Wizualizacja i analiza ilościowa angiogenezy embrionalnej u Xenopus tropicalis

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja unaczynienia kijanek Xenopus tropicalis. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii układu krążenia, takie jak sposób regulacji angiogenezy. Główną zaletą tej techniki jest to, że naczynia krwionośne w nienaruszonym zarodku typu studzienkowego można uwidocznić za pomocą prostego wstrzyknięcia barwnika fluorescencyjnego.

Zacznij od użycia mikropodajnika, aby napełnić stożkową szklaną mikropipetę około pięcioma mikrolitrami klarownego, acetylowanego roztworu LDL diI, uważając, aby nie załadowano żadnych wytrąconych cząstek. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj cienkiej pary kleszczyków o numerze 55, aby przyciąć końcówkę pipety, aby dostosować objętość przesłanego kompleksu i ustawić system iniekcji sterowany ciśnieniem tak, aby wyrzucał około pięciu nanolitrów roztworu na wstrzyknięcie. Następnie zanurz końcówkę pipety w 0,04% MS-222 w 0,1X zmodyfikowanej soli fizjologicznej Bartha lub MBS w specjalnie wykonanej formie Sylgard.

Następnie przenieś zarodek Xenopus tropicalis do pleśni Sylgard i potwierdź całkowitą sedację przy braku odpowiedzi na stymulację płetwy grzbietowej. Pod mikroskopem preparacyjnym załadować brzuszną stronę zarodka do wgłębienia formy w kształcie litery V w pozycji lekko ukośnej. Ciasno dopasuj dwie szpilki o średnicy 0,1 milimetra do uchwytu na szpilkę i użyj jednej szpilki do przebicia skóry nad sercem, które powinno wyraźnie pulsować.

Włóż szpilkę przez otwór w przestrzeni między sercem a skórą bez nakłuwania serca i umieść włożoną końcówkę w obszarze, w którym zostanie wykonane nacięcie. Następnie pocieraj drugą szpilkę o włożoną szpilkę, aby wykonać liniowe nacięcie i użyj obu szpilek razem, aby delikatnie poszerzyć nacięcie, odsłaniając serce. Aby wstrzyknąć acetylowany roztwór LDL DiI, włóż szklaną końcówkę pipety do serca i wstrzyknij od 50 do 60 nanolitrów acetylowanego LDL DiI w około 10 impulsach wyrzutowych.

Po dostarczeniu całego roztworu barwnika upewnij się, że serce nadal bije i przenieś zarodek na nową szalkę Petriego zawierającą 0,1 X MBS. Po pięciu do 10 minutach kijanka powinna dojść do siebie po znieczuleniu i zacząć się poruszać. Po wstrzyknięciu odpowiedniej liczby zarodków należy przeprowadzić wizualne badania przesiewowe prawidłowo oznakowanych znieczulonych zarodków pod mikroskopem fluorescencyjnym, odrzucając wszelkie zwierzęta, które mają oznaczone inne narządy.

Zarodki, które nie zostały wystarczająco oznakowane, mogą być ponownie wstrzyknięte. Następnie zrób zdjęcia prawidłowo oznaczonych zarodków. Aby uzyskać dokładniejsze zobrazowanie naczyń krwionośnych, utrwal znieczulone zarodki w 4% paraformaldehydzie przez godzinę w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem w celu wizualizacji za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Jeśli wystarczająca ilość acetylowanego LDL diI zostanie wstrzyknięta do serca, tylna żyła kardynalna lub PCV powinna być natychmiast widoczna pod mikroskopem fluorescencyjnym. Żyły międzysomomityczne lub ISV wyłaniają się grzbietowo z PCV w fali od przodu do tylnej, zaczynając od stadium 36 i kończąc około stadium 40 do 41, stając się lekko rozgałęzione około stadium 43. PCV i ISV rosną w stereotypowym wzorcu angiogennym, który jest pod ścisłą kontrolą rozwojową.

Co ciekawe, knockdown sygnalizacji TIE-2 przez antysensowne morfaliny zmniejsza długość i złożoność ISV, podczas gdy ekspresja konstytutywnie aktywnej formy TIE-2 indukuje nadmierne rozgałęzianie ISV. Wskaźnik złożoności żył może być obliczony w celu oceny złożoności ISV i można wygenerować renderowane ścieżki w celu wizualizacji ogólnej architektury embrionalnego układu naczyniowego Xenopus tropicalis. Pierwotny protokół został opisany dla stosowania Xenopus laevis przez Levin and Colics i dostosowaliśmy go do Xenopus tropicalis.

Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Przed tą procedurą można przeprowadzić manipulacje genetyczne i farmakologiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, które geny i szlaki sygnałowe regulują rozwój naczyń krwionośnych. Korzystając z tej procedury, oznakowane naczynia krwionośne mogą być obrazowane w nienaruszonym zwierzęciu w czasie rzeczywistym, zapewniając potężne narzędzie do badania dynamiki rozwoju naczyń krwionośnych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wstrzyknąć acetylowany LDL diI do serca kijanki Xenopus tropicalis, aby uwidocznić jej unaczynienie.