Air-Therm Heater (AIRTHERM-SMT-1W) firmy World Precision Instruments</td></tr><tr><td>Stage-top Inkubator&nbsp;</td><td>OKOLabs</td><td>H301</td><td>BoldLine z dwupozycyjnym uchwytem na suwak</td></tr><tr><td>Komputer</td><td>Hewlett-Packard</td><td>Z620 lub równoważny</td><td>4-rdzeniowy procesor Intel Xeon, >32 GB RAM, >2 TB RAID 10, karta graficzna nVidia Quadro&nbsp;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Nikon Elements</td><td>Nikon Instruments</td><td>AR v 4.20</td><td>ND Acquisition to wielowymiarowe narzędzie konfiguracyjne służące do konfiguracji oprogramowania Elements.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie FIJI (ImageJ)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Bezpłatne, otwarte oprogramowanie pobrane online pod następującym adresem URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads</td></tr><tr><td>Wtyczka KAV</td><td>Nie</td><td></td> dotyczy <td>Nie dotyczy Bezpłatne, otwarte oprogramowanie pobrane online pod następującym adresem URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis</td></tr></tbody></table>

analiza kinetyczna waskulogenezy określa ilościowo dynamikę waskulogenezy i angiogenezy in vitro

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Waskulogeneza to złożony proces, w którym śródbłonkowe komórki macierzyste i progenitorowe ulegają tworzeniu naczyń de novo. Ilościowa ocena unaczynienia stała się centralnym odczytem funkcjonalności śródbłonkowych komórek progenitorowych, dlatego podjęto kilka prób ulepszenia modeli unaczynienia zarówno in vitro, jak i in vivo. Jednak standardowe metody mają ograniczony zakres, a pomiary statyczne nie są w stanie uchwycić wielu aspektów tego wysoce dynamicznego procesu. Dlatego celem opracowania tego nowatorskiego protokołu była ocena kinetyki waskulogenezy in vitro w celu ilościowego określenia tempa tworzenia i stabilizacji sieci, a także zapewnienia wglądu w potencjalne mechanizmy leżące u podstaw dysfunkcji naczyń krwionośnych. Zastosowanie tego protokołu wykazano na przykładzie komórek tworzących kolonie śródbłonka płodu (ECFC) narażonych na cukrzycę matki. Płodowe ECFC uzyskano z krwi pępowinowej pobranej po urodzeniu, wyhodowano i posiano w szkiełkach zawierających macierz błony podstawnej, gdzie uległy unaczynieniu. Obrazy całych studni szkiełka uzyskano za pomocą poklatkowej mikroskopii z kontrastem fazowym przez 15 godzin. Obrazy zostały przeanalizowane w celu uzyskania danych ilościowych za pomocą oprogramowania analitycznego o nazwie Analiza Kinetyczna Waskulogenezy (KAV). KAV wykorzystuje segmentację obrazu, a następnie szkieletyzację do analizy komponentów sieci ze stosów obrazów kontrastu fazowego z wieloma punktami czasowymi w celu uzyskania dziesięciu parametrów (9 zmierzonych, 1 obliczony) struktury sieci, w tym: sieci zamknięte, obszary sieciowe, węzły, gałęzie, całkowita długość gałęzi, średnia długość gałęzi, węzły trójgałęziowe, węzły czterogałęziowe, struktury sieciowe i stosunek rozgałęzień do węzłów. Zastosowanie tego protokołu pozwoliło na zidentyfikowanie zmienionych wskaźników unaczynienia w ECFC uzyskanych z ciąż powikłanych cukrzycą. Technika ta ma jednak szerokie implikacje wykraczające poza zakres opisany w niniejszym dokumencie. Wdrożenie tego podejścia poprawi ocenę mechanistyczną i poprawi funkcjonalne odczyty waskulogenezy i innych biologicznie ważnych procesów rozgałęziania w wielu typach komórek lub stanach chorobowych.

KAV generuje wizualne reprezentacje struktury sieci 
Kontrast pomiędzy ECFC a tłem macierzy na obrazach w kontraście fazowym umożliwia programowi KAV identyfikację struktur specyficznych dla komórek. Sieci ECFC zidentyfikowane przez KAV są przedstawione graficznie w formie szkieletu oraz maski, aby zilustrować struktury wykorzystywane przez oprogramowanie do kwantyfikacji (Rysunek 2A). Co istotne, jakościowa ocena reprezentacji szkieletu i maski pozwala na szybką weryfikację czułości i dokładności KAV, co może być pomocne przy ustalaniu optymalnych ustawień progowych oraz interpretacji wyników analizy. Gdy jakość obrazów w kontraście fazowym jest wysoka i osiągnięto wystarczający kontrast, KAV precyzyjnie identyfikuje sieci ECFC, o czym świadczy podobieństwo pomiędzy obrazem w kontraście fazowym a wygenerowanym przez KAV szkieletem i maską (Rysunek 2A oraz Wideo 1).
Alternatywnie, jeśli obrazy w kontraście fazowym nie charakteryzują się wysokim kontrastem i/lub występują artefakty obrazowania, takie jak prążkowanie, dokładność detekcji sieci ulega zmniejszeniu, a wyniki stają się niejednoznaczne (Rycina 2B). Ponadto powstanie pęcherzyków powietrza w pożywce komórkowej może również utrudniać dokładność detekcji (Rycina 2). Problemy z jakością obrazu można jednak często rozwiązać poprzez wybór innych metod progowania dostępnych w oprogramowaniu KAV. Na przykład obraz w kontraście fazowym na Rycynie 2B został przeanalizowany przy użyciu identycznych ustawień przetwarzania obrazu, z wyjątkiem metody progowania. Z wersji szkieletowej (Skeleton) i maski (Mask) wynika, że progowanie metodą Otsu doprowadziło do dokładniejszej detekcji sieci ECFC widocznych na obrazie w kontraście fazowym (Rycina 2B). Zatem jakość obrazu ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnych i znaczących wyników w tym teście. Niemniej jednak różne metody progowania zawarte w interfejsie użytkownika KAV umożliwiają dostosowanie analizy obrazu w zależności od jakości obrazów wejściowych.
Mikroskopia poklatkowa identyfikuje różnice jakościowe i ilościowe w waskulogenezie ECFC po płodowej ekspozycji na cukrzycę ciążową 
Niedawno podejście analityczne KAV zostało zastosowane do oceny funkcji płodowych ECFC po ekspozycji na macierną cukrzycę typu 2 (T2DM) in utero16. Dzięki zastosowaniu KAV zidentyfikowano zmienioną kinetykę waskulogenezy w płodowych ECFC eksponowanych na T2DM. Jednakże, poza ekspozycją na T2DM, która występuje przez cały okres ciąży, cukrzyca ciążowa (GDM), czyli rozwój nietolerancji glukozy zazwyczaj w trzecim trymestrze ciąży, również upośledza funkcję ECFC13. W związku z tym zastosowano KAV, aby ustalić, czy ECFC eksponowane na GDM również wykazują zmienioną kinetykę tworzenia sieci ECFC. Fazę 1 (0-5 h) i Fazę 2 (5+ h) oceniono za pomocą mikroskopii poklatkowej w połączeniu z analizą KAV (Rycina 3). Reprezentatywne obrazy w kontraście fazowym, pozyskane na początku akwizycji obrazu (0.50 h) oraz w trakcie przebiegu czasowego (5.00 i 10.00 h), przedstawiają tworzenie sieci ECFC w czterech próbkach badanych w jednym dniu eksperymentalnym (Rycina 3 oraz Wideo 1). Pomimo równoważnego zasiewu komórek, co zaobserwowano na obrazach w kontraście fazowym w 0.50 h, różnice jakościowe w strukturze sieci są widoczne w punktach czasowych 5.00 i 10.00 h. ECFC z niepowikłanej ciąży (UC) tworzą złożoną i gęstą sieć 5 godzin po wysianiu, co jest zgodne z naszymi wcześniej opublikowanymi danymi16. Przeciwnie, ECFC z próbki GDM 1 (GDM1) tworzą bardzo niewiele struktur sieciowych, które nie są ze sobą połączone. Wzór ten nie odzwierciedla jednak wszystkich próbek ECFC uzyskanych z ciąż z GDM, co wskazuje na heterogeniczność między próbkami. Próbki GDM2 i GDM3 wykazują większe tworzenie sieci w porównaniu z GDM1, choć wzorce łączności wydają się zmienione w stosunku do próbki UC. Co ważne, KAV mierzy kilka komponentów strukturalnych sieci ECFC, aby zidentyfikować zarówno oczywiste, jak i subtelne fenotypy.
Oprócz generowania obrazów szkieletowych i masek struktury sieci, KAV kwantyfikuje dziesięć parametrów struktury sieci, w tym liczbę poszczególnych struktur sieci, węzłów, węzłów trójdzielnych, węzłów czterodzielnych, odgałęzień, całkowitą długość odgałęzień, średnią długość odgałęzień, stosunek odgałęzień do węzłów, całkowitą liczbę sieci zamkniętych oraz powierzchnię sieci16. KAV kompiluje dane dla każdej próbki w jednej tabeli wartości dla wszystkich obrazów z przebiegu czasowego. Tabela 1 zawiera reprezentatywne surowe dane z jednego badania obrazowania dla jednej próbki ECFC. Parametry struktury sieci mierzone przez KAV są uporządkowane w kolumnach, a dane z kolejnych obrazów pozyskanych w czasie są uporządkowane w wierszach. Na przykład w naszych badaniach obraz 1 został uzyskany 30 min po wysianiu, a kolejne obrazy gromadzono co 15 min. Surowe wartości wygenerowane przez KAV mogą być następnie przedstawione na wykresach lub poddane dalszej analizie przy użyciu bardziej złożonych metod statystycznych16.
Przedstawiono pięć wykresów obrazujących średnie wartości struktury sieci z trzech oddzielnych eksperymentów dla pojedynczej próbki kontrolnej (UC) oraz trzech próbek GDM (Rysunek 4). Próbka UC w tych eksperymentach zachowywała się podobnie do wcześniej analizowanych próbek UC16. Wcześniej zidentyfikowano, że waskulogeneza ECFC in vitro jest dwufazowa i składa się z Fazy 1 (0 - 5 h) oraz Fazy 2 (5 - 10 h)16. Wzorzec ten jest spójny w obecnych badaniach, co potwierdza wykres przedstawiający dane dotyczące zamkniętych sieci (Rysunek 4). Próbka UC utworzyła większą liczbę zamkniętych sieci w porównaniu do wszystkich trzech próbek GDM. Co ciekawe, trzy z czterech próbek wykazują podobny czas osiągnięcia maksymalnej liczby zamkniętych sieci, co następuje między 2,5 a 3 godzinami. Jednak w próbce GDM2 osiągnięcie maksymalnej liczby zamkniętych sieci nastąpiło wolniej, tj. 5 godzin po wysiewie. Ponadto, mimo że próbka GDM2 utworzyła mniej sieci maksymalnych w porównaniu do próbki UC, utworzone sieci były utrzymywane w czasie podobnie jak w próbce UC. Przeciwnie, w przypadku GDM1 i GDM3, które utworzyły mniej sieci w porównaniu do próbki UC, odnotowano również ogólny spadek liczby sieci w czasie. Podsumowując, z wykresu przedstawiającego liczbę zamkniętych sieci wynika, że wszystkie próbki ECFC wykazały dwufazowy wzorzec tworzenia sieci, jednak tempo ich tworzenia oraz osiągnięta maksymalna liczba sieci różnią się w zależności od próbki.
Pole sieci reprezentuje średnią powierzchnię wewnątrz zamkniętych sieci utworzonych przez ECFCs. W związku z tym, im większa liczba zamkniętych sieci, tym mniejsze są obszary sieci. Wzorzec ten jest odzwierciedlony na wykresach pola sieci, gdzie próbka UC, która utworzyła większą liczbę zamkniętych sieci, wykazywała z czasem mniejsze obszary sieci w porównaniu do trzech próbek GDM (Rycina 4). Próbka GDM2, w której maksymalna liczba zamkniętych sieci została osiągnięta wolniej, wykazywała początkowo duże pole sieci, jednak z czasem obszar ten się ustabilizował, co było najbardziej zbliżone do próbki UC w 15. godzinie. Z biegiem czasu średnie pole sieci we wszystkich próbkach wzrosło z powodu destabilizacji sieci. Jednak niektóre próbki, takie jak GDM1 i GDM3, wykazały szybszy wzrost pola sieci, co prawdopodobnie wskazuje na mniejszą stabilność w porównaniu do pozostałych próbek, w których wzrost był bardziej stopniowy.
ECFCs eksponowane na GDM wykazują obniżoną stabilność sieci 
Stosunek odgałęzień do węzłów jest nowym fenotypem obliczanym przez KAV i zidentyfikowanym w naszych poprzednich badaniach, który wskazuje na łączność sieci16. W niniejszym badaniu próbka UC wykazała niski stosunek, co reprezentowało wysoki poziom łączności sieci utrzymywany w czasie (Rysunek 4). Przeciwnie, trzy próbki GDM miały wyższy stosunek odgałęzień do węzłów, szczególnie w fazie 2 tworzenia sieci. Obserwacja ta świadczy o zmniejszonej łączności i destabilizacji struktur sieciowych.
Ogólnie GDM1 utworzyło mniej węzłów i odgałęzień w porównaniu z pozostałymi próbkami, a redukcja ta utrzymała się w trakcie trwania eksperymentu. GDM2 i GDM3 utworzyły i utrzymały większą liczbę odgałęzień w porównaniu z próbką UC, szczególnie między 5 a 15 h. Liczba węzłów wykrytych w sieciach GDM2 i GDM3 była bardziej zbliżona do liczby węzłów w próbce UC, zwłaszcza między 10 a 15 h. Większa liczba odgałęzień przy podobnej liczbie węzłów może wyjaśniać zwiększony stosunek liczby odgałęzień do węzłów, widoczny w późniejszych punktach czasowych w próbkach GDM. Co ważne, jednoczesne zmiany liczby odgałęzień i węzłów mogą być trudne do zinterpretowania na oddzielnych wykresach. Jednakże nowy stosunek liczby odgałęzień do węzłów oferuje sposób oceny tego, jak zmiany w liczbie zarówno odgałęzień, jak i węzłów – w tym niewielkie zmiany trudne do wykrycia na pojedynczych wykresach – wpływają na zmienioną łączność sieci.
<img alt="Schemat struktury sieci; węzły, odgałęzienia, sieci zamknięte; badanie łączności lub szlaków." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57044/57044fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat przedstawiający 10 parametrów określanych ilościowo za pomocą kinetycznej analizy waskulogenezy (KAV). Metoda KAV określa ilościowo dziesięć różnych parametrów struktury sieci. Wszystkie parametry są oznaczone kolorami i ponumerowane na schemacie (1-10). Parametry obejmują liczbę odgałęzień (zielony, 1), sieci zamkniętych (niebieski, 2) i węzłów (czerwony, 3), średnią powierzchnię sieci (pomarańczowy, 4), liczbę struktur sieciowych (czarny, 5), węzły trójdzielne (żółty, 6) i węzły czterodzielne (fioletowy, 7), a także całkowitą (9) i średnią (10) długość odgałęzień oraz stosunek liczby odgałęzień do liczby węzłów (10). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57044/57044fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schematy fazy, szkieletu i maski; przetwarzanie obrazu dla analizy wzorców; progowanie metodą Otsu i średnią." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57044/57044fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Analiza kinetyczna waskulogenezy (KAV) ilościowo określa strukturę sieci. (A) Przedstawienia szkieletowe i maskowe struktur sieci zidentyfikowanych przez KAV na obrazach w kontraście fazowym stanowią wizualizację struktur sieci wykrytych i zmierzonych za pomocą KAV. Pasek skali = 500 µm. (B) Reprezentatywny obraz w kontraście fazowym sieci ECFC 10 h po wysianiu, charakteryzujący się niskim kontrastem i widocznymi liniami siatki powstałymi w wyniku łączenia pojedynczych obrazów. W celu poprawy dokładności pomiarów, w przypadku niskiego kontrastu obrazów fazowych lub wystąpienia artefaktów siatki, wtyczka KAV umożliwia wybór różnych metod progowania, takich jak metoda średniej (Mean) lub metoda Otsu. Przedstawiono szkielety i maski obrazu w kontraście fazowym dla obu metod progowania (Mean oraz Otsu). Obrazy w kontraście fazowym wykonano przy użyciu obiektywu 10X. Pasek skali = 500 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57044/57044fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres wzrostu grzyba w czasie dla UC, GDM1-3 w 0,5h, 5h, 10h; wyniki eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57044/57044fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wewnątrzmaciczna ekspozycja na GDM zmienia tworzenie sieci ECFC. Obrazy tworzenia sieci ECFC rejestrowano w odstępach 15 min przez 15 h za pomocą mikroskopii kontrastowej. Reprezentatywne obrazy kontrastowe w odstępach 5 h, zaczynając od momentu wysiewu (0,5 h), przedstawiono dla UC oraz trzech próbek GDM. Obrazy kontrastowe wykonano przy użyciu obiektywu 10X. Pasek skali = 500 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57044/57044fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy analizujące strukturę sieci; trendy w zamkniętych sieciach, obszarach, odgałęzieniach, węzłach w ciągu 15 godzin." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57044/57044fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: ECFC narażone na wewnątrzmaciczny GDM wykazują zmienioną kinetykę tworzenia sieci. ECFC pobrano z ciąży niepowikłanej (UC, kolor czarny) oraz z trzech ciąż powikłanych cukrzycą ciążową (GDM 1-3, kolor czerwony). Obrazy w kontraście fazowym rejestrowano w odstępach 15 min przez 15 h. Oprogramowanie Kinetic Analysis of Vasculogenesis (KAV) służyło do ilościowego oznaczania zamkniętych sieci, obszarów sieci, odgałęzień, węzłów oraz stosunku odgałęzień do węzłów. Przedstawione dane obrazują średnią ± błąd standardowy średniej (SEM) z trzech oddzielnych eksperymentów dla każdej próbki. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57044/57044fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza mikroporowatości gleby; porównanie obrazów mikroskopowych struktury gleby poddanej działaniu czynników." src="/files/ftp_upload/57044/57044video1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Wideo 1"> 
Wideo 1: Wewnątrzmaciczna ekspozycja na GDM zmienia kinetykę tworzenia sieci ECFC. Obrazy tworzenia sieci ECFC rejestrowano co 15 min przez 15 h za pomocą mikroskopii kontrastowej. Przedstawiono obrazy kontrastowe dla grupy UC oraz trzech próbek GDM w czasie 15 h, zaczynając od 0,5 h. Pasek skali reprezentuje 500 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57044/Video1.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Obraz</td>
			<td>Całkowite sieci rozgałęzień</td>
			<td>Węzły</td>
			<td>Triplety</td>
			<td>Czwórki</td>
			<td>Gałęzie</td>
			<td>Całkowita długość rozgałęzień*</td>
			<td>Średnia długość gałęzi*</td>
			<td>Stosunek liczby odgałęzień do liczby węzłów</td>
			<td>Sieci zamknięte</td>
			<td>Obszar sieciowy**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>382</td>
			<td>290</td>
			<td>278</td>
			<td>11</td>
			<td>943</td>
			<td>47210</td>
			<td>124</td>
			<td>3.25</td>
			<td>9</td>
			<td>480214</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>284</td>
			<td>345</td>
			<td>337</td>
			<td>8</td>
			<td>940</td>
			<td>50699</td>
			<td>179</td>
			<td>2.72</td>
			<td>16</td>
			<td>264469</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>205</td>
			<td>376</td>
			<td>366</td>
			<td>9</td>
			<td>910</td>
			<td>55728</td>
			<td>272</td>
			<td>2.42</td>
			<td>27</td>
			<td>150621</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>162</td>
			<td>422</td>
			<td>407</td>
			<td>15</td>
			<td>947</td>
			<td>59692</td>
			<td>368</td>
			<td>2.24</td>
			<td>40</td>
			<td>98713</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>132</td>
			<td>454</td>
			<td>441</td>
			<td>12</td>
			<td>967</td>
			<td>61923</td>
			<td>469</td>
			<td>2.13</td>
			<td>53</td>
			<td>72951</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>122</td>
			<td>435</td>
			<td>419</td>
			<td>14</td>
			<td>907</td>
			<td>62587</td>
			<td>513</td>
			<td>2.09</td>
			<td>68</td>
			<td>56948</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>88</td>
			<td>429</td>
			<td>411</td>
			<td>17</td>
			<td>852</td>
			<td>63983</td>
			<td>727</td>
			<td>1.99</td>
			<td>74</td>
			<td>51429</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>68</td>
			<td>451</td>
			<td>437</td>
			<td>13</td>
			<td>874</td>
			<td>63960</td>
			<td>941</td>
			<td>1.94</td>
			<td>74</td>
			<td>51780</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>93</td>
			<td>437</td>
			<td>417</td>
			<td>18</td>
			<td>905</td>
			<td>60901</td>
			<td>655</td>
			<td>2.07</td>
			<td>49</td>
			<td>82919</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>126</td>
			<td>511</td>
			<td>487</td>
			<td>24</td>
			<td>1075</td>
			<td>61981</td>
			<td>492</td>
			<td>2.1</td>
			<td>37</td>
			<td>116857</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>49</td>
			<td>397</td>
			<td>384</td>
			<td>12</td>
			<td>737</td>
			<td>61823</td>
			<td>1262</td>
			<td>1.86</td>
			<td>79</td>
			<td>48805</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>81</td>
			<td>376</td>
			<td>364</td>
			<td>10</td>
			<td>751</td>
			<td>56817</td>
			<td>701</td>
			<td>2</td>
			<td>63</td>
			<td>64431</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13</td>
			<td>98</td>
			<td>509</td>
			<td>482</td>
			<td>26</td>
			<td>1028</td>
			<td>60799</td>
			<td>620</td>
			<td>2.02</td>
			<td>44</td>
			<td>98056</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14</td>
			<td>93</td>
			<td>449</td>
			<td>416</td>
			<td>31</td>
			<td>909</td>
			<td>58282</td>
			<td>627</td>
			<td>2.02</td>
			<td>45</td>
			<td>94081</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="11">*zaokrąglono do najbliższego mikrona, **zaokrąglono do najbliższego mikrona^2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Reprezentatywne surowe dane z jednego badania obrazowania dla jednej próbki ECFC.

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania poklatkowego i analizy unaczynienia in vitro za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym w połączeniu z oprogramowaniem open source, Analiza Kinetyczna Waskulogenezy. Protokół ten można zastosować do ilościowej oceny potencjału naczyniowego wielu typów komórek lub warunków eksperymentalnych, które modelują chorobę naczyniową.

Analiza kinetyczna waskulogenezy określa ilościowo dynamikę waskulogenezy i angiogenezy in vitro

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

Ogólnym celem tej metody eksperymentalnej jest wizualizacja i ilościowe określenie dynamicznego procesu waskulogenezy w czasie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie angiogenezy i waskulogenezy dotyczące szybkości tworzenia naczyń i różnic między utworzonymi wzorcami strukturalnymi sieci. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona ilościowe określenie dużej liczby punktów czasowych waskulogenezy, dając możliwość oceny kinetyki procesu naczyniopochodnego.Metoda ta może być stosowana do dowolnej populacji komórek lub stanu patologicznego, który wpływa na procesy unaczynienia lub angiogenezy w celu badania pojedynczych populacji komórek lub systemów kohodowli. Około jednej do dwóch godzin przed rozpoczęciem eksperymentu podgrzej inkubator Microscope Stage Top do 37 stopni Celsjusza i ustaw dwutlenek węgla na 5%, a wilgotność na 85%Napełnij zbiornik wilgotności inkubatora, jeśli jest pusty. Umieść komorę żywej komórki na mikroskopie, a następnie umieść pustą komorę w jednej z dwóch otwartych pozycji w komorze żywej komórki.Napełnij szkiełko wodą destylowaną i ustaw dmuchawę wtórną na 39 do 42 stopni Celsjusza, aby podgrzać szkiełka od dołu i zminimalizować kondensację. Utrzymanie odpowiedniej temperatury i wilgotności w komorze obrazowania żywych komórek ma kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu. Dodaj drugi slajd jako pusty do momentu, gdy będzie można dodać slajd eksperymentalny.Następnie dodaj wodę do zbiorników otaczających studnie na drugim slajdzie, aby naśladować warunki panujące podczas eksperymentu z obrazowaniem. Aby załadować szkiełko komory doświadczalnej z matrycą membrany podstawnej, najpierw załaduj pipetę o pojemności 20 mikrolitrów zimną końcówką pipety o pojemności 20 mikrolitrów i za pomocą nożyczek odetnij około jednego centymetra od końca końcówki. Ustaw objętość pipety na nieco większą niż 10 mikrolitrów i powoli zasysaj matrycę do zmodyfikowanej końcówki pipety.Natychmiast umieść końcówkę pipety na środku jednego z gniazdek, delikatnie dotykając końcówki do dna studzienki i powoli naciśnij tłok, aby wypchnąć matrycę. Po dodaniu matrycy do wszystkich 15 dołków, dociśnij pokrywkę do końca na szkiełko. Dokładne i spójne pipetowanie objętości Matrigelu do każdego dołka ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości obrazów z kontrastem fazowym.Następnie umieść szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 do 60 minut obok 50-mililitrowej stożkowej nasadki rurki wypełnionej dwoma do trzech mililitrami PBS, aby zmniejszyć odwodnienie matrycy. Gdy matryca zestala się, usuń supernatant z hodowli komórek tworzących kolonie śródbłonka przez noc i umyj komórki siedmioma mililitrami PBS. Odessać PBS, umyć i odłączyć komórki od dwóch do trzech mililitrów trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do pięciu minut.Następnie ponownie zawieś zdysocjowane komórki w trzech mililitrach Endothelial Growth Medium-2, aby rozbić wszelkie grudki komórek i przenieść powstałą zawiesinę komórek do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Po ponownym zawieszeniu wszystkich próbek komórek tworzących kolonie śródbłonka, osadzaj komórki przez wirowanie i ponownie zawieś granulki w jednym do dwóch mililitrów świeżej pożywki do wzrostu śródbłonka. Policz liczbę żywotnych komórek w każdej próbce i dodaj wystarczającą ilość komórek tworzących kolonie śródbłonka do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra, aby umożliwić rozcieńczenie komórek do 1,4 razy 10 do czwartej komórki na 175 mikrolitrów średniego stężenia.Następnie wymieszaj każdą mieszankę wzorcową, delikatnie pipetując. Zdjąć pokrywkę szkiełka i nanieść na szkiełko 50 mikrolitrów każdej mieszanki wzorcowej na studzienkę w trzech egzemplarzach. Aby zobrazować komórki, zastąp puste szkiełko jednym szkiełkiem eksperymentalnym i dodaj wodę do zbiorników otaczających komórki na szkiełku.Przejdź przez każdą pozycję stage i upewnij się, że wybrano środek pierwszego dołka. Skoncentruj się na komórkach platerowanych w studzience i ustaw pozycję Z stołu montażowego. Gdy ustawienia są dokładne, wyłącz światła, aby rozpocząć eksperyment z obrazowaniem.Po zakończeniu obrazowania przeskaluj i wyeksportuj pliki stosu obrazów w oprogramowaniu Image Capture, zapisując obrazy jako pliki TIFF do analizy. Aby przeanalizować obrazy, przeciągnij plik Kinetic Analysis of Vasculogenesis z jego folderu na szary pasek u dołu okna oprogramowania, aby otworzyć oprogramowanie, a następnie kliknij przycisk Zapisz, aby dodać oprogramowanie do listy. Kliknij Plik i otwórz, aby wybrać plik obrazu do otwarcia, lub przeciągnij plik obrazu na szary pasek w oprogramowaniu.Kliknij opcję Obraz, Dostosuj i Jasność/Kontrast, aby otworzyć okno Jasność/Kontrast. Kliknij przycisk Resetuj w oknie Jasność/Kontrast, aby wyświetlić obraz. Następnie kliknij opcję Obraz, Typ i 8-bitowy, aby przekonwertować obrazy na 8-bitowe.Wybierz Narzędzia i Menedżer obszaru zainteresowania, a następnie użyj odpowiednio ukształtowanego narzędzia wyboru, aby utworzyć nowy obszar zainteresowania. Kliknij przycisk Dodaj, aby dodać kształt obszaru zainteresowania do okna Menedżer obszaru zainteresowania, a następnie kliknij etykietę Region zainteresowania w Menedżerze regionu zainteresowania, aby wyświetlić region na obrazie. W razie potrzeby dostosuj obszar zainteresowania.Gdy region jest na miejscu, kliknij Obraz, a następnie Przytnij, aby przyciąć obraz. Następnie otwórz menu Edycja i wybierz opcję Wyczyść na zewnątrz, aby usunąć dane obrazu poza obszarem zainteresowania dla każdego obrazu w stosie. Następnie otwórz menu Wtyczki i wybierz wtyczkę Analizuj sieć.Użyj strzałki listy rozwijanej w wyskakującym okienku, aby zmienić metodę progowania i kliknij OK, aby rozpocząć przetwarzanie oprogramowania. Pod koniec analizy otworzy się tabela danych i stos połączonych obrazów przedstawiających wersje Szkieletu i Maski. Kliknij opcję Plik i Zapisz jako, aby przenieść wartości liczbowe do arkusza kalkulacyjnego i zapisać arkusz kalkulacyjny zawierający nieprzetworzone wartości danych.Kliknij na połączony obraz szkieletu i maski i zapisz stos obrazów połączonej maski szkieletu oraz przycięty stos obrazów kontrastu fazowego jako pliki TIFF. Następnie kliknij okno Menedżer regionów zainteresowań, wybierz region zainteresowania używany do przycinania obrazów, a następnie kliknij Więcej i Zapisz, aby zapisać obszar zainteresowania do wykorzystania w przyszłości. Sieci komórkowe tworzące kolonie śródbłonka, zidentyfikowane za pomocą kinetycznej analizy waskulogenezy, są przedstawione obrazowo jako wersje szkieletu i maski, aby zilustrować struktury używane przez oprogramowanie do kwantyfikacji.Gdy jakość obrazów kontrastu fazowego jest wysoka i osiągnięty jest wystarczający kontrast, kinetyczna analiza waskulogenezy dokładnie zidentyfikuje sieci komórkowe tworzące kolonie śródbłonka, na co wskazują podobieństwa obserwowane między obrazem kontrastu fazowego a kinetycznymi wersjami szkieletu i maski wygenerowanymi przez analizę kinetyczną waskulogenezy. Jeśli obrazy z kontrastem fazowym nie mają wysokiego kontrastu lub jeśli występują artefakty obrazowania, takie jak siatka, dokładność wykrywania sieci jest zmniejszona, a wyniki stają się niejednoznaczne. Jednak różne metody progowania, takie jak Średnia i Otsu, pokazane tutaj, można wybrać przed analizą w menu rozwijanym oprogramowania, aby uwzględnić różnice w jakości obrazu.Wykorzystanie analizy kinetycznej waskulogenezy w celu określenia, czy komórki tworzące kolonie śródbłonka narażone na cukrzycę ciążową wykazują zmienioną kinetykę tworzenia sieci, ujawnia niejednorodnie zmienione tworzenie struktury sieci w hodowlach cukrzycy ciążowej w porównaniu z kulturami komórek tworzących kolonie śródbłonka z niepowikłanej ciąży. Rzeczywiście, nieskomplikowane próbki ciążowe zazwyczaj tworzą większą liczbę zamkniętych sieci w porównaniu z próbkami cukrzycy ciążowej. Wszystkie próbki komórek tworzących kolonie śródbłonka wykazują jednak ogólny dwufazowy wzorzec tworzenia sieci, chociaż tempo tworzenia i maksymalna liczba osiągniętych sieci różnią się w zależności od próbki.Zgodnie z tą procedurą, wartości danych wygenerowane przez analizę kinetyczną waskulogenezy można przedstawić na wykresie i przeanalizować w celu określenia, czy struktury sieciowe utworzone przez różne próbki różnią się statystycznie, a jeśli tak, to w jakich punktach czasowych. Analiza kinetyczna waskulogenezy umożliwia efektywne przetwarzanie eksperymentów poklatkowych obejmujących dużą liczbę obrazów. Po opanowaniu akwizycji, przetwarzania końcowego i analizy obrazu można zakończyć w ciągu dwóch dni, jeśli wszystkie systemy działają prawidłowo.

kinetic-analysis-vasculogenesis-quantifies-dynamics-vasculogenesis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Mysia siatkówka noworodka dostarcza dobrze scharakteryzowanego fizjologicznego modelu angiogenezy, który pozwala na badanie ról różnych genów lub leków modulujących angiogenezę w kontekście in vivo. Barwienie immunofluorescencyjne w celu dokładnej wizualizacji splotu naczyniowego ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego typu badań.

Barwienie immunofluorescencyjne siatkówki noworodka myszy w celu zbadania angiogenezy in vivo

Protokół opisuje test mikrokieszeni rogówki, tak jak został on opracowany u myszy.

Test mikrokieszeni rogówki: model angiogenezy w oku myszy

Opisujemy mikrochirurgiczne podejście do generowania pętli tętniczo-żylnej (AV) jako model do analizy unaczynienia in vivo w izolowanym i dobrze scharakteryzowanym środowisku. Model ten jest nie tylko przydatny do badania angiogenezy, ale jest również optymalnie przystosowany do inżynierii osiowo unaczynionych i przeszczepialnych tkanek.

Pętla tętniczo-żylna (AV) w małym modelu zwierzęcym do badania angiogenezy i inżynierii tkanek unaczynionych

Ten protokół demonstruje metodę opartą na fluorescencji do wizualizacji układu naczyniowego i ilościowego określenia jego złożoności u Xenopus tropicalis. Naczynia krwionośne można obrazować kilka minut po wstrzyknięciu barwnika fluorescencyjnego do bijącego serca zarodka po manipulacjach genetycznych i/lub farmakologicznych w celu zbadania rozwoju układu sercowo-naczyniowego in vivo.

Wizualizacja i analiza ilościowa angiogenezy embrionalnej u Xenopus tropicalis

Ten artykuł przedstawia kompleksową procedurę oceny in vitro, czy klasyczna angiogeneza nowotworów występuje w naczyniakach zarodkowych (HBs) i jaka jest jej rola w HBs. Wyniki podkreślają złożoność neowaskularyzacji HB i sugerują, że ta powszechna forma angiogenezy jest jedynie mechanizmem uzupełniającym w neowaskularyzacji HB.

Kompleksowa procedura oceny wydajności in vitro przypuszczalnego neowaskularyzmu naczyniaka zarodkowego przy użyciu testu kiełkowania sferoidalnego

Progenitorzy śródbłonka pochodzący z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC-EPs) mają potencjał, aby zrewolucjonizować leczenie chorób sercowo-naczyniowych i umożliwić tworzenie bardziej wiernych modeli chorób sercowo-naczyniowych. W artykule opisano enkapsulację iPSC-EP w trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach kolagenu oraz analizę ilościową potencjału naczyniowego tych komórek.

Model 3D in vitro i potok obliczeniowy do ilościowego określenia potencjału naczyniopochodnego progenitorów śródbłonka pochodzących z iPSC

Tutaj dostarczamy chip mikroprzepływowy i automatycznie sterowany, wysoce wydajny system mikroprzepływowy krążenia, który podsumowuje początkowe mikrośrodowisko neowaskularyzacji, umożliwiając stymulację komórek śródbłonka (EC) przez wysokie naprężenie ścinające światło, fizjologiczny poziom przepływu przezśródbłonkowego i rozkład różnych czynników wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) jednocześnie.

Model mikroprzepływowy naśladujący początkowe zdarzenie neowaskularyzacji

Ten test wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała embrionalne hodowane w żelu 3D-collagen do analizy procesów biologicznych, które kontrolują angiogenezę kiełkowania in vitro. Technika ta może być stosowana do testowania leków, modelowania chorób oraz do badania określonych genów w kontekście delecji, które są śmiertelne dla zarodka.

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

Przedstawiona tutaj metoda może ocenić wpływ odczynników na angiogenezę lub przepuszczalność naczyń in vivo bez barwienia. Metoda wykorzystuje wstrzyknięcie dekstranu-FITC przez żyłę ogonową w celu uwidocznienia naczyń nowych lub nieszczelności naczyniowej.

Zmodyfikowany test in vivo Matrix Gel Plug Test do badań angiogenezy

To badanie przedstawia dwuwymiarowy (2D) test migracji ran drapanych i trójwymiarowy (3D) test kiełkowania sferoidów, wraz z odpowiednimi metodami analizy, w tym ekstrakcją RNA i immunocytochemią, jako odpowiednie testy do badania angiogenezy in vitro.

Badanie angiogenezy na poziomie funkcjonalnym i molekularnym poprzez wykorzystanie testu migracji ran drapanych i testu kiełkowania sferoidalnego

Angiogeneza kiełkowania, fundamentalna dla rozwoju i choroby, obejmuje złożone procesy molekularne i mechaniczne. Przedstawiamy wszechstronny model 2,5D ex vivo, który analizuje kiełkowanie komórek z tętnic szyjnych świń, ujawniając angiogenezę zależną od sztywności i wyraźną mechanikę komórek lidera-podążacza. Model ten pomaga w rozwijaniu strategii inżynierii tkankowej i podejść do terapii nowotworów.

Model 2.5D do mechanicznej charakterystyki ex vivo angiogenezy kiełkowania w żywej tkance

Poznaj metodę kinetycznej analizy waskulogenezy in vitro z wykorzystaniem mikroskopii kontrastu fazowego i dedykowanego oprogramowania. Technika umożliwia ilościową ocenę potencjału waskulogennego różnych typów komórek.

Analiza kinetyczna waskulogenezy określa ilościowo dynamikę waskulogenezy i angiogenezy in vitro

Przeglądaj więcej filmów