Wizualizacja i analiza ilościowa angiogenezy embrionalnej u Xenopus tropicalis
25 maja 2017
Ten protokół demonstruje metodę opartą na fluorescencji do wizualizacji układu naczyniowego i ilościowego określenia jego złożoności u Xenopus tropicalis. Naczynia krwionośne można obrazować kilka minut po wstrzyknięciu barwnika fluorescencyjnego do bijącego serca zarodka po manipulacjach genetycznych i/lub farmakologicznych w celu zbadania rozwoju układu sercowo-naczyniowego in vivo.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja układu naczyniowego kijanek Xenopus tropicalis. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii układu sercowo-naczyniowego, takie jak mechanizmy regulacji angiogenezy. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wizualizacji naczyń krwionośnych w nienaruszonym embrionie hodowanym w studzience za pomocą prostego wstrzyknięcia barwnika fluorescencyjnego.
Należy rozpocząć od napełnienia stożkowej szklanej mikropipety za pomocą mikroladownika około pięciu µL przejrzystego roztworu acetylowanego LDL z diI, dbając o to, aby nie pobrać żadnych wytrąconych cząstek. Pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą precyzyjnej pęsety nr 55 należy odciąć końcówkę pipety, aby dostosować objętość wprowadzonego kompleksu, a następnie ustawić system wtryskiwania sterowany ciśnieniem tak, aby podczas każdego wtrysku podawano około pięciu nL roztworu. Następnie końcówkę pipety zanurza się w 0,04% MS-222 w 0,1X modyfikowanym roztworze soli Bartha (MBS) w specjalnie wykonanej formie z Sylgardu.
Następnie przenieś zarodek Xenopus tropicalis do formy Sylgard i potwierdź pełną sedację, sprawdzając brak reakcji na stymulację płetwy grzbietowej. Pod mikroskopem stereoskopowym umieść zarodek stroną brzuszną do góry w V-kształtnym wgłębieniu formy, w lekko ukośnej pozycji. Mocno zamocuj dwie szpilki minutian o średnicy 0,1 mm w uchwycie i użyj jednej szpilki, aby przebić skórę nad sercem, które powinno widocznie tętnić.
Wprowadź szpilkę przez otwór w przestrzeni między sercem a skórą, nie przebijając serca, i umieść włożoną końcówkę w obszarze, w którym zostanie wykonane nacięcie. Następnie potrzyj drugą szpilkę o tę wprowadzoną, aby wykonać liniowe nacięcie, a następnie użyj obu szpilek razem, aby delikatnie poszerzyć nacięcie, odsłaniając serce. Aby wstrzyknąć roztwór acetylowanego LDL z DiI, wprowadź końcówkę szklanej pipety do serca i wstrzyknij od 50 do 60 nano litrów acetylowanego LDL z DiI w około 10 impulsach wypychania.
Po podaniu całego roztworu barwnika należy potwierdzić, że serce nadal bije, a następnie przenieść embrion do nowej szalki Petriego zawierającej 0,1X MBS. Po upływie od pięciu do 10 minut kijanek powinny dojść do siebie po znieczuleniu i zacząć się poruszać. Po wstrzyknięciu odpowiedniej liczby embrionów należy przeprowadzić wizualną selekcję prawidłowo oznakowanych, znieczulonych embrionów pod mikroskopem fluorescencyjnym, odrzucając zwierzęta, u których oznakowano inne organy.
Zarodki, które nie zostały w dostatecznym stopniu oznakowane, można poddać ponownej iniekcji. Następnie należy zarejestrować obrazy prawidłowo oznakowanych zarodków. Aby uzyskać dokładniejsze obrazy naczyń krwionośnych, ponownie znieczulone zarodki należy utrwalić w 4% paraformaldehydzie przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, z osłoną przed światłem, w celu wizualizacji za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Jeśli do serca wstrzyknie się odpowiednią ilość diI acetylowanego LDL, żyła główna tylna, czyli PCV, powinna być natychmiast widoczna pod mikroskopem fluorescencyjnym. Żyły międzysomityczne, czyli ISV, wyłaniają się grzbietowo z PCV w fali biegnącej od przodu do tyłu, która rozpoczyna się w stadium 36 i kończy około stadium 40 do 41, stając się lekko rozgałęzionymi około stadium 43. PCV i ISV rosną według stereotypowego wzorca angiogennego, który znajduje się pod ścisłą kontrolą rozwojową.
Co ciekawe, wyciszenie sygnalizacji TIE-2 za pomocą morfolino antysensownych zmniejsza długość i złożoność naczyń ISV, natomiast ekspresja konstytutywnie aktywnej formy TIE-2 indukuje nadmierne rozgałęzianie się ISV. W celu oceny złożoności naczyń ISV można obliczyć wskaźnik złożoności żył (Vein Complexity Index), a w celu wizualizacji ogólnej architektury naczyń krwionośnych embrionu Xenopus tropicalis można wygenerować wyrenderowane ścieżki. Oryginalny protokół został opisany dla Xenopus laevis przez Levina i Colicsa, a my zaadaptowaliśmy go dla Xenopus tropicalis.
Po opanowaniu tej techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, można ją zrealizować w ciągu jednej godziny. Przed tym zabiegiem można przeprowadzić manipulacje genetyczne i farmakologiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. dotyczące tego, które geny i szlaki sygnałowe regulują rozwój naczyń krwionośnych. Dzięki zastosowaniu tej procedury możliwe jest obrazowanie oznakowanego układu naczyniowego u żywego zwierzęcia w czasie rzeczywistym, co stanowi potężne narzędzie do badania dynamiki rozwoju naczyń.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wstrzyknąć acetylowany LDL znakowany diI do serca kijanki Xenopus tropicalis w celu wizualizacji jej naczyń krwionośnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia metodę opartą na fluorescencji, służącą do wizualizacji układu naczyniowego oraz ilościowej oceny jego złożoności u Xenopus tropicalis. Technika ta umożliwia obrazowanie naczyń krwionośnych wkrótce po wstrzyknięciu barwnika fluorescencyjnego do serca zarodka, co ułatwia badania nad rozwojem układu sercowo-naczyniowego in vivo.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia układu sercowo-naczyniowego
- Angiogeneza
- Biologia rozwoju
Wstęp
- Xenopus tropicalis jest organizmem modelowym do badania rozwoju kręgowców.
- Zrozumienie rozwoju naczyń krwionośnych jest kluczowe dla uzyskania wiedzy na temat różnych chorób.
- Techniki obrazowania fluorescencyjnego usprawniają wizualizację struktur biologicznych.
- Metoda ta pozwala na obserwację zmian naczyniowych w czasie rzeczywistym.
Cel badania
- W celu wizualizacji układu naczyniowego kijanek Xenopus tropicalis.
- W celu zbadania regulacji angiogenezy.
- W celu zapewnienia prostej i skutecznej metody badania rozwoju układu sercowo-naczyniowego.
Zastosowane metody
- Wstrzyknięcie barwnika fluorescencyjnego do serca zarodka.
- Użycie mikrolodera i szpiczastej szklanej mikropipety w celu precyzyjnego podania barwnika.
- Wizualizacja naczyń krwionośnych pod mikroskopem stereotypowym.
- Zastosowanie manipulacji genetycznych i farmakologicznych w celu zbadania ich wpływu na układ naczyniowy.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja naczyń krwionośnych w nienaruszonych embrionach.
- Ilościowe określenie złożoności naczyniowej uzyskane dzięki obrazowaniu.
- Poznanie dynamiki rozwoju układu sercowo-naczyniowego.
- Wykazana skuteczność metody iniekcji barwnika fluorescencyjnego.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę badania rozwoju naczyń krwionośnych.
- Obrazowanie fluorescencyjne jest potężnym narzędziem do analizy w czasie rzeczywistym.
- Podejście to może usprawnić dalsze badania nad biologią układu sercowo-naczyniowego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia bezpośrednią wizualizację i kwantyfikację złożoności naczyniowej w modelu kręgowca, wspierając wczesną walidację celów w szlakach angiogenezy. Dostarczając ilościowych odczytów wypączkowywania i rozgałęziania naczyń, ułatwia ona mechanistyczną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów naczyniowych przed przystąpieniem do kampanii identyfikacji wiodących związków. System Xenopus tropicalis stanowi istotną w kontekście chorób platformę do oceny fenotypów angiogennych z pewnością prognostyczną w przedklinicznych badaniach sercowo-naczyniowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących regulatorów angiogenezy, takich jak sygnalizacja TIE-2, poprzez bezpośrednią obserwację wzorców kiełkowania naczyń.
- Wartość operacyjna: Zapewnia szybki, tygodniowy schemat pracy w celu oceny wpływu genów lub szlaków sygnalizacyjnych na rozwój naczyniowy bez konieczności stosowania modeli modyfikowanych genetycznie.
- Wartość prognostyczna: Ilościowe wyniki, takie jak indeks złożoności żył (Vein Complexity Index), wspierają obiektywną ocenę efektów modulacji celu w celu podejmowania decyzji dotyczących selekcji projektów w portfelu.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Generuje standaryzowane, powtarzalne znakowanie naczyń krwionośnych, kompatybilne z późniejszymi etapami obrazowania i analizy.
- Wynik ilościowy: Umożliwia pomiar długości żył międzysomitycznych oraz stopnia złożoności rozgałęzień jako odczyty zależne od dawki w procesie przesiewowym związków.
- Skalowalność: Prosta procedura wstrzykiwania barwnika i obrazowania umożliwia średnioprzepustową ocenę perturbacji farmakologicznych lub genetycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje stereotypową angiogenezę u Xenopus tropicalis, dostarczając wiedzy na temat ludzkich szlaków rozwoju naczyniowego.
- Ciągłość translacyjna: Łączy wstępne odkrycia z walidacją przedkliniczną poprzez konserwatywne mechanizmy angiogenne.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia szybkie testowanie modulatorów szlaków w celu wyjaśnienia biologii celu przed zainwestowaniem w badania na modelach ssaków.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć – od testowania hipotez dotyczących celu po identyfikację związków wiodących – dostarczając danych o fenotypie naczyniowym, które stanowią podstawę do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w programach skoncentrowanych na angiogenezie.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez łączenie zaburzeń genetycznych lub farmakologicznych z mierzalnymi zmianami w architekturze naczyniowej.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych wyników opartych na obrazowaniu, odpowiednich do oceny wpływu związków na pękawanie angiogenne.
- Analityka: Zapewnia ilościowe wskaźniki złożoności naczyniowej, które umożliwiają obiektywne porównania między różnymi warunkami doświadczalnymi.
- Badania translacyjne: Wykorzystuje konserwatywne mechanizmy angiogenezy, aby zapewnić ciągłość między modelami embrionalnymi a naczyniowymi systemami ssaków.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy ponowną platformę fenotypowania naczyniowego, którą można zastosować w wielu projektach dotyczących celów angiogennych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów angiogennych poprzez bezpośrednią, ilościową wizualizację sieci naczyniowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje ocenę naczyniową za pomocą prostego wstrzyknięcia barwnika i powtarzalnego obrazowania, minimalizując zmienność międzyeksperymentalną.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów naczyniowych, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia w późnych etapach programów sercowo-naczyniowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację modyfikatorów angiogenezy skorygowaną o ryzyko, w oparciu o ilościowe wyniki fenotypowe.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach mikrochirurgicznych w zakresie manipulacji embrionami oraz mikroiniekcji w obszarze serca.
- Zależne od infrastruktury mikroskopii fluorescencyjnej w celu wizualizacji naczyń i rejestracji obrazów.
- Wymaga standaryzacji etapów rozwoju embrionów oraz czasu iniekcji w celu uzyskania spójnego znakowania naczyń.
- Wiąże się z koniecznością rozważenia adaptacji przy przenoszeniu wyników na inne systemy modelowe lub w kontekście istotności dla ludzi.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zależność od dostępności embrionów oraz potrzebę dokładnej optymalizacji stężenia barwnika, aby uniknąć niespecyficznego znakowania.
