Name: Metoda skutecznego ponownego fałdowania i oczyszczania domeny wiążącej ligand chemoreceptora (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: Poznaj metodę ponownego fałdowania i oczyszczania domeny wiążącej ligand chemoreceptora Tlp3 z bakterii Campylobacter jejuni. Protokół umożliwia uzyskanie miligramowych ilości funkcjonalnego białka do badań strukturalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Yu C. Liu za jego wczesną pracę nad produkcją Tlp3-LBD. Mayra A. Machuca jest zadłużona w Departamento Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS za stypendium doktoranckie.

1. Ekspresja jego 6-tlp3-LBD w E. coli
<ol>
	<li>Zaszczepić 150 ml sterylnego bulionu Luria-Bertani (LB) zawierającego 50 μg mL-1 ampicyliny komórkami BL21-Codon-Plus(DE3)-RIPL przekształconymi wektorem pET151/D-TOPO w celu ekspresji His 6-Tlp3-LBD (reszty aminokwasowe 42-291) i inkubować go w temperaturze 37 °C w wytrząsarce (średnica orbity, 25 mm) z prędkością 200 obr./min przez noc.</li>
	<li>Przygotować sześć 2 litrowych kolb Erlenmeyera zawierających 800 ml sterylnego bulionu LB i 50 μg ml-1 ampicyliny. Zaszczepić każdą kolbę 20 ml nocnej kultury uzyskanej w kroku 1.1. Inkubować je w temperaturze 37 °C, wytrząsając w sposób ciągły z prędkością 200 obr./min, aż gęstość optyczna przy długości fali 600 nm osiągnie 0,6.</li>
	<li>Pobrać 1 ml podwielokrotności z jednej z kolb (nieindukowana próbka kontrolna), osad za pomocą wirówki stołowej (13 000 x g, 4 °C, 10 min) i odrzucić supernatant. Przechowywać osad bakteryjny w temperaturze -20 °C do późniejszej analizy SDS-PAGE.</li>
	<li>Indukować ekspresję białka przez dodanie 1 mM izopropylu β-D-tiogalaktozydu (IPTG) do każdej kolby z hodowlą. Kontynuować inkubację kolb w temperaturze 37 °C w wytrząsarce z prędkością 200 obr./min przez dodatkowe 4 godziny.</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie przy 5 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. 
	UWAGA: W tym momencie procedurę można wstrzymać, umieszczając osad komórkowy w zamrażarce o temperaturze -80 °C w celu przechowywania.</li>
</ol>
2. Izolacja i denaturacja ciał inkluzyjnych
<ol>
	<li>Przenieść wszystkie osady komórkowe otrzymane w kroku 1.5 do zlewki o pojemności 250 ml i dodać 100 ml buforu A (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl). Poczekaj, aż komórki całkowicie się rozmrozą (jeśli są zamrożone) i ponownie zawieś osad. Próbkę należy przechowywać na lodzie, chyba że wskazano inaczej.</li>
	<li>Przepuść zawieszone komórki przez homogenizator wysokociśnieniowy trzy razy, aby zlizować komórki i zapewnić całkowite ścinanie genomowego DNA.</li>
	<li>Odwirować lizat przy 10 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Pobrać 1 ml próbki supernatantu (frakcji rozpuszczalnej) i przechowywać ją w temperaturze -20 °C do późniejszej analizy SDS-PAGE. Resztę supernatantu należy odrzucić i umieścić osad na lodzie. 
	UWAGA: Ta pastylka jest koloru białego (łatwo odróżnić ją od nieprzerwanych komórek, które mają odcień brązu) i zawiera ciała inkluzji.</li>
	<li>Zawiesić dokładnie osady inkluzji w 20 ml lodowatego buforu B (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,2 mM fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF), 1% Triton X-100). Ułatwia to rozpuszczanie błony i białek błonowych. Wirować przez 1-2 minuty, aby wspomóc ponowne podwieszenie.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 10 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dokładnie zawiesić osad w 20 ml lodowatego buforu B, wirując probówkę przez 1 - 2 minuty. Upewnij się, że osad jest rozbity na małe kawałki. Pipetować próbkę w górę i w dół, aby ułatwić ponowne zawieszenie osadów. 
	UWAGA: Ważne jest, aby dokładnie zawiesić osad, aby uzyskać ciała wtrącające wolne od zanieczyszczeń.</li>
	<li>Powtórz krok 2.5. Jeżeli supernatant jest mętny lub zabarwiony, należy powtarzać kroki 2.6 i 2.5 (w tej kolejności), aż supernatant stanie się klarowny i bezbarwny.</li>
	<li>Zawiesić osad w 20 ml lodowatego buforu C (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,2 mM PMSF), wirując probówkę przez 1 - 2 minuty.</li>
	<li>Powtórz krok 2.5.</li>
	<li>Dodać 25 ml lodowatego buforu denaturującego D (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 8 M mocznik, 10 mM ditiotreitol (DTT), 0,2 mM PMSF) w celu rozpuszczenia osadu ciał inkluzyjnych. Dokładnie zawiesić, wirując przez 1 - 2 minuty lub do momentu, gdy granulka zostanie rozbita na małe kawałki.</li>
	<li>Mieszać zawiesinę przez obrót osiowy z prędkością obrotową 30 obr./min przez 30 - 120 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Klarować zdenaturowany roztwór białka przez odwirowanie w temperaturze 30 000 x g, 4 °C przez 30 minut, umieścić supernatant na lodzie i wyrzucić osad.</li>
	<li>Zmierz stężenie białka za pomocą testu Bradforda. 24 Weź porcję do analizy żelu SDS i umieść ją w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: W tym momencie procedurę można wstrzymać poprzez szybkie zamrożenie poddanej próbki w ciekłym azocie i utrzymanie jej w temperaturze -80 °C do przechowywania.</li>
</ol>
3. Ponowne fałdowanie białek
<ol>
	<li>Przygotować 250 ml buforu E (3 M mocznik, 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,4 M monochlorowodorku L-argininy, 20 mM zredukowanego L-glutationu, 2 mM utlenionego L-glutationu) w zlewce o pojemności 500 ml i schłodzić bufor do temperatury 4 °C.</li>
	<li>Dodać 60 mg zdenaturowanej mieszanki białkowej zawierającej His 6-Tlp3-LBD otrzymany w kroku 2.13 do 250 ml buforu E, mieszając bufor z prędkością 500 obr./min. Inkubować mieszankę do ponownego składania w temperaturze 4 °C, ciągle mieszając przy 500 obr./min przez 24-48 godzin. Końcowe stężenie białka na tym etapie wynosi 0,2 mg mL-1.</li>
	<li>Przygotuj 7 l buforu A w wiadrze o pojemności 8 - 10 l i schładzaj go do temperatury 4 °C w ramach przygotowań do następnego kroku (krok 3.4), który będzie miał miejsce w ciągu 24 - 48 godzin (patrz schemat blokowy w <silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Zanurz ~50 cm kawałek rurki dializacyjnej o średnicy 28 mm, z odcięciem masy cząsteczkowej przy 12 - 14 kDa, w 200 ml 10 mM soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA-Na2) i podgrzej ją nad płomieniem gazowym do wrzenia. Przepłukać membranę dializacyjną 200 ml ddH2O.</li>
	<li>Zacisnąć jeden koniec błony dializacyjnej zamknięciem rurki dializacyjnej i przenieść 250 ml mieszaniny do ponownego składania otrzymanej w kroku 3.2 do rurki dializowej. Zamknij otwarty koniec innym zaciskiem. Sprawdź integralność membrany, aby upewnić się, że nie ma wycieków.</li>
	<li>Umieścić rurkę dializacyjną w wiadrze do dializy ze wstępnie schłodzonymi 7 litrami buforu A przygotowanego w kroku 3.3. Umieść mieszadło magnetyczne, upewniając się, że nie będzie dotykać rurki dializacyjnej podczas mieszania.</li>
	<li>Dializować próbkę w temperaturze 4 °C, kontynuując mieszanie przy prędkości 500 obr./min i zmieniać bufor co najmniej cztery razy w ciągu 12 godzin. Po ostatniej wymianie buforu pozostawić próbkę do dializy przez noc. 
	UWAGA: Podczas dializy nadmiar mocznika (~3 M) jest stopniowo usuwany ze zdenaturowanego roztworu białka, co umożliwia ponowne fałdowanie białka. Obfite wytrącanie białek można zaobserwować pod koniec dializy.</li>
	<li>Wyjąć rurkę dializacyjną z wiadra i przenieść jej zawartość do zlewki o pojemności 500 ml. Roztwór białkowy należy przechowywać na lodzie, chyba że wskazano inaczej.</li>
	<li>Przefiltruj roztwór białka przez membranę o wielkości porów 0,43 μm do szklanej butelki o pojemności 500 ml, aby usunąć wszelkie wytrącone białko.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie jego6-znakowanego białka za pomocą unieruchomionej chromatografii powinowactwa jonów metali
<ol>
	<li>Naładować i zrównoważyć 5 ml wstępnie wypełnionej kolumny chelatującej.
	<ol>
		<li>Podłącz kolumnę do pompy perystaltycznej, upewniając się, że w rurce łączącej nie jest uwięzione powietrze.</li>
		<li>Przemyć kolumnę, przepuszczając przez 25 - 50 ml ddH2O.</li>
		<li>Naładuj kolumnę, ładując 3 ml 0,1 M NiCl2, a następnie przepuszczając przez 25 ml ddH2O.</li>
		<li>Zrównoważyć kolumnę z 25 ml buforu F (bufor ładujący, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 20 mM imidazolu).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosować ponownie sfałdowaną próbkę białka otrzymaną w kroku 3.9 do składu buforu F, dodając 2,5 ml 1 M Tris-HCl pH 8,0, 25 ml 5 M NaCl i 2,5 ml 2 M roztworów podstawowych imidazolu.</li>
	<li>Załadować próbkę do kolumny z szybkością 5 ml/min lub mniejszą i odrzucić przepływowe (niezwiązane białka).</li>
	<li>Przemyć kolumnę 50 - 100 ml buforu F w celu usunięcia niespecyficznie związanych białek i wyrzucić przepływ</li>.
	<li>Eluować Jego 6-Tlp3-LBD za pomocą 25 ml buforu G (bufor elucyjny, 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 500 mM imidazol) i połączyć przepływające frakcje zawierające białko (oznaczone przy użyciu odczynnika Bradforda).</li>
	<li>Zmierzyć stężenie białka w próbce zbiorczej za pomocą testu Bradforda. Pobrać małą porcję do analizy SDS-PAGE i umieścić w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
5. Usunięcie6-tagowego tagu za pomocą proteazy TEV (opcjonalnie)
<ol>
	<li>Przygotować i schłodzić do temperatury 4 °C 4 l buforu H (bufor rozszczepiający TEV, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 % (v/v) glicerolu, 2 mM DTT).</li>
	<li>Wyciąć około 5 - 7 cm rurki do dializy (średnica 2 - 3 cm) i zanurzyć ją w 200 ml ddH2O.</li>
	<li>Dodaj Jego6-znakowaną proteazę TEV do białka His6-tag przygotowanego w kroku 4.5, aby uzyskać końcowy stosunek molowy 1 TEV: 8 białka.</li>
	<li>Zacisnąć jeden koniec rurki za pomocą nakrętki rurki do dializy i napełnić ją mieszaniną białka/proteazy TEV. Zamknij drugi koniec i upewnij się, że nie ma wycieków.</li>
	<li>Umieścić rurkę dializacyjną we wstępnie schłodzonym 4 litrze buforu H (od kroku 5.1) i inkubować ją w temperaturze 4 °C, ciągle mieszając przez 2 godziny. Zmienić bufor i kontynuować dializę przez noc, aby umożliwić zakończenie reakcji rozszczepienia, w której pośredniczy TEV.</li>
	<li>W międzyczasie przygotować i schłodzić (4 °C) 4 l buforu I (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 % (v/v) glicerolu) w ramach przygotowań na następny dzień.</li>
	<li>Po całonocnej dializie wymienić bufor na bufor przygotowany w kroku 5.6 i dializować przez kolejne 1-2 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wyjąć probówkę z wiadra do dializy, odpiąć jeden koniec rurki i przenieść roztwór białka do probówki Falcon o pojemności 50 ml. Przefiltrować roztwór przez filtr strzykawkowy o porach 0,43 μm i trzymać go na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej.</li>
	<li>Zmierzyć objętość próbki i dostosować stężenie Tris, NaCl i imidazolu do składu buforu F (np. na 25 ml roztworu białkowego w buforze J dodać 0,25 ml 1 M Tris-HCl pH 8,0, 1,75 ml 5 M NaCl i 0,25 ml 2 M imidazolu).</li>
	<li>Przygotuj 5 ml kolumny chelatującej HP HiTrap zgodnie z opisem w kroku 4.1.</li>
	<li>Załadować próbkę do kolumny (natężenie przepływu: 5 ml/min) i zebrać przepływ, który zawiera nieoznakowany Tlp3-LBD (pozostałości 42 - 291). Nierozszczepione białko, rozszczepione Jego6-tag iJego 6-TEV są zatrzymywane przez kolumnę.</li>
	<li>Przemyć kolumnę 5 ml buforu F (bufor ładujący), aby umożliwić przepływ całego nieoznakowanego białka i zebranie eluatu.</li>
	<li>Zebrać eluat otrzymany w krokach 5.11 i 5.12 i zmierzyć stężenie białka. Pobrać małą porcję i przechowywać ją w temperaturze -20 °C do analizy SDS-PAGE.</li>
</ol>
6. Chromatografia wykluczająca rozmiar (filtracja żelowa) Tlp3-LBD
<ol>
	<li>Przygotować 1 l buforu A (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl) i przefiltrować go za pomocą membrany 0,43 μm.</li>
	<li>Zrównoważyć kolumnę wykluczającą wielkość 26/60 z buforem A przy natężeniu przepływu 4 ml/min.</li>
	<li>Zagęścić próbkę białka otrzymaną w kroku 5.13 do objętości 3-4 ml za pomocą koncentratora odśrodkowego o pojemności 15 ml z wartością odcięcia 10 kDa (4 °C, 4 000 x g).</li>
	<li>Sklarować roztwór białkowy przez odwirowanie w temperaturze 13 000 x g, 4 °C przez 30 minut w celu usunięcia wytrąconego białka.</li>
	<li>Załadować próbkę do wstępnie zrównoważonej kolumny filtracyjnej z żelem 26/60. Przeprowadzić chromatografię w buforze A przy natężeniu przepływu 4 ml/min. Monitoruj ślad UV. Tlp3-LBD eluuje się w objętości retencyjnej 210 - 220 ml. Połącz frakcje szczytowe.</li>
	<li>Zmierz stężenie białka. Weź małą porcję do analizy SDS-PAGE.</li>
</ol>
7. SDS-PAGE Analiza próbek pobranych na różnych etapach oczyszczania białka
<ol>
	<li>Przygotować 1 l buforu do pracy SDS-PAGE (bufor J), zawierającego 25 mM Tris, 250 mM glicyny o pH 8,3 i 0,1% (w/v) dodecylosiarczanu sodu (SDS).</li>
	<li>Przygotuj 10 ml 5x buforu ładującego SDS-PAGE (bufor K), zawierającego 0,25 M Tris-HCl pH 6,8, 10% (w/v) SDS, 50% (v/v) glicerolu, 1 mM DTT i 0,05% błękitu bromofenolowego.</li>
	<li>Odczekać, aby podwielokrotności zebrane podczas różnych etapów oczyszczania (etapy 1.3, 2.3, 2.13, 4.6, 5.13, 6.6) uległy rozmrożeniu.</li>
	<li>Dla każdej próbki zmieszać objętość odpowiadającą 15 μg białka ogółem z 2 μl buforu ładującego 5x SDS-PAGE i dostosować objętość do 10 μl za pomocą ddH2O.</li>
	<li>Podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 5–10 minut, wirować je w temperaturze 10 000 x g przez 30 sekund i przenieść próbki do czystej probówki.</li>
	<li>Przygotuj żel SDS-PAGE, używając 15% poliakryloamidowego żelu separującego (dla 5 ml: 2,5 ml 30% (w/v) bis-akrylamidu, 1,2 ml 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 1,2 ml ddH2O, 50 μL 10% (w/v) SDS, 50 μL 20% (w/v) nadsiarczanu amonu (APS), 3 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) i 5% poliakryloamidu żelu do układania w stos (na 2 ml): 340 μL 30% (w/v) bis-akrylamidu, 250 μL 1 M Tris pH 6,8, 1,37 mL ddH2O, 20 μL 10% (w/v) SDS, 20 μL 20% (w/v) APS, 2 μL TEMED).</li>
	<li>Zmontuj aparat do elektroforezy i napełnij go buforem do uruchamiania 1x SDS zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	<li>Załadować marker masy cząsteczkowej białka i próbki przygotowane w kroku 7.5. Wykonaj elektroforezę przy stałym prądzie 25 mA.</li>
	<li>Przenieść żel do pojemnika i spłukać go ddH2O. Dodać 150 ml roztworu barwiącego Coomassie Blue zawierającego 25% (v/v) izopropanolu, 10% (v/v) kwasu octowego i 0,03% (w/v) Brilliant Blue R-250. Umieść pojemnik na poziomej platformie obrotowej na 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Spłukać żelddH2O i umieścić w roztworze odbarwiającym zawierającym 5% (v/v) metanolu i 7% (v/v) kwasu octowego. Odbarwić podczas mieszania za pomocą poziomej platformy obrotowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Zobrazuj żel i przeanalizuj.</li>
</ol>
8. Spektroskopia dichroizmu kołowego (CD) Analiza spektroskopii drugorzędowej struktury ponownie złożonego czystego białka
<ol>
	<li>Przenieść 0,5-1 mg ponownie sfałdowanego białka otrzymanego w kroku 6.6 do rurki dializacyjnej i umieścić ją w wiadrze do dializy zawierającym 5 litrów buforu L (50 mM fosforanu sodu o pH 7,4), wstępnie schłodzonego do temperatury 4 °C. Próbkę należy dializować w temperaturze 4 °C przy ciągłym mieszaniu i wykonać co najmniej 3-4 zmiany buforu w ciągu 2-4 godzin przed pozostawieniem próbki do dializy na noc.</li>
	<li>Zagęścić odciśnięty roztwór białka do 0,06 mg mL-1 za pomocą odśrodkowego koncentratora o masie 10 kDa.</li>
	<li>Klarować roztwór przez odwirowanie w temperaturze 13 000 x g, 4 °C przez 30 min.</li>
	<li>Zapisać widmo CD dalekiego UV próbki w temperaturze 25 °C w zakresie długości fal 200–260 nm za pomocą spektropolarymetru o częstotliwości skanowania 20 nm min-1. Należy użyć buforu dializacyjnego jako ślepej próby. Powtórz zapis w trzech egzemplarzach i wygeneruj uśrednione widmo.</li>
	<li>Oblicz zawartość struktury drugorzędowej, dekonwoluując widma CD za pomocą programu CDSSTR z DichroWeb sever25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Przedstawiono prostą procedurę ekspresji i ponownego fałdowania z ciał inkluzyjnych peryplazmatycznego LBD bakteryjnego chemoreceptora Tlp3. Przygotowanie czystego białka obejmuje nadekspresję genu kodowanego plazmidem pET w E. coli, oczyszczanie i rozpuszczanie ciał inkluzyjnych, ponowne fałdowanie zdenaturowanego białka i jego oczyszczanie przez kolejne etapy chromatografii powinowactwa i wykluczania wielkości. Ułatwiona przez mocznik denaturacja i ponowne fałdowanie za pośrednictwem rozcieńczania/dializy są k...

Wykazano, że chemotaksja i ruchliwość odgrywają ważną rolę w patogenezie Campylobacter jejuni, promując kolonizację bakteryjną i inwazję gospodarza1,2,3. Chemotaksja pozwala bakteriom przemieszczać się w kierunku optymalnego środowiska do wzrostu, zgodnie z sygnałami chemicznymi. Proces ten polega na rozpoznawaniu wewnątrzkomórkowych i środowiskowych sygnałów chemicznych przez zestaw białek zwanych chemoreceptorami lub białkami podobnymi do przetworników (Tlp). Większość chemoreceptorów to białka osadzone w błonie z pozacytoplazmatyczną domeną wiążącą ligand (LBD), domeną transbłonową i cytoplazmatyczną domeną sygnalizacyjną, z których ta ostatnia oddziałuje z cytozolowymi białkami sygnalizacyjnymi, które przekazują sygnał do silników wiciowych4,5,6,7.
Jedenaście różnych chemoreceptorów zostało zidentyfikowanych w genomie C. jejuni<sup class="xref">4,8. Do tej pory scharakteryzowano tylko niektóre z tych chemoreceptorów, a specyficzność ligandów Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712 i Tlp1113 jest znana. Identyfikacja naturalnych ligandów pozostałych chemoreceptorów tego gatunku oraz licznych chemoreceptorów u innych bakterii może być znacznie ułatwiona dzięki produkcji pofałdowanych i wysoce czystych rekombinowanych chemoreceptorów LBDs14,15,16. Jednak próby heterologicznej ekspresji peryplazmatycznych LBD chemoreceptorów bakteryjnych w Escherichia coli często skutkują ich celowaniem w ciała inkluzyjne17,18,19. Niemniej jednak zjawisko to może ułatwić łatwą izolację i odzyskanie białka w ręku. W tym miejscu przedstawiono metodę odzyskiwania białek z ciał inkluzyjnych, ich ponownego fałdowania i oczyszczania, na przykładzie peryplazmatycznego LBD chemoreceptora C. jejuni Tlp3. Ten przykład został wybrany, ponieważ Tlp3-LBD należy do rodziny dCACHE20 domen sensorycznych, które są obficie występujące w dwuskładnikowych kinazach histydynowych i chemoreceptorach u prokariontów20,21,22,23.
W tym podejściu, konstrukcja wyrażenia, oparta na wektorze pET151/D-TOPO, została zaprojektowana tak, aby zawierała N-końcowy znacznik His6, po którym następuje miejsce cięcia proteazy wirusa wytrawiania tytoniu (TEV), w celu późniejszego usunięcia znacznika19. Protokół opisuje nadekspresję białek w E. coli, izolację i rozpuszczalność ciał inkluzyjnych za pośrednictwem mocznika oraz ponowne fałdowanie białek przez zubożenie mocznika. Po ponownym fałdowaniu próbka jest oczyszczana za pomocą chromatografii powinowactwa, z opcjonalnym usuwaniem znaczników i chromatografią wykluczającą rozmiar. Stan pofałdowania oczyszczonego białka potwierdza się za pomocą spektroskopii dichroizmu kołowego. Jest to zmodyfikowana wersja metody, która została wcześniej opracowana w celu odzyskania i oczyszczenia LBD innego chemoreceptora, Helicobacter pylori TlpC19. Ta procedura, podsumowana w Rysunek 1, daje 10 - 20 mg czystego, nieoznakowanego Tlp3-LBD na 1 l kultury bakteryjnej, o czystości białka >90%, zgodnie z szacunkami SDS-PAGE.

<table><tbody><tr><td>Tris base</td><td>AMRESCO</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>MERK MILIPORE</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>G-BIOSCIENCES</td><td>A051-B</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)</td><td>MERCK</td><td>52332</td><td></td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>AMRESCO</td><td>694</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-tiogalaktozyd (IPTG)</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td></td><td></td></tr> AST0487 <tr><td>Mocznik</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC0568</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td>C-1029</td><td></td></tr><tr><td>Monochlorowodorek L-argininy</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A5131</td><td></td></tr><tr><td>Zredukowany L-glutation</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Utleniony L-glutation</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G4376</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy (NaH2PO4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego odwodniona (EDTA)</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC20302.260</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td></td><td></td></tr> BIOGB0232 <tr><td>Chlorek niklu (NiCl2)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>339350</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC0167</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>Niebarwiona drabinka białkowa, szeroka Zakres (10-250 kDa)</td><td>NEW ENGLAND BIOLABS</td><td>P7703</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultracel Koncentrator odśrodkowy (Millipore)</td><td>MERCK</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Rurka Falcon</td><td>Rurka</td> do dializy FALCON <td>BDAA352070</td><td></td></tr><tr><td>LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY</td><td>Dializa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wężowa skóra Rurki do dializy</td><td>THERMO SCIENTIFIC&trade;</td><td>68100</td><td></td></tr><tr><td>Paczkowana kolumna chelatująca HiTrap HP</td><td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td><td>17-0408-01</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator wysokociśnieniowy EmulsiFlex-C5</td><td>AVESTIN</td><td>EmulsiFlex&trade; - Pompa</td> perystaltyczna C5 <td></td></tr><tr><td>P-1</td><td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td><td>18-1110-91</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna wykluczająca rozmiar Superdex 200 HiLoad 26/60&nbsp;</td><td>GE HEALTHCARE NAUKI PRZYRODNICZE</td><td></td><td></td></tr> 28989336 <tr><td>Spektropolarymetr JASCO J-815</td><td>JASCO</td><td>J-815</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda skutecznego ponownego fałdowania i oczyszczania domeny wiążącej ligand chemoreceptora

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identyfikacja naturalnych ligandów chemoreceptorów i badania strukturalne mające na celu wyjaśnienie molekularnych podstaw specyficzności ligandów mogą być znacznie ułatwione dzięki produkcji miligramowych ilości czystych, pofałdowanych domen wiążących ligandy. Próby heterologicznej ekspresji peryplazmatycznych domen wiążących ligandy chemoreceptorów bakteryjnych w Escherichia coli (E. coli) często skutkują ich ukierunkowaniem na ciała inkluzyjne. W tym miejscu przedstawiono metodę odzyskiwania białek z ciał inkluzyjnych, ich ponownego fałdowania i oczyszczania, na przykładzie peryplazmatycznej domeny wiążącej ligand dCACHE chemoreceptora Campylobacter jejuni (C. jejuni) Tlp3. Podejście to obejmuje ekspresję białka będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą rozszczepialnego6-znacznika His , izolację i solubilizację ciał inkluzyjnych za pośrednictwem mocznika, ponowne fałdowanie białka przez zubożenie mocznika oraz oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa, a następnie usuwanie znaczników i chromatografię wykluczania wielkości. Spektroskopia dichroizmu kołowego służy do potwierdzenia stanu fałdowania czystego białka. Wykazano, że protokół ten jest ogólnie przydatny do wytwarzania miligramowych ilości domen wiążących ligand peryplazmatyczny dCACHE innych chemoreceptorów bakteryjnych w postaci rozpuszczalnej i krystalizacyjnej.

Rekombinacyjna ekspresja białka His6-Tlp3-LBD w E. coli doprowadziła do odkładania się białka w ciałkach inkluzyjnych. Wydajność ekspresji z 1 L hodowli bakteryjnej obliczona w kroku 2.13 wyniosła około 10 mg białka His6-Tlp3-LBD zdeponowanego w ciałkach inkluzyjnych. Procedura izolacji białka, opisana tutaj i przedstawiona na Rysunku 1, składa się z solubilizacji ciałek inkluzyjnych, refoldingowania i oczyszczania białka za pom...

Przedstawiono procedurę ponownego fałdowania domeny wiążącej ligand peryplazmatyczny dCACHE chemoreceptora Campylobacter jejuni Tlp3 z ciał inkluzyjnych i oczyszczania w celu uzyskania miligramowych ilości białka.

Metoda skutecznego ponownego fałdowania i oczyszczania domeny wiążącej ligand chemoreceptora

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Ogólnym celem tej procedury jest ponowne złożenie domeny wiążącej ligand chemoreceptora z ciał inkluzyjnych i oczyszczenie jej do wykorzystania w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych. Aby ustalić, jakie sygnały wysyła bakteryjny chemoreceptor i w jaki sposób, można użyć izolowanych domen wiążących ligand do badań przesiewowych pod kątem bibliotek małych cząsteczek lub do określenia struktury z ligandem i bez niego. Ucisk zewnątrzkomórkowej domeny wiążącej ligand w E. coli często powoduje odkładanie się w ciałach inkluzyjnych.Tutaj pokazujemy, w jaki sposób można odzyskać miligramową ilość funkcjonalnego białka z ciał inkluzyjnych. Na początek zaszczep 150 ml sterylnego bulionu LB zawierającego 50 mikrogramów na ml ampicyliny komórkami BL21-CodonPlus RIPL przekształconymi wektorem pET151 D-TOPO w celu ekspresji heksahistydyny TIp3-LBD. Inkubuj kulturę w temperaturze 200 obr./min i 37 stopni Celsjusza przez noc.Przygotować sześć 2-litrowych kolb Erlenmeyera zawierających 800 ml sterylnego bulionu LB i 50 mikrogramów na ml ampicyliny. Zaszczepić każdą kolbę 20 ml nocnej kultury. Inkubować kolby w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wytrząsając w sposób ciągły przy 200 obr./min, aż OD600 osiągnie 0,6.W tym momencie indukuj ekspresję białka, dodając 1 milimolowy IPTG do każdej kolby. Kontynuować inkubację kolb w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wytrząsarce przy 200 obr./min przez dodatkowe cztery godziny. Zbierz komórki przez odwirowanie w temperaturze 5000 xg i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut.Następnie odrzucić supernatant. Przenieś wszystkie granulki komórek do zlewki o pojemności 250 ml i dodaj 100 ml buforu A. W przypadku zamrożenia pozwól komórkom całkowicie się rozmrozić, a następnie ponownie zawieś osad. Próbkę należy przechowywać na lodzie, chyba że wskazano inaczej.Następnie przepuść zawieszone komórki przez homogenizator wysokociśnieniowy trzy razy, aby zlizować komórki i zapewnić całkowite ścinanie genomowego DNA. Następnie odwiruj lizat w temperaturze 10 000 xg i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Pobrać próbkę supernatantu o pojemności jednego ml i przechowywać ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do późniejszej analizy SDS-PAGE.Następnie wyrzuć resztę supernatantu i umieść osad na lodzie. Następnie dokładnie zawieś osad ciał inkluzyjnych w 20 ml lodowatego buforu B. Ułatwia to rozpuszczanie błony i białek błonowych. Wirować próbkę przez jedną do dwóch minut, aby ułatwić ponowne zawieszenie.Po odwirowaniu próbki, dokładnie ponownie zawiesić osad w 20 ml lodowatego buforu B, najpierw przetaczając probówkę przez jedną do dwóch minut. Upewnij się, że granulka jest połamana na małe kawałki. Następnie należy pipetować próbkę w górę i w dół, aby ją ponownie zawiesić.Odwirować próbkę jak poprzednio i odrzucić supernatant. Jeśli supernatant jest mętny lub zabarwiony, ponownie odwirować próbkę i użyć dodatkowego lodowatego buforu B w celu jej ponownego zawieszenia. Powtórzyć wirowanie i ponowne zawieszenie, aż supernatant stanie się klarowny i bezbarwny przed ponownym granulowaniem.Dodać 20 ml lodowatego buforu C do osadu i ponownie go zawiesić, wirując probówkę przez jedną do dwóch minut. Następnie, po odwirowaniu próbki, dodaj 25 ml lodowatego buforu denaturującego D. Dokładnie ponownie zawieś osad ciał inkluzyjnych, wirując probówkę przez jedną do dwóch minut lub do momentu, gdy osad zostanie rozbity na małe kawałki. Mieszać zawiesinę przez obrót osiowy przy 30 obr./min i 4 stopnie Celsjusza przez 30 do 120 minut.Klarować zdenaturowany roztwór białka przez odwirowanie w temperaturze 30 000 xg i czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut. Następnie umieść supernatant na lodzie i wyrzuć granulkę. Mieszając 250 ml buforu E przy 500 obr./min, dodaj 60 miligramów zdenaturowanej mieszanki białkowej zawierającej heksahistadynę TIp3-LBD.Inkubować mieszankę do ponownego składania w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ciągle mieszając przy 500 obr./min przez 24 do 48 godzin. Końcowe stężenie białka wynosi 0,2 mg na ml. Po przygotowaniu siedmiu litrów wstępnie schłodzonego buforu A i rurki do dializy zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć zamknięcia rurki do dializy, aby zacisnąć jeden koniec membrany dializacyjnej i przenieść mieszaninę dializacyjną do rurki.Następnie zaciśnij otwarty koniec i upewnij się, że nie ma wycieków. Umieścić rurkę do dializy w wiadrze do dializy ze wstępnie schłodzonym buforem A. Następnie dodaj mieszadło magnetyczne, upewniając się, że nie dotyka ono rurki dializacyjnej podczas mieszania. Dializować próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ciągle mieszając przy prędkości 500 obr./min i zmieniać bufor co najmniej cztery razy w ciągu 12 godzin.Po ostatniej wymianie buforu pozostawić próbkę do dializacji przez noc. Następnego ranka wyjmij rurkę do dializy z wiadra i przenieś jej zawartość do zlewki o pojemności 500 ml. Roztwór białkowy należy przechowywać na lodzie, chyba że wskazano inaczej.Przefiltruj roztwór białka przez membranę o wielkości porów 0,43 mikrona do szklanej butelki o pojemności 500 ml, aby usunąć wszelkie wytrącone białko. Po umyciu, naładowaniu i wyrównaniu kolumny chelatującej zgodnie z protokołem tekstowym, należy dostosować otrzymaną ponownie złożoną próbkę białka do składu buforu F, dodając 25 ml 5 M chlorku sodu, 2,5 ml 1 M tris-HCl o pH 8,0 i 2,5 ml 2 M roztworów podstawowych imidazolu. Załadować próbkę do kolumny z szybkością 5 ml na minutę lub mniejszą i odrzucić przepływ, który zawiera niezwiązane białka.Następnie przemyć kolumnę 50 do 100 ml buforu F w celu usunięcia niespecyficznie związanych białek i odrzucenia przepływu. Eluować heksahistadynę TIp3-LBD za pomocą 25 ml buforu G. Następnie połączyć przepływające frakcje zawierające białko. Po przygotowaniu buforu H i rurki do dializy zgodnie z protokołem tekstowym, dodać proteazę TEV znakowaną heksahistadyną do białka znakowanego heksahistadyną w przewodach.Dodaj końcowy stosunek molowy jednego TEV do ośmiu białka. Umieścić zaciśniętą rurkę dializacyjną we wstępnie schłodzonych czterech litrach buforu H i inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ciągle mieszając przez dwie godziny. Następnie należy zmienić bufor i kontynuować dializę przez noc, aby umożliwić zakończenie reakcji rozszczepienia, w której pośredniczy TEV.Po wymianie do buforu I, przefiltrowaniu roztworu białkowego i ponownym dostosowaniu próbki, załadować próbkę do przygotowanej kolumny HP chelatującej HiTrap o pojemności pięciu ml. Przy natężeniu przepływu pięciu ml na minutę zebrać przepływ, który zawiera nieoznakowany TIp3-LBD. Na rozszczepionym białku rozszczepiony znacznik heksahistadyny i heksahistadyna TEV są zatrzymywane przez kolumnę.Użyć pięciu ml buforu F do przemycia kolumny, aby umożliwić przepływ nieoznakowanego białka i zebranie eluatu. Następnie, po zrównoważeniu kolumny wykluczającej wielkość oraz zagęszczeniu i sklarowaniu próbki białka zgodnie z protokołem tekstowym, załadować próbkę do wstępnie zbalansowanej kolumny filtracyjnej żelu 26/60. Zastosuj bufor A z natężeniem przepływu czterech ml na minutę i monitoruj ślad UV pod kątem elucji białek.TIp3-LBD eluuje się w objętości retencyjnej od 210 do 220 ml. Na koniec, po chromatografii, połącz frakcje, a następnie zmierz stężenie białka i przeprowadź SDS-PAGE. Procedura izolacji białka pokazana na tym filmie dała od 10 do 20 mg czystego, nieznakowanego TIp3-LBD na jeden litr kultury bakteryjnej.Jak widać tutaj, białko eluowane z żelowej kolumny filtracyjnej ma pojedynczy, symetryczny pik, odpowiadający objętości retencji 220 ml przy obliczonej masie cząsteczkowej 29 kDa. Jak wykazano tutaj przez SDS-PAGE, ciała inkluzyjne zawierały głównie heksahistadynę TIp3-LBD o pozornej masie cząsteczkowej 28 kDa, która jest bliska wartości obliczonej na podstawie sekwencji aminokwasów 31,8 kDa. Usuwanie znaczników heksahistadyny, chromatografia powinowactwa i etapy filtracji żelu dały wysoce czyste białko.Spektroskopia CD z użyciem CDSSTR ujawniła, że drugorzędowa struktura heksahistydyny TIp3-LBD składała się z 31% zawartości alfa-helisy i 23% beta-arkusza. Były one również bliskie przewidywanym wartościom wynoszącym odpowiednio 37% i 26%r z analizy sekwencji przy użyciu serwera JPred 3. Protokół ten wymaga co najmniej pięciu dni od początku do końca i w razie potrzeby może zostać wstrzymany na trzech różnych etapach.Próbując tej procedury, należy pamiętać, że dokładne i całkowite ponowne zawieszenie ciał inkluzyjnych w buforze denaturującym poprzez wirowanie lub pipetowanie w górę iw dół ma kluczowe znaczenie dla całej tej realizacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ponownie złożyć i oczyścić domenę wiążącą ligand chemoreceptora TIp3. Oczyszczone białko można wykorzystać do wiązania kwasów w celu zbadania specyficzności liganda dla tego receptora.Ponadto wykazaliśmy wcześniej, że białko uzyskane w tej procedurze może być wykorzystane do produkcji wysoce uporządkowanych kryształów, co utorowało drogę do badań nad strukturalnymi podstawami jego specyficzności ligandowej. Procedura ta może być ogólnie przydatna do produkcji mg ilości chemoreceptorów z innych bakterii w postaci krystalizującej i rozpuszczalnej. Zastosowaliśmy ten protokół w jego oryginalnej lub nieznacznie zmodyfikowanej formie do ponownego złożenia i oczyszczenia domeny wiążącej ligand innych chemoreceptorów tego typu do badań krystalograficznych.Należy pamiętać, że w każdym pojedynczym przypadku prawdopodobnie konieczna będzie optymalizacja protokołu, na przykład składu denaturujących i składających oraz czasów inkubacji.

method-for-efficient-refolding-purification-chemoreceptor-ligand

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy implementację strategii REPLACE do celowania w interakcje białko-białko. REPLACE to iteracyjna strategia obejmująca podejścia syntetyczne i obliczeniowe w celu przekształcenia zoptymalizowanych inhibitorów peptydowych w cząsteczki podobne do leków.

Opracowanie inhibitorów oddziaływań białko-białko poprzez REPLACE: zastosowanie do projektowania i rozwoju konkurencyjnych inhibitorów CDK niebędących ATP

Tutaj opisujemy metody, które powszechnie stosujemy w laboratorium, aby określić, jak natura interakcji między receptorem limfocytów T a antygenami nowotworowymi, prezentowana przez ludzkie antygeny leukocytów, reguluje funkcjonalność komórek T; metody te obejmują produkcję białek, krystalografię rentgenowską, biofizykę i eksperymenty z funkcjonalnymi komórkami T.

Wykorzystanie krystalografii rentgenowskiej, biofizyki i testów funkcjonalnych do określenia mechanizmów rządzących rozpoznawaniem antygenów nowotworowych przez receptory komórek T

Protokół dla wysoce precyzyjnych eksperymentów FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki jest przedstawiony tutaj. Ponadto metodologia ta może być wykorzystana do identyfikacji trzech stanów konformacyjnych w domenie wiążącej ligand receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA). Wyznaczanie precyzyjnych odległości jest pierwszym krokiem w kierunku budowy modeli konstrukcyjnych w oparciu o eksperymenty FRET.

Wysoka precyzja FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki do określania struktury biomolekuły

To badanie przedstawia szczegółową procedurę przeprowadzania eksperymentów z transferem energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) na receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR) przy użyciu znakowania specyficznego dla miejsca poprzez inkorporację nienaturalnych aminokwasów (UAA). Protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący przygotowania próbek, eksperymentów i analizy danych smFRET.

Wizualizacja dynamiki konformacyjnej receptorów błonowych za pomocą jednocząsteczkowego FRET

Ten protokół wprowadza dostępne narzędzia do modelowania ligandów małocząsteczkowych na mapach krioEM makromolekuł.

Modelowanie ligandów na mapach pochodzących z kriomikroskopii elektronowej

Opisujemy metodologię opartą na dywersyfikacji sekwencji w celu oszacowania preferencji aminokwasowych wielospecyficznych miejsc wiązania w interakcjach białko-białko (PPI). W ramach tej strategii tysiące potencjalnych ligandów peptydowych są generowane i badane in silico, pokonując w ten sposób niektóre ograniczenia dostępnych metod eksperymentalnych.

Obliczeniowe przewidywanie preferencji aminokwasów potencjalnie wielospecyficznych domen wiążących peptydy zaangażowanych w interakcje białko-białko

Przedstawiamy tutaj protokół strukturalnie ukierunkowanego projektowania interakcji wiązania białko-ligand między Sanglifehriną A a Cyklofiliną A/Ganoderiol-F, niezbędny w odkrywaniu nowych leków. Stabilność zespołu ligand-receptor została oceniona za pomocą symulacji dynamiki molekularnej.

Struktura-kierowana projektowanie i opracowywanie nowych inhibitorów cyklofiliny A oraz pochodnych ganoderiol-F: podejście In-Silico

Projektowanie białek polega na budowie sekwencji aminokwasów i włączaniu określonych motywów w celu stworzenia funkcjonalnych wariantów. Takie podejście ma kluczowe znaczenie dla opracowania peptydów przeciwdrobnoustrojowych (AMP) do zwalczania patogenów opornych na antybiotyki. W artykule przedstawiono procedurę budowy białek z wykorzystaniem różnych narzędzi bioinformatycznych.

Zastosowanie I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, serwera HADDOCK i lorii HEX do projektowania białek De Novo i In Silico

Przedstawiono protokół syntezy peptoidów o mieszanej funkcjonalności kationowej w tej samej sekwencji (monomery typu lizyny i argininy). Opisano również późniejsze testy tych związków przeciwko Leishmania mexicana, pasożytniczym pierwotniakom wywołującym leiszmaniozę skórną.

Skuteczna metoda syntezy peptoidów z monomerami typu mieszanego lizyny/argininy i oceny ich aktywności przeciwleiszmanicznej

Udało nam się ustalić metodę izolacji RNA z nasion roślin zawierających duże ilości olejów, białek i polifenoli, które mają działanie hamujące izolację RNA o wysokiej czystości. Nasza metoda jest odpowiednia do monitorowania ekspresji genów z transkryptami niskiego poziomu w nasionach.

Skuteczna metoda izolacji wysoce oczyszczonego RNA z nasion do zastosowania w ilościowej analizie transkryptomu

Poznaj metodę ponownego fałdowania i oczyszczania domeny wiążącej ligand chemoreceptora Tlp3 z bakterii Campylobacter jejuni. Protokół umożliwia uzyskanie miligramowych ilości funkcjonalnego białka do badań strukturalnych.

Metoda skutecznego ponownego fałdowania i oczyszczania domeny wiążącej ligand chemoreceptora

Przeglądaj więcej filmów