Name: Kompleksowa procedura oceny wydajności in vitro przypuszczalnego neowaskularyzmu naczyniaka zarodkowego przy użyciu testu kiełkowania sferoidalnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Poznaj metodę oceny neowaskularyzacji naczyniaka zarodkowego za pomocą testu kiełkowania sferoidalnego in vitro. Technika ta pozwala badać klasyczną angiogenezę nowotworową i jej znaczenie dla terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Szanghajskiego Komitetu Nauki i Technologii (15411951800, 15410723200). Autorzy pragną podziękować prof. YuMei Wen i prof. Chao Zhao z Wydziału Mikroorganizmów Chorobotwórczych Uniwersytetu Fudan za pomoc techniczną.

Ta metoda została wykonana zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi i przepisami Komisji Etyki Badań Szpitala Huashan Uniwersytetu Fudan. Na każdym etapie przestrzegano odpowiednich standardowych środków bezpieczeństwa. Aby zapoznać się ze schematyczną prezentacją, zapoznaj się z rysunkiem 1.
1. Hodowla komórkowa i konstrukt plazmidu
<ol>
	<li>Rutynowo utrzymuj ludzką komórkę śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 jednostkami/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny w wilgotnym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Trawi plazmid PLKO.1 z ApaI i EcoRI do syntezy fragmentu shRNA. Upewnij się, że sekwencja oligonukleotydowa wektora shRNA VHL to CCGGGATCTGGAAGACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTCTCTCAGATCTTTTTG14.</li>
	<li>Następnie zmieszać układ 20 μΜ z 5 μL oligonugolituzy, 5 μl odwróconego oligo, 5 μL 10x buforu NEB i 35 μL ddH2O razem (całkowita objętość wynosi 50 μL). Podgrzewać mieszaninę w temperaturze 98 °C przez 4 minuty i powoli schładzać do temperatury pokojowej w ciągu kilku godzin.</li>
	<li>Związać wyżarzone oligonukleocyty i plazmid PLKO.1 razem z ligazą T4 w temperaturze 4 °C przez noc. 16 godzin później dodać 5 μl mieszanki ligacyjnej do 25 μl kompetentnych komórek DH5α. Następnie należy przeprowadzić badania przesiewowe pomyślnie podwiązanych plazmidów i zweryfikować wstawiony fragment za pomocą sekwencjonowania.</li>
</ol>
2. Pakiet lentiwirusa i infekcja
<ol>
	<li>W sumie wymieszaj 10 μg wektora PLKO.1-shVHL lub PLKO.1-shScramble, 7,5 μg plazmidu pakującego psPAX2 i 2,5 μg plazmidu otoczkowego pMD2.G w 500 μl pożywki DMEM bez płodowej surowicy bydlęcej (FBS) przez 25 min.</li>
	<li>Dodać 7 mLDMEM bez FBS do roztworu przygotowanego powyżej.</li>
	<li>Hodowla komórek 293FT w DMEM bez FBS w szalkach do hodowli tkankowych o średnicy 10 cm. Upewnij się, że liczba komórek 293FT wynosi 1 x 107 za pomocą licznika komórek.</li>
	<li>Dodać 1 ml przygotowanego powyżej roztworu do pożywki z komórek 293FT w celu transfekcji. 
	nuta: Linia komórkowa 293FT wywodzi się z linii komórkowej 293F i stabilnie eksprymuje duży antygen T SV40. Dlatego jest odpowiednim gospodarzem do produkcji lentiwirusa.</li>
	<li>Po 6 godzinach zastąpić pożywkę hodowlaną DMEM zawierającym 10% FBS.</li>
	<li>Zebrać pożywkę za pomocą pipety po 48 godzinach od transfekcji. 
	nuta: Wirus występuje w DMEM zawierającym 10% FBS. Martwe komórki unoszą się na podłożu. Użyj sterylnej membrany 0,45 μm do przefiltrowania martwych komórek i zanieczyszczeń. Ogólnie rzecz biorąc, nie ma potrzeby sprawdzania mnogości infekcji (MOI). Ma to na celu ustanowienie stabilnej linii komórek. W ostatnim kroku wszystkie żywe komórki bez udanej infekcji umrą przez puromycynę. Grupa shScramble i komórki HUVEC są grupą kontrolną. Upewnij się, że wszystkie komórki HUVEC umrą przy zastosowanym stężeniu puromycyny przez 72 godziny. Każda studzienka ma taką samą liczbę komórek.</li>
	<li>Hodować komórki HUVEC w pożywce lentiwirusowej przez 72 godziny. Następnie dodać puromycynę do pożywki komórek HUVEC w stężeniu 2 μg/ml przez 24 godziny. Jako grupę kontrolną należy stosować komórki HUVEC bez żadnego leczenia. Upewnij się, że do tego czasu wszystkie komórki kontrolne umrą. 
	nuta: Żywe komórki reprezentują stabilną linię komórkową komórek knockdown VHL i komórek shSramble. Gęstość posiewu wynosi 5,000/dołek w płytkach 96-dołkowych.</li>
</ol>
3. Generowanie sferoidów komórek śródbłonka
<ol>
	<li>Trypsynizuj komórki HUVEC i ponownie zawieś w pożywce DMEM z 10% FBS. Mając umiarkowaną liczbę komórek w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym, dodaj 1 ml typsyny-EDTA.</li>
	<li>Zasiej komórki na 96-dołkowej płytce 3D z okrągłym dnem, o gęstości komórek 1 × 103 komórek/dołek. Użyj studzienki, która może pomieścić sferoidę o pojemności 0,50 μl, aby zawiesić sferoidę. Policz komórki za pomocą systemu licznika komórek zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w sposób ciągły przez 72 godziny. W tych warunkach upewnij się, że zawieszone komórki automatycznie tworzą sferoidy komórek. Po 36 godzinach wymienić połowę pożywki hodowlanej.</li>
</ol>
4. Test angiogenezy in vitro
<ol>
	<li>Rozmrozić roztwór żelu w temperaturze 4 °C i rozcieńczyć go zredukowaną pożywką surowicy w stosunku rozcieńczenia 1:5.</li>
	<li>Odessać sferoidy z pożywki hodowlanej DMEM za pomocą mikropipety. Po umyciu sferoid 5 ml zredukowanej pożywki surowicy, delikatnie i ostrożnie zawiesić sferoidy w rozcieńczonym żelu. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Zanurz 300 μl zmieszanej cieczy w 15-dołkowej płytce. Po inkubacji w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 godzinę dodać 400 μl zredukowanej pożywki surowicy do każdej studzienki. Napełnij sterylną wodą wokół studni, aby wytworzyć nawilżone środowisko utrudniające parowanie.</li>
	<li>Następnie hodować płytkę w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przy 100% wilgotności przez 1 godzinę.</li>
	<li>Ostrożnie odessać starą pożywkę i zastąpić ją 600 μl zredukowanej pożywki surowicy z 1% suplementami wzrostu komórek śródbłonka w każdym dołku.</li>
	<li>Po 12 godzinach lub 24 godzinach wykonaj zdjęcia pod mikroskopem światła odwróconego (40*).</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Prześlij obrazy na internetową platformę analizy obrazów, aby uzyskać dane o długości kiełków (tabela materiałów).</li>
	<li>Na stronie internetowej utwórz konto przez e-mail.</li>
	<li>Następnie prześlij obrazy, klikając przycisk przesyłania.</li>
	<li>Pobierz wynik, klikając przycisk pobierania. 
	nuta: Oprogramowanie wygeneruje przetworzony obraz i dane. Dane składają się z pięciu części: skumulowanej długości kiełków, średniej długości kiełków, odchylenia standardowego długości kiełków, powierzchni kiełków i powierzchni sferoidalnej. Na przetworzonym obrazie każdy parametr jest obrysowany innym kolorem, aby ułatwić identyfikację na przetworzonym obrazie: czerwony reprezentuje szkielet kiełków, żółty liczbę kiełków, niebieski strukturę kiełków, biały koniec kiełka i pomarańczową sferoidę.</li>
</ol>

<ol><li>Lonser, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0140673603136434">von Hippel-Lindau disease.</a> Lancet. 361 (9374), 2059-2067 (2003).</li>
<li>Hussein, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+capillary+haemangioblastoma%3A+the+pathologist%27s+viewpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Central nervous system capillary haemangioblastoma: the pathologist's viewpoint.</a> Int J Exp Pathol. 88 (5), 311-324 (2007).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemangioblastomas+might+derive+from+neoplastic+transformation+of+neural+stem+cells%2Fprogenitors+in+the+specific+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Hemangioblastomas might derive from neoplastic transformation of neural stem cells/progenitors in the specific niche.</a> Carcinogenesis. 32 (1), 102-109 (2011).</li>
<li>Zhuang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+derived+vasculogenesis+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Tumor derived vasculogenesis in von Hippel-Lindau disease-associated tumors.</a> Sci Rep. 4, 4102(2014).</li>
<li>Glasker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VHL-deficient+vasculogenesis+in+hemangioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">VHL-deficient vasculogenesis in hemangioblastoma.</a> Exp Mol Pathol. 96 (2), 162-167 (2014).</li>
<li>Wizigmann-Voos, S., Breier, G., Risau, W., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+vascular+endothelial+growth+factor+and+its+receptors+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+and+sporadic+hemangioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas.</a> Cancer Res. 55 (6), 1358-1364 (1995).</li>
<li>Cancilla, P. A., Zimmerman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+a+cerebellar+hemangioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The fine structure of a cerebellar hemangioblastoma.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 24 (4), 621-628 (1965).</li>
<li>Kawamura, J., Garcia, J. H., Kamijyo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+hemangioblastoma%3A+histogenesis+of+stroma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Cerebellar hemangioblastoma: histogenesis of stroma cells.</a> Cancer. 31 (6), 1528-1540 (1973).</li>
<li>Jurco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemangioblastomas%3A+histogenesis+of+the+stromal+cell+studied+by+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hemangioblastomas: histogenesis of the stromal cell studied by immunocytochemistry.</a> Hum Pathol. 13 (1), 13-18 (1982).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+tumorigenic+cells+and+implication+of+their+aberrant+differentiation+in+human+hemangioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of tumorigenic cells and implication of their aberrant differentiation in human hemangioblastomas.</a> Cancer Biol Ther. 12 (8), 727-736 (2011).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD41+and+CD45+expression+marks+the+angioformative+initiation+of+neovascularisation+in+human+haemangioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biol%22%5BJournal%5D)">CD41 and CD45 expression marks the angioformative initiation of neovascularisation in human haemangioblastoma.</a> Tumour Biol. 37 (3), 3765-3774 (2016).</li>
<li>Sharifpanah, F., Sauer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Spheroid-Based+Sprout+Assay+in+Three-Dimensional+Fibrin+Scaffold%3A+A+Novel+In+Vitro+Model+for+the+Study+of+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Spheroid-Based Sprout Assay in Three-Dimensional Fibrin Scaffold: A Novel In Vitro Model for the Study of Angiogenesis.</a> Methods Mol Biol. 1430, 179-189 (2016).</li>
<li>Cai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNA+taurine+upregulated+1+enhances+tumor-induced+angiogenesis+through+inhibiting+microRNA-299+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNA taurine upregulated 1 enhances tumor-induced angiogenesis through inhibiting microRNA-299 in human glioblastoma.</a> Oncogene. 36 (3), 318-331 (2017).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Conveniently+Screening+pLKO.1-TRC+Vector+Tagged+with+TurboGFP%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Construction of Conveniently Screening pLKO.1-TRC Vector Tagged with TurboGFP.</a> Appl Biochem Biotechnol. 181 (2), 699-709 (2017).</li>
<li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1202-1215 (2009).</li>
<li>D'Alessio, A., Moccia, F., Li, J. H., Micera, A., Kyriakides, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+and+Vasculogenesis+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis and Vasculogenesis in Health and Disease.</a> Biomed Res Int. 2015, 126582(2015).</li>
<li>Finkenzeller, G., Graner, S., Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Stark, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+in+vivo+vasculogenic+potential+of+endothelial+progenitor+cells+in+comparison+to+human+umbilical+vein+endothelial+cells+in+a+spheroid-based+implantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Impaired in vivo vasculogenic potential of endothelial progenitor cells in comparison to human umbilical vein endothelial cells in a spheroid-based implantation model.</a> Cell Prolif. 42 (4), 498-505 (2009).</li>
<li>Morin, K. T., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+angiogenesis+and+vasculogenesis+in+fibrin+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel.</a> Exp Cell Res. 319 (16), 2409-2417 (2013).</li>
<li>Blacher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+invasion+in+the+spheroid+sprouting+assay%3A+a+spatial+organisation+analysis+adaptable+to+cell+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell invasion in the spheroid sprouting assay: a spatial organisation analysis adaptable to cell behaviour.</a> PLoS One. 9 (5), 97019(2014).</li>
<li>Straume, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+heat+shock+protein+27+induces+long-term+dormancy+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (22), 8699-8704 (2012).</li>
<li>Naumov, G. N., Akslen, L. A., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+angiogenesis+in+human+tumor+dormancy%3A+animal+models+of+the+angiogenic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Role of angiogenesis in human tumor dormancy: animal models of the angiogenic switch.</a> Cell Cycle. 5 (16), 1779-1787 (2006).</li>
<li>Naumov, G. N., Folkman, J., Straume, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+dormancy+due+to+failure+of+angiogenesis%3A+role+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Tumor dormancy due to failure of angiogenesis: role of the microenvironment.</a> Clin Exp Metastasis. 26 (1), 51-60 (2009).</li>
<li>Wang, Y., Yang, J., Du, G., Ma, D., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+respond+to+cerebral+ischemia+without+susceptibility+to+HB-tumorigenesis+in+VHL+heterozygous+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects respond to cerebral ischemia without susceptibility to HB-tumorigenesis in VHL heterozygous knockout mice.</a> Mol Carcinog. 56 (10), 2342-2351 (2017).</li>
<li>Stratmann, R., Krieg, M., Haas, R., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+control+of+angiogenesis+in+hemangioblastomas+by+the+von+Hippel-Lindau+tumor+suppressor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Putative control of angiogenesis in hemangioblastomas by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 56 (11), 1242-1252 (1997).</li>
<li>Correa de Sampaio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterogeneous+in+vitro+three+dimensional+model+of+tumour-stroma+interactions+regulating+sprouting+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis.</a> PLoS One. 7 (2), 30753(2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ostatnio wiele dziedzin badań biologii naczyniowej zostało pobudzonych przez badanie śródbłonka angiogennego15. W tym artykule opracowaliśmy technikę kiełkowania sferoidy śródbłonka jako model eksperymentalny do badania tworzenia naczyń, które wynikają z utraty funkcji genu VHL w zmanipulowanych komórkach śródbłonka w celu identyfikacji nowych cząsteczek kandydujących kaskady angiogennej. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, jest to pierwszy raport, w którym zbadano angiogenne działanie endogennych z...

Hemangioblastoma (HBs) to łagodne guzy naczyniowe, które występują wyłącznie w ludzkim ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Rozwijają się one u pacjentów z chorobą von Hippla-Lindaua (VHL) lub zmianami sporadycznymi. VHL-HBs są trudne do wyleczenia poprzez leczenie chirurgiczne ze względu na częste nawroty i liczne zmiany wynikające z tego zaburzenia genetycznego1. Chociaż inaktywacja genu supresorowego guza VHL została uznana za główną przyczynę nowotworzenia VHL-HBs, pochodzenie cytologiczne (w tym neowaskularyzacja) i proces ewolucyjny HBs pozostają w dużej mierze kontrowersyjne2. W związku z tym lepsze zrozumienie mechanizmów biologicznych HB-neowaskularnych może dostarczyć użytecznych informacji na temat najbardziej obiecujących strategii przeciwnaczyniowych dla VHL-HBs.
Ostatnie badania sugerują, że neowaskularyzacja HB jest podobna do embriologicznej waskulogenezy3,4,5. Klasyczna angiogeneza za pośrednictwem czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), która wywodzi się ze śródbłonka naczyniowego i jest napędzana utratą funkcji VHL, spowodowała proliferację i tworzenie się neowaskularne, co zostało zakwestionowane6. W 1965 roku Cancilla i Zimmerman odkryli, używając mikroskopii elektronowej, że HB pochodzą z endothelium7. Później okazało się, że komórki zrębu pochodzą z elementu wazoformatywnego8. W 1982 roku Jurco i wsp. odkryli, że komórki zrębu są pochodzenia śródbłonkowego9. Dlatego postawiliśmy hipotezę, że ludzkie komórki śródbłonka naczyniowego są oryginalnymi komórkami HB-neowaskularyzacji10. Chociaż lepiej jest używać pierwotnych kultur z komórek HB pochodzących z operacji pacjentów z VHL, nasze poprzednie badania wykazały, że pierwotne kultury z HB nie są stabilne i nie można ustalić linii komórkowych3. Co więcej, pierwotne kultury w środowisku 3D nie mogły zidentyfikować cytologicznego pochodzenia HB-neowaskularyzacji, ponieważ zawierają one przodków składników naczyniowych HB10,11. Dlatego, jako prymitywny i klasyczny model komórek śródbłonka, ludzkie komórki śródbłonka naczyniowego (HUVEC) mogą służyć jako alternatywny model komórkowy dla HBs.
Test kiełkowania sferoidów to nowy model w inżynierii tkankowej12,13. W tym artykule opracowano system kokultury 3D oparty na kolagenie in vitro z wykorzystaniem testu kiełkowania sferoidalnego, którego ogólnym celem była ocena, czy w HBs występuje klasyczna angiogeneza guza, a także jej rola w HBs.

<table><tbody><tr><td>ludzka komórka śródbłonka żyły pępowinowej</td><td>Fudan IBS Cell Center</td><td>FDCC-HXN180</td><td></td></tr><tr><td>dulbecco' s zmodyfikowany orzeł" s średni&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11995040</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; </td><td></td>26400044</tr><tr><td>PLKO.1-puro vector</td><td>Addgene</td><td>#8453</td><td></td></tr><tr><td>plazmid upakowania psPAX2&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12260</td><td></td></tr><tr><td>plazmid kopertowy pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>3D okrągłodenne 96-dołkowe płytki</td><td>S-Bio</td><td>MS-9096M</td><td></td></tr><tr><td>matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM podłoże</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>zredukowana pożywka surowicy&nbsp;</td></tr><tr><td>Płytka 15-dołkowa</td><td>Ibidi</td><td>81501</td><td>Pęcherzyki powietrza w żelu można zredukować poprzez wyrównanie &mu; &ndash; Przesuń angiogenezę przed użyciem w inkubatorze na noc</td></tr><tr><td>suplementy wzrostu komórek śródbłonka</td><td>Sciencell</td><td>#1052</td><td></td></tr><tr><td>10-centymetrowe naczynie hodowlane</td><td>Corning</td><td>Scipu000813</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>typsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny system licznika komórek &nbsp;</td>Oprogramowanie do analizy obrazu <td>biotechnologicznego</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Winmasis</td><td></td><td>http://mywim.wimasis.com&nbsp;</td></tr></tbody></table>

kompleksowa procedura oceny wydajności in vitro przypuszczalnego neowaskularyzmu naczyniaka zarodkowego przy użyciu testu kiełkowania sferoidalnego

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

Inaktywacja genu supresorowego nowotworu von Hippel-Lindau (VHL) odgrywa kluczową rolę w rozwoju naczyniaków zarodkowych (HBs) w ludzkim ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Jednak zarówno pochodzenie cytologiczne, jak i proces ewolucyjny HBs (w tym neowaskularyzacja) pozostają kontrowersyjne, a antyangiogeneza VHL-HBs, oparta na klasycznej angiogenezie HBs, przyniosła rozczarowujące wyniki w badaniach klinicznych. Jedną z głównych przeszkód w skutecznym klinicznym przełożeniu leczenia przeciwnaczyniowego jest brak dokładnego zrozumienia neowaskularyzacji w tym guzie naczyniowym. W tym artykule przedstawiono kompleksową procedurę oceny in vitro, czy w HBs występuje klasyczna angiogeneza guza, a także jej rola w HBs. Dzięki tej procedurze naukowcy mogą dokładnie zrozumieć złożoność neowaskularyzacji HB i zidentyfikować funkcję tej powszechnej formy angiogenezy w HBs. Protokoły te można wykorzystać do oceny najbardziej obiecującej terapii przeciwnaczyniowej nowotworów, która ma wysoki potencjał translacyjny zarówno w leczeniu nowotworów, jak i w optymalizacji leczenia antyangiogennego HBs w przyszłych translacjach. Wyniki podkreślają złożoność neowaskularyzacji HB i sugerują, że ta powszechna forma angiogenezy jest jedynie mechanizmem uzupełniającym w neowaskularyzacji HB.

Oryginalne zdjęcia wykonano za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego. Typowe obrazy dla grupy kontrolnej oraz grupy VHL przedstawiono na Rysunku 2-A1 oraz Rysunku 2-A2. Długość wypustek w grupie kontrolnej jest mniejsza niż w grupie VHL.
Po przesłaniu obrazów platforma internetowa bezpośrednio dostarcza wyniki analizy. Wynik składa s...

Ten artykuł przedstawia kompleksową procedurę oceny in vitro, czy klasyczna angiogeneza nowotworów występuje w naczyniakach zarodkowych (HBs) i jaka jest jej rola w HBs. Wyniki podkreślają złożoność neowaskularyzacji HB i sugerują, że ta powszechna forma angiogenezy jest jedynie mechanizmem uzupełniającym w neowaskularyzacji HB.

Kompleksowa procedura oceny wydajności in vitro przypuszczalnego neowaskularyzmu naczyniaka zarodkowego przy użyciu testu kiełkowania sferoidalnego

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest ocena wydajności przypuszczalnej neowaskularyzmu naczyniaka zarodkowego przy użyciu testu kiełkowania sferoidalnego in vitro. Metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie angiogenezy, takie jak angiogeneza guza. Główną zaletą tej techniki jest to, że produkt kompleksowej procedury oceny in vitro, w której klasyczna angiogeneza guza występuje w naczyniaku zarodkowym i rośnie w naczyniaku zarodkowym.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię naczynia krwiotwórczego i unaczynienia, ponieważ wyniki podkreślają złożoność neowaskularyzacji heangioblastumor, a to sugeruje, że ta powszechna forma angiogenezy jest tylko mechanizmem uzupełniającym. Tak więc ta metoda może zapewnić wgląd w badania nad neowaskularyzacją naczynia krwionośnego. Może być również stosowany do nowotworów, angiogenezy i aplikacji związanej z unaczynieniem w niektórych guzach litych, takich jak mimikra naczyniopochodna w guzie szklanym.Prawdziwa demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ generowanie tych zmanipulowanych etapów sferoidalnych komórek śródbłonka jest trudne do nauczenia. Ponieważ ważne są odpowiednie warunki. Po pierwsze, hoduj komórki śródbłonka HUVEC w pożywce hodowlanej DMEM uzupełnionej dziesięcioprocentową płodową surowicą bydlęcą, penicyliną i streptomycyną.Następnie utrzymuj kulturę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentową zawartością dwutlenku węgla. Następnie, aby zsyntetyzować fragment shRNA, trawić plazmid za pomocą enzymów restrykcyjnych ApaI i EcoRI. Następnie do strawionego plazmidu dodać oligonukleotydy do przodu i do tyłu, 10x bufor NEB i podwójnie destylowaną wodę do końcowej objętości 50 mikrolitrów.Po dodaniu wszystkich odczynników podgrzej mieszaninę w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez cztery minuty. Następnie stopniowo schładzaj do temperatury pokojowej w ciągu kilku godzin. Użyj ligazy T4 do ligacji wyżarzonych oligonukleotydów i plazmidu.Inkubuj probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia dodaj pięć mikrolitrów mieszanki ligacyjnej do 25 mikrolitrów komórek kompetentnych DH5alpha. W 500 mikrolitrach pożywki DMEM dodaj wektor lentiwirusowy lub wektor zaszyfrowany wraz z innymi plazmidami opakowaniowymi.Następnie inkubuj mieszaninę lentiwirusową przez 25 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji dodać 7 mililitrów pożywki DMEM do mieszanego roztworu jajecznicy lub lentiwirusa. Hoduj komórki 293FT w pożywce DMEM bez płodowej surowicy bydlęcej w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym.Dodaj jeden mililitr lentiwirusowego lub zaszyfrowanego roztworu do komórek 293FT w naczyniu hodowlanym. Po sześciu godzinach odessać starą pożywkę z naczynia hodowlanego. Następnie zastąp starą pożywkę świeżą pożywką DMEM zawierającą 10 procent płodowej surowicy bydlęcej.Po 48 godzinach zbierz podłoże. Przenieś komórki śródbłonka HUVEC do pożywki lentiwirusowej i utrzymuj przez 72 godziny. Następnie dodaj dwa mikrogramy na mililitr puromycyny do pożywki do hodowli komórkowych HUVEC.Na koniec inkubuj kulturę przez kolejne 24 godziny. Następnego dnia dodaj jeden mililitr trypsyny EDTA, aby trypsynizować komórki HUVEC. Następnie ponownie zawiesić zawiesinę komórek trypsynizowanych w pożywce DMEM z 10-procentową płodową surowicą bydlęcą.Policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek. Po zliczeniu zasiej komórki na 96-dołkowej płytce 3D z okrągłym dnem. Po wysianiu inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla przez 72 godziny bez przerwy.Po 36 godzinach zastąp połowę pożywki hodowlanej świeżą pożywką. Najpierw rozmrozić roztwór żelu w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie rozcieńczyć go w stosunku od jednego do pięciu zredukowanym podłożem surowicy. Odessać sferoidy z podłoża DMEM za pomocą mikropipety.Następnie przemyj sferoidy pięcioma mililitrami zredukowanej pożywki surowicy. Ostrożnie przenieś zawieszone sferoidy i rozcieńczony żel. W 15-dołkowej płytce zanurzyć 300 mikrośmieci zmieszanej cieczy sferoidów i rozcieńczonego żelu.Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowego dwutlenku węgla przez godzinę. Następnie dodaj 400 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy do jednego dołka. Aby zapobiec parowaniu, napełnij otoczenie studni sterylną wodą.Następnie hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, pięciu procent dwutlenku węgla i 100 procent wilgotności przez godzinę. Po inkubacji odessać starą pożywkę i dodać 600 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy z jednym procentem suplementu wzrostu komórek śródbłonka do studzienki i inkubować przez jeden dzień. Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu światła odwróconego.W tym przypadku sferoidalne kiełkowanie komórek jest rejestrowane za pomocą mikroskopu światła odwróconego w celu zbadania wpływu wyciszania genu VHL na potencjał angiogenny komórek śródbłonka. Obserwuje się, że sferoida kiełkuje 12 godzin po leczeniu lentiwirusem zarówno w kontrolnych, jak i wyciszonych komórkach śródbłonka VHL. Następnie przeprowadzana jest analiza statystyczna w celu ilościowego określenia długości kiełków generowanych przez sferoidy wyciszone przez gen VHL.Wydaje się, że średnia długość kiełków wynosi około 125 mikrometrów w grupach wyciszonych VHL, podczas gdy w grupie kontrolnej wynosi tylko około 65 mikrometrów. Średnia skumulowana długość kiełków w grupie wyciszonej VHL wynosi około 1250 mikrometrów, podczas gdy w grupie kontrolnej 680 mikrometrów. Wyniki te wskazują na dwukrotny wzrost długości kiełków w grupach wyciszonych VHL.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 48 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Postępując zgodnie z tą procedurą i metodą, taką jak test tworzenia naczyń włosowatych, można przeprowadzić test w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania. Na przykład badanie zdolności angiogennej komórek śródbłonka naczyń krwionośnych.Po tym rozwoju technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się angiogenezą do zbadania wewnętrznego unaczynienia guza. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, które geny tracą funkcję w zmanipulowanych komórkach śródbłonka używanych do testu eksplodacyjnego.

a-comprehensive-procedure-to-evaluate-vitro-performance-putative

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Protokół opisuje, jak zaprojektować perfuzyjną sieć naczyniową w sferoidzie. Mikrośrodowisko otaczające sferoidę jest zaprojektowane tak, aby indukować angiogenezę i łączyć sferoidę z mikrokanałami w urządzeniu mikroprzepływowym. Metoda pozwala na perfuzję sferoidy, co jest długo oczekiwaną techniką w kulturach trójwymiarowych.

Perfuzyjna sieć naczyniowa z modelem tkankowym w urządzeniu mikroprzepływowym

Ten protokół przedstawia nowatorski test kulkowy in vitro, który bardziej odpowiednio modeluje proces angiogenezy kiełkowania in vivo poprzez włączenie perycytów. Ta modyfikacja umożliwia testowi kulkowemu dokładniejsze odwzorowanie heterotypowych interakcji komórkowych między komórkami śródbłonka a komórkami ściennymi, które mają kluczowe znaczenie dla angiogenezy.

Włączenie perycytów do testu kiełkowania kulek komórek śródbłonka

Ta metoda opisuje hodowlę komórek śródbłonka pochodzących z iPSC jako 40 perfundowanych mikronaczyń 3D w standaryzowanej platformie mikroprzepływowej. Platforma ta umożliwia badanie angiogennego kiełkowania sterowanego gradientem w 3D, w tym zespolenia i stabilizacji kiełków angiogennych w sposób skalowalny i wysokoprzepustowy.

Standaryzowany i skalowalny test do badania perfundowanego angiogennego kiełkowania 3D komórek śródbłonka pochodzących z iPSC in vitro

Trójwymiarowy system testowania angiogenezy sferoidalnej w kokulturze został zaprojektowany tak, aby naśladować fizjologiczną angiogenezę. Sferoidy kohodowlane są tworzone przez dwa prekursory ludzkich komórek naczyniowych, ECFC i MSC, i zatopione w żelu kolagenowym. Nowy system jest skuteczny w ocenie modulatorów angiogennych i dostarcza bardziej istotnych informacji do badania in vivo.

Trójwymiarowy system oznaczania angiogenezy wykorzystujący sferoidy współhodowlane utworzone przez komórki tworzące kolonie śródbłonka i mezenchymalne komórki macierzyste

Ten protokół przedstawia test kiełkowania naczyniówki, model ex vivo proliferacji mikronaczyniowej. Test ten może być stosowany do oceny szlaków zaangażowanych w proliferację mikronaczyniówek i oceny leczenia farmakologicznego przy użyciu typu dzikiego i genetycznie zmodyfikowanej tkanki myszy.

Test kiełkowania naczyniówki ex vivo w angiogenezie mikronaczyniowej oka

Ten test wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała embrionalne hodowane w żelu 3D-collagen do analizy procesów biologicznych, które kontrolują angiogenezę kiełkowania in vitro. Technika ta może być stosowana do testowania leków, modelowania chorób oraz do badania określonych genów w kontekście delecji, które są śmiertelne dla zarodka.

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

Wzajemne oddziaływanie między komórkami nabłonka sutka a komórkami śródbłonka przyczynia się do progresji raka piersi, wzrostu guza i przerzutów. W tym badaniu sferoidy zostały wykonane z komórek raka piersi wraz z komórkami śródbłonka naczyń krwionośnych i/lub limfatycznych i wykazują ich przydatność jako systemu in vitro do badań nad rakiem piersi.

Sferoidy komórek nabłonka i śródbłonka sutka jako potencjalny funkcjonalny model in vitro do badań nad rakiem piersi

Tutaj prezentujemy protokół, który umożliwia szybką, solidną i tanią produkcję sferoid nowotworowych, a następnie enkapsulację hydrożelową. Ma szerokie zastosowanie, ponieważ nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Byłoby to szczególnie przydatne do badania interakcji sferoida-matryca oraz budowania modeli fizjologii lub patologii tkanek in vitro.

Wytwarzanie i enkapsulacja sferoidów nowotworowych w hydrożelach glikolu polietylenowego do badania oddziaływań sferoida-matryca

To badanie przedstawia dwuwymiarowy (2D) test migracji ran drapanych i trójwymiarowy (3D) test kiełkowania sferoidów, wraz z odpowiednimi metodami analizy, w tym ekstrakcją RNA i immunocytochemią, jako odpowiednie testy do badania angiogenezy in vitro.

Badanie angiogenezy na poziomie funkcjonalnym i molekularnym poprzez wykorzystanie testu migracji ran drapanych i testu kiełkowania sferoidalnego

Poznaj metodę oceny neowaskularyzacji naczyniaka zarodkowego za pomocą testu kiełkowania sferoidalnego in vitro. Technika ta pozwala badać klasyczną angiogenezę nowotworową i jej znaczenie dla terapii.

Kompleksowa procedura oceny wydajności in vitro przypuszczalnego neowaskularyzmu naczyniaka zarodkowego przy użyciu testu kiełkowania sferoidalnego (Wideo) | JoVE Journal

Kompleksowa procedura oceny wydajności in vitro przypuszczalnego neowaskularyzmu naczyniaka zarodkowego przy użyciu testu kiełkowania sferoidalnego

Przeglądaj więcej filmów