Analiza kinetyczna waskulogenezy określa ilościowo dynamikę waskulogenezy i angiogenezy in vitro

Ogólnym celem tej metody eksperymentalnej jest wizualizacja i ilościowe określenie dynamicznego procesu waskulogenezy w czasie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie angiogenezy i waskulogenezy dotyczące szybkości tworzenia naczyń i różnic między utworzonymi wzorcami strukturalnymi sieci. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona ilościowe określenie dużej liczby punktów czasowych waskulogenezy, dając możliwość oceny kinetyki procesu naczyniopochodnego.

Metoda ta może być stosowana do dowolnej populacji komórek lub stanu patologicznego, który wpływa na procesy unaczynienia lub angiogenezy w celu badania pojedynczych populacji komórek lub systemów kohodowli. Około jednej do dwóch godzin przed rozpoczęciem eksperymentu podgrzej inkubator Microscope Stage Top do 37 stopni Celsjusza i ustaw dwutlenek węgla na 5%, a wilgotność na 85%Napełnij zbiornik wilgotności inkubatora, jeśli jest pusty. Umieść komorę żywej komórki na mikroskopie, a następnie umieść pustą komorę w jednej z dwóch otwartych pozycji w komorze żywej komórki.

Napełnij szkiełko wodą destylowaną i ustaw dmuchawę wtórną na 39 do 42 stopni Celsjusza, aby podgrzać szkiełka od dołu i zminimalizować kondensację. Utrzymanie odpowiedniej temperatury i wilgotności w komorze obrazowania żywych komórek ma kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu. Dodaj drugi slajd jako pusty do momentu, gdy będzie można dodać slajd eksperymentalny.

Następnie dodaj wodę do zbiorników otaczających studnie na drugim slajdzie, aby naśladować warunki panujące podczas eksperymentu z obrazowaniem. Aby załadować szkiełko komory doświadczalnej z matrycą membrany podstawnej, najpierw załaduj pipetę o pojemności 20 mikrolitrów zimną końcówką pipety o pojemności 20 mikrolitrów i za pomocą nożyczek odetnij około jednego centymetra od końca końcówki. Ustaw objętość pipety na nieco większą niż 10 mikrolitrów i powoli zasysaj matrycę do zmodyfikowanej końcówki pipety.

Natychmiast umieść końcówkę pipety na środku jednego z gniazdek, delikatnie dotykając końcówki do dna studzienki i powoli naciśnij tłok, aby wypchnąć matrycę. Po dodaniu matrycy do wszystkich 15 dołków, dociśnij pokrywkę do końca na szkiełko. Dokładne i spójne pipetowanie objętości Matrigelu do każdego dołka ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości obrazów z kontrastem fazowym.

Następnie umieść szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 do 60 minut obok 50-mililitrowej stożkowej nasadki rurki wypełnionej dwoma do trzech mililitrami PBS, aby zmniejszyć odwodnienie matrycy. Gdy matryca zestala się, usuń supernatant z hodowli komórek tworzących kolonie śródbłonka przez noc i umyj komórki siedmioma mililitrami PBS. Odessać PBS, umyć i odłączyć komórki od dwóch do trzech mililitrów trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do pięciu minut.

Następnie ponownie zawieś zdysocjowane komórki w trzech mililitrach Endothelial Growth Medium-2, aby rozbić wszelkie grudki komórek i przenieść powstałą zawiesinę komórek do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Po ponownym zawieszeniu wszystkich próbek komórek tworzących kolonie śródbłonka, osadzaj komórki przez wirowanie i ponownie zawieś granulki w jednym do dwóch mililitrów świeżej pożywki do wzrostu śródbłonka. Policz liczbę żywotnych komórek w każdej próbce i dodaj wystarczającą ilość komórek tworzących kolonie śródbłonka do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra, aby umożliwić rozcieńczenie komórek do 1,4 razy 10 do czwartej komórki na 175 mikrolitrów średniego stężenia.

Następnie wymieszaj każdą mieszankę wzorcową, delikatnie pipetując. Zdjąć pokrywkę szkiełka i nanieść na szkiełko 50 mikrolitrów każdej mieszanki wzorcowej na studzienkę w trzech egzemplarzach. Aby zobrazować komórki, zastąp puste szkiełko jednym szkiełkiem eksperymentalnym i dodaj wodę do zbiorników otaczających komórki na szkiełku.

Przejdź przez każdą pozycję stage i upewnij się, że wybrano środek pierwszego dołka. Skoncentruj się na komórkach platerowanych w studzience i ustaw pozycję Z stołu montażowego. Gdy ustawienia są dokładne, wyłącz światła, aby rozpocząć eksperyment z obrazowaniem.

Po zakończeniu obrazowania przeskaluj i wyeksportuj pliki stosu obrazów w oprogramowaniu Image Capture, zapisując obrazy jako pliki TIFF do analizy. Aby przeanalizować obrazy, przeciągnij plik Kinetic Analysis of Vasculogenesis z jego folderu na szary pasek u dołu okna oprogramowania, aby otworzyć oprogramowanie, a następnie kliknij przycisk Zapisz, aby dodać oprogramowanie do listy. Kliknij Plik i otwórz, aby wybrać plik obrazu do otwarcia, lub przeciągnij plik obrazu na szary pasek w oprogramowaniu.

Kliknij opcję Obraz, Dostosuj i Jasność/Kontrast, aby otworzyć okno Jasność/Kontrast. Kliknij przycisk Resetuj w oknie Jasność/Kontrast, aby wyświetlić obraz. Następnie kliknij opcję Obraz, Typ i 8-bitowy, aby przekonwertować obrazy na 8-bitowe.

Wybierz Narzędzia i Menedżer obszaru zainteresowania, a następnie użyj odpowiednio ukształtowanego narzędzia wyboru, aby utworzyć nowy obszar zainteresowania. Kliknij przycisk Dodaj, aby dodać kształt obszaru zainteresowania do okna Menedżer obszaru zainteresowania, a następnie kliknij etykietę Region zainteresowania w Menedżerze regionu zainteresowania, aby wyświetlić region na obrazie. W razie potrzeby dostosuj obszar zainteresowania.

Gdy region jest na miejscu, kliknij Obraz, a następnie Przytnij, aby przyciąć obraz. Następnie otwórz menu Edycja i wybierz opcję Wyczyść na zewnątrz, aby usunąć dane obrazu poza obszarem zainteresowania dla każdego obrazu w stosie. Następnie otwórz menu Wtyczki i wybierz wtyczkę Analizuj sieć.

Użyj strzałki listy rozwijanej w wyskakującym okienku, aby zmienić metodę progowania i kliknij OK, aby rozpocząć przetwarzanie oprogramowania. Pod koniec analizy otworzy się tabela danych i stos połączonych obrazów przedstawiających wersje Szkieletu i Maski. Kliknij opcję Plik i Zapisz jako, aby przenieść wartości liczbowe do arkusza kalkulacyjnego i zapisać arkusz kalkulacyjny zawierający nieprzetworzone wartości danych.

Kliknij na połączony obraz szkieletu i maski i zapisz stos obrazów połączonej maski szkieletu oraz przycięty stos obrazów kontrastu fazowego jako pliki TIFF. Następnie kliknij okno Menedżer regionów zainteresowań, wybierz region zainteresowania używany do przycinania obrazów, a następnie kliknij Więcej i Zapisz, aby zapisać obszar zainteresowania do wykorzystania w przyszłości. Sieci komórkowe tworzące kolonie śródbłonka, zidentyfikowane za pomocą kinetycznej analizy waskulogenezy, są przedstawione obrazowo jako wersje szkieletu i maski, aby zilustrować struktury używane przez oprogramowanie do kwantyfikacji.

Gdy jakość obrazów kontrastu fazowego jest wysoka i osiągnięty jest wystarczający kontrast, kinetyczna analiza waskulogenezy dokładnie zidentyfikuje sieci komórkowe tworzące kolonie śródbłonka, na co wskazują podobieństwa obserwowane między obrazem kontrastu fazowego a kinetycznymi wersjami szkieletu i maski wygenerowanymi przez analizę kinetyczną waskulogenezy. Jeśli obrazy z kontrastem fazowym nie mają wysokiego kontrastu lub jeśli występują artefakty obrazowania, takie jak siatka, dokładność wykrywania sieci jest zmniejszona, a wyniki stają się niejednoznaczne. Jednak różne metody progowania, takie jak Średnia i Otsu, pokazane tutaj, można wybrać przed analizą w menu rozwijanym oprogramowania, aby uwzględnić różnice w jakości obrazu.

Wykorzystanie analizy kinetycznej waskulogenezy w celu określenia, czy komórki tworzące kolonie śródbłonka narażone na cukrzycę ciążową wykazują zmienioną kinetykę tworzenia sieci, ujawnia niejednorodnie zmienione tworzenie struktury sieci w hodowlach cukrzycy ciążowej w porównaniu z kulturami komórek tworzących kolonie śródbłonka z niepowikłanej ciąży. Rzeczywiście, nieskomplikowane próbki ciążowe zazwyczaj tworzą większą liczbę zamkniętych sieci w porównaniu z próbkami cukrzycy ciążowej. Wszystkie próbki komórek tworzących kolonie śródbłonka wykazują jednak ogólny dwufazowy wzorzec tworzenia sieci, chociaż tempo tworzenia i maksymalna liczba osiągniętych sieci różnią się w zależności od próbki.

Zgodnie z tą procedurą, wartości danych wygenerowane przez analizę kinetyczną waskulogenezy można przedstawić na wykresie i przeanalizować w celu określenia, czy struktury sieciowe utworzone przez różne próbki różnią się statystycznie, a jeśli tak, to w jakich punktach czasowych. Analiza kinetyczna waskulogenezy umożliwia efektywne przetwarzanie eksperymentów poklatkowych obejmujących dużą liczbę obrazów. Po opanowaniu akwizycji, przetwarzania końcowego i analizy obrazu można zakończyć w ciągu dwóch dni, jeśli wszystkie systemy działają prawidłowo.