Wizualizacja i analiza ilościowa angiogenezy embrionalnej u Xenopus tropicalis
25 maja 2017
Ten protokół demonstruje metodę opartą na fluorescencji do wizualizacji układu naczyniowego i ilościowego określenia jego złożoności u Xenopus tropicalis. Naczynia krwionośne można obrazować kilka minut po wstrzyknięciu barwnika fluorescencyjnego do bijącego serca zarodka po manipulacjach genetycznych i/lub farmakologicznych w celu zbadania rozwoju układu sercowo-naczyniowego in vivo.
Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja unaczynienia kijanek Xenopus tropicalis. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii układu krążenia, takie jak sposób regulacji angiogenezy. Główną zaletą tej techniki jest to, że naczynia krwionośne w nienaruszonym zarodku typu studzienkowego można uwidocznić za pomocą prostego wstrzyknięcia barwnika fluorescencyjnego.
Zacznij od użycia mikropodajnika, aby napełnić stożkową szklaną mikropipetę około pięcioma mikrolitrami klarownego, acetylowanego roztworu LDL diI, uważając, aby nie załadowano żadnych wytrąconych cząstek. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj cienkiej pary kleszczyków o numerze 55, aby przyciąć końcówkę pipety, aby dostosować objętość przesłanego kompleksu i ustawić system iniekcji sterowany ciśnieniem tak, aby wyrzucał około pięciu nanolitrów roztworu na wstrzyknięcie. Następnie zanurz końcówkę pipety w 0,04% MS-222 w 0,1X zmodyfikowanej soli fizjologicznej Bartha lub MBS w specjalnie wykonanej formie Sylgard.
Następnie przenieś zarodek Xenopus tropicalis do pleśni Sylgard i potwierdź całkowitą sedację przy braku odpowiedzi na stymulację płetwy grzbietowej. Pod mikroskopem preparacyjnym załadować brzuszną stronę zarodka do wgłębienia formy w kształcie litery V w pozycji lekko ukośnej. Ciasno dopasuj dwie szpilki o średnicy 0,1 milimetra do uchwytu na szpilkę i użyj jednej szpilki do przebicia skóry nad sercem, które powinno wyraźnie pulsować.
Włóż szpilkę przez otwór w przestrzeni między sercem a skórą bez nakłuwania serca i umieść włożoną końcówkę w obszarze, w którym zostanie wykonane nacięcie. Następnie pocieraj drugą szpilkę o włożoną szpilkę, aby wykonać liniowe nacięcie i użyj obu szpilek razem, aby delikatnie poszerzyć nacięcie, odsłaniając serce. Aby wstrzyknąć acetylowany roztwór LDL DiI, włóż szklaną końcówkę pipety do serca i wstrzyknij od 50 do 60 nanolitrów acetylowanego LDL DiI w około 10 impulsach wyrzutowych.
Po dostarczeniu całego roztworu barwnika upewnij się, że serce nadal bije i przenieś zarodek na nową szalkę Petriego zawierającą 0,1 X MBS. Po pięciu do 10 minutach kijanka powinna dojść do siebie po znieczuleniu i zacząć się poruszać. Po wstrzyknięciu odpowiedniej liczby zarodków należy przeprowadzić wizualne badania przesiewowe prawidłowo oznakowanych znieczulonych zarodków pod mikroskopem fluorescencyjnym, odrzucając wszelkie zwierzęta, które mają oznaczone inne narządy.
Zarodki, które nie zostały wystarczająco oznakowane, mogą być ponownie wstrzyknięte. Następnie zrób zdjęcia prawidłowo oznaczonych zarodków. Aby uzyskać dokładniejsze zobrazowanie naczyń krwionośnych, utrwal znieczulone zarodki w 4% paraformaldehydzie przez godzinę w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem w celu wizualizacji za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Jeśli wystarczająca ilość acetylowanego LDL diI zostanie wstrzyknięta do serca, tylna żyła kardynalna lub PCV powinna być natychmiast widoczna pod mikroskopem fluorescencyjnym. Żyły międzysomomityczne lub ISV wyłaniają się grzbietowo z PCV w fali od przodu do tylnej, zaczynając od stadium 36 i kończąc około stadium 40 do 41, stając się lekko rozgałęzione około stadium 43. PCV i ISV rosną w stereotypowym wzorcu angiogennym, który jest pod ścisłą kontrolą rozwojową.
Co ciekawe, knockdown sygnalizacji TIE-2 przez antysensowne morfaliny zmniejsza długość i złożoność ISV, podczas gdy ekspresja konstytutywnie aktywnej formy TIE-2 indukuje nadmierne rozgałęzianie ISV. Wskaźnik złożoności żył może być obliczony w celu oceny złożoności ISV i można wygenerować renderowane ścieżki w celu wizualizacji ogólnej architektury embrionalnego układu naczyniowego Xenopus tropicalis. Pierwotny protokół został opisany dla stosowania Xenopus laevis przez Levin and Colics i dostosowaliśmy go do Xenopus tropicalis.
Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Przed tą procedurą można przeprowadzić manipulacje genetyczne i farmakologiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, które geny i szlaki sygnałowe regulują rozwój naczyń krwionośnych. Korzystając z tej procedury, oznakowane naczynia krwionośne mogą być obrazowane w nienaruszonym zwierzęciu w czasie rzeczywistym, zapewniając potężne narzędzie do badania dynamiki rozwoju naczyń krwionośnych.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wstrzyknąć acetylowany LDL diI do serca kijanki Xenopus tropicalis, aby uwidocznić jej unaczynienie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół demonstruje metodę opartą na fluorescencji do wizualizacji unaczynienia i ilościowego określenia jego złożoności w Xenopus tropicalis. Technika ta pozwala na obrazowanie naczyń krwionośnych wkrótce po wstrzyknięciu fluorescencyjnego barwnika do serca zarodka, ułatwiając badania nad rozwojem układu krążenia in vivo.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia układu krążenia
- Angiogeneza
- Biologia rozwoju
Tło
- Xenopus tropicalis jest organizmem modelowym do badań nad rozwojem kręgowców.
- Rozumienie rozwoju unaczynienia jest kluczowe dla poznania różnych chorób.
- Techniki fluorescencyjnego obrazowań poprawiają wizualizacje struktur biologicznych.
- Ta metoda pozwala na obserwację zmian unaczynienia w czasie rzeczywistym.
Cel badania
- Aby zwizualizować unaczynienie kijanek Xenopus tropicalis.
- Aby zbadać regulację angiogenesy.
- Aby zapewnić prostą i skuteczną metodę badania rozwoju układu krążenia.
Stosowane metody
- Wstrzyknięcie fluorescencyjnego barwnika do serca zarodka.
- Użycie mikro załadowacza i stożkowej szkłanej mikro pipety dla precyzyjnego wstrzyknięcia barwnika.
- Wizualizacja naczyń krwionośnych pod mikroskopem sekcującym.
- Zastosowanie manipulacji genetycznych i farmakologicznych do badania wpływu na unaczynienie.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja naczyń krwionośnych w całych zarodkach.
- Ilościowa ocena złożoności naczyń osiągnięta poprzez obrazową analizę.
- Uzyskane wglądy w dynamikę rozwoju układu krążenia.
- Zadokumentowana skuteczność metody wstrzyknięcia fluorescencyjnego barwnika.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę badania rozwoju unaczynienia.
- Fluorescencyjne obrazowań jest potężnym narzędziem do analizy w czasie rzeczywistym.
- To podejście może ułatwić dalsze badania nad biologią układu krążenia.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization and quantification of vascular complexity in a vertebrate model, supporting early-stage target validation in angiogenesis pathways. By providing quantitative readouts of vessel sprouting and branching, it facilitates mechanistic de-risking of vascular targets before committing to lead identification campaigns. The Xenopus tropicalis system offers a disease-relevant platform for assessing angiogenic phenotypes with predictive confidence in preclinical cardiovascular research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding angiogenic regulators such as TIE-2 signaling through direct observation of vessel sprouting patterns.
- Operational Value: Provides a rapid, one-week workflow to assess gene or pathway impact on vascular development without requiring genetically engineered models.
- Predictive Value: Quantifiable outputs like the Vein Complexity Index support objective assessment of target modulation effects for portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible vascular labeling compatible with downstream imaging and analysis pipelines.
- Quantitative Output: Enables measurement of intersomitic vein length and branching complexity as dose-responsive readouts for compound screening.
- Scalability: Simple dye injection and imaging procedure supports medium-throughput evaluation of pharmacological or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models stereotypic angiogenesis in Xenopus tropicalis, offering insight into human vascular development pathways.
- Translational Continuity: Connects early discovery findings to preclinical validation through conserved angiogenic mechanisms.
- Mechanistic De-risking: Allows rapid testing of pathway modulators to clarify target biology before investing in mammalian model studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing vascular phenotype data that informs go/no-go decisions in angiogenesis-focused programs.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking genetic or pharmacological perturbations to quantifiable changes in vascular architecture.
- Screening: Delivers reproducible, imaging-based readouts suitable for evaluating compound effects on angiogenic sprouting.
- Analytics: Provides quantitative vascular complexity metrics that enable objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Leverages conserved angiogenesis mechanisms to support continuity from embryonic models to mammalian vascular systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular phenotyping platform applicable across multiple angiogenesis target projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in angiogenic target validation through direct, quantitative visualization of vascular networks.
- Operational Value: Standardizes vascular assessment via simple dye injection and reproducible imaging, minimizing inter-experiment variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of vascular targets, reducing late-stage failure risk in cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of angiogenesis modifiers based on quantitative phenotypic outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques for embryo handling and cardiac microinjection.
- Dependent on fluorescence microscopy infrastructure for vessel visualization and image capture.
- Necessitates standardization of embryo staging and injection timing for consistent vascular labeling.
- Involves adaptation considerations when extending findings to other model systems or human relevance contexts.
- Practical limitations include reliance on embryonic accessibility and the need for careful optimization of dye concentration to avoid non-specific labeling.
