Metoda skutecznego ponownego fałdowania i oczyszczania domeny wiążącej ligand chemoreceptora

Ogólnym celem tej procedury jest ponowne złożenie domeny wiążącej ligand chemoreceptora z ciał inkluzyjnych i oczyszczenie jej do wykorzystania w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych. Aby ustalić, jakie sygnały wysyła bakteryjny chemoreceptor i w jaki sposób, można użyć izolowanych domen wiążących ligand do badań przesiewowych pod kątem bibliotek małych cząsteczek lub do określenia struktury z ligandem i bez niego. Ucisk zewnątrzkomórkowej domeny wiążącej ligand w E. coli często powoduje odkładanie się w ciałach inkluzyjnych.

Tutaj pokazujemy, w jaki sposób można odzyskać miligramową ilość funkcjonalnego białka z ciał inkluzyjnych. Na początek zaszczep 150 ml sterylnego bulionu LB zawierającego 50 mikrogramów na ml ampicyliny komórkami BL21-CodonPlus RIPL przekształconymi wektorem pET151 D-TOPO w celu ekspresji heksahistydyny TIp3-LBD. Inkubuj kulturę w temperaturze 200 obr./min i 37 stopni Celsjusza przez noc.

Przygotować sześć 2-litrowych kolb Erlenmeyera zawierających 800 ml sterylnego bulionu LB i 50 mikrogramów na ml ampicyliny. Zaszczepić każdą kolbę 20 ml nocnej kultury. Inkubować kolby w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wytrząsając w sposób ciągły przy 200 obr./min, aż OD600 osiągnie 0,6.

W tym momencie indukuj ekspresję białka, dodając 1 milimolowy IPTG do każdej kolby. Kontynuować inkubację kolb w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wytrząsarce przy 200 obr./min przez dodatkowe cztery godziny. Zbierz komórki przez odwirowanie w temperaturze 5000 xg i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut.

Następnie odrzucić supernatant. Przenieś wszystkie granulki komórek do zlewki o pojemności 250 ml i dodaj 100 ml buforu A. W przypadku zamrożenia pozwól komórkom całkowicie się rozmrozić, a następnie ponownie zawieś osad. Próbkę należy przechowywać na lodzie, chyba że wskazano inaczej.

Następnie przepuść zawieszone komórki przez homogenizator wysokociśnieniowy trzy razy, aby zlizować komórki i zapewnić całkowite ścinanie genomowego DNA. Następnie odwiruj lizat w temperaturze 10 000 xg i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Pobrać próbkę supernatantu o pojemności jednego ml i przechowywać ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do późniejszej analizy SDS-PAGE.

Następnie wyrzuć resztę supernatantu i umieść osad na lodzie. Następnie dokładnie zawieś osad ciał inkluzyjnych w 20 ml lodowatego buforu B. Ułatwia to rozpuszczanie błony i białek błonowych. Wirować próbkę przez jedną do dwóch minut, aby ułatwić ponowne zawieszenie.

Po odwirowaniu próbki, dokładnie ponownie zawiesić osad w 20 ml lodowatego buforu B, najpierw przetaczając probówkę przez jedną do dwóch minut. Upewnij się, że granulka jest połamana na małe kawałki. Następnie należy pipetować próbkę w górę i w dół, aby ją ponownie zawiesić.

Odwirować próbkę jak poprzednio i odrzucić supernatant. Jeśli supernatant jest mętny lub zabarwiony, ponownie odwirować próbkę i użyć dodatkowego lodowatego buforu B w celu jej ponownego zawieszenia. Powtórzyć wirowanie i ponowne zawieszenie, aż supernatant stanie się klarowny i bezbarwny przed ponownym granulowaniem.

Dodać 20 ml lodowatego buforu C do osadu i ponownie go zawiesić, wirując probówkę przez jedną do dwóch minut. Następnie, po odwirowaniu próbki, dodaj 25 ml lodowatego buforu denaturującego D. Dokładnie ponownie zawieś osad ciał inkluzyjnych, wirując probówkę przez jedną do dwóch minut lub do momentu, gdy osad zostanie rozbity na małe kawałki. Mieszać zawiesinę przez obrót osiowy przy 30 obr./min i 4 stopnie Celsjusza przez 30 do 120 minut.

Klarować zdenaturowany roztwór białka przez odwirowanie w temperaturze 30 000 xg i czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut. Następnie umieść supernatant na lodzie i wyrzuć granulkę. Mieszając 250 ml buforu E przy 500 obr./min, dodaj 60 miligramów zdenaturowanej mieszanki białkowej zawierającej heksahistadynę TIp3-LBD.

Inkubować mieszankę do ponownego składania w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ciągle mieszając przy 500 obr./min przez 24 do 48 godzin. Końcowe stężenie białka wynosi 0,2 mg na ml. Po przygotowaniu siedmiu litrów wstępnie schłodzonego buforu A i rurki do dializy zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć zamknięcia rurki do dializy, aby zacisnąć jeden koniec membrany dializacyjnej i przenieść mieszaninę dializacyjną do rurki.

Następnie zaciśnij otwarty koniec i upewnij się, że nie ma wycieków. Umieścić rurkę do dializy w wiadrze do dializy ze wstępnie schłodzonym buforem A. Następnie dodaj mieszadło magnetyczne, upewniając się, że nie dotyka ono rurki dializacyjnej podczas mieszania. Dializować próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ciągle mieszając przy prędkości 500 obr./min i zmieniać bufor co najmniej cztery razy w ciągu 12 godzin.

Po ostatniej wymianie buforu pozostawić próbkę do dializacji przez noc. Następnego ranka wyjmij rurkę do dializy z wiadra i przenieś jej zawartość do zlewki o pojemności 500 ml. Roztwór białkowy należy przechowywać na lodzie, chyba że wskazano inaczej.

Przefiltruj roztwór białka przez membranę o wielkości porów 0,43 mikrona do szklanej butelki o pojemności 500 ml, aby usunąć wszelkie wytrącone białko. Po umyciu, naładowaniu i wyrównaniu kolumny chelatującej zgodnie z protokołem tekstowym, należy dostosować otrzymaną ponownie złożoną próbkę białka do składu buforu F, dodając 25 ml 5 M chlorku sodu, 2,5 ml 1 M tris-HCl o pH 8,0 i 2,5 ml 2 M roztworów podstawowych imidazolu. Załadować próbkę do kolumny z szybkością 5 ml na minutę lub mniejszą i odrzucić przepływ, który zawiera niezwiązane białka.

Następnie przemyć kolumnę 50 do 100 ml buforu F w celu usunięcia niespecyficznie związanych białek i odrzucenia przepływu. Eluować heksahistadynę TIp3-LBD za pomocą 25 ml buforu G. Następnie połączyć przepływające frakcje zawierające białko. Po przygotowaniu buforu H i rurki do dializy zgodnie z protokołem tekstowym, dodać proteazę TEV znakowaną heksahistadyną do białka znakowanego heksahistadyną w przewodach.

Dodaj końcowy stosunek molowy jednego TEV do ośmiu białka. Umieścić zaciśniętą rurkę dializacyjną we wstępnie schłodzonych czterech litrach buforu H i inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ciągle mieszając przez dwie godziny. Następnie należy zmienić bufor i kontynuować dializę przez noc, aby umożliwić zakończenie reakcji rozszczepienia, w której pośredniczy TEV.

Po wymianie do buforu I, przefiltrowaniu roztworu białkowego i ponownym dostosowaniu próbki, załadować próbkę do przygotowanej kolumny HP chelatującej HiTrap o pojemności pięciu ml. Przy natężeniu przepływu pięciu ml na minutę zebrać przepływ, który zawiera nieoznakowany TIp3-LBD. Na rozszczepionym białku rozszczepiony znacznik heksahistadyny i heksahistadyna TEV są zatrzymywane przez kolumnę.

Użyć pięciu ml buforu F do przemycia kolumny, aby umożliwić przepływ nieoznakowanego białka i zebranie eluatu. Następnie, po zrównoważeniu kolumny wykluczającej wielkość oraz zagęszczeniu i sklarowaniu próbki białka zgodnie z protokołem tekstowym, załadować próbkę do wstępnie zbalansowanej kolumny filtracyjnej żelu 26/60. Zastosuj bufor A z natężeniem przepływu czterech ml na minutę i monitoruj ślad UV pod kątem elucji białek.

TIp3-LBD eluuje się w objętości retencyjnej od 210 do 220 ml. Na koniec, po chromatografii, połącz frakcje, a następnie zmierz stężenie białka i przeprowadź SDS-PAGE. Procedura izolacji białka pokazana na tym filmie dała od 10 do 20 mg czystego, nieznakowanego TIp3-LBD na jeden litr kultury bakteryjnej.

Jak widać tutaj, białko eluowane z żelowej kolumny filtracyjnej ma pojedynczy, symetryczny pik, odpowiadający objętości retencji 220 ml przy obliczonej masie cząsteczkowej 29 kDa. Jak wykazano tutaj przez SDS-PAGE, ciała inkluzyjne zawierały głównie heksahistadynę TIp3-LBD o pozornej masie cząsteczkowej 28 kDa, która jest bliska wartości obliczonej na podstawie sekwencji aminokwasów 31,8 kDa. Usuwanie znaczników heksahistadyny, chromatografia powinowactwa i etapy filtracji żelu dały wysoce czyste białko.

Spektroskopia CD z użyciem CDSSTR ujawniła, że drugorzędowa struktura heksahistydyny TIp3-LBD składała się z 31% zawartości alfa-helisy i 23% beta-arkusza. Były one również bliskie przewidywanym wartościom wynoszącym odpowiednio 37% i 26%r z analizy sekwencji przy użyciu serwera JPred 3. Protokół ten wymaga co najmniej pięciu dni od początku do końca i w razie potrzeby może zostać wstrzymany na trzech różnych etapach.

Próbując tej procedury, należy pamiętać, że dokładne i całkowite ponowne zawieszenie ciał inkluzyjnych w buforze denaturującym poprzez wirowanie lub pipetowanie w górę iw dół ma kluczowe znaczenie dla całej tej realizacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ponownie złożyć i oczyścić domenę wiążącą ligand chemoreceptora TIp3. Oczyszczone białko można wykorzystać do wiązania kwasów w celu zbadania specyficzności liganda dla tego receptora.

Ponadto wykazaliśmy wcześniej, że białko uzyskane w tej procedurze może być wykorzystane do produkcji wysoce uporządkowanych kryształów, co utorowało drogę do badań nad strukturalnymi podstawami jego specyficzności ligandowej. Procedura ta może być ogólnie przydatna do produkcji mg ilości chemoreceptorów z innych bakterii w postaci krystalizującej i rozpuszczalnej. Zastosowaliśmy ten protokół w jego oryginalnej lub nieznacznie zmodyfikowanej formie do ponownego złożenia i oczyszczenia domeny wiążącej ligand innych chemoreceptorów tego typu do badań krystalograficznych.

Należy pamiętać, że w każdym pojedynczym przypadku prawdopodobnie konieczna będzie optymalizacja protokołu, na przykład składu denaturujących i składających oraz czasów inkubacji.