Name: Wykorzystanie krystalografii rentgenowskiej, biofizyki i testów funkcjonalnych do określenia mechanizmów rządzących rozpoznawaniem antygenów nowotworowych przez receptory komórek T (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Poznaj metody krystalografii rentgenowskiej i biofizyki do analizy interakcji receptora komórek T z antygenami nowotworowymi. Techniki te umożliwiają uzyskanie danych strukturalnych wysokiej rozdzielczości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

BM jest wspierane przez stypendium doktoranckie Cancer Research UK. AG jest wspierane przez stypendium doktoranckie Life Science Research Network Wales. VB jest wspierany przez stypendium doktoranckie Cancer Research Wales. DKC jest stypendystą Wellcome Trust Research Career Development Fellow (WT095767). Usługa AKS jest badaczem Wellcome Trust. GHM jest finansowany przez wspólną sieć badawczą Life Science Research Network Wales i stypendium doktoranckie Tenovus Cancer Care. Dziękujemy personelowi Diamond Light Source za zapewnienie udogodnień i wsparcia.

1. Ekspresja białka
<ol>
	<li>Twórz konstrukty genów do generowania rozpuszczalnych TCR i pHLA, jak szczegółowo opisano wcześniej17,18. Zaprojektuj każdą konstrukcję z 5' BamH1 i 3' miejscem restrykcyjnym EcoR1 do wstawienia do wektora pGMT7.</li>
	<li>Przekształć E. coli Rosetta (DE3)pLysS za pomocą wektora plazmidowego pochodzącego z pGMT7 zawierającego sekwencję kodującą białko będące przedmiotem zainteresowania, inkubując 1 μl plazmidu o stężeniu 50-200 ng/μl z 5 μl E. coli przez 5 minut w temperaturze 4 °C, 2 minuty w temperaturze 42 °C i 5 minut w temperaturze 4 °C, i pozostawić na noc w temperaturze 37 °C na płytce agarowej LB uzupełnionej 50 mg/l karbenicyliny.</li>
	<li>Zbieraj pojedyncze kolonie i hoduj w temperaturze 37 °C i 220 obr./min w 30 ml pożywki TYP (16 g/l tryptonu, 16 g/l ekstraktu drożdżowego i 5 g/l HK2O4) uzupełnionej 100 μM karbenicyliną, aż zawiesina osiągnie gęstość optyczną (OD600) między 0,4 a 0,6.</li>
	<li>Indukować produkcję białka w podwielokrotności 5 ml przez wprowadzenie 0,5 mM izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) przez 3 godziny. Zachować 20 μl zawiesiny z indukcją i bez indukcji do analizy elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) i wybarwić żel.</li>
	<li>Dodać kultury starterowe do 1 l TYPU uzupełnionego karbenicyliną o wielkości 100 μM i hodować komórki, jak opisano powyżej w kroku 1.3, aż zawiesina osiągnie OD600 między 0,4 a 0,6.</li>
	<li>Indukuj ekspresję białka przez 3 godziny za pomocą 0,5 mM IPTG. Odwirować komórki przez 20 minut przy stężeniu 3 000 x g i ostrożnie odlać sklarowany sklarowany stan.</li>
	<li>Rozpuścić osad w 40 ml buforu do lizy (10 mM Tris, pH 8,1; 10 mM chlorek magnezu, MgCl2; 150 mM NaCl; i 10% glicerolu), sonikować na lodzie przez 30 minut przy 60% mocy w odstępie 2 s i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 minut z 0,1 g/l DNazy.</li>
	<li>Zawiesinę zawierającą białka w postaci ciał inkluzyjnych (IB) należy traktować 100 ml buforu do przemywania (0,5% Triton X-100; 50 mM Tris, pH 8,1; 100 mM NaCl; i 10 mM EDTA).</li>
	<li>Odwirować próbkę przez 20 minut w temperaturze 4 °C i 8 000 x g i ostrożnie odlać supernatant. Zawiesić osad w 100 ml buforu do resuspensji (50 mM Tris, pH 8,1; 100 mM NaCl; i 10 mM EDTA, pH 8,1), odwirować jak poprzednio przy 8,000 x g i ostrożnie odlać sklarowany szwaczek.</li>
	<li>Na koniec rozpuścić osad w 10 ml buforu guanidyny (6 M guanidyny; 50 mM Tris, pH 8,1; 2 mM EDTA, pH 8,1; i 100 mM NaCl) i zmierzyć stężenie białka przy 280 nm za pomocą spektrofotometru.</li>
</ol>
2. Ponowne składanie pHLA i TCR
<ol>
	<li>W przypadku fałdowania pHLA zmieszać 30 mg HLA-A2 (lub HLA-A2 ze znacznikiem biotyny) IBs, 30 mg β2m IBs i 4 mg peptydu przez 30 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej w końcowej objętości 6 ml buforu guanidyny uzupełnionego 10 mM ditiotreitolem (DTT).</li>
	<li>Rozpocząć ponowne fałdowanie białek poprzez rozcieńczenie poprzedniej mieszaniny w 1 l wstępnie schłodzonego buforu do zawijania HLA (50 mM Tris, pH 8,1; 400 mM L-argininy; 2 mM EDTA, pH 8,1; 6 mM cysteaminy; i 4 mM cystaminy).</li>
	<li>Pozostawić zawijany HLA mieszając w temperaturze 4 °C przez 3 godziny, a następnie przenieść go do probówki dializacyjnej MWCO (odcięcie masy cząsteczkowej) o stężeniu 12,4 kDa i dializować dwukrotnie przez 24 godziny w stosunku do 20 l 10 mM Tris, pH 8,1.</li>
	<li>W przypadku fałdowania TCR zmieszać 30 mg IB o łańcuchu TCR α i 30 mg IB o łańcuchu TCR β przez 30 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej w 6 ml buforu guanidyny uzupełnionego 10 mM DTT.</li>
	<li>Rozpocząć ponowne fałdowanie białek przez rozcieńczenie zdenaturowanej mieszaniny TCR w 1 l wstępnie schłodzonego buforu do ponownego zawijania TCR (50 mM Tris, pH 8,1; 2,5 M mocznika; 2 mM EDTA, pH 8,1; 6 mM cysteaminy; i 4 mM cytaminy) przez 3 godziny.</li>
	<li>Przenieść ponownie złożony produkt do probówki dializacyjnej MWCO o stężeniu 12,4 kDa i dializować dwukrotnie przez 24 godziny w stosunku do 20 l 10 mM Tris, pH 8,1.</li>
	<li>Przefiltruj oba fałdy pHLA lub TCR za pomocą filtra membranowego 0,45 μm dla etapów oczyszczania.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie za pomocą szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC)
<ol>
	<li>Załadować przefiltrowany preparat do ponownego zawijania (pHLA lub TCR) do kolumny z żywicą anionowymienną o pojemności 7,9 ml i 50 μm, wstępnie zrównoważonej z 20 ml 10 mM Tris, pH 8,1 w elastycznym i intuicyjnym systemie chromatograficznym</li>.
	<li>Eluować białko w dawce 5 ml/min z gradientem soli (0-500 mM NaCl w 10 mM Tris, pH 8,1, ponad 8 objętości kolumny) i zebrać frakcje 1 ml.</li>
	<li>Przeanalizować frakcje odpowiadające białku będącemu przedmiotem zainteresowania za pomocą SDS-PAGE, połączyć ze sobą frakcje zawierające interesujące białko i zagęścić je do 500 μL za pomocą 10-kDa MWCO 20 lub 10 kDa MWCO 4 przez wirowanie przez 20 minut przy 4,000 x g, odrzucając przepływ.</li>
	<li>Załadować skoncentrowane preparaty białkowe do pętli iniekcyjnej o pojemności 2 ml na kolumnę chromatograficzną o pojemności 24 ml z wykluczeniem, wstępnie zrównoważoną odpowiednim buforem elucyjnym: solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), HBS (10 mM HEPES, pH 7,4; 150 mM NaCl; 3,4 mM EDTA; i 0,005% środka powierzchniowo czynnego) lub buforem krystalicznym (10 mM Tris, pH 8,1 i 10 mM NaCl).</li>
	<li>Eluować białka z szybkością przepływu 0,5 ml/min w objętości 1 kolumny; zebrać 1 ml frakcji zawierających białko będące przedmiotem zainteresowania, zweryfikowane przez SDS-PAGE. 
	UWAGA: Metody te zostały wykorzystane do wygenerowania rozpuszczalnych TCR PMEL17 i gp100, a także wszystkich pHLA użytych w tym badaniu: HLA-A*0201 z YLEPGPVTA (A2-YLE), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1A), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE-7A) lub YLEPGPVAA (A2-YLE-8A).</li>
</ol>
4. Analiza powierzchniowego rezonansu plazmonów (SPR)
<ol>
	<li>Wykonaj analizę wiązania równowagi lub analizę termodynamiczną przy użyciu systemu analizy interakcji molekularnych wyposażonego w czujnik CM5 chip19.</li>
	<li>Aktywuj chip CM5, przepływając mieszaninę 100 mM N-hydroksysukcynimidu (NHS) i 400 mM 1-etylo-3-(3-dimetylopropylo)-karboiimidu (EDC) przez 10 minut przy natężeniu przepływu 10 μl/min i w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Załaduj około 5 000 jednostek odpowiedzi (RU) streptawidyny (110 μl z 200 μg / ml w octanie 10 mM, pH 4,5) przez kowalencyjne połączenie z powierzchnią chipa we wszystkich czterech komórkach przepływowych i użyj 100 μl 1 M chlorowodorku etanoloaminy do dezaktywacji pozostałych grup reaktywnych.</li>
	<li>Podłącz około 500-600 RU pHLA, przy ~1 μM w komercyjnym buforze (dostarczonym przez producenta), z chipem czujnika CM5 przy wolnym natężeniu przepływu 10 μL/min, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie na powierzchni chipa.</li>
	<li>Nasycić powierzchnię chipa 1 mM biotyną w komercyjnym buforze (dostarczonym przez producenta) przez 60 s.</li>
	<li>Wstrzyknąć dziesięć seryjnych rozcieńczeń rozpuszczalnych TCR do odpowiednich komórek przepływowych przy wysokim natężeniu przepływu 30 μl/min w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Oblicz wartości stałej wiązania równowagi (KD (E)) za pomocą nieliniowego dopasowania krzywej (y = (P1x)/(P2+x)) 20. 
	UWAGA: y = jednostki odpowiedzi, x = stężenie analityka, P1 = rmax, P2 = KD.</li>
	<li>Wykonaj analizę kinetyczną przy założeniu powiązania Langmuira 1:1 i dopasuj dane za pomocą algorytmu dopasowania globalnego w pakiecie oprogramowania2.</li>
	<li>Wykonaj eksperymenty termodynamiczne, powtarzając tę metodę w następujących temperaturach: 5 °C, 12 °C, 18 °C, 25 °C i 30 °C19.</li>
	<li>Użyj wartości KD wyznaczonych przez SPR w różnych temperaturach, aby obliczyć ΔG° przy użyciu standardowego równania termodynamicznego (ΔG° = -RTlnKD)19. 
	UWAGA: R = stała gazowa, T = temperatura w K, ln = logarytm naturalny.</li>
	<li>Oblicz parametry termodynamiczne zgodnie z równaniem Gibbsa-Helmholtza (ΔG° = ΔH − TΔS°)19.</li>
	<li>Wykreślić energię swobodną wiązania, ΔG° (ΔG° = -RTlnKD), w zależności od temperatury (K) za pomocą regresji nieliniowej, aby dopasować równanie trójparametrowe (y = ΔH+ΔCp*(x-298)-x*ΔS-x*ΔCp*ln(x/298))19. 
	UWAGA: y = temperatura w K, x = ΔG°.</li>
</ol>
5. Kalorymetria miareczkowa izotermiczna (ITC)
<ol>
	<li>Przeprowadzić eksperymenty ITC przy użyciu izotermicznego kalorymetru miareczkowego. Wstrzyknąć 30 μM pHLA do kuwety kalorymetru i załadować 210 μM rozpuszczalnego TCR do strzykawki. Stosować następujące warunki buforowe: 20 mM Hepes (pH 7,4) zawierające 150 mM NaCl.</li>
	<li>Wykonać 20 wstrzyknięć TCR, każde o objętości 2 μl. Oblicz ΔH i KD za pomocą oprogramowania analitycznego.</li>
</ol>
6. Krystalizacja, zbieranie danych dyfrakcyjnych i udoskonalanie modelu
<ol>
	<li>Wykonaj próby krystalizacji za pomocą robota krystalizacyjnego.</li>
	<li>Hodować kryształy przez dyfuzję pary wodnej w temperaturze 18 °C za pomocą techniki siedzącej kropli na 96-dołkowej płytce ze zbiornikiem zawierającym 60 μl buforu krystalizacyjnego (ług macierzysty)21.</li>
	<li>Stężyć rozpuszczalny pHLA do około 10 mg/ml (0,2 mM) w buforze krystalicznym, wirując z prędkością 3 000 x g w koncentratorze odśrodkowym o masie cząsteczkowej 10 kda.</li>
	<li>W przypadku struktur kokompleksnych należy zmieszać TCR i pHLA w stosunku molowym 1:1, aby uzyskać roztwór białka o stężeniu około 10 mg/ml (0,1 mM).</li>
	<li>Dodać 200 nL samego pHLA lub mieszaninę TCR i pH w stosunku molowym 1:1 do 200 nl każdego roztworu zbiornika z ekranu krystalizacji za pomocą robota krystalizacyjnego i naciąć kryształy pod mikroskopem po 24 godzinach, 48 godzinach, 72 godzinach, a następnie raz w tygodniu.</li>
	<li>Zbieraj monokryształy, ręcznie montując je w pętlach kriogenicznych pod mikroskopem i chłodzić je kriogenicznie, zanurzając i przechowując w ciekłym azocie (100 K). 
	UWAGA: Ładowanie kryształów wymaga trochę praktyki, a decydowanie, które kryształy są wystarczająco dobre do zbierania danych, przychodzi z doświadczeniem. Z reguły im większy i bardziej regularny kryształ, tym lepiej.</li>
	<li>Zbieraj dane w strumieniu azotu gazowego o temperaturze 100 K. 
	UWAGA: Dane te zostały uzyskane w krajowym ośrodku nauk synchrotronowych Diamond Light Source (DLS) w Wielkiej Brytanii.</li>
	<li>Przeanalizuj dane, szacując intensywność odbicia za pomocą xia2, używając zarówno MOSFLM22, jak i XDS packages23, a następnie przeskaluj dane za pomocą SCALA lub AIMLESS 24 i pakietu CCP425.</li>
	<li>Rozwiąż struktury za pomocą wymiany molekularnej za pomocą PHASER26.</li>
	<li>Dostosuj model za pomocą COOT27 i uściślij model za pomocą REFMAC528.</li>
	<li>Przygotuj reprezentacje graficzne za pomocą PYMOL29.</li>
	<li>Oblicz kontakty za pomocą programu "kontakt" w pakiecie CCP4. Użyj punktu odcięcia 4 A dla styków van der Waalsa i odcięcia 3,4 A dla wiązań wodorowych i mostków solnych.</li>
	<li>Obliczanie komplementarności powierzchni za pomocą programu "SC" w pakiecie CCP4.</li>
	<li>Oblicz kąt skrzyżowania kompleksu TCR-pHLA, zgodnie z opisem30. 
	UWAGA: Na potrzeby tego badania dane odbicia i końcowe współrzędne modelu zostały zdeponowane w bazie danych PDB (PMEL17 TCR-A2-YLE-9V PDB: 5EU6, A2-YLE PDB: 5EU3, A2-YLE-3A PDB: 5EU4 i A2-YLE-5A PDB: 5EU5).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów ani nie mają sprzecznych interesów finansowych.

Przedstawione tutaj protokoły stanowią ramy dla molekularnej i komórkowej analizy odpowiedzi limfocytów T w kontekście każdej choroby ludzkiej. Chociaż rak był głównym celem tego badania, zastosowaliśmy bardzo podobne podejścia do zbadania odpowiedzi limfocytów T na wirusy 32,33,34,35,36,37 i podczas autoimmunizacji 38,39,40. Ponadto wykorzystaliśmy te techniki szerzej, aby zrozumieć zasady molekularne, które rządzą rozpoznawaniem antygenu limfocytów T 2,19,41,42. Rzeczywiście, nieprzewidywalny charakter modyfikacji reszt peptydowych, nawet tych spoza reszt kontaktowych TCR, wpływa na rozpoznawanie limfocytów T, co ma ważne implikacje dla projektowania peptydów heteroklitycznych. Odkrycia te bezpośrednio przyczyniły się do opracowania nowych terapii limfocytami T, w tym szczepionek peptydowych 6,43 i sztucznych TCR o wysokim powinowactwie 3,4,5,20,44, a także ulepszonej diagnostyki 45,46,47.
Krytyczne kroki w ramach protokołu Wytwarzanie wysoce czystego, funkcjonalnego białka jest niezbędne dla wszystkich metod opisanych w tym artykule.
Modyfikacje i rozwiązywanie problemów Trudności w wytwarzaniu białka o wysokiej czystości często wiążą się z ekspresją wysoce czystych, nierozpuszczalnych IB z systemu ekspresji E. coli . Zwykle modyfikacja protokołu ekspresji (np . indukcja przy różnych gęstościach optycznych, użycie różnych szczepów E. coli lub użycie różnych formacji pożywki) rozwiązuje te problemy.
Ograniczenia techniki Techniki te wykorzystują rozpuszczalne cząsteczki białek (TCR i pHLA), które normalnie ulegają ekspresji na powierzchni komórki. Dlatego ważne jest, aby upewnić się, że wyniki strukturalne/biofizyczne są zgodne z podejściami komórkowymi w celu potwierdzenia znaczenia biologicznego.
Znaczenie techniki w odniesieniu do istniejących/alternatywnych metod Dzięki zastosowaniu krystalografii rentgenowskiej i biofizyki popartej analizą funkcjonalną, my i inni wykazaliśmy, że TCR specyficzne dla epitopów nowotworowych charakteryzują się na ogół niskim powinowactwem do wiązania48. To niskie powinowactwo do TCR może pomóc wyjaśnić, dlaczego limfocyty T nie są naturalnie skuteczne w usuwaniu raka. Wysokorozdzielcze struktury atomowe kompleksów między przeciwnowotworowymi TCR a pokrewnymi antygenami nowotworowymi zaczynają ujawniać molekularne podstawy tego słabego powinowactwa. Co więcej, badania te są pomocne w określeniu mechanizmów, które leżą u podstaw interwencji terapeutycznych mających na celu przezwyciężenie tego problemu, zasiewając przyszłe ulepszenia16. W tym badaniu zbadaliśmy pierwszą strukturę naturalnie występującego αβTCR w kompleksie z epitopem czerniaka ograniczonym gp100 HLA-A*0201. Struktura, w połączeniu z dogłębnym badaniem biofizycznym, ujawniła ogólny sposób wiązania interakcji. Odkryliśmy również nieoczekiwany przełącznik molekularny, który wystąpił w zmutowanej formie peptydu, który zniósł wiązanie TCR (oceniane za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego) i rozpoznawanie limfocytów T CD8 + (eksperymenty funkcjonalne). Ten nowy mechanizm prezentacji antygenu HLA był możliwy jedynie przy użyciu opisanych metod o wysokiej rozdzielczości.
Przyszłe zastosowania lub wskazówki po opanowaniu tej techniki Ogólnie rzecz biorąc, nasze wyniki pokazują moc krystalografii rentgenowskiej i metod biofizycznych w połączeniu z solidnymi analizami funkcjonalnymi. Korzystając z tych podejść, możliwe jest przeanalizowanie precyzyjnych mechanizmów molekularnych, które rządzą rozpoznawaniem antygenu limfocytów T. Rzeczywiście, możliwe jest również zastosowanie tego podejścia do rozwiązania struktury nieligowanych TCR, pokazując, w jaki sposób zmiany konformacyjne mogą odgrywać rolę podczas dyskryminacji antygenowej 49,50,51. Lepsze zrozumienie wysoce złożonej i dynamicznej natury, która leży u podstaw interakcji TCR-pHLA, ma również oczywiste implikacje dla projektowania terapii. Możliwość bezpośredniego "zobaczenia" cząsteczek, które są ukierunkowane terapeutycznie, a także wpływu, jaki modyfikacje mają na rozpoznawanie antygenów, z pewnością poprawi rozwój tych leków w przyszłości. W tym badaniu pokazujemy, że nawet zmiany w pojedynczej reszcie peptydowej, która nie jest silnie zaangażowana przez TCR, mogą nieprzewidywalnie przenosić zmiany strukturalne na inne reszty w peptydzie związanym z HLA, co z kolei dramatycznie zmienia rozpoznawanie limfocytów T. Pełniejsze zrozumienie mechanizmów molekularnych wykorzystywanych podczas rozpoznawania antygenu limfocytów T będzie niezwykle korzystne przy projektowaniu przyszłych terapii dla szerokiego zakresu chorób u ludzi.

Krystalografia rentgenowska była i nadal będzie niezwykle potężną techniką pozwalającą zrozumieć naturę oddziaływań ligand-receptor. Wizualizując te interakcje w szczegółach atomowych, możliwe jest nie tylko ujawnienie mechanizmów molekularnych rządzących wieloma procesami biologicznymi, ale także bezpośrednia zmiana interfejsów kontaktowych w celu uzyskania korzyści terapeutycznych. W połączeniu z technikami, takimi jak powierzchniowy rezonans plazmonowy i izotermiczna kalorymetria miareczkowa (by wymienić tylko kilka), takie modyfikacje mogą być następnie analizowane biofizycznie w celu oceny bezpośredniego wpływu na powinowactwo wiązania, kinetykę oddziaływania i termodynamikę. Wreszcie, przeprowadzając eksperymenty funkcjonalne na odpowiednich typach komórek, można uzyskać szczegółowy obraz molekularnego i funkcjonalnego wpływu modyfikacji interakcji receptor-ligand, dostarczając bardzo konkretnych informacji mechanistycznych. Ogólnie rzecz biorąc, tego typu metody zapewniają obraz rozdzielczości atomowej umożliwiający określenie, jak działają systemy biologiczne, z towarzyszącymi implikacjami dla postępów diagnostycznych i terapeutycznych.
Nasze laboratorium rutynowo wykorzystuje te techniki do badania receptorów, które pośredniczą w odporności ludzkich limfocytów T na patogeny i raka, w autoimmunizacji i podczas transplantacji. Tutaj skupiamy się na odpowiedzi ludzkich limfocytów T CD8 + na raka, w której pośredniczy interakcja między receptorem komórek T (TCR) a peptydami pochodzącymi z nowotworu (pHLA) ograniczonymi ludzkim antygenem leukocytów (HLA). Jest to ważne, ponieważ chociaż limfocyty T CD8 + są w stanie celować w komórki rakowe, my i inni wcześniej wykazaliśmy, że przeciwnowotworowe TCR nieoptymalnie wiążą się z pokrewnym pHLA1,2. W związku z tym wiele laboratoriów próbowało zmienić TCR3,4,5 lub ligand peptydowy6,7,8 w celu zwiększenia immunogenności i lepszego celowania w komórki rakowe. Jednak te podejścia nie zawsze są skuteczne i mogą mieć poważne skutki uboczne, w tym toksyczność poza celem4,9,10. Dalsze badania nad mechanizmami molekularnymi, które rządzą rozpoznawaniem antygenów nowotworowych przez limfocyty T, będą miały zasadnicze znaczenie dla przezwyciężenia tych niedoborów.
W obecnym badaniu skupiliśmy się na odpowiedziach na autologiczne komórki czerniaka przez limfocyty T CD8+ specyficzne dla fragmentu dyferencyjnej antygenu melanocytów glikoproteiny 100 (gp100), gp100280-288, prezentowanej przez HLA-A*0201 (najczęściej wyrażana ludzka klasa PHLA I). Antygen ten był szeroko badanym celem immunoterapii czerniaka i został opracowany jako tak zwany "heteroklityczny" peptyd, w którym walina zastępuje alaninę w pozycji kotwiczenia 9 w celu poprawy stabilności pHLA11. Podejście to zostało wykorzystane do zwiększenia indukcji CTL reagujących na czerniaka in vitro i zostało z powodzeniem zastosowane w badaniach klinicznych12. Jednak modyfikacje reszt peptydowych mogą mieć nieprzewidywalny wpływ na swoistość limfocytów T, o czym świadczy słaba skuteczność większości heterolitycznych peptydów w klinice6,13. Rzeczywiście, inna heteroklityczna forma gp100280-288, w której reszta peptydowa Glu3 została podstawiona przez Ala, zniosła rozpoznanie przez poliklonalną populację limfocytów T specyficznych dla gp100280-28814,15. Wcześniej wykazaliśmy, że nawet niewielkie zmiany w resztach kotwiczących peptydów mogą znacząco zmienić rozpoznawanie limfocytów T w nieprzewidywalny sposób6,16. W związku z tym badanie skupiło się na zbudowaniu bardziej szczegółowego obrazu tego, w jaki sposób limfocyty T CD8 + rozpoznają gp100 i jak modyfikacje interakcji między TCR a pHLA mogą wpływać na tę funkcję.
Tutaj wygenerowaliśmy wysoce czyste, rozpuszczalne formy dwóch TCR-ów specyficznych dla gp100280-288 przedstawionych przez HLA-A*0201 (A2-YLE), jak również naturalne i zmienione formy pHLA. Odczynniki te wykorzystano do wytworzenia kryształów białka w celu rozwiązania trójskładnikowej struktury atomowej ludzkiego TCR w kompleksie z heteroklityczną formą A2-YLE, a także dwoma zmutowanymi pHLA w postaci nieligowanej. Następnie zastosowaliśmy podejście polegające na skanowaniu peptydów, aby zademonstrować wpływ podstawień peptydów na TCR, przeprowadzając dogłębne eksperymenty biofizyczne. Na koniec wygenerowaliśmy genetycznie zmodyfikowaną linię limfocytów T CD8 +, przeprogramowaną do ekspresji jednego z TCR specyficznych dla A2-YLE, w celu przeprowadzenia eksperymentów funkcjonalnych w celu przetestowania biologicznego wpływu różnych modyfikacji peptydów. Dane te pokazują, że nawet modyfikacje reszt peptydowych, które znajdują się poza motywem wiązania TCR, mogą mieć nieprzewidywalny efekt domina na sąsiednie reszty peptydowe, które znoszą wiązanie TCR i rozpoznawanie limfocytów T. Nasze odkrycia stanowią pierwszy przykład mechanizmów strukturalnych leżących u podstaw rozpoznawania przez limfocyty T tego ważnego celu terapeutycznego w czerniaku.

<table><tbody><tr><td>S.O.C. MEDIA</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbi-Safe Nowy inkubator orbitalny</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>carbenicillin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quick Coomassie Bejca SafeStain&nbsp;</td><td>Wirówka Generon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Legend RT&nbsp;</td><td>Sorvall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Chlorek</td> magnezu Fisher<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Arcos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Glicerol Fishera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonopuls HD 2070&nbsp;</td>DNA <td>Bandeliny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Guanidyna rybaka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND1000&nbsp;</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptides</td><td>Peptide Protein Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-arginina&nbsp;</td><td>SAFC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cysteamina&nbsp;</td><td>Cystamine Fishera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Rurki dializacyjne <td>Fishera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Mocznik Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metricel 0,45 &mu; m filtr membranowy</td><td>Pall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>POROS 10/100 HQ&nbsp;</td><td>Biosystemy</td><td></td><td></td> stosowane</tr><tr><td>&Auml; Czysty system FPLC KTA&nbsp;</td><td>GE Healthcare Nauki Przyrodnicze</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 kDa MWCO Vivaspin 20&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 kDa MWCO Vivaspin 4&nbsp;</td><td>Kolumna Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy z solą fizjologiczną&nbsp;</td>Bufor <td>Oxoid</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BIAcore HBS&nbsp;</td>Zestaw do biotynylacji <td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Avidity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BIAcore T200</td><td>Zestaw</td> sprzęgający chip GE Healthcare Life Sciences <td></td><td></td></tr><tr><td>CM5</td><td></td> Streptawidyna&nbsp;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcal Wiceprezes-ITC&nbsp;</td><td>GE Healthcare Nauki Przyrodnicze</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepes&nbsp;</td>Robot krystalizacyjny <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gryphon</td><td>Art Robbins Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intelli-plate&nbsp;</td><td>Art Robbins Instrumenty</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sita krystalizacji i odczynniki</td><td>Wymiary</td><td></td><td></td>molekularne</tr><tr><td>75 cm2 kolba&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; m filtry</td><td>Miller-GP, Rurka</td> ultrawirówkowa Millipore <td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100 XP z wirnikiem SW28</td> Mikrokulki <td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD8&nbsp;</td>Anty-CD3/CD28 Dynabeads <td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Mikrogranulki anty-PE Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CK medium, PHA</td><td>Alere Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anty-TCRV&beta; mAb&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>BD</tr><tr><td>dasatinib&nbsp;</td><td>Axon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MIP-1 i beta oraz TNF i alfa; ELISA&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 51Cr&nbsp;</td><td>Licznik PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1450 Microbeta</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie krystalografii rentgenowskiej, biofizyki i testów funkcjonalnych do określenia mechanizmów rządzących rozpoznawaniem antygenów nowotworowych przez receptory komórek t

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Ludzkie cytotoksyczne limfocyty T CD8+ (CTL) są znane z tego, że odgrywają ważną rolę w kontroli nowotworów. Aby wykonać tę funkcję, receptor limfocytów T z ekspresją powierzchniową komórki (TCR) musi funkcjonalnie rozpoznawać peptydy pochodzące z guza (pHLA) ograniczone ludzkim antygenem leukocytarnym (HLA). Jednak my i inni wykazaliśmy, że większość TCR wiąże się nieoptymalnie z antygenami nowotworowymi. Odkrycie mechanizmów molekularnych, które definiują to słabe rozpoznanie, może pomóc w opracowaniu nowych terapii celowanych, które pozwolą obejść te niedociągnięcia. Rzeczywiście, obecne terapie, którym brakuje tego zrozumienia molekularnego, nie są powszechnie skuteczne. W tym miejscu opisujemy metody, które powszechnie stosujemy w laboratorium, aby określić, w jaki sposób charakter interakcji między TCR a pHLA wpływa na funkcjonalność limfocytów T. Metody te obejmują generowanie rozpuszczalnych TCR i pHLA oraz stosowanie tych odczynników do krystalografii rentgenowskiej, analizy biofizycznej i barwienia komórek T specyficznych dla antygenu za pomocą multimerów pHLA. Korzystając z tych podejść i kierując się analizą strukturalną, możliwe jest zmodyfikowanie interakcji między TCR i pHLA, a następnie przetestowanie, jak te modyfikacje wpływają na rozpoznawanie antygenu komórek T. Odkrycia te pomogły już wyjaśnić mechanizm rozpoznawania wielu antygenów nowotworowych przez limfocyty T i mogą ukierunkować rozwój zmienionych peptydów i zmodyfikowanych TCR w nowych terapiach przeciwnowotworowych.

Tutaj opisujemy metody, które powszechnie stosujemy w laboratorium, aby określić, jak natura interakcji między receptorem limfocytów T a antygenami nowotworowymi, prezentowana przez ludzkie antygeny leukocytów, reguluje funkcjonalność komórek T; metody te obejmują produkcję białek, krystalografię rentgenowską, biofizykę i eksperymenty z funkcjonalnymi komórkami T.

Wykorzystanie krystalografii rentgenowskiej, biofizyki i testów funkcjonalnych do określenia mechanizmów rządzących rozpoznawaniem antygenów nowotworowych przez receptory komórek T

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie rozpuszczalnych leżących receptorów limfocytów T i peptydowych białek HLA o jakości wystarczającej do wykorzystania w analizie biofizycznej i strukturalnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania z zakresu immunologii komórek T. Na przykład, dlaczego limfocyty T nie reagują silnie na raka?Główną zaletą tej techniki jest to, że otrzymujemy dane mechanistyczne o niezwykle wysokiej rozdzielczości, wyjaśniające, w jaki sposób receptory komórek T rozpoznają swoje cele, co prowadzi do odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem komórek T. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę praktycznie każdej choroby ludzkiej, ponieważ limfocyty T odgrywają kluczową rolę w większości odpowiedzi immunologicznych. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w odpowiedzi immunologiczne limfocytów T, można ją również zastosować do innych systemów, które są kontrolowane przez interakcje ligandów receptora.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ bardzo trudno jest wytworzyć rozpuszczalne, aktywne białka o wystarczającej jakości do eksperymentów biofizycznych i strukturalnych. Aby rozpocząć procedurę ponownego fałdowania peptydu HLA do sześciu mililitrów buforu guanidyny z 10 milimetrem ditiotreitolu, dodaj 30 miligramów ciał inkluzyjnych HLA-A2, 30 miligramów ciał inkluzyjnych beta 2-M i cztery miligramy pożądanego peptydu będącego przedmiotem zainteresowania. Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie rozcieńczyć mieszaninę jednym litrem buforu do zawijania HLA, wstępnie schłodzonego do czterech stopni Celsjusza i mieszać mieszaninę przez trzy godziny w tej temperaturze. Mieszaninę należy dializować dwukrotnie w stosunku do 20 litrów 10 milimolowych trisów o pH 8,1 przez 24 godziny każdy. Aby rozpocząć procedurę ponownego fałdowania TCR, do sześciu mililitrów buforu guanidyny z 10 milimolowym ditiotreitolem dodaj po 30 miligramów IB TCR Alpha i beta.Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i rozcieńczyć mieszaninę w jednym litrze wstępnie schłodzonego buforu do ponownego zawijania TCR. Rozcieńczoną mieszaninę TCR należy ponownie zawinąć i dializować w taki sam sposób, jak mieszaninę peptydów HLA. Przefiltrować obie dializowane mieszaniny do ponownego zawijania przez filtr membranowy o średnicy 0,45 mikrometra.Następnie załaduj jeden z przefiltrowanych preparatów do ponownego zawijania na 7,9 mililitra 50 mikrometrów kolumny z żywicą anionowymienną, wstępnie zrównoważoną 20 mililitrami 10-milimolowych trisów, pH 8,1. Eluuj białko za pomocą systemu buforowego gradientu soli w tempie pięciu mililitrów na minutę. Zbierz ułamki o wielkości jednego mililitra i przeanalizuj je za pomocą SDS-Page.Połącz frakcje zawierające ponownie złożone białko. Umieść mieszaninę białek w koncentratorze odśrodkowym o masie cząsteczkowej 10 kilodaltonów. Odwirowywać mieszaninę przez 20 minut lub tak długo, jak jest to wymagane, w ilości 4000 razy g, aby zagęścić mieszaninę do 500 mikrolitrów.Odrzuć przepływ. Uformować skoncentrowany preparat białkowy w dwumililitrową pętlę iniekcyjną i wstrzyknąć białko do kolumny chromatograficznej wykluczającej o wielkości 24 mililitrów, wstępnie zrównoważonej odpowiednim buforem elucji. Eluować białko za pomocą jednej kolumny buforu o objętości 0,5 mililitra na minutę.Zbierz frakcje o wielkości jednego mililitra, przeanalizuj frakcje za pomocą SDS-Page i połącz frakcje zawierające interesujące Cię białko. Przygotować 10 seryjnych rozcieńczeń roztworu TCR w zakresie stężeń od 10 razy powyżej do 10 razy poniżej KD specyficznego oddziaływania peptydu TCR HLA, jeśli jest znane. W przeciwnym razie zacznij od stężenia TCR wynoszącego 200 mikromolów.Następnie aktywuj chip czujnika pokryty karboksymetylowanym dekstranem, przepływając jeden do jednego mieszaniny 100 milimolów i N-hydroksysukcynimidu oraz 400 milimolowego EDC po chipie z natężeniem przepływu 10 mikrolitrów na minutę przez 10 minut, w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie załaduj 110 mikrolitrów po 200 mikrogramów na mililitr streptawidyny i 10 milimolowy octan pH 4,5 we wszystkich czterech komórkach przepływowych, aby funkcjonalizować powierzchnię chipa. Dezaktywować wszystkie pozostałe grupy reaktywne za pomocą 100 mikrolitrów jednego molowego chlorowodorku etanoloamidu.Następnie przelej roztwór około jednego mikromolowego peptydu HLA w buforze dostarczonym przez producenta chipa po powierzchni chipa z prędkością 10 mikrolitrów na minutę, aż liczba jednostek odpowiedzi wzrośnie o 500 do 600. Nasącz powierzchnię chipa jedną milimolową biotyną i buforem dostarczonym przez producenta przez 60 sekund. Następnie wstrzyknąć 10 seryjnych rozcieńczeń roztworu TCR w ilości 30 mikrolitrów na minutę w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Oblicz stałą wiązania równowagi i przeprowadź analizę kinetykę. Wykonaj w ten sposób serię eksperymentów SPR, zmieniając tylko temperaturę, w której wstrzykiwane są rozcieńczenia TCR. Określ stałą wiązania równowagi dla każdej temperatury i oblicz energie Gibbsa oraz inne parametry termodynamiczne.Połącz energie Gibbsa z temperaturą za pomocą dopasowania regresji nieliniowej. Stężyć roztwór peptydu HLA do 0,2 milimola i buforu krystalizacyjnego przez odwirowanie pod ciśnieniem 3 000 razy g, w koncentratorze odśrodkowym o masie cząsteczkowej 10 kilodaltonów. Przygotować 0,1 milimolowy roztwór jeden do jednego TCR i peptydu HLA do krystalizacji kokompleksu.Korzystając z robota krystalizacyjnego i zestawu do badań przesiewowych, przygotuj próby krystalizacji przy użyciu techniki siedzącej kropli na 96-dołkowej płytce. Z 60 mikrolitrami buforu krystalizacyjnego w każdym zbiorniku, a każda kropla składa się z 200 nanolitrów roztworu białkowego i buforu. Wyhoduj kryształy w temperaturze 18 stopni Celsjusza.Oceń kryształy pod mikroskopem po 24 godzinach, 48 godzinach, 72 godzinach, a następnie co tydzień. Gdy wyrosną monokryształy o odpowiedniej jakości, zbierz monokryształy za pomocą pętli kompatybilnej z kriogenem i przechowuj kryształy w ciekłym azocie. Wykonaj synchrotronową dyfrakcję promieniowania rentgenowskiego pod strumieniem azotu o temperaturze 100 kelwinów, przeanalizuj dane i rozwiąż struktury za pomocą odpowiedniego oprogramowania.Oblicz kontakty, komplementarność powierzchni i kąt przecięcia z rozwiązanych konstrukcji. Za pomocą tych metod TCR i peptydowe cząsteczki HLA uległy ekspresji i ponownie sfałdowały się do postaci rozpuszczalnej. Peptydem w cząsteczkach peptydu HLA był antygen gp100.SPR wykorzystano do określenia powinowactwa wiązania PMEL17 TCR do antygenu w różnych temperaturach. Następnie zastosowano SPR i izotermiczne miareczkowanie kalorymetryczne w celu wyznaczenia parametrów termodynamicznych oddziaływania białko-białko. Kompleks PMEL17 TCR A2-YLE-9V skrystalizowano i oceniono za pomocą synchrotronowej dyfrakcji rentgenowskiej.Zidentyfikowano pętle TCR CDR i peptydowe reszty HLA, z którymi styka się białko TCR, a także zbadano charakter tych kontaktów. Peptydowe cząsteczki HLA ze zmutowanymi formami peptydu zostały również oczyszczone i skrystalizowane w ten sposób. Zbadanie różnic strukturalnych, które mogłyby zapobiec interakcjom wiązania z TCR.Stwierdzono, że mutacja trzeciej lub piątej reszty znacząco zmienia położenie proliny czwartej, co zakłóciłoby wiele kontaktów z pętlą TCR CDR-3 Alpha. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby wybrać tylko najczystsze białka do dalszej analizy. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak barwienie tetramerem peptydowym HLA, przy użyciu rozpuszczalnych białek w celu wyizolowania limfocytów T specyficznych dla antygenu z krwi pacjenta w celu diagnostyki i dalszej analizy.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się immunologią limfocytów T do szczegółowego zbadania wiązania HLA peptydu TCR, umożliwiając opracowanie nowych leków na raka i inne choroby ludzkie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować białka TCR i peptydowe HLA o jakości wystarczającej do przeprowadzenia analizy biofizycznej i strukturalnej.

using-x-ray-crystallography-biophysics-functional-assays-to-determine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Test uwalniania chromu, powszechnie stosowana metoda wykrywania aktywności cytotoksycznych limfocytów T, posiada kilka ograniczeń. W niniejszym artykule, wykorzystując antygenowo specyficzne limfocyty T CD8 oraz linię komórkową raka piersi u ludzi SKBR3, zbadano podejście oparte na impedancji pod kątem zdolności do wykrywania śmierci komórek.

Wyznaczenie optymalnej aktywności cytotoksycznej ludzkich limfocytów T CD8 specyficznych dla Her2neu poprzez porównanie testu uwalniania Cr51 z systemem xCELLigence

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Opisujemy jednokomórkowy test wysokoprzepustowy do pomiaru cytotoksyczności limfocytów T podczas inkubacji z komórkami docelowymi nowotworu. Metoda ta wykorzystuje gęsty, elastomerowy układ dołków sub-nanolitrowych (~ 100 000 dołków / tablicę) w celu przestrzennego ograniczenia limfocytów T i komórek docelowych w określonych proporcjach i jest sprzężona z mikroskopią fluorescencyjną w celu monitorowania koniugacji efektor-cel i późniejszej apoptozy.

Ilościowy, wysokoprzepustowy test cytotoksyczności pojedynczej komórki dla limfocytów T

Opisano test wiązania komórkowego oparty na cytometrii przepływowej, który jest używany głównie jako narzędzie przesiewowe do identyfikacji związków, które hamują wiązanie znakowanego fluorescencyjnie ligandu chemokiny CXC 12 (CXCL12) z receptorem chemokiny CXC 4 (CXCR4).

Test oparty na cytometrii przepływowej w celu identyfikacji związków, które zakłócają wiązanie znakowanego fluorescencyjnie ligandu chemokiny CXC 12 z receptorem chemokiny CXC 4

Ten artykuł wykorzystuje test oparty na cytometrii przepływowej do badania bibliotek chemicznych inhibitorów w celu identyfikacji inhibitorów i ich celów, które wpływają na sygnalizację receptora limfocytów T. Opisane tutaj metody można również rozszerzyć o badania przesiewowe o wysokiej przepustowości.

Identyfikacja mediatorów sygnalizacji receptora limfocytów T poprzez badania przesiewowe bibliotek inhibitorów chemicznych

Opisujemy ilościowy system testów cytolizy in vitro w czasie rzeczywistym, aby ocenić siłę działania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenu ukierunkowanych na płynne i lite komórki nowotworowe. Protokół ten można rozszerzyć w celu oceny innych komórek efektorowych układu odpornościowego, a także leczenia skojarzonego.

Test siły działania w czasie rzeczywistym dla chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego ukierunkowanych na stałe i hematologiczne komórki nowotworowe

Tutaj opisujemy metodę wspólnej hodowli in vitro do rekurencyjnego wyzwania limfocytów T ukierunkowanych na nowotwór, co pozwala na fenotypową i funkcjonalną analizę aktywności przeciwnowotworowych limfocytów T.

Ponowne badanie komórek nowotworowych in vitro w celu predykcyjnej oceny funkcji przeciwnowotworowej komórek T receptora antygenu chimerycznego

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak używać mikroskopii świetlnej do czterowymiarowej wizualizacji dynamiki receptorów powierzchniowych w żywych komórkach. Tutaj pokazano receptory limfocytów T na pierwotnych limfocytach T CD4 +.

Czterowymiarowa wizualizacja dynamiki powierzchniowego receptora limfocytów T przy użyciu mikroskopii świetlnej kratowej

Tutaj prezentujemy protokół do badania lokalizacji in vivo przeciwciał w modelach ksenoprzeszczepów guza myszy.

Analiza rozmieszczenia nowotworów i tkanek przeciwciała terapeutycznego specyficznego dla antygenu docelowego

Ten protokół opisuje metodologię nieinwazyjnego śledzenia limfocytów T genetycznie zmodyfikowanych do ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych in vivo za pomocą klinicznie dostępnej platformy.

Dynamiczne obrazowanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej [18F] tetrafluoroboranu / tomografii komputerowej

Przedstawiono tutaj protokół znakowania radioizotopowego komórek za pomocą radioizotopu pozytonowej tomografii emisyjnej (PET), 89Zr (t1/2 78.4 h), przy użyciu gotowego do użycia syntonu radioznakującego, [89Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN). Znakowanie radioizotopowane komórek za pomocą [89Zr]Zr-DBN umożliwia nieinwazyjne śledzenie i obrazowanie podanych komórek znakowanych radioaktywnie w organizmie za pomocą PET przez okres do 7 dni po podaniu.

Obrazowanie transportu komórek za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej: metoda znakowania radioaktywnego komórek

Poznaj metody krystalografii rentgenowskiej i biofizyki do analizy interakcji receptora komórek T z antygenami nowotworowymi. Techniki te umożliwiają uzyskanie danych strukturalnych wysokiej rozdzielczości.

Wykorzystanie krystalografii rentgenowskiej, biofizyki i testów funkcjonalnych do określenia mechanizmów rządzących rozpoznawaniem antygenów nowotworowych przez receptory komórek T (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie krystalografii rentgenowskiej, biofizyki i testów funkcjonalnych do określenia mechanizmów rządzących rozpoznawaniem antygenów nowotworowych przez receptory komórek T

Przeglądaj więcej filmów