Wykorzystanie krystalografii rentgenowskiej, biofizyki i testów funkcjonalnych do określenia mechanizmów rządzących rozpoznawaniem antygenów nowotworowych przez receptory komórek T

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie rozpuszczalnych leżących receptorów limfocytów T i peptydowych białek HLA o jakości wystarczającej do wykorzystania w analizie biofizycznej i strukturalnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania z zakresu immunologii komórek T. Na przykład, dlaczego limfocyty T nie reagują silnie na raka?

Główną zaletą tej techniki jest to, że otrzymujemy dane mechanistyczne o niezwykle wysokiej rozdzielczości, wyjaśniające, w jaki sposób receptory komórek T rozpoznają swoje cele, co prowadzi do odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem komórek T. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę praktycznie każdej choroby ludzkiej, ponieważ limfocyty T odgrywają kluczową rolę w większości odpowiedzi immunologicznych. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w odpowiedzi immunologiczne limfocytów T, można ją również zastosować do innych systemów, które są kontrolowane przez interakcje ligandów receptora.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ bardzo trudno jest wytworzyć rozpuszczalne, aktywne białka o wystarczającej jakości do eksperymentów biofizycznych i strukturalnych. Aby rozpocząć procedurę ponownego fałdowania peptydu HLA do sześciu mililitrów buforu guanidyny z 10 milimetrem ditiotreitolu, dodaj 30 miligramów ciał inkluzyjnych HLA-A2, 30 miligramów ciał inkluzyjnych beta 2-M i cztery miligramy pożądanego peptydu będącego przedmiotem zainteresowania. Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie rozcieńczyć mieszaninę jednym litrem buforu do zawijania HLA, wstępnie schłodzonego do czterech stopni Celsjusza i mieszać mieszaninę przez trzy godziny w tej temperaturze. Mieszaninę należy dializować dwukrotnie w stosunku do 20 litrów 10 milimolowych trisów o pH 8,1 przez 24 godziny każdy. Aby rozpocząć procedurę ponownego fałdowania TCR, do sześciu mililitrów buforu guanidyny z 10 milimolowym ditiotreitolem dodaj po 30 miligramów IB TCR Alpha i beta.

Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i rozcieńczyć mieszaninę w jednym litrze wstępnie schłodzonego buforu do ponownego zawijania TCR. Rozcieńczoną mieszaninę TCR należy ponownie zawinąć i dializować w taki sam sposób, jak mieszaninę peptydów HLA. Przefiltrować obie dializowane mieszaniny do ponownego zawijania przez filtr membranowy o średnicy 0,45 mikrometra.

Następnie załaduj jeden z przefiltrowanych preparatów do ponownego zawijania na 7,9 mililitra 50 mikrometrów kolumny z żywicą anionowymienną, wstępnie zrównoważoną 20 mililitrami 10-milimolowych trisów, pH 8,1. Eluuj białko za pomocą systemu buforowego gradientu soli w tempie pięciu mililitrów na minutę. Zbierz ułamki o wielkości jednego mililitra i przeanalizuj je za pomocą SDS-Page.

Połącz frakcje zawierające ponownie złożone białko. Umieść mieszaninę białek w koncentratorze odśrodkowym o masie cząsteczkowej 10 kilodaltonów. Odwirowywać mieszaninę przez 20 minut lub tak długo, jak jest to wymagane, w ilości 4000 razy g, aby zagęścić mieszaninę do 500 mikrolitrów.

Odrzuć przepływ. Uformować skoncentrowany preparat białkowy w dwumililitrową pętlę iniekcyjną i wstrzyknąć białko do kolumny chromatograficznej wykluczającej o wielkości 24 mililitrów, wstępnie zrównoważonej odpowiednim buforem elucji. Eluować białko za pomocą jednej kolumny buforu o objętości 0,5 mililitra na minutę.

Zbierz frakcje o wielkości jednego mililitra, przeanalizuj frakcje za pomocą SDS-Page i połącz frakcje zawierające interesujące Cię białko. Przygotować 10 seryjnych rozcieńczeń roztworu TCR w zakresie stężeń od 10 razy powyżej do 10 razy poniżej KD specyficznego oddziaływania peptydu TCR HLA, jeśli jest znane. W przeciwnym razie zacznij od stężenia TCR wynoszącego 200 mikromolów.

Następnie aktywuj chip czujnika pokryty karboksymetylowanym dekstranem, przepływając jeden do jednego mieszaniny 100 milimolów i N-hydroksysukcynimidu oraz 400 milimolowego EDC po chipie z natężeniem przepływu 10 mikrolitrów na minutę przez 10 minut, w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie załaduj 110 mikrolitrów po 200 mikrogramów na mililitr streptawidyny i 10 milimolowy octan pH 4,5 we wszystkich czterech komórkach przepływowych, aby funkcjonalizować powierzchnię chipa. Dezaktywować wszystkie pozostałe grupy reaktywne za pomocą 100 mikrolitrów jednego molowego chlorowodorku etanoloamidu.

Następnie przelej roztwór około jednego mikromolowego peptydu HLA w buforze dostarczonym przez producenta chipa po powierzchni chipa z prędkością 10 mikrolitrów na minutę, aż liczba jednostek odpowiedzi wzrośnie o 500 do 600. Nasącz powierzchnię chipa jedną milimolową biotyną i buforem dostarczonym przez producenta przez 60 sekund. Następnie wstrzyknąć 10 seryjnych rozcieńczeń roztworu TCR w ilości 30 mikrolitrów na minutę w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Oblicz stałą wiązania równowagi i przeprowadź analizę kinetykę. Wykonaj w ten sposób serię eksperymentów SPR, zmieniając tylko temperaturę, w której wstrzykiwane są rozcieńczenia TCR. Określ stałą wiązania równowagi dla każdej temperatury i oblicz energie Gibbsa oraz inne parametry termodynamiczne.

Połącz energie Gibbsa z temperaturą za pomocą dopasowania regresji nieliniowej. Stężyć roztwór peptydu HLA do 0,2 milimola i buforu krystalizacyjnego przez odwirowanie pod ciśnieniem 3 000 razy g, w koncentratorze odśrodkowym o masie cząsteczkowej 10 kilodaltonów. Przygotować 0,1 milimolowy roztwór jeden do jednego TCR i peptydu HLA do krystalizacji kokompleksu.

Korzystając z robota krystalizacyjnego i zestawu do badań przesiewowych, przygotuj próby krystalizacji przy użyciu techniki siedzącej kropli na 96-dołkowej płytce. Z 60 mikrolitrami buforu krystalizacyjnego w każdym zbiorniku, a każda kropla składa się z 200 nanolitrów roztworu białkowego i buforu. Wyhoduj kryształy w temperaturze 18 stopni Celsjusza.

Oceń kryształy pod mikroskopem po 24 godzinach, 48 godzinach, 72 godzinach, a następnie co tydzień. Gdy wyrosną monokryształy o odpowiedniej jakości, zbierz monokryształy za pomocą pętli kompatybilnej z kriogenem i przechowuj kryształy w ciekłym azocie. Wykonaj synchrotronową dyfrakcję promieniowania rentgenowskiego pod strumieniem azotu o temperaturze 100 kelwinów, przeanalizuj dane i rozwiąż struktury za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

Oblicz kontakty, komplementarność powierzchni i kąt przecięcia z rozwiązanych konstrukcji. Za pomocą tych metod TCR i peptydowe cząsteczki HLA uległy ekspresji i ponownie sfałdowały się do postaci rozpuszczalnej. Peptydem w cząsteczkach peptydu HLA był antygen gp100.

SPR wykorzystano do określenia powinowactwa wiązania PMEL17 TCR do antygenu w różnych temperaturach. Następnie zastosowano SPR i izotermiczne miareczkowanie kalorymetryczne w celu wyznaczenia parametrów termodynamicznych oddziaływania białko-białko. Kompleks PMEL17 TCR A2-YLE-9V skrystalizowano i oceniono za pomocą synchrotronowej dyfrakcji rentgenowskiej.

Zidentyfikowano pętle TCR CDR i peptydowe reszty HLA, z którymi styka się białko TCR, a także zbadano charakter tych kontaktów. Peptydowe cząsteczki HLA ze zmutowanymi formami peptydu zostały również oczyszczone i skrystalizowane w ten sposób. Zbadanie różnic strukturalnych, które mogłyby zapobiec interakcjom wiązania z TCR.

Stwierdzono, że mutacja trzeciej lub piątej reszty znacząco zmienia położenie proliny czwartej, co zakłóciłoby wiele kontaktów z pętlą TCR CDR-3 Alpha. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby wybrać tylko najczystsze białka do dalszej analizy. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak barwienie tetramerem peptydowym HLA, przy użyciu rozpuszczalnych białek w celu wyizolowania limfocytów T specyficznych dla antygenu z krwi pacjenta w celu diagnostyki i dalszej analizy.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się immunologią limfocytów T do szczegółowego zbadania wiązania HLA peptydu TCR, umożliwiając opracowanie nowych leków na raka i inne choroby ludzkie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować białka TCR i peptydowe HLA o jakości wystarczającej do przeprowadzenia analizy biofizycznej i strukturalnej.