Kompleksowa procedura oceny wydajności in vitro przypuszczalnego neowaskularyzmu naczyniaka zarodkowego przy użyciu testu kiełkowania sferoidalnego

Ogólnym celem tego eksperymentu jest ocena wydajności przypuszczalnej neowaskularyzmu naczyniaka zarodkowego przy użyciu testu kiełkowania sferoidalnego in vitro. Metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie angiogenezy, takie jak angiogeneza guza. Główną zaletą tej techniki jest to, że produkt kompleksowej procedury oceny in vitro, w której klasyczna angiogeneza guza występuje w naczyniaku zarodkowym i rośnie w naczyniaku zarodkowym.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię naczynia krwiotwórczego i unaczynienia, ponieważ wyniki podkreślają złożoność neowaskularyzacji heangioblastumor, a to sugeruje, że ta powszechna forma angiogenezy jest tylko mechanizmem uzupełniającym. Tak więc ta metoda może zapewnić wgląd w badania nad neowaskularyzacją naczynia krwionośnego. Może być również stosowany do nowotworów, angiogenezy i aplikacji związanej z unaczynieniem w niektórych guzach litych, takich jak mimikra naczyniopochodna w guzie szklanym.

Prawdziwa demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ generowanie tych zmanipulowanych etapów sferoidalnych komórek śródbłonka jest trudne do nauczenia. Ponieważ ważne są odpowiednie warunki. Po pierwsze, hoduj komórki śródbłonka HUVEC w pożywce hodowlanej DMEM uzupełnionej dziesięcioprocentową płodową surowicą bydlęcą, penicyliną i streptomycyną.

Następnie utrzymuj kulturę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentową zawartością dwutlenku węgla. Następnie, aby zsyntetyzować fragment shRNA, trawić plazmid za pomocą enzymów restrykcyjnych ApaI i EcoRI. Następnie do strawionego plazmidu dodać oligonukleotydy do przodu i do tyłu, 10x bufor NEB i podwójnie destylowaną wodę do końcowej objętości 50 mikrolitrów.

Po dodaniu wszystkich odczynników podgrzej mieszaninę w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez cztery minuty. Następnie stopniowo schładzaj do temperatury pokojowej w ciągu kilku godzin. Użyj ligazy T4 do ligacji wyżarzonych oligonukleotydów i plazmidu.

Inkubuj probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia dodaj pięć mikrolitrów mieszanki ligacyjnej do 25 mikrolitrów komórek kompetentnych DH5alpha. W 500 mikrolitrach pożywki DMEM dodaj wektor lentiwirusowy lub wektor zaszyfrowany wraz z innymi plazmidami opakowaniowymi.

Następnie inkubuj mieszaninę lentiwirusową przez 25 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji dodać 7 mililitrów pożywki DMEM do mieszanego roztworu jajecznicy lub lentiwirusa. Hoduj komórki 293FT w pożywce DMEM bez płodowej surowicy bydlęcej w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym.

Dodaj jeden mililitr lentiwirusowego lub zaszyfrowanego roztworu do komórek 293FT w naczyniu hodowlanym. Po sześciu godzinach odessać starą pożywkę z naczynia hodowlanego. Następnie zastąp starą pożywkę świeżą pożywką DMEM zawierającą 10 procent płodowej surowicy bydlęcej.

Po 48 godzinach zbierz podłoże. Przenieś komórki śródbłonka HUVEC do pożywki lentiwirusowej i utrzymuj przez 72 godziny. Następnie dodaj dwa mikrogramy na mililitr puromycyny do pożywki do hodowli komórkowych HUVEC.

Na koniec inkubuj kulturę przez kolejne 24 godziny. Następnego dnia dodaj jeden mililitr trypsyny EDTA, aby trypsynizować komórki HUVEC. Następnie ponownie zawiesić zawiesinę komórek trypsynizowanych w pożywce DMEM z 10-procentową płodową surowicą bydlęcą.

Policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek. Po zliczeniu zasiej komórki na 96-dołkowej płytce 3D z okrągłym dnem. Po wysianiu inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla przez 72 godziny bez przerwy.

Po 36 godzinach zastąp połowę pożywki hodowlanej świeżą pożywką. Najpierw rozmrozić roztwór żelu w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie rozcieńczyć go w stosunku od jednego do pięciu zredukowanym podłożem surowicy. Odessać sferoidy z podłoża DMEM za pomocą mikropipety.

Następnie przemyj sferoidy pięcioma mililitrami zredukowanej pożywki surowicy. Ostrożnie przenieś zawieszone sferoidy i rozcieńczony żel. W 15-dołkowej płytce zanurzyć 300 mikrośmieci zmieszanej cieczy sferoidów i rozcieńczonego żelu.

Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowego dwutlenku węgla przez godzinę. Następnie dodaj 400 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy do jednego dołka. Aby zapobiec parowaniu, napełnij otoczenie studni sterylną wodą.

Następnie hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, pięciu procent dwutlenku węgla i 100 procent wilgotności przez godzinę. Po inkubacji odessać starą pożywkę i dodać 600 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy z jednym procentem suplementu wzrostu komórek śródbłonka do studzienki i inkubować przez jeden dzień. Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu światła odwróconego.

W tym przypadku sferoidalne kiełkowanie komórek jest rejestrowane za pomocą mikroskopu światła odwróconego w celu zbadania wpływu wyciszania genu VHL na potencjał angiogenny komórek śródbłonka. Obserwuje się, że sferoida kiełkuje 12 godzin po leczeniu lentiwirusem zarówno w kontrolnych, jak i wyciszonych komórkach śródbłonka VHL. Następnie przeprowadzana jest analiza statystyczna w celu ilościowego określenia długości kiełków generowanych przez sferoidy wyciszone przez gen VHL.

Wydaje się, że średnia długość kiełków wynosi około 125 mikrometrów w grupach wyciszonych VHL, podczas gdy w grupie kontrolnej wynosi tylko około 65 mikrometrów. Średnia skumulowana długość kiełków w grupie wyciszonej VHL wynosi około 1250 mikrometrów, podczas gdy w grupie kontrolnej 680 mikrometrów. Wyniki te wskazują na dwukrotny wzrost długości kiełków w grupach wyciszonych VHL.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 48 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Postępując zgodnie z tą procedurą i metodą, taką jak test tworzenia naczyń włosowatych, można przeprowadzić test w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania. Na przykład badanie zdolności angiogennej komórek śródbłonka naczyń krwionośnych.

Po tym rozwoju technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się angiogenezą do zbadania wewnętrznego unaczynienia guza. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, które geny tracą funkcję w zmanipulowanych komórkach śródbłonka używanych do testu eksplodacyjnego.