Modelowanie ligandów na mapach pochodzących z kriomikroskopii elektronowej
19 lipca 2024
Ten protokół wprowadza dostępne narzędzia do modelowania ligandów małocząsteczkowych na mapach krioEM makromolekuł.
Jesteśmy zainteresowani zrozumieniem procesów fizjologicznych zachodzących w całej komórce, szczególnie na granicy faz błony. Używamy cryoEM jako głównej techniki i pracujemy nad różnymi interesującymi i wymagającymi problemami biologicznymi, badając wiele kompleksów makromolekularnych. Określenie struktur białek błonowych i innych labilnych kompleksów było wyzwaniem kilka dekad temu.
Jednak postęp techniczny w dziedzinie krioEM oraz nowatorskie środowiska detergentów i mimetyków lipidów utorowały drogę do szybkiego określenia struktury tych kompleksów. Struktury te można teraz uzyskać w wysokiej rozdzielczości i potencjalnie wykorzystać w odkrywaniu leków. W przypadku krioEM-u z pojedynczymi cząstkami wyzwania obejmują uzyskanie stabilnej i jednorodnej próbki, osadzenie próbki w losowej orientacji w cienkim lodzie, przetwarzanie dużej liczby obrazów przy niskim stosunku sygnału do szumu oraz dokładne określenie orientacji kątowej i klasyfikacji podczas rekonstrukcji 3D.
Identyfikacja i modelowanie małych cząsteczek na mapach krioEM kompleksów białek ligandowych jest trudne ze względu na nieodłączny szum w danych oraz izotropową i niską rozdzielczość mapy, niejednorodność próbki i elastyczność ligandów. Protokół ten jest przewodnikiem krok po kroku dotyczącym identyfikacji i modelowania ligandów i cząsteczek rozpuszczalników na mapach krioEM o niskiej i średniej rozdzielczości. Zacznij od pobrania nienaostrzonych map połówkowych apo-enolazy z dodatkowych danych w EMDB.
Następnie otwórz ChimeraX i kliknij Otwórz na pasku narzędzi. Wybierz mapy połówkowe apo-enolazy. Wpisz to w wierszu poleceń, aby połączyć połówki map i uzyskać niewyostrzoną mapę apo-enolase.
Dostosuj próg mapy do 0,0595, aby zredukować szumy. Następnie wpisz to polecenie, aby zmienić nazwę połączonej mapy. Kliknij Otwórz.
Wybierz PEP enolase niezaostrzone mapy połówkowe i wpisz to polecenie w wierszu poleceń. Dostosuj próg mapy do 0,0721, aby zredukować szum i zmienić nazwę mapy. Następnie wyświetl niewyostrzone mapy enolazy apo-enolase i PEP i kliknij Dopasuj w panelu mapy, aby obliczyć mapę różnic.
Wpisz to polecenie w wierszu polecenia, aby odjąć mapę enolazy PEP od mapy apo-enolase i dostosować próg. Pokoloruj odjętą mapę na zielono, co oznacza gęstość dodatnią. Następnie otwórz PDB i pobierz współrzędne enolazy oktomerycznej Mycobacterium tuberculosis.
Następnie w ChimeraX kliknij Otwórz na pasku narzędzi i wybierz nazwę pliku. Kliknij Wyświetlanie molekuł, Ukryj atomy i Pokaż kreskówkę. Wpisz to polecenie, aby zmienić nazwę modelu.
Wybierz model z panelu modelu. Kliknij prawym przyciskiem myszy na pasku narzędzi. Następnie kliknij przycisk Przenieś model i umieść model w pobliżu mapy enolazy PEP.
Wyrównaj model względem mapy. Dopasuj ten model do niewyostrzonej mapy enolazy PEP, wpisując to polecenie w wierszu polecenia. Sprawdź dopasowanie.
Dostosuj reprezentację koloru i struktury. Otwórz Coot z terminala, wpisując coot Kliknij Plik, a następnie Otwórz współrzędne i wybierz Apo-enolase.pdb. Następnie pobierz mapę zaostrzoną enolazą związaną z PEP z EMDB.
Wyświetl tę mapę w Coot, klikając Plik i Otwórz mapę. Przewiń środkowy przycisk myszy, aby ustawić próg na 7.00 sigma. Kliknij pozycję Weryfikuj, a następnie pozycję Niemodelowane obiekty blob.
W nowym oknie wpisz 7.00 jako RMSD i kliknij Znajdź obiekty blob. Zlokalizuj niemodelowaną gęstość liganda w pobliżu reszt miejsca aktywnego seryny-42, lizyny-386 i argininy-364. Następnie kliknij Plik, Pobierz monomer i wprowadź PEP, aby pobrać plik modelu monomeru PEP z biblioteki monomerów Coot.
Przesuń cząsteczkę PEP do gęstości za pomocą opcji obróć/przesuń cząsteczkę łańcucha strefy w menu paska bocznego. Następnie kliknij strefę uściślania w przestrzeni rzeczywistej w menu paska bocznego, aby dopasować cząsteczkę PEP do gęstości. Oceń dopasowanie i kliknij Akceptuj po zakończeniu.
Użyj opcji Scal cząsteczkę na karcie Edycja, aby scalić dopasowany ligand z modelem apo-enolase i zapisać model jako pep-enolase.pdb. Następnie kliknij Oblicz, NCS narzędzia, a następnie NCS Ligandy, aby dodać ligandy do pozostałych monomerów w pliku współrzędnych. Dla opcji białka z NCS należy wybrać plik współrzędnych apo-enolaza.
pdb i identyfikator łańcucha A jako główny łańcuch NCS. Następnie dla cząsteczki zawierającej ligand wybierz apo-enolazę. pdb jako plik współrzędnych, identyfikator łańcucha J i numer pozostałości od 1 do 1.
Kliknij Znajdź stanowiska kandydatów. Kliknij na poszczególne kandydujące ligandy i przeanalizuj wizualnie dopasowanie. Następnie zamodeluj dwa jony magnezu w gęstości miejsca aktywnego, klikając na umieść atom na wskaźniku i wybierając Mg z listy typów atomów wskaźnika.
Dodaj również jony magnezu w monomerach związanych z symetrią. Oceń dopasowanie dla atomów magnezu związanych z symetrią. Zapisz model, klikając Plik, a następnie Zapisz współrzędne, wybierz nazwę pliku i wpisując Enolase+PEP+Mg.pdb.
Następnie otwórz Phenix GUI. Uruchom zadanie uściślania w czasie rzeczywistym przy użyciu parametrów domyślnych z zapisanym modelem i zaostrzoną mapą powiązaną z PEP. Aby zwizualizować modelowany ligand, otwórz PyMOL.
Kliknij Plik i Otwórz, aby załadować udoskonalony model z zadania uściślania Phenix. Załaduj również zaostrzoną mapę z PEP. Zmień nazwę mapy na wyostrzoną PEP, klikając Akcje, a następnie zmień nazwę.
Następnie wybierz ligandy, klikając Wyświetlacz, a następnie Sekwencja. Wpisz to w wierszu poleceń i naciśnij enter. Spowoduje to wyrzeźbienie gęstości mapy wokół zaznaczenia.
Kliknij ostatnie pole, C, obok mesh_ligand obiektu, aby zmienić kolor siatki liganda na niebieski. Wyświetlanie reszt miejsca aktywnego oddziałujących z PEP i jonami magnezu w reprezentacji patyczków i kul oraz enzymu enolazy w reprezentacji kreskówki. Ustaw rozmiar siatki.
Wpisz to w wierszu poleceń, aby wykonać śledzenie promieni i zapisać obraz jako plik PNG. Podczas glikolizy enolaza przekształca 2-fosfoglicerynian w fosfoenolopirogronian, niezbędny produkt pośredni dla różnych szlaków metabolicznych. Mapa różnic między apoenzymem a enzymem związanym z PEP wykazała wyraźną gęstość ligandów.
Zaobserwowano również dodatkowe zagęszczenie w miejscu aktywnym modelowanego białka. Fosfoenolopirogronian i dwa jony magnezu modelowano w gęstości obserwowanej w pobliżu liganda. Fosfoenolopirogronian tworzył wiązania wodorowe z kilkoma resztami w miejscu aktywnym, takimi jak lizyna-386 i arginina-364.
Jony magnezu tworzyły wiązania koordynacyjne metali z asparaginianem-241, glutaminianem-283, asparaginianem-310 i fosforanem fosfoenolopirogronianu.
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia narzędzia dostępne do modelowania ligandów małocząsteczkowych w mapach cryoEM makrocząsteczek. Badanie koncentruje się na zrozumieniu procesów fizjologicznych na interfejsie błonowym z wykorzystaniem cryoEM w celu rozwiązania różnorodnych problemów biologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Kriomikroskopia elektronowa (cryoEM)
- Kompleksy makromolekularne
- Odkrywanie leków
Wprowadzenie
- Zrozumienie procesów fizjologicznych w obrębie komórki.
- Wyzwania w określaniu struktur białek błonowych.
- Postępy w technikach cryoEM.
- Znaczenie struktur o wysokiej rozdzielczości dla projektowania leków.
Cel badania
- Do modelowania ligandów małocząsteczkowych w mapach cryoEM.
- Do lepszego zrozumienia struktur białek błonowych.
- Do ułatwienia szybkiego wyznaczania struktury niestabilnych kompleksów.
Zastosowane metody
- Technika krio-EM pojedynczych cząsteczek.
- Zatapianie próbek w cienkiej warstwie lodu.
- Przetwarzanie obrazów o niskim stosunku sygnału do szumu.
- Rekonstrukcja 3D i klasyfikacja orientacji kątowej.
Główne wyniki
- Uzyskanie struktur białek błonowych o wysokiej rozdzielczości.
- Skuteczne modelowanie ligandów małocząsteczkowych w mapach cryoEM.
- Przezwyciężenie problemów ze stabilnością i homogenicznością próbek.
- Postępy w potencjale odkrywania leków dzięki analizom strukturalnym.
Wnioski
- Krio-EM jest potężnym narzędziem do badania kompleksów makromolekularnych.
- Modelowanie ligandów pozwala na lepsze zrozumienie oddziaływań leków.
- Postęp techniczny nieustannie usprawnia badania w dziedzinie biologii strukturalnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Modelowanie oddziaływań białko-ligand w wysokiej rozdzielczości z wykorzystaniem map cryoEM staje się coraz bardziej kluczowe dla wczesnych etapów odkrywania leków i mechanistycznego ograniczania ryzyka. Zdolność do dokładnej identyfikacji i optymalizacji wiązania ligandów w złożonych kompleksach makromolekularnych zwiększa pewność predykcji w walidacji celu i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji w procesie selekcji portfela projektów. Integracja zaawansowanych przepływów pracy cryoEM pozwala zespołom biofarmaceutycznym rozwiązywać problemy związane z niejednoznacznością strukturalną i przyspieszać identyfikację wiodących związków w oparciu o strukturę.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację miejsc wiązania ligandów oraz sieci oddziaływań w kompleksach makromolekularnych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie strukturalnych podstaw angażowania celu.
- Zwiększa pewność predykcyjną w zakresie funkcjonalnej walidacji celu oraz późniejszej selekcji.
Przesiewy i rozwój testów
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych modeli strukturalnych dla obliczeniowych i eksperymentalnych przepływów pracy przesiewowych.
- Umożliwia odtwarzalne identyfikowanie gęstości ligandów oraz ilościową ocenę sposobów wiązania.
- Wspiera standaryzację analiz poprzez dostarczenie struktur referencyjnych dla stanów z związanym ligandem oraz stanów apo.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Łączy spostrzeżenia strukturalne z układami istotnymi dla przebiegu choroby poprzez modelowanie fizjologicznie ważnych kompleksów.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej, wspierając optymalizację ukierunkowaną na strukturę.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez potwierdzenie wiązania ligandu w odpowiednich kompleksach biologicznych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ten workflow modelowania ligandów oparty na cryoEM łączy wczesną fazę odkrywania, identyfikację związków wiodących oraz badania przedkliniczne, dostarczając wysoce wiarygodnych danych strukturalnych do testowania hipotez i optymalizacji związków.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących wiązania ligandów i modulacji szlaków sygnałowych.
- Przesiewy: Dostarczają powtarzalnych, ilościowych map gęstości ligandów do analizy porównawczej.
- Analityka: Zapewnia dopracowane współrzędne atomowe i mapy różnicowe w celu wsparcia oceny statystycznej zdarzeń wiązania.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki strukturalne z celami istotnymi dla chorób i strategiami biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia skalowalny, zestandaryzowany przepływ pracy dla bieżących inicjatyw w zakresie projektowania leków w oparciu o strukturę.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje modelowanie i optymalizację ligandów w różnorodnych układach białkowych.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji dla decyzji go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez redukcję ryzyka strukturalnego na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój strukturalnie zwalidowanych celów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przetwarzaniu danych cryoEM, budowaniu modeli oraz obsłudze oprogramowania do ich rafinacji.
- Wymaga dostępu do wysokowydajnej infrastruktury obliczeniowej oraz narzędzi do wizualizacji.
- Konieczna jest standaryzacja progów map, kryteriów walidacji i rafinacji współrzędnych pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych klas białek, typów ligandów lub zakresów rozdzielczości.
- Zależność od jakości próbki, rozdzielczości mapy oraz ograniczeń wynikających z szumów w danych cryoEM.
