Name: Wizualizacja i analiza ilościowa angiogenezy embrionalnej u Xenopus tropicalis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Poznaj metodę fluorescencyjną wizualizacji naczyń krwionośnych i analizy ich złożoności u kijanek Xenopus tropicalis. Technika ta umożliwia badanie angiogenezy embrionalnej in vivo poprzez wstrzyknięcie barwnika do serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało zainspirowane pracą Levine et al., która opisała tę eksperymentalną metodę i dostarczyła wyczerpującego opisu rozwoju naczyń krwionośnych u Xenopus laevis. Dziękujemy członkom naszego laboratorium za ich wkład. Badanie to było wspierane przez Inicjatywę Badawczą Uniwersytetu Yonsei z 2015 r. (2015-22-0095) oraz Program Rozwoju Bio i Technologii Medycznych Narodowej Fundacji Badawczej (NRF) finansowany przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości (NRF-2013M3A9D5072551)

Wszystkie eksperymenty były zgodne z protokołami zatwierdzonymi przez Yonsei University College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committees.
1. Przygotowanie zarodków Xenopus tropicalis
UWAGA: Zarodki Xenopus tropicalis zostały wyprodukowane zgodnie z wcześniejszym opisem10, z niewielką modyfikacją. Zarodki Xenopus tropicalis zostały sklasyfikowane zgodnie z tabelami Nieuwkoopa i Faber11 .
<ol>
	<li>Indukcja owulacji
	<ol>
		<li>Aby przygotować się do krycia, należy wstrzyknąć ludzką gonadotropinę kosmówkową (hCG) do grzbietowego worka limfatycznego pary żab (jednego samca i jednej samicy) w dniu poprzedzającym dzień krycia. Wstrzyknąć 20 jednostek na samicę żaby i 10 jednostek na samca. Trzymaj samca i samicę w tym samym zbiorniku na noc (przez ponad 18 godzin).</li>
		Aby przygotować szczepionkę<li>, następnego dnia wstrzyknij 200 jednostek hCG wstępnie zaszczepionej samicy i 100 jednostek hCG wstępnie zaszczepionemu samcowi; zaszczepiona samica zacznie składać jaja w ciągu około 3 godzin i będzie to robić przez cały dzień. Trzymaj parę samca i samicy razem do naturalnego krycia lub w oddzielnych zbiornikach do zapłodnienia in vitro (krok 1.2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapłodnienie 
	UWAGA: Jaja mogą być zapłodnione przez krycie naturalne lub zapłodnienie in vitro. W kryciu naturalnym jaja są zapładniane w miarę ich składania, a zatem nie można kontrolować czasu zapłodnienia. Alternatywnie, przygotowana samica żaby może być trzymana w osobnym zbiorniku, a niezapłodnione jaja mogą być zbierane do zapłodnienia in vitro, co generuje setki zarodków zapłodnionych w tym samym czasie. To ostatnie podejście jest przydatne, gdy mikroiniekcja ukierunkowana na blastomery zostanie wykonana przed znakowaniem naczyń. W tym podejściu jednak składa się w ofierze samca.
	<ol>
		<li>Naturalne krycie
		<ol>
			<li>Pozostaw zagruntowaną parę samic i samców w tym samym zbiorniku. Samiec ściska samicę, co prowadzi do natychmiastowego zapłodnienia złożonych jaj. Zbierz jajka szklaną lub plastikową pipetą i przenieś je na szalkę Petriego. Aby zapobiec przywieraniu jaj do pipety, należy pokryć wewnętrzną powierzchnię pipety 0,5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zapłodnienie in vitro (IVF)
		<ol>
			<li>Po zagruntowaniu oddziel zagruntowaną samicę od samca. Samica zacznie spontanicznie składać jaja po około 3 godzinach. Przenieś kilka złożonych jaj za pomocą pipety pokrytej BSA na szalkę Petriego i sprawdź ich jakość pod mikroskopem. Jeśli złożono zdrowe jaja (przezroczysty pigment, elastyczny w kształcie kuli), przygotuj się do wycięcia jąder z zaszczepionego samca.</li>
			<li>Przygotować 0,4% metanosulfonianu trikainy (MS222) do eutanazji i wstrzyknąć 300 μl do grzbietowego worka limfatycznego przygotowanego samca. Po około 10 minutach samiec straci zmysł równowagi i utrzyma się na powierzchni; Potwierdź, że samiec został poddany eutanazji, szczypiąc tylną nogę parą kleszczy i obserwując brak reakcji.</li>
			<li>Wyciąć dwa jądra, oczyścić je, szybko stukając nimi w niestrzępiący się papier, a następnie przenieść je do mikroprobówki zawierającej 1 ml 60% pożywki L-15 Leibovitz (60%) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS); szczegółowa procedura jest opisana w innym miejscu10.</li>
			<li>Delikatnie zmiel jądra tłuczkiem, aby wydobyć plemniki. Przy tym stężeniu (tj. 2 jądra w 1 ml 10% FBS w 60% L-15), kilka kropli roztworu jądra (0,1 ml) może zapłodnić około trzystu jaj. Pozostałe plemniki można przechowywać w temperaturze 4 °C w szczelnie zamkniętej probówce i wykorzystać do zapłodnienia in vitro następnego dnia.</li>
			<li>Wyciśnij jaja z samicy na małą szalkę Petriego. Przytrzymaj górną część samicy do góry nogami na dłoni i włóż palec wskazujący między jej tylne nogi. Rozłóż tylne nogi palcem wskazującym, a drugą ręką, aby odsłonić kloakę. Przyłóż kloakę do szalki Petriego. Posmaruj szalkę Petriego 0,5% BSA, aby równomiernie rozprowadzić jaja jako monowarstwę podczas IVF.</li>
			<li>Dodaj kilka kropli (0,1 ml) pożywki L-15 zawierającej plemniki do komórek jajowych. W przypadku zapłodnienia synchronicznego delikatnie wymieszaj roztwór nasienia w poprzek naczynia. Po 4 minutach w temperaturze pokojowej napełnij szalkę Petriego 0,01x zmodyfikowanym roztworem soli fizjologicznej Bartha (MBS), inkubuj przez 10 minut i zastąp roztwór roztworem 0,1x MBS. Zapłodnione jaja zostaną poddane pierwszemu rozszczepieniu po około 1 godzinie w temperaturze pokojowej. 1x MBS to 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,5 mM NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mMMgSO4 i 0,7 mM CaCl2, pH 7,5.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>(Opcjonalnie) Wstrzyknięcie antysensownych oligonukleotydów morfolinooligonukleotydów (MO) i/lub mRNA
	<ol>
		<li>Aby zbadać wpływ interesującego genu na tworzenie naczyń krwionośnych, należy wykonać mikroiniekcję antysensownego MO i/lub mRNA.</li>
		<li>W przypadku takich eksperymentów należy usunąć galaretę z jaj z 2% L-cysteiną w 1x MBS (pH 7,5-7,8). Zamień 0,1x MBS w naczyniu zawierającym zapłodnione zarodki z 2% L-cysteiną w 1x MBS. Delikatnie zakręć naczyniem, aby wymieszać roztwór. 
		UWAGA: Zwykle potrzeba około 5 minut, aby zarodki zostały odgalaretowate. Na tym etapie należy często monitorować jaja, aby upewnić się, że nie są nadmiernie narażone na działanie roztworu. Jeśli jaja są nadmiernie naświetlone, stracą elastyczność i staną się spłaszczone, co spowoduje nieprawidłowy rozwój i śmiertelność.</li>
		<li>Umyj pozbawione galaretki jajka pięć razy za pomocą 0,1x MBS. Wykonać mikroiniekcję w 4% Ficollu rozpuszczonym w 0,1x MBS. Zazwyczaj wstrzykuje się 4 ng MO i 600 pg mRNA na blastomer na etapie dwukomórkowym. Wstrzyknąć do jednej komórki, aby manipulować ekspresją genów tylko po jednej stronie zarodka. Jako grupę kontrolną należy użyć niewstrzykniętej strony tego samego zarodka.</li>
		<li>Jako kolejną kontrolę specyficzności manipulacji genami, wstrzyknij taką samą ilość kontrolnego MO (CoMO) lub kontrolnego mRNA (np. mRNA beta-galaktozydazy). CoMO musi mieć taką samą masę cząsteczkową jak MO specyficzny dla genu i nie może być ukierunkowany na żaden gen w genomie Xenopus. Aby ułatwić wizualizację wstrzykniętej strony, użyj MO znakowanego fluoresceiną lub wstrzyknij jednocześnie znacznik (np. mRNA EGFP).</li>
		<li>Pozostawić wstrzyknięte zarodki w 4% Ficoll na 2 godziny, a następnie przenieść je na nową 60-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną 0,1x MBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podnoszenie
	<ol>
		<li>Hodować zarodki w temperaturze 23 °C. Chociaż tempo rozwoju można spowolnić lub przyspieszyć, stosując odpowiednio temperatury poniżej lub powyżej 23 °C (zakres: 16-26 °C), zaleca się ich zwiększenie do 23 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>(Opcjonalnie) Leczenie odczynnikami farmakologicznymi
	<ol>
		<li>W przypadku manipulacji farmakologicznych należy podawać leki rozwijającym się zarodkom poprzez kąpiel</li>.
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie iniekcji DiI-AcLDL
<ol>
	<li>Wykonaj stożkową szklaną pipetę za pomocą standardowego ściągacza do mikropipet. Umieść rurkę ze szkła borokrzemianowego w ściągaczu do mikropipet i użyj następujących ustawień: ciśnienie, 200; ciepło, 30; ciągnąć, 30; prędkość, 120; czas, 200.</li>
	<li>Roztwór podstawowy DiI-AcLDL przechowywać w temperaturze 4 °C. Pobrać górną przezroczystą część roztworu do wstrzykiwań, ale nie cząstki wytrącone na dnie probówki. Wszelkie zanieczyszczenia w szklanej pipecie będą zakłócać prawidłowe wylewanie roztworu.</li>
	<li>Przygotować szklaną pipetę napełnić odpowiednią ilością roztworu DiI-AcLDL (~5 μL) za pomocą mikroładowarki.</li>
	<li>Stopniowo odetnij końcówkę szklanej pipety za pomocą cienkich kleszczy (numer 55). Ustawić system iniekcji z kontrolowanym ciśnieniem w taki sposób, aby jednorazowo wyrzucane było około 5 nl roztworu; 50-60 nL roztworu DiI-AcLDL wystarcza do zabarwienia naczyń jednego zarodka.</li>
	<li>Nie pozostawiaj pipety z DiI-AcLDL w powietrzu przez dłuższy czas, aby uniknąć wysuszenia. Końcówkę pipety należy zanurzyć w roztworze 0,04% MS222 w 0,1 x MBS. Tuż przed wstrzyknięciem go do zarodka (krok 4.2.1) sprawdź, czy taka sama ilość barwnika wyrzuca się.</li>
</ol>
3. Konfiguracja iniekcji
<ol>
	<li>Pleśń Sylgard
	<ol>
		<li>Aby przygotować małą foremkę Sylgard, wymieszaj bazę Sylgard i utwardzacz w stosunku wagowym 10 do 1. Napełnij około połowy małej szalki Petriego (szalka 35 mm lub 60 mm) tym zmieszanym roztworem, a następnie pozostaw ją do zestalenia się na około 48 godzin w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>znieczulenie
	<ol>
		<li>Użyj 0,04% MS222 w 1x MBS (pH 7,5-8,0) do znieczulenia. Gdy potrzebne jest długie znieczulenie (np. podczas obrazowania na żywo), użyj 0,04% MS222 w 0,1x MBS, aby zmniejszyć nierównowagę osmotyczną. Aby dostosować pH, dodaj kilka kropli NaOH (~20 μL) i sprawdź pH za pomocą papieru pH.</li>
		<li>Poczekaj, aż przeniesione zarodki przestaną się poruszać. Dotknij płetw grzbietowych zarodków i sprawdź, czy reagują, aby potwierdzić całkowite znieczulenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawianie zarodków do wstrzyknięcia
	<ol>
		<li>Wciąć powierzchnię utwardzonej formy Sylgard cienkim i ostrym ostrzem. Wykonaj wklęsłe wgłębienie w kształcie litery V, w którym umieścisz zarodki (patrz rysunek 2D). Umieścić znieczulony zarodek, brzusznie do góry, w lekko skośny sposób (około 30°) (ryc. 2D).</li>
		<li>Napełnij formę roztworem MS222 i umieść zarodki w formie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Iniekcja DiI-AcLDL
<ol>
	<li>Nacięcie skóry pokrywającej serce
	<ol>
		<li>Przygotuj dwie szpilki (minuterii, 0,10 mm) do przecięcia skóry pokrywającej serce. Mocno przymocuj każdy kołek do uchwytu na kołek; serce powinno być łatwe do zidentyfikowania podczas pulsowania (ryc. 2A-2C, różowy).</li>
		<li>Nakłuć skórę zarodka jedną szpilką. Włóż szpilkę przez otwór w przestrzeni między sercem a skórą (Rysunek 2C, pełna strzałka). Nie nakłuwać serca. Umieść włożoną część tej szpilki w obszarze, w którym zostanie wykonane nacięcie.</li>
		<li>Wykonaj liniowe nacięcie, delikatnie pocierając drugą szpilkę trzymaną na zewnątrz skóry o włożoną szpilkę. Delikatnie poszerz to nacięcie za pomocą dwóch szpilek, odsłaniając serce (Rysunek 2B' i 2D', strzałka). Pipeta wypełniona DiI-AcLDL może teraz bezpośrednio zbliżać się do serca (ryc. 2D').</li>
	</ol>
	</li>
	<li>zastrzyk
	<ol>
		<li>Włóż końcówkę załadowanej szklanej pipety do serca i wstrzyknij 50-60 nl roztworu DiI-AcLDL w około 10 impulsach wyrzutowych. Nie należy wstrzykiwać nadmiernej ilości roztworu, ponieważ powoduje to pęknięcie serca. Sprawdź, czy po wstrzyknięciu serce nadal bije. Po każdym wstrzyknięciu należy sprawdzić, czy taka sama ilość DiI-AcLDL jest wyrzucana; W przeciwnym razie końcówka pipety może zostać zablokowana (patrz krok 2.5).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rekonwalescencja i badania przesiewowe wzroku
	<ol>
		<li>Przenieś wstrzyknięte zarodki na nową szalkę Petriego wypełnioną 0,1x MBS w celu odzyskania sprawności. Po 5-10 minutach kijanki powinny odzyskać przytomność i zacząć się poruszać. W tym momencie można zobrazować oznakowane naczynia. Zaleca się wizualne badanie przesiewowe pomyślnie oznakowanych zarodków pod mikroskopem fluorescencyjnym (ryc. 3A i 3B). Jeśli do zarodka zostanie wstrzyknięta niewystarczająca ilość DiI-AcLDL, można go wstrzyknąć ponownie (ryc. 3C).</li>
		<li>Wyrzuć kijanki, które mają oznaczone inne narządy (ryc. 3D). Kontynuuj aż do uzyskania wymaganej liczby pomyślnie oznakowanych zarodków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>(Opcjonalnie) Utrwalenie zarodków
	<ol>
		<li>W celu dokładniejszego zobrazowania naczyń krwionośnych należy użyć mikroskopii konfokalnej; może być łatwiej ustalić oznakowane zarodki do mikroskopii konfokalnej. Najpierw znieczulić znakowane zarodki w 0,04% MS222 w 1x MBS (pH 7,5-8,0), a następnie utrwalić je w 4% paraformaldehydzie w 1X buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Utrwalone zarodki mogą być przechowywane przez kilka dni w temperaturze 4 °C; chronić wstrzykiwane próbki przed światłem, aby uniknąć fotowybielania DiI.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Obrazowanie DiI-AcLDL
<ol>
	<li>Obrazowanie stereoskopowe
	<ol>
		<li>Wykonaj zdjęcia pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym (ryc. 3), aby ocenić ogólną morfologię układu krwionośnego.</li>
		<li>Rozpuść 1% agarozy w 1x PBS dla stałych zarodków lub w 1x MBS dla żywych zarodków. Wlej stopioną agarozę na szalkę Petriego i poczekaj, aż zastygnie. Wykonaj płytkie wgłębienie na powierzchni żelu agarozowego, które będzie pasować do zarodka, który ma być zobrazowany, gdy leży na jego bocznej stronie. Napełnij naczynie buforem (roztwór MS222 dla znieczulonych zarodków lub 1x PBS dla zarodków stałych).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikroskopia fluorescencyjna (zestaw filtrów rodaminowych)
	<ol>
		<li>Ponieważ DiI jest barwnikiem wzbudzonym na zielono i emitującym czerwień, obraz odbywa się przy użyciu standardowego zestawu filtrów dla rodaminy lub fluoroforów związanych ze spektralnie (maksymalne wzbudzenie przy 554 nm i emisja przy 571 nm). Umieść wstrzyknięte zarodki we wgłębieniach w formie agarozowej i zrób zdjęcia (ryc. 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikroskopia konfokalna 
	UWAGA: W celu dokładniejszej analizy architektury naczyniowej należy użyć mikroskopii konfokalnej.
	<ol>
		<li>Jeśli używasz mikroskopu odwróconego, umieść zarodki na naczyniu ze szklanym dnem. Dodaj kilka kropli 1x PBS i unieruchamiaj je, umieszczając na wierzchu szkiełko nakrywkowe. Usuń nadmiar PBS. Jeśli mają być obrazowane żywe zarodki, należy użyć znieczulonych zarodków i użyć 0,015% MS222 w 0,1x MBS zamiast PBS.</li>
		<li>W przypadku obrazowania w małym powiększeniu użyj obiektywu 4X do 10X, aby znaleźć obszar zainteresowania; rostralna część tylnej żyły kardynalnej (PCV) jest przydatnym regionem do badania angiogenezy rozwojowej (ryc. 4, przerywane ramki).
		<ol>
			<li>Użyj ustawienia akwizycji dla czerwonego fluoroforu emisyjnego (takiego jak rodamina).</li>
			<li>Twórz obrazy z ułożonymi w stos, obrazując boczną połowę zarodka. Najpierw ustaw ostrość na PCV po bocznej stronie w pobliżu obiektywu, a następnie ustaw dolną granicę ostrości w miejscu, w którym ustawione są naczynia znajdujące się najbliżej obiektywu. Ustaw górną granicę w miejscu, w którym można ustawić ostrość na przyśrodkowej części obrazowanego PCV. Wyobraź sobie całą boczną połowę zarodka. Używaj oprogramowania, które przechowuje metadane dotyczące ustawień akwizycji, takie jak skale x, y i z, ponieważ są one wymagane do obliczenia długości naczyń.</li>
			<li>W razie potrzeby użyj trybu skanowania kafelków, aby zobrazować całe unaczynienie zarodka. Empirycznie określ liczbę płytek poziomych i pionowych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku obrazowania w dużym powiększeniu postępuj zgodnie z powyższymi procedurami, aby zobrazować rostralną część PCV i 4 najbardziej rostralne żyły międzysomomityczne (ISV) (ryc. 4, ramka przerywana). Dostosuj odpowiednio liczbę stosów (z-stack) i kafelków (tile scan).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja naczyń oznaczonych znakiem DiI
UWAGA: Naczynia oznaczone znakiem DiI można śledzić ręcznie lub za pomocą oprogramowania. Używamy "Simple neuryte tracer", darmowej wtyczki ImageJ (NIH), która umożliwia półautomatyczne śledzenie struktur przypominających rurki, takich jak naczynia krwionośne i neuryty12. Za pomocą tego bezpłatnego oprogramowania można obliczyć następujące parametry. Szczegółowa procedura korzystania z tego oprogramowania jest opisana w innym miejscu (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer)12. Poniżej używamy przykładów unaczynienia zarodków, w których sygnalizacja Tie2 jest zahamowana lub wzmocniona (Rysunek 4A-4C)5. Zarodki wstrzyknięte antysensownie Tie2MO wykazują zmniejszenie angiogenezy i skraca ISV (Figura 4B), podczas gdy jednoczesne wstrzyknięcie konstytutywnie aktywnego zmutowanego mRNA Tie2 (caTie2 mRNA) nadmiernie ratuje ten fenotyp, powodując wybujałe gałęzie ISV (Figura 4C).
<ol>
	<li>Długości niezależnych dostawców oprogramowania
	<ol>
		<li>Korzystając z prostego śledzenia neurytów, oblicz długość każdego śledzonego naczynia. Oblicz długości 4 najbardziej rostralnych niezależnych dostawców oprogramowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oddziały niezależnego dostawcy oprogramowania 
	UWAGA: W zarodkach typu dzikiego tylko kilka krótkich gałęzi wyrasta z najbardziej rostralnych ISV w stadium 42.
	<ol>
		<li>W Simple neuryt tracer śledź te małe naczynia po utworzeniu ISV, z którego pochodzą gałęzi podstawowej. Oblicz następujące parametry tych gałęzi pochodzących od niezależnych dostawców oprogramowania.</li>
		<li>Łączna liczba oddziałów
		<ol>
			<li>Po wyśledzeniu wszystkich niezależnych dostawców oprogramowania i skojarzonych gałęzi oblicz łączną liczbę gałęzi (Rysunek 5B-5D).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Kolejność oddziałów
		<ol>
			<li>Ponieważ prosty znacznik neurytów rejestruje kolejność każdej gałęzi (rysunek 5A), oblicz liczbę gałęzi dla każdej gałęzi. Większość naczyń w zarodkach typu dzikiego powinna być gałęziami pierwszorzędowymi (tj. ISV).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wskaźnik złożoności żył (VCI)
		<ol>
			<li>Ponieważ VCI jest użytecznym parametrem dla złożoności naczyń, który nadaje większą wagę gałęziom wyższego rzędu, oblicz VCI dla każdego zarodka, korzystając ze wzoru na rysunku 5A. Na przykład zarodki, którym wstrzyknięto Tie2MO, mają niższy VCI w porównaniu z kontrolą (Figura 5B i 5C), a zarodki wstrzyknięte mRNA caTie2 mają wyższe VCI (Figura 5D).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Herbert, S. P., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+endothelial+cell+behaviour+during+blood+vessel+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).</li>
<li>Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+vascular+morphogenesis+and+homeostasis+through+the+angiopoietin-Tie+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).</li>
<li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arteries+and+veins%3A+making+a+difference+with+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Arteries and veins: making a difference with zebrafish.</a> Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).</li>
<li>Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+endothelial+cells+allows+in+vivo%2C+continuous+characterization+of+the+vascular+development+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis.</a> Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+Mediates+Ca2%2B-Dependent+Inhibition+of+Tie2+Signaling+and+Acts+as+a+Developmental+Brake+During+Embryonic+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell-stage+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo.</a> Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).</li>
<li>Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Xenopus+laevis+tissues+to+determine+the+ability+of+motor+neurons+to+acquire+a+novel+target%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target.</a> PLoS One. 8 (2), 55541(2013).</li>
<li>Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+tropicalis+as+a+model+organism+for+genetics+and+genomics%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future.</a> Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).</li>
<li>Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+lysine+residues+of+plasma+lipoproteins+in+high+affinity+binding+to+cell+surface+receptors+on+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts.</a> J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).</li>
<li>Showell, C., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+collection+and+in+vitro+fertilization+of+the+western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293(2009).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+Table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal Table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , North-Holland Publishing Company. Guilders. Amsterdam. (1956).</li>
<li>Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Neurite+Tracer%3A+open+source+software+for+reconstruction%2C+visualization+and+analysis+of+neuronal+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes.</a> Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).</li>
<li>Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+TrkB+signaling+in+presynaptic+retinal+ganglion+cells+mediates+axon+arbor+growth+and+synapse+maturation+during+the+establishment+of+retinotectal+synaptic+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity.</a> J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).</li>
<li>Cha, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionarily+repurposed+networks+reveal+the+well-known+antifungal+drug+thiabendazole+to+be+a+novel+vascular+disrupting+agent%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent.</a> PLoS Biol. 10 (8), 1001379(2012).</li>
<li>Ny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+Xenopus+laevis+reporter+model+to+study+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis.</a> Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).</li>
<li>Bussmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arteries+provide+essential+guidance+cues+for+lymphatic+endothelial+cells+in+the+zebrafish+trunk%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk.</a> Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).</li>
<li>Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+acetylated+low-density+lipoprotein+uptake+and+low+tyrosine+kinase+with+immunoglobulin+and+epidermal+growth+factor+homology+domains-2+%28Tie2%29+promoter+activity+distinguish+sinusoids+from+other+vessel+types+in+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow.</a> Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół został po raz pierwszy opracowany przez Ali H. Brivanlou i współpracowników w celu zbadania zdarzeń rozwojowych podczas tworzenia naczyń krwionośnych u Xenopus laevis4, ale, jak pokazano w tym manuskrypcie, można go zastosować do innych małych zwierząt. Wstrzyknięcie barwnika do serca jest proste do wykonania, a całą sieć naczyniową można zobrazować pod mikroskopem fluorescencyjnym, a także mikroskopem konfokalnym. Jeśli barwnik zostanie wstrzyknięty do serca ...

Waskulogeneza, tworzenie nowych naczyń krwionośnych z nowo powstałych komórek śródbłonka, oraz angiogeneza, tworzenie nowych naczyń z wcześniej istniejących naczyń, to dwa odrębne procesy, które kształtują unaczynienie embrionalne1. Wszelkie rozregulowanie tych procesów skutkuje różnymi chorobami serca i nieprawidłowościami strukturalnymi naczyń. Ponadto wzrost guza wiąże się z niekontrolowanym wzrostem naczyń. W związku z tym mechanizmy molekularne leżące u podstaw waskulogenezy i angiogenezy są przedmiotem intensywnych badań2.
Xenopus i danio pręgowany są atrakcyjnymi modelami kręgowców do badań nad waskulogenezą i angiogenezą, z kilku powodów. Po pierwsze, ich zarodki są małe; W związku z tym stosunkowo łatwo jest zobrazować całe unaczynienie. Po drugie, rozwój embrionalny jest szybki; Potrzeba tylko kilku dni, aby rozwinęła się cała naczyniowość, w tym czasie można zobrazować rozwijające się naczynia krwionośne. Po trzecie, interwencje genetyczne i farmakologiczne przed i w trakcie tworzenia naczyń krwionośnych są łatwe do wykonania, na przykład poprzez mikrowstrzyknięcie antysensownych nukleotydów morfolinowych (MO) do rozwijającego się zarodka lub poprzez zastosowanie leków w kąpieli3,4,5.
Unikalną przewagą Xenopus nad danio pręgowanym jest to, że manipulacje embriologiczne mogą być wykonywane, ponieważ Xenopus podąża za stereotypowymi holoblastycznymi podziałami, a mapa losu embrionalnego jest dobrze zdefiniowana6. Na przykład, możliwe jest wygenerowanie zarodka, w którym tylko jedna boczna strona jest genetycznie manipulowana poprzez wstrzyknięcie antysensownego MO do jednej komórki w stadium dwukomórkowym. Możliwe jest również przeszczepienie zawiązka serca z jednego zarodka do drugiego w celu określenia, czy gen pełni swoją funkcję poprzez mechanizm wewnętrzny czy zewnętrzny komórki7. Chociaż techniki te zostały w większości opracowane w przypadku Xenopus laevis, który jest allotetraploidalny i dlatego nie jest idealny do badań genetycznych, można je bezpośrednio zastosować do Xenopus tropicalis, blisko spokrewnionego gatunku diploidalnego8.
Jednym ze sposobów wizualizacji unaczynienia u żywego zarodka Xenopus jest wstrzyknięcie barwnika fluorescencyjnego w celu oznaczenia naczyń krwionośnych. Acetylowana lipoproteina o niskiej gęstości (AcLDL) znakowana cząsteczką fluorescencyjną, taką jak DiI, jest bardzo przydatną sondą. W przeciwieństwie do nieacetylowanego LDL, AcLDL nie wiąże się z receptorem LDL9, ale jest endocytozowany przez makrofagi i komórki śródbłonka. Wstrzyknięcie DiI-AcLDL do serca żywego zwierzęcia powoduje specyficzne znakowanie fluorescencyjne komórek śródbłonka, a całe unaczynienie można zobrazować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w żywych lub utrwalonych zarodkach4.
Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły wizualizacji i kwantyfikacji naczyń krwionośnych za pomocą DiI-AcLDL u Xenopus tropicalis (Rysunek 1). Przedstawiamy kluczowe punkty praktyczne, wraz z przykładami udanych i nieudanych eksperymentów. Ponadto udostępniamy prostą metodę ilościowej analizy złożoności naczyń krwionośnych, która może być przydatna w ocenie wpływu czynników genetycznych i środowiskowych na kształtowanie sieci naczyniowej.

<table><tbody><tr><td>35 mm szalka Petriego</td><td>SPL</td><td>10035</td><td>Rama formy Sylgard</td></tr><tr><td>60 mm szalka Petriego</td><td>SPL</td><td>10060</td><td>Taca do wychowywania zarodków</td></tr><tr><td>Szkło borokrzemianowe</td><td>Instrument Sutter</td><td>B100-50-10</td><td>Igła do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3059-10G</td><td>Odczynnik powlekający</td></tr><tr><td>CaCl2D.S.P.GR</td> <td>Odczynnik</td><td></td><td>0,1x MBS składnik</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Superior</td><td>HSU-0111520</td><td>Do obrazowania konfokalnego</td></tr><tr><td>DiI-AcLDL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3484</td><td>Roztwór do barwienia naczyń</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH.30919.02</td><td>Do przechowywania jądra</td></tr><tr><td>Oświetlacz światłowodowy</td><td>World Precision Instruments</td><td>Z-LITE-Z</td><td>Light</td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma</td><td>F4375</td><td>Bufor do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Ściągacz do mikropipet</td><td>Instrument Sutter</td><td>P-97</td><td>Ściągacz igieł iniekcyjnych</td></tr><tr><td>Kleszcz</td><td>Fine Science Tool</td><td>11255-20</td><td>Do wylęgu zarodków i cięcia końcówek igieł</td></tr><tr><td>Naczynie ze szklanym dnem</td><td>SPL</td><td>100350</td><td>Do obrazowania konfokalnego</td></tr><tr><td>hCG</td><td>MNS Korea Do</td><td></td><td>gruntowania żab</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Środek buforujący</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Lab. Companion</td><td>ILP-02</td><td>Do hodowli zarodków</td></tr><tr><td>KCl</td><td>DAEJUNG</td><td>6566-4400</td><td>MBS</td></tr><tr><td>składnik L15 medium</td><td>Gibco</td><td>11415-114</td><td>Do przechowywania</td></tr><tr><td>jądra L-cysteina</td><td>Sigma</td><td>168149-100G</td><td>Odczynnik do usuwania galaretki</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td>składnik MBS</td></tr><tr><td>Mikroprobówka</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C-S Do</td><td>przechowywania jądra</td></tr><tr><td>MS222</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td>Proszek znieczulający</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>DAEJUNG</td><td>7647-14-5</td><td>Składnik MBS</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S-0899</td><td>Odczynnik regulujący pH</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Utrwalacze</td></tr><tr><td>PBS</td><td>BIOSESANG</td><td>P2007</td><td>Bufor do obrazowania</td></tr><tr><td>papieru pH</td><td>Sigma</td><td>P4536-100EA</td><td>Do potwierdzania pH</td></tr><tr><td>WTRYSKIWACZ PICO-LITR</td><td>Instrumenty Waner</td><td>PLI-100A</td><td>Do iniekcji</td></tr><tr><td>Pin</td><td>Pinservice</td><td>26002-10</td><td>Do nacięcia</td></tr><tr><td>Uchwyt na piny</td><td>Scitech Korea</td><td>26016-12</td><td>Do nacięcia</td></tr><tr><td>Precyzyjny mikroskop lornetkowy stereo zoom</td><td>Świat Przyrządy precyzyjne</td><td>PZMIII</td><td>do badań przesiewowych</td></tr><tr><td>Standardowy mikromanipulator sterowany ręcznie&nbsp;</td><td>Waner instruments</td><td>W4 64-0056</td><td>Do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Zestaw</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>do iniekcji DiI</td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Korea Ace Scientific Co.</td><td>Ym. B78-400</td><td>Do pobierania jaj i zarodków</td></tr></tbody></table>

wizualizacja i analiza ilościowa angiogenezy embrionalnej u xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Naczynia krwionośne dostarczają tlen i składniki odżywcze do całego ciała, a tworzenie sieci naczyniowej jest pod ścisłą kontrolą rozwoju. Skuteczna wizualizacja naczyń krwionośnych in vivo i wiarygodna kwantyfikacja ich złożoności są kluczem do zrozumienia biologii i chorób sieci naczyniowej. W tym miejscu przedstawiamy szczegółową metodę wizualizacji naczyń krwionośnych za pomocą dostępnego na rynku barwnika fluorescencyjnego, kompleksu lipoprotein DiI o niskiej gęstości acetylowanej z ludzkiego osocza (DiI-AcLDL) oraz ilościowego określenia ich złożoności w Xenopus tropicalis. Naczynia krwionośne można znakować za pomocą prostego wstrzyknięcia DiI-AcLDL do bijącego serca zarodka, a naczynia krwionośne w całym zarodku można obrazować w żywych lub utrwalonych zarodkach. W połączeniu z zaburzeniami genów poprzez celowaną mikroiniekcję kwasów nukleinowych i/lub stosowanie odczynników farmakologicznych w kąpieli, rola genu lub szlaku sygnałowego w rozwoju naczyń krwionośnych może być zbadana w ciągu jednego tygodnia bez uciekania się do wyrafinowanych genetycznie zmodyfikowanych zwierząt. Ze względu na dobrze zdefiniowany układ żylny Xenopus i jego stereotypową angiogenezę, kiełkowanie wcześniej istniejących naczyń, złożoność naczyń można skutecznie określić ilościowo po eksperymentach perturbacyjnych. Ten stosunkowo prosty protokół powinien służyć jako łatwo dostępne narzędzie w różnych dziedzinach badań sercowo-naczyniowych.

Harmonogram eksperymentów (Rysunki 1 i 2)
Krótko po zapłodnieniu można przeprowadzić ukierunkowaną mikroiniekcję w celu modulacji ekspresji genów. Na przykład można wstrzyknąć antysensowne MO, które specyficznie wiąże się z kodonem startowym endogennego mRNA Tie2, hamując translację docelowego mRNA Tie2 poprzez zawadę steryczną. MO można sprzężyć z fluoresceiną w celu łatwego wizualnego przesiewania pomyślnie wstrzykniętych embrion...

Ten protokół demonstruje metodę opartą na fluorescencji do wizualizacji układu naczyniowego i ilościowego określenia jego złożoności u Xenopus tropicalis. Naczynia krwionośne można obrazować kilka minut po wstrzyknięciu barwnika fluorescencyjnego do bijącego serca zarodka po manipulacjach genetycznych i/lub farmakologicznych w celu zbadania rozwoju układu sercowo-naczyniowego in vivo.

Wizualizacja i analiza ilościowa angiogenezy embrionalnej u Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja układu naczyniowego kijanek Xenopus tropicalis. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii układu sercowo-naczyniowego, takie jak mechanizmy regulacji angiogenezy. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wizualizacji naczyń krwionośnych w nienaruszonym embrionie hodowanym w studzience za pomocą prostego wstrzyknięcia barwnika fluorescencyjnego.Należy rozpocząć od napełnienia stożkowej szklanej mikropipety za pomocą mikroladownika około pięciu µL przejrzystego roztworu acetylowanego LDL z diI, dbając o to, aby nie pobrać żadnych wytrąconych cząstek. Pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą precyzyjnej pęsety nr 55 należy odciąć końcówkę pipety, aby dostosować objętość wprowadzonego kompleksu, a następnie ustawić system wtryskiwania sterowany ciśnieniem tak, aby podczas każdego wtrysku podawano około pięciu nL roztworu. Następnie końcówkę pipety zanurza się w 0,04% MS-222 w 0,1X modyfikowanym roztworze soli Bartha (MBS) w specjalnie wykonanej formie z Sylgardu.Następnie przenieś zarodek Xenopus tropicalis do formy Sylgard i potwierdź pełną sedację, sprawdzając brak reakcji na stymulację płetwy grzbietowej. Pod mikroskopem stereoskopowym umieść zarodek stroną brzuszną do góry w V-kształtnym wgłębieniu formy, w lekko ukośnej pozycji. Mocno zamocuj dwie szpilki minutian o średnicy 0,1 mm w uchwycie i użyj jednej szpilki, aby przebić skórę nad sercem, które powinno widocznie tętnić.Wprowadź szpilkę przez otwór w przestrzeni między sercem a skórą, nie przebijając serca, i umieść włożoną końcówkę w obszarze, w którym zostanie wykonane nacięcie. Następnie potrzyj drugą szpilkę o tę wprowadzoną, aby wykonać liniowe nacięcie, a następnie użyj obu szpilek razem, aby delikatnie poszerzyć nacięcie, odsłaniając serce. Aby wstrzyknąć roztwór acetylowanego LDL z DiI, wprowadź końcówkę szklanej pipety do serca i wstrzyknij od 50 do 60 nano litrów acetylowanego LDL z DiI w około 10 impulsach wypychania.Po podaniu całego roztworu barwnika należy potwierdzić, że serce nadal bije, a następnie przenieść embrion do nowej szalki Petriego zawierającej 0,1X MBS. Po upływie od pięciu do 10 minut kijanek powinny dojść do siebie po znieczuleniu i zacząć się poruszać. Po wstrzyknięciu odpowiedniej liczby embrionów należy przeprowadzić wizualną selekcję prawidłowo oznakowanych, znieczulonych embrionów pod mikroskopem fluorescencyjnym, odrzucając zwierzęta, u których oznakowano inne organy.Zarodki, które nie zostały w dostatecznym stopniu oznakowane, można poddać ponownej iniekcji. Następnie należy zarejestrować obrazy prawidłowo oznakowanych zarodków. Aby uzyskać dokładniejsze obrazy naczyń krwionośnych, ponownie znieczulone zarodki należy utrwalić w 4% paraformaldehydzie przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, z osłoną przed światłem, w celu wizualizacji za pomocą mikroskopii konfokalnej.Jeśli do serca wstrzyknie się odpowiednią ilość diI acetylowanego LDL, żyła główna tylna, czyli PCV, powinna być natychmiast widoczna pod mikroskopem fluorescencyjnym. Żyły międzysomityczne, czyli ISV, wyłaniają się grzbietowo z PCV w fali biegnącej od przodu do tyłu, która rozpoczyna się w stadium 36 i kończy około stadium 40 do 41, stając się lekko rozgałęzionymi około stadium 43. PCV i ISV rosną według stereotypowego wzorca angiogennego, który znajduje się pod ścisłą kontrolą rozwojową.Co ciekawe, wyciszenie sygnalizacji TIE-2 za pomocą morfolino antysensownych zmniejsza długość i złożoność naczyń ISV, natomiast ekspresja konstytutywnie aktywnej formy TIE-2 indukuje nadmierne rozgałęzianie się ISV. W celu oceny złożoności naczyń ISV można obliczyć wskaźnik złożoności żył (Vein Complexity Index), a w celu wizualizacji ogólnej architektury naczyń krwionośnych embrionu Xenopus tropicalis można wygenerować wyrenderowane ścieżki. Oryginalny protokół został opisany dla Xenopus laevis przez Levina i Colicsa, a my zaadaptowaliśmy go dla Xenopus tropicalis.Po opanowaniu tej techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, można ją zrealizować w ciągu jednej godziny. Przed tym zabiegiem można przeprowadzić manipulacje genetyczne i farmakologiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. dotyczące tego, które geny i szlaki sygnałowe regulują rozwój naczyń krwionośnych. Dzięki zastosowaniu tej procedury możliwe jest obrazowanie oznakowanego układu naczyniowego u żywego zwierzęcia w czasie rzeczywistym, co stanowi potężne narzędzie do badania dynamiki rozwoju naczyń.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wstrzyknąć acetylowany LDL znakowany diI do serca kijanki Xenopus tropicalis w celu wizualizacji jej naczyń krwionośnych.

visualization-quantitative-analysis-embryonic-angiogenesis-xenopus

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Przedstawiamy metodę immunohistochemii całego preparatu oraz konfokalnej mikroskopii skaningowej z wielokrotnym znakowaniem w celu analizy tworzenia złożonej sieci naczyniowej w skórze kończyny zarodka myszy.

Analiza immunohistochemiczna całego preparatu dla naczyń krwionośnych skóry kończyny zarodkowej: model systemowy do badania morfogenezy rozgałęzień naczyniowych w zarodku

Wykorzystując ilościową PCR, demonstrujemy, w jaki sposób uznany model CAM kurczaka może być użyty do ilościowej analizy przerzutowania ludzkich komórek nowotworowych do odległych narządów.

Ilościowa analiza przerzutów nowotworowych z wykorzystaniem modelu zarodka ptaka

Xenopus laevis dostarcza idealnego systemu modelowego do badania specyfikacji losu komórki i funkcji fizjologicznych poszczególnych komórek siatkówki w pierwotnej hodowli komórkowej. Tutaj przedstawiamy technikę preparowania tkanek siatkówki i generowania pierwotnych kultur komórkowych, które są obrazowane pod kątem aktywności wapnia i analizowane przez hybrydyzację in situ.

Sekcja, hodowla i analiza embrionalnej tkanki siatkówki Xenopus laevis

Ten film opisuje metodę mikroiniekcji do dostarczania komórek raka piersi do przestrzeni okołobiałkowej transgenicznych embrionów danio pręgowanego. Po inkubacji wizualizujemy zarodek pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby obserwować inwazję, rozprzestrzenianie się i przerzuty komórek rakowych.

Analiza inwazyjności zPDX: badanie inwazyjnego zachowania przerzutowych komórek rakowych w ksenoprzeszczepach zarodków danio pręgowanego

W embrionach Xenopus, komórki z dachu blastocoelu są pluripotencjalne i mogą być zaprogramowane do generowania różnych tkanek. W tym miejscu opisujemy protokoły stosowania eksplantatów dachowych z blastocoelu jako systemu testowego do badania kluczowych cech in vivo i in vitro wczesnego rozwoju neuronalnego.

Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Celem tej metody jest wygenerowanie in vivo modelu angiogenezy guza poprzez ksenografowanie komórek nowotworowych ssaków do zarodka danio pręgowanego, który ma fluorescencyjnie znakowane naczynia krwionośne. Obrazując ksenoprzeszczep i związane z nim naczynia, można uzyskać ilościowy pomiar odpowiedzi angiogennej.

Obrazowanie in vivo i kwantyfikacja odpowiedzi angiogennej gospodarza w ksenoprzeszczepach guza danio pręgowanego

Prezentowany tutaj jest protokół do analizy hybrydyzacji RNA in situ u ryb danio pręgowanych oraz testu tworzenia probówek w indukowanych pluripotencjalnych komórkach śródbłonka pochodzących od pacjenta w celu zbadania roli endoglinu w tworzeniu naczyń krwionośnych.

Hybrydyzacja in situ w całości w zarodkach danio pręgowanego i test tworzenia rurek w iPSC-EC w celu zbadania roli endoglinu w rozwoju naczyniowym

Tutaj opisujemy narzędzia i metody obliczeniowe, które umożliwiają wizualizację i analizę trzy- i czterowymiarowych danych obrazowych zarodków myszy w kontekście osiowego wydłużania i segmentacji, uzyskanych przez optyczną tomografię projekcyjną in toto oraz przez obrazowanie na żywo i barwienie immunofluorescencyjne w całości za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Trój- i czterowymiarowe podejścia do wizualizacji i analizy w celu badania wydłużenia osiowego i segmentacji kręgowców

Ten test wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała embrionalne hodowane w żelu 3D-collagen do analizy procesów biologicznych, które kontrolują angiogenezę kiełkowania in vitro. Technika ta może być stosowana do testowania leków, modelowania chorób oraz do badania określonych genów w kontekście delecji, które są śmiertelne dla zarodka.

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

Opisujemy protokół ksenotransplantacji do żółtka przezroczystych zarodków danio pręgowanego, który jest zoptymalizowany za pomocą prostej, szybkiej metody oceny poziomu. Analizy po wstrzyknięciu obejmują przeżycie i ocenę obciążenia chorobowego ksenoprzeszczepionymi komórkami za pomocą cytometrii przepływowej.

Prosta, szybka i skuteczna metoda analizy ksenotransplantacji guza w przezroczystych zarodkach danio pręgowanego

Poznaj metodę fluorescencyjną wizualizacji naczyń krwionośnych i analizy ich złożoności u kijanek Xenopus tropicalis. Technika ta umożliwia badanie angiogenezy embrionalnej in vivo poprzez wstrzyknięcie barwnika do serca.

Wizualizacja i analiza ilościowa angiogenezy embrionalnej u Xenopus tropicalis

Przeglądaj więcej filmów