Analiza kinetyczna waskulogenezy określa ilościowo dynamikę waskulogenezy i angiogenezy in vitro
31 stycznia 2018
Tutaj prezentujemy protokół obrazowania poklatkowego i analizy unaczynienia in vitro za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym w połączeniu z oprogramowaniem open source, Analiza Kinetyczna Waskulogenezy. Protokół ten można zastosować do ilościowej oceny potencjału naczyniowego wielu typów komórek lub warunków eksperymentalnych, które modelują chorobę naczyniową.
Ogólnym celem tej metody eksperymentalnej jest wizualizacja i ilościowe określenie dynamicznego procesu waskulogenezy w czasie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie angiogenezy i waskulogenezy dotyczące szybkości tworzenia naczyń i różnic między utworzonymi wzorcami strukturalnymi sieci. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona ilościowe określenie dużej liczby punktów czasowych waskulogenezy, dając możliwość oceny kinetyki procesu naczyniopochodnego.
Metoda ta może być stosowana do dowolnej populacji komórek lub stanu patologicznego, który wpływa na procesy unaczynienia lub angiogenezy w celu badania pojedynczych populacji komórek lub systemów kohodowli. Około jednej do dwóch godzin przed rozpoczęciem eksperymentu podgrzej inkubator Microscope Stage Top do 37 stopni Celsjusza i ustaw dwutlenek węgla na 5%, a wilgotność na 85%Napełnij zbiornik wilgotności inkubatora, jeśli jest pusty. Umieść komorę żywej komórki na mikroskopie, a następnie umieść pustą komorę w jednej z dwóch otwartych pozycji w komorze żywej komórki.
Napełnij szkiełko wodą destylowaną i ustaw dmuchawę wtórną na 39 do 42 stopni Celsjusza, aby podgrzać szkiełka od dołu i zminimalizować kondensację. Utrzymanie odpowiedniej temperatury i wilgotności w komorze obrazowania żywych komórek ma kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu. Dodaj drugi slajd jako pusty do momentu, gdy będzie można dodać slajd eksperymentalny.
Następnie dodaj wodę do zbiorników otaczających studnie na drugim slajdzie, aby naśladować warunki panujące podczas eksperymentu z obrazowaniem. Aby załadować szkiełko komory doświadczalnej z matrycą membrany podstawnej, najpierw załaduj pipetę o pojemności 20 mikrolitrów zimną końcówką pipety o pojemności 20 mikrolitrów i za pomocą nożyczek odetnij około jednego centymetra od końca końcówki. Ustaw objętość pipety na nieco większą niż 10 mikrolitrów i powoli zasysaj matrycę do zmodyfikowanej końcówki pipety.
Natychmiast umieść końcówkę pipety na środku jednego z gniazdek, delikatnie dotykając końcówki do dna studzienki i powoli naciśnij tłok, aby wypchnąć matrycę. Po dodaniu matrycy do wszystkich 15 dołków, dociśnij pokrywkę do końca na szkiełko. Dokładne i spójne pipetowanie objętości Matrigelu do każdego dołka ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości obrazów z kontrastem fazowym.
Następnie umieść szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 do 60 minut obok 50-mililitrowej stożkowej nasadki rurki wypełnionej dwoma do trzech mililitrami PBS, aby zmniejszyć odwodnienie matrycy. Gdy matryca zestala się, usuń supernatant z hodowli komórek tworzących kolonie śródbłonka przez noc i umyj komórki siedmioma mililitrami PBS. Odessać PBS, umyć i odłączyć komórki od dwóch do trzech mililitrów trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do pięciu minut.
Następnie ponownie zawieś zdysocjowane komórki w trzech mililitrach Endothelial Growth Medium-2, aby rozbić wszelkie grudki komórek i przenieść powstałą zawiesinę komórek do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Po ponownym zawieszeniu wszystkich próbek komórek tworzących kolonie śródbłonka, osadzaj komórki przez wirowanie i ponownie zawieś granulki w jednym do dwóch mililitrów świeżej pożywki do wzrostu śródbłonka. Policz liczbę żywotnych komórek w każdej próbce i dodaj wystarczającą ilość komórek tworzących kolonie śródbłonka do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra, aby umożliwić rozcieńczenie komórek do 1,4 razy 10 do czwartej komórki na 175 mikrolitrów średniego stężenia.
Następnie wymieszaj każdą mieszankę wzorcową, delikatnie pipetując. Zdjąć pokrywkę szkiełka i nanieść na szkiełko 50 mikrolitrów każdej mieszanki wzorcowej na studzienkę w trzech egzemplarzach. Aby zobrazować komórki, zastąp puste szkiełko jednym szkiełkiem eksperymentalnym i dodaj wodę do zbiorników otaczających komórki na szkiełku.
Przejdź przez każdą pozycję stage i upewnij się, że wybrano środek pierwszego dołka. Skoncentruj się na komórkach platerowanych w studzience i ustaw pozycję Z stołu montażowego. Gdy ustawienia są dokładne, wyłącz światła, aby rozpocząć eksperyment z obrazowaniem.
Po zakończeniu obrazowania przeskaluj i wyeksportuj pliki stosu obrazów w oprogramowaniu Image Capture, zapisując obrazy jako pliki TIFF do analizy. Aby przeanalizować obrazy, przeciągnij plik Kinetic Analysis of Vasculogenesis z jego folderu na szary pasek u dołu okna oprogramowania, aby otworzyć oprogramowanie, a następnie kliknij przycisk Zapisz, aby dodać oprogramowanie do listy. Kliknij Plik i otwórz, aby wybrać plik obrazu do otwarcia, lub przeciągnij plik obrazu na szary pasek w oprogramowaniu.
Kliknij opcję Obraz, Dostosuj i Jasność/Kontrast, aby otworzyć okno Jasność/Kontrast. Kliknij przycisk Resetuj w oknie Jasność/Kontrast, aby wyświetlić obraz. Następnie kliknij opcję Obraz, Typ i 8-bitowy, aby przekonwertować obrazy na 8-bitowe.
Wybierz Narzędzia i Menedżer obszaru zainteresowania, a następnie użyj odpowiednio ukształtowanego narzędzia wyboru, aby utworzyć nowy obszar zainteresowania. Kliknij przycisk Dodaj, aby dodać kształt obszaru zainteresowania do okna Menedżer obszaru zainteresowania, a następnie kliknij etykietę Region zainteresowania w Menedżerze regionu zainteresowania, aby wyświetlić region na obrazie. W razie potrzeby dostosuj obszar zainteresowania.
Gdy region jest na miejscu, kliknij Obraz, a następnie Przytnij, aby przyciąć obraz. Następnie otwórz menu Edycja i wybierz opcję Wyczyść na zewnątrz, aby usunąć dane obrazu poza obszarem zainteresowania dla każdego obrazu w stosie. Następnie otwórz menu Wtyczki i wybierz wtyczkę Analizuj sieć.
Użyj strzałki listy rozwijanej w wyskakującym okienku, aby zmienić metodę progowania i kliknij OK, aby rozpocząć przetwarzanie oprogramowania. Pod koniec analizy otworzy się tabela danych i stos połączonych obrazów przedstawiających wersje Szkieletu i Maski. Kliknij opcję Plik i Zapisz jako, aby przenieść wartości liczbowe do arkusza kalkulacyjnego i zapisać arkusz kalkulacyjny zawierający nieprzetworzone wartości danych.
Kliknij na połączony obraz szkieletu i maski i zapisz stos obrazów połączonej maski szkieletu oraz przycięty stos obrazów kontrastu fazowego jako pliki TIFF. Następnie kliknij okno Menedżer regionów zainteresowań, wybierz region zainteresowania używany do przycinania obrazów, a następnie kliknij Więcej i Zapisz, aby zapisać obszar zainteresowania do wykorzystania w przyszłości. Sieci komórkowe tworzące kolonie śródbłonka, zidentyfikowane za pomocą kinetycznej analizy waskulogenezy, są przedstawione obrazowo jako wersje szkieletu i maski, aby zilustrować struktury używane przez oprogramowanie do kwantyfikacji.
Gdy jakość obrazów kontrastu fazowego jest wysoka i osiągnięty jest wystarczający kontrast, kinetyczna analiza waskulogenezy dokładnie zidentyfikuje sieci komórkowe tworzące kolonie śródbłonka, na co wskazują podobieństwa obserwowane między obrazem kontrastu fazowego a kinetycznymi wersjami szkieletu i maski wygenerowanymi przez analizę kinetyczną waskulogenezy. Jeśli obrazy z kontrastem fazowym nie mają wysokiego kontrastu lub jeśli występują artefakty obrazowania, takie jak siatka, dokładność wykrywania sieci jest zmniejszona, a wyniki stają się niejednoznaczne. Jednak różne metody progowania, takie jak Średnia i Otsu, pokazane tutaj, można wybrać przed analizą w menu rozwijanym oprogramowania, aby uwzględnić różnice w jakości obrazu.
Wykorzystanie analizy kinetycznej waskulogenezy w celu określenia, czy komórki tworzące kolonie śródbłonka narażone na cukrzycę ciążową wykazują zmienioną kinetykę tworzenia sieci, ujawnia niejednorodnie zmienione tworzenie struktury sieci w hodowlach cukrzycy ciążowej w porównaniu z kulturami komórek tworzących kolonie śródbłonka z niepowikłanej ciąży. Rzeczywiście, nieskomplikowane próbki ciążowe zazwyczaj tworzą większą liczbę zamkniętych sieci w porównaniu z próbkami cukrzycy ciążowej. Wszystkie próbki komórek tworzących kolonie śródbłonka wykazują jednak ogólny dwufazowy wzorzec tworzenia sieci, chociaż tempo tworzenia i maksymalna liczba osiągniętych sieci różnią się w zależności od próbki.
Zgodnie z tą procedurą, wartości danych wygenerowane przez analizę kinetyczną waskulogenezy można przedstawić na wykresie i przeanalizować w celu określenia, czy struktury sieciowe utworzone przez różne próbki różnią się statystycznie, a jeśli tak, to w jakich punktach czasowych. Analiza kinetyczna waskulogenezy umożliwia efektywne przetwarzanie eksperymentów poklatkowych obejmujących dużą liczbę obrazów. Po opanowaniu akwizycji, przetwarzania końcowego i analizy obrazu można zakończyć w ciągu dwóch dni, jeśli wszystkie systemy działają prawidłowo.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół obrazowania time-lapse oraz analizy waskulogenezy in vitro z wykorzystaniem mikroskopii fazowo-kontrastowej oraz oprogramowania Kinetic Analysis of Vasculogenesis. Metoda ta umożliwia ilościową ocenę potencjału waskulogennego różnych typów komórek oraz warunków eksperymentalnych związanych z chorobami naczyniowymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Waskulogeneza
- Angiogeneza
- Techniki hodowli komórkowych
Wstęp
- Zrozumienie waskulogenezy jest kluczowe dla uzyskania wiedzy na temat chorób naczyniowych.
- Obrazowanie time-lapse zapewnia dynamiczną wizualizację tworzenia naczyń.
- Metodę tę można zastosować do różnych populacji komórek i warunków.
- Analiza ilościowa pogłębia zrozumienie procesu tworzenia sieci naczyniowej.
Cel badania
- W celu wizualizacji i kwantyfikacji procesu waskulogenezy w czasie.
- W celu oceny kinetyki tworzenia naczyń w różnych układach eksperymentalnych.
- W celu zbadania wzorców strukturalnych utworzonych sieci naczyniowych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie komory do obrazowania żywych komórek z kontrolowaną temperaturą i wilgotnością.
- Wykorzystanie Matrigelu do stworzenia macierzy dla hodowli komórkowych.
- Obrazowanie time-lapse endotelialnych komórek formujących kolonie.
- Analiza obrazów przy użyciu oprogramowania Kinetic Analysis of Vasculogenesis.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja procesów waskulogennych w czasie.
- Ilościowe dane dotyczące tempa tworzenia naczyń oraz wzorców strukturalnych.
- Identyfikacja różnic w potencjale waskulogenicznym pomiędzy typami komórek.
- Generowanie tabel danych i obrazów złożonych do dalszej analizy.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę badania waskulogenezy.
- Analiza ilościowa może prowadzić do lepszego zrozumienia chorób naczyniowych.
- Metodę tę można dostosować do różnych warunków eksperymentalnych i typów komórek.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe określenie kinetyki waskulogenezy dostarcza prognostycznego odczytu funkcjonalności endotelialnych komórek progenitorowych, umożliwiając mechanistyczną redukcję ryzyka w modelach chorób naczyniowych. Podejście to wspiera walidację celów terapeutycznych poprzez powiązanie dynamiki tworzenia sieci z warunkami patofizjologicznymi, takimi jak cukrzyca u matki. Metoda ta usprawnia opracowywanie testów procesów rozgałęziania, poprawiając ciągłość translacyjną od etapu odkryć do oceny przedklinicznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez pomiar tempa tworzenia i stabilizacji sieci w komórkach progenitorowych śródbłonka.
- Wartość operacyjna: Umożliwia redukcję ryzyka biologicznego dzięki ilościowemu porównaniu potencjału waskulogennego w różnych stanach chorobowych.
- Wartość naukowa: Zwiększa wiarygodność prognostyczną poprzez identyfikację zmienionej kinetyki w płodowych ECFCs wystawionych na działanie cukrzycy w porównaniu z grupą kontrolną.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych układów biologicznych do dalszych etapów analizy poprzez standaryzowane wysiewanie na matrycę błony podstawnej oraz obrazowanie time-lapse.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie standaryzacji i powtarzalności testów dzięki zautomatyzowanej segmentacji i szkieletyzacji struktur sieciowych.
- Wartość naukowa: Wykazanie gotowości do screeningu poprzez wyznaczenie dziesięciu parametrów ilościowych (dziewięciu mierzonych i jednego obliczonego) do analizy sieci.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Omawia istotność choroby poprzez zastosowanie protokołu do płodowych ECFC z ciąż powikłanych cukrzycą.
- Wartość operacyjna: Opisuje ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, umożliwiając podłużną ocenę dynamiki waskulogennej.
- Wartość naukowa: Skupia się na wartości predykcyjnego ograniczania ryzyka poprzez identyfikację dwufazowych wzorców tworzenia sieci oraz zmienionej maksymalnej wydajności tworzenia sieci w modelach chorób.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesów odkrywczych – od testowania hipotez po identyfikację wiodących związków – dostarczając dynamicznych, ilościowych odczytów waskulogenezy, które stanowią podstawę do ocen mechanistycznych i fenotypowych.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia, w jaki sposób metoda ta wspiera weryfikację hipotez, wyjaśnianie szlaków sygnałowych oraz ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez analizę kinetyki tworzenia sieci w ciągu 15 godzin.
- Przesiewanie: Opisuje gotowość testu, powtarzalność oraz wyniki ilościowe uzyskane dzięki obrazowaniu w fazowym kontraście w trybie time-lapse oraz parametrom pochodnym z KAV, takim jak sieci zamknięte, całkowita długość odgałęzień i stosunek odgałęzień do węzłów.
- Analityka: Wskazuje pomiary, odczyty i wyniki statystyczne, które umożliwiają porównanie struktur sieci w różnych warunkach i punktach czasowych.
- Badania translacyjne: Łączy tę metodę z ciągłością badań przedklinicznych, wykazując zmienioną waskulogenezę w ECFC poddanych działaniu czynników cukrzycowych, co wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektów w oparciu o ocenę ryzyka.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako powtarzalną możliwość oceny waskulogenezy i innych procesów rozgałęziania w różnych typach komórek i stanach chorobowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w procesie tworzenia sieci naczyniowej.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność oceny waskulogenezy w formatach wielodobojowych oraz w eksperymentach time-lapse.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje go/no-go, efektywność kapitałowa i zmniejszone ryzyko biologiczne w późnych etapach dzięki wczesnemu wykrywaniu dysfunkcyjnych fenotypów waskulogennych.
- Wpływ na portfolio: Decyzje o priorytetyzacji i rozwoju dostosowane do ryzyka, oparte na ilościowej kinetyce tworzenia sieci oraz parametrach strukturalnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza naukowa z zakresu hodowli komórkowych, obrazowania żywych komórek oraz obsługi oprogramowania do analizy obrazu.
- Konieczność zapewnienia instrumentacji i infrastruktury analitycznej, w tym mikroskopu w kontraście fazowym, komory do obrazowania żywych komórek z kontrolą temperatury i wilgotności oraz oprogramowania Kinetic Analysis of Vasculogenesis.
- Wymogi standaryzacji między zespołami w zakresie przygotowywania płytek z macierzą, gęstości siania komórek oraz wyboru metody progowania (np. Mean lub Otsu) w celu zapewnienia spójnej detekcji sieci.
- Kwestie adaptacji w różnych systemach modelowych, w tym zróżnicowane źródła komórek progenitorowych śródbłonka oraz składy macierzy zewnątrzkomórkowej.
- Ograniczenia praktyczne opisane w materiałach źródłowych: dokładność detekcji sieci spada przy niskim kontraście obrazu lub występowaniu artefaktów obrazowania, takich jak prążkowanie, co wymaga kontroli jakości obrazów w kontraście fazowym.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:59
Microscope Preparation and Endothelial Colony Forming Cell (ECFC) Matrix Plating
4:46
Image Acquisition and Processing and Kinetic Analysis of Vasculogenesis (KAV)
8:12
Results: Representative Kinetic Analysis of Vasculogenesis
10:22
Conclusion
