Name: Modelowanie ligandów na mapach pochodzących z kriomikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Poznaj metody modelowania małocząsteczkowych ligandów w mapach kriomikroskopii elektronowej. Wykorzystaj narzędzia ChimeraX, Coot i Phenix do analizy struktur białek błonowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SJ jest laureatem stypendium doktoranckiego od DAE-TIFR, a finansowanie jest potwierdzone. KRV przyjmuje do wiadomości grant DBT B-Life DBT/PR12422/MED/31/287/2014 oraz wsparcie Departamentu Energii Atomowej Rządu Indii pod numerem identyfikacyjnym projektu. RTI4006.

Modeling Small Molecule Ligands in CryoEM Maps of Macromolecules

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ulepszenia w sprzęcie i oprogramowaniu mikroskopowym spowodowały w ostatnich latach wzrost liczby struktur krioelektromagnetycznych. Chociaż najwyższa rozdzielczość osiągana w tej chwili w krioEM pojedynczych cząstek wynosi 1,2 A 57,58,59, większość struktur jest określana w okolicach rozdzielczości 3-4 A. Modelowanie ligandów na mapach o średniej i niskiej rozdzielczości może być trudne i często obarczone niejednoznacznością. Biorąc pod uwagę powszechne zastosowanie cryoEM zarówno w środowisku akademickim, jak i w przemyśle farmaceutycznym do badań translacyjnych i odkrywania leków, niezbędne jest zapewnienie prawidłowego i niejednoznacznego modelowania ligandów. W związku z tym rozsądne jest ilościowe określenie rozdzielczości atomów ligandów poprzez obliczenie wyników Q60, które są obecnie dostępne w EMDB jako metryka do oceny jakości map i dopasowania modelu, a także w Chimera.
W pierwszym przykładzie ChimeraX został użyty do obliczenia mapy różnic w przestrzeni rzeczywistej między mapami apo i związanymi z ligandem w enzymie enolazy M. tuberculosis. Dodatkowa gęstość przy wysokim progu sugeruje obecność ligandu, fosfoenolopirogronianu, w miejscu aktywnym i Mg2+ związanego z ligandem. Należy zauważyć, że w tym przypadku mapa ma średnią rozdzielczość (3,2 A), a cząsteczki wody nie mogą być modelowane z pewnością (rysunek 1). Ograniczeniem związanym z tą metodą jest to, że można ją stosować tylko wtedy, gdy wiązanie liganda nie wywołuje znaczących zmian konformacyjnych w białku. Normalizacja mapy nie została wykonana w tym przypadku, ponieważ zarówno zestawy danych apo, jak i ligandów zostały pozyskane w tym samym rozmiarze piksela i przetworzone z identycznymi parametrami w Relion. Warto jednak zauważyć, że przy porównywaniu map wygenerowanych przez różne programy do rekonstrukcji, takich jak Relion 46,47 i CryoSparc61, lub o różnej jakości, normalizacja map staje się niezbędna, zanim będzie można dokonać miarodajnych porównań.
Następnym przykładem jest mGlu5, który ulega dużej reorganizacji molekularnej po związaniu agonistycznym, jak wynika ze struktur krioEM51,62 (Figura 2). W tym scenariuszu nie jest możliwe obliczenie prostej mapy różnic między receptorami niezwiązanymi (apo) i związanymi z ligandem ze względu na znaczne różnice między mapami. W tym przypadku wykorzystano Servalcat, który wykorzystuje niewyostrzone i nieważone półmapy jako dane wejściowe do uściślania w przestrzeni odwrotnej, a następnie oblicza mapę różnicy między mapą eksperymentalną a mapą uzyskaną z modelu. Przy wysokim progu można zwizualizować różnice i pełnić rolę przewodnika do korekty i ulepszenia modelu. Zaobserwowano kilka niemodelowanych pęcherzyków w domenie zewnątrzkomórkowej i w pobliżu domeny transbłonowej mGlu5 i wykorzystano je jako przewodnik do modelowania ligandów (ryc. 2).
Trzeci przykład pokazuje, w jaki sposób rozdzielczość (2,3 A) odgrywa kluczową rolę w interpretacji map i modelowaniu inhibitora wielkości fragmentu w β-galaktozydazie. W tym przypadku wyzwanie polegało na zidentyfikowaniu bardzo małego liganda (<200 Da) na mapie różnic Servalcat wśród nieodłącznego szumu w danych i dokładnym jego modelowaniu. Oprócz wysokiej rozdzielczości globalnej wyznaczonej za pomocą korelacji powłoki Fouriera (FSC), rozdzielczość lokalna specyficzna dla liganda była również wystarczająco wysoka, aby zapewnić dokładne rozmieszczenie centrów chiralnych ligandów (ryc. 3). Gęstość cząsteczek rozpuszczalnika zaobserwowano na mapie różnic w całym enzymie, a zwłaszcza wokół liganda. Wykazano również wpływ rozdzielczości na modelowanie ligandów i atomów rozpuszczalnika (ryc. 4). Ważne jest, aby zachować ostrożność podczas modelowania cząsteczek wody lub rozpuszczalnika, ponieważ czasami hałas na niskim progu może przypominać cząsteczki wody lub rozpuszczalnika, co prowadzi do potencjalnych błędnych interpretacji.
Inną ważną kwestią jest to, że same mapy krioEM mogą nie wystarczyć do dokładnej identyfikacji jonu metalu na własną rękę. Dodatkowe metody biofizyczne, takie jak rozszerzona absorpcja promieniowania rentgenowskiego o drobnej strukturze (EXAFS) lub spektroskopia rentgenowska z dyspersją energii (EDX), są często konieczne do potwierdzenia obecności i tożsamości jonu metalu. Zarówno w enzymach enolazy, jak i β-galaktozydazy, Mg2+ modelowano ze względu na bogactwo już dostępnych informacji na temat tych białek, potwierdzających tożsamość jonu metalu. Również koordynacja jonów metali w tych przypadkach, której przykładem jest klasyczna geometria oktaedryczna i bliskie ideału odległości koordynacyjne Mg2+, dostarczyła istotnego dowodu na ich tożsamość.
Ogólnie rzecz biorąc, podczas modelowania ligandów na mapach krioEM należy wziąć pod uwagę kilka ważnych kwestii. Na początek ważny jest wybór odpowiedniej mapy do identyfikacji i modelowania ligandów. We wszystkich przypadkach niewyostrzona i nieważona mapa lub półmapa jest zalecana zamiast mapy zaostrzonej i ważonej, aby uwidocznić gęstość liganda, ponieważ wyostrzanie i ważenie może spowodować niedoostrzenie lub nadmierne zaostrzenie (szum spowodowany zakończeniem serii) obszarów na mapie. Może to skutkować nieoptymalną gęstością liganda, a zastosowanie różnych współczynników B może być wykorzystane do oceny gęstości podczas budowania modelu w Coot. Chociaż istnieje ryzyko związane z używaniem zaostrzonej mapy do identyfikacji ligandów na mapie krioEM, niewyostrzona mapa może nie pokazywać pełnych szczegółów gęstości ligandów, ale może być wykorzystana do celów demonstracyjnych, jak pokazano na rysunku 1B, C.
Pozycja modelowanego liganda powinna zostać zweryfikowana, zwłaszcza w przypadkach, gdy dane są słabe. Jak pokazano tutaj dla mGlu5, lokalna rozdzielczość różni się na mapie cryoEM, a bezstronne modelowanie liganda może być trudne. Servalcat może być używany jako cenne narzędzie do wykrywania potencjalnych niedokładności w modelowaniu białek i ligandów22.
Niejednorodność składu może występować w kompleksie białko-ligand, w którym ligand może być obecny tylko w określonej populacji (jeśli ligand ma niską masę cząsteczkową, etap klasyfikacji może nie usunąć niejednorodności). Niemniej jednak ważne jest, aby podczas przetwarzania obrazu przed modelowaniem liganda wykonać krok63 klasyfikacji 3D iteracyjnie i sprawdzić, czy gęstość liganda ulega poprawie. Jeśli obecnych jest wiele kopii białka, należy zachować ostrożność przy stosowaniu symetrii w poprzek mapy podczas początkowego generowania i udoskonalania modelu, ponieważ może to uśrednić gęstość ligandów we wszystkich cząsteczkach związanych z symetrią. Symetria powinna być narzucona dopiero po dokładnym sprawdzeniu mapy w celu potwierdzenia obecności gęstości ligandów we wszystkich łańcuchach białkowych.
W zależności od stanu (kryształ lub roztwór) i lokalizacji (zakopane lub powierzchnia), atomy mogą być dynamiczne, a w udoskonaleniu modelu nazywa się to parametrem przemieszczenia atomowego (ADP). Wraz z mapą różnic, która dostarcza wizualnych wskazówek dotyczących możliwych niedokładności w modelu, wartości ADP mogą być wykorzystane do oceny dokładności ligandów po udoskonaleniu 64,65,66,67. Zazwyczaj ligand powinien mieć podobne wartości ADP jak otaczające go pozostałości, tj. jeśli są stabilnie związane i dokładnie modelowane. Jednak ligandy na obrzeżach lub atomy liganda (takie jak lipidy), które są dalekie od makrocząsteczek, mogą mieć wyższe wartości ADP. Oprócz doprecyzowania współrzędnych, zarówno Refmac33,34, jak i Phenix pozwalają na doprecyzowanie wartości ADP28, 68. W Refmac aproksymacja Motta-Bethe'a służy do obliczania współczynnika rozpraszania elektronów poszczególnych atomów podczas obliczania mapy. W najnowszej wersji Phenixu wprowadzono indywidualne udoskonalanie czynnika B, podobne do krystalografii, w celu wyjaśnienia nieporządku atomowego. Bardzo często w udoskonalonych modelach wyprowadzonych z cryoEM, obserwuje się szeroki zakres wartości ADP (czasami wartości bliskie zeru), a nawet Q-score, który jest używany w EMDB do oceny dopasowania modelu do mapy, zależy od zdeponowanej mapy pierwotnej i charakteru wyostrzenia współczynnika B60. W budowaniu modeli krioEM często stosuje się wiele map, a co za tym idzie, mapy używane w modelowaniu i udoskonalaniu powinny być wyraźnie wymienione w metodach, ponieważ ze względu na rozdzielczość anizotropową w wielu makrocząsteczkach, jedna mapa może nie wystarczyć do wyjaśnienia wszystkich szczegółów.
W modelowaniu ligandów w makrocząsteczkach jednym z głównych ograniczeń map krioEM (podobnie jak w krystalografii) jest to, że jeśli miejsce wiązania liganda ma niską rozdzielczość lub jeśli związany ligand jest dynamiczny, ustalenie prawidłowej konformacji może okazać się trudne. Ponadto większość struktur krioEM ma rozdzielczość poniżej 3 A, a reprezentacja cząsteczek wody na mapach jest ograniczona, co utrudnia ocenę roli hydratacji w wiązaniu ligandów lub leków (jak pokazano tutaj na przykładach enolazy i mGluR). Metody obliczeniowe mogą być stosowane w połączeniu z danymi krioelektromagnetycznymi w celu wyeliminowania tych ograniczeń69. W przeciwieństwie do krystalografii, tylko model jest poddawany udoskonalaniu, a nie mapa. Obecnie jedyną metodą wskazania obecności liganda lub zapewnienia dokładnego modelowania jest generowanie map pominięć (przy użyciu narzędzi takich jak Servalcat). W związku z tym istnieje szereg narzędzi, które mogą pomóc naukowcom w budowaniu i ocenie modelu, ale istnieje kilka obszarów w zakresie udoskonalania modelu, w których w najbliższej przyszłości można spodziewać się nowszych podejść lub modyfikacji obecnych podejść.
W tym artykule skupiliśmy się na aktualnych podejściach do modelowania ligandów, które obejmują ręczną kontrolę gęstości liganda, generowanie pliku geometrii liganda, a następnie modelowanie liganda na mapie cryoEM. Jest to ekscytujący okres w biologii strukturalnej i odkrywaniu leków, ponieważ bezpośrednie detektory elektronów z większą liczbą klatek na sekundę i wykorzystaniem szybszego pozyskiwania danych70 zaowocowały uzyskaniem map o wysokiej rozdzielczości (<2,8 A) kilku makrocząsteczek często związanych ligandami drobnocząsteczkowymi w stosunkowo krótkim czasie. Niedawne wprowadzenie zautomatyzowanych narzędzi do modelowania ligandów, takich jak GEMspot69 w pakiecie Schrödinger i EMERALD17 w pakiecie Rosetta, które próbują znaleźć najbardziej prawdopodobną pozycję związaną liganda przy jednoczesnym uwzględnieniu eksperymentalnych danych krioEM, daje nadzieję na usprawnienie i automatyzację tego procesu. Podobnie jak w przypadku krystalografii rentgenowskiej, przewiduje się, że identyfikacja sposobów wiązania ligandów małocząsteczkowych za pomocą cryoEM, być może dwóch lub więcej w ciągu jednego dnia, stanie się realną możliwością.

Komórki spełniają swoje funkcje, przeprowadzając niezliczone reakcje chemiczne jednocześnie i niezależnie, a każda z nich jest skrupulatnie regulowana, aby zapewnić im przetrwanie i zdolność adaptacji w odpowiedzi na sygnały środowiskowe. Osiąga się to poprzez rozpoznawanie molekularne, które umożliwia biomolekułom, zwłaszcza białkom, tworzenie przejściowych lub stabilnych kompleksów z innymi makrocząsteczkami, a także małymi cząsteczkami lub ligandami1. Tak więc interakcje białko-ligand mają fundamentalne znaczenie dla wszystkich procesów w biologii, które obejmują regulację ekspresji i aktywności białek, rozpoznawanie substratów i kofaktorów przez enzymy, a także sposób, w jaki komórki postrzegają i przekazują sygnały1,2. Lepsze zrozumienie właściwości kinetycznych, termodynamicznych i strukturalnych kompleksu białko-ligand ujawnia molekularne podstawy interakcji ligandów, a także ułatwia racjonalne projektowanie leków poprzez optymalizację interakcji i swoistości leków. Ekonomicznym i szybszym podejściem do badania interakcji białko-ligand jest zastosowanie dokowania molekularnego, które jest metodą obliczeniową, która wirtualnie przesiewa różnorodny zakres małych cząsteczek i przewiduje tryb wiązania i powinowactwo tych ligandów do białek docelowych3. Jednak dowody eksperymentalne ze struktur o wysokiej rozdzielczości wyznaczonych za pomocą dyfrakcji rentgenowskiej (XRD), magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) lub kriomikroskopii elektronowej (cryoEM) dostarczają niezbędnego dowodu na takie przewidywania i pomagają w opracowaniu nowszych i skuteczniejszych aktywatorów lub inhibitorów dla danego celu. W tym artykule użyto skrótu "cryoEM", jak powszechnie określa się tę technikę. Trwa jednak debata na temat wyboru właściwej nomenklatury, a ostatnio zaproponowano termin cryogenic-sample Electron Microscopy (cryoEM), aby wskazać, że próbka znajduje się w temperaturze kriogenicznej i jest obrazowana za pomocą elektronów4. Podobnie, mapy wyprowadzone z cryoEM zostały nazwane potencjałem elektronowym, potencjałem elektrostatycznym lub potencjałem Coulomba, a dla uproszczenia używamy tutaj map cryoEM 5,6,7,8,9,10.
Chociaż XRD był złotym standardem w wysokorozdzielczym określaniu struktury kompleksów białko-ligand, post resolution-revolution11 cryoEM nabrał rozpędu, na co wskazuje gwałtowny wzrost liczby map potencjału Coulomba lub map krioEM zdeponowanych w Bazie Danych Mikroskopii Elektronowej (EMDB)12,13 w ciągu ostatnich kilku lat14. Dzięki postępom w metodach przygotowywania, obrazowania i przetwarzania próbek, liczba depozycji Protein Data Bank (PDB)14 z wykorzystaniem cryoEM wzrosła z 0,7% do 17% w latach 2010-2020, przy czym około 50% zgłoszonych struktur w 2020 r. określono w rozdzielczości 3,5 A lub lepszej15,16. CryoEM został szybko przyjęty przez społeczność biologów strukturalnych, w tym przemysł farmaceutyczny, ponieważ umożliwia badanie elastycznych i niekrystalicznych makrocząsteczek biologicznych, zwłaszcza białek błonowych i kompleksów wielobiałkowych, w rozdzielczości bliskiej atomowi, pokonując proces krystalizacji i uzyskując dobrze dyfrakcyjne kryształy wymagane do określenia struktury w wysokiej rozdzielczości za pomocą XRD.
Dokładne modelowanie liganda na mapie krioEM jest najważniejsze, ponieważ służy jako plan kompleksu białko-ligand na poziomie molekularnym. W krystalografii rentgenowskiej stosuje się kilka zautomatyzowanych narzędzi do budowania ligandów, które zależą od kształtu i topologii gęstości liganda w celu dopasowania lub wbudowania liganda w gęstość elektronów17,18,19,20. Niemniej jednak, jeśli rozdzielczość jest niższa niż 3 A, podejścia te mają tendencję do uzyskiwania mniej pożądanych wyników, ponieważ cechy topologiczne, od których zależą w celu rozpoznania i budowania, stają się mniej zdefiniowane. W wielu przypadkach metody te okazały się nieskuteczne w dokładnym modelowaniu ligandów na mapach krioEM, ponieważ mapy te zostały określone w zakresie od niskiej do średniej rozdzielczości, zwykle między 3,5 A -5 A17.
Pierwszy krok w określaniu struktury 3D kompleksu białko-ligand za pomocą cryoEM polega na albo współoczyszczaniu liganda z białkiem (gdy ligand ma wysokie powinowactwo do wiązania z białkiem), albo na inkubacji roztworu białka z ligandem przez określony czas przed przygotowaniem siatki. Następnie niewielką objętość próbki umieszcza się na oczyszczonej plazmowo dziurawej siatce TEM, a następnie błyskawicznie zamraża się w ciekłym etanie i ostatecznie obrazuje za pomocą krio-TEM. Obrazy projekcyjne 2D od setek tysięcy do milionów pojedynczych cząstek są uśredniane w celu zrekonstruowania trójwymiarowej (3D) mapy potencjału kulombowskiego makrocząsteczki. Identyfikacja i modelowanie ligandów i cząsteczek rozpuszczalników na tych mapach stanowi w wielu przypadkach poważne wyzwania ze względu na rozdzielczość anizotropową na całej mapie (tj. rozdzielczość nie jest jednolita w całej makrocząsteczce), elastyczność w regionie, w którym związany jest ligand, oraz szum w danych. Wiele narzędzi do modelowania, udoskonalania i wizualizacji, które zostały opracowane dla XRD, jest obecnie dostosowywanych do użytku w cryoEM do tych samych celów18, 19, 20, 21. W tym artykule przedstawiono przegląd różnych metod i oprogramowania stosowanych obecnie do identyfikacji ligandów, budowania modeli i doprecyzowywania współrzędnych wyznaczonych przez cryoEM. Opracowano protokół krok po kroku, aby zilustrować procesy związane z modelowaniem ligandów przy użyciu określonych kompleksów białko-ligand o różnej rozdzielczości i złożoności.
Pierwszy krok w modelowaniu ligandów na mapach cryoEM obejmuje identyfikację gęstości ligandów (niebiałkowych) na mapie. Jeśli wiązanie liganda nie indukuje żadnych zmian konformacyjnych w białku, wówczas obliczenie prostej mapy różnic między kompleksem białko-ligand a białkiem apo zasadniczo podkreśla regiony o dodatkowej gęstości, co sugeruje obecność liganda. Takie różnice można zaobserwować od razu, ponieważ wymagają one tylko dwóch map, a nawet mapy pośrednie podczas procesu udoskonalania 3D mogą być wykorzystane do sprawdzenia, czy ligand jest obecny. Dodatkowo, jeśli rozdzielczość jest wystarczająco wysoka (<3,0 A), mapa różnic może również dostarczyć informacji na temat lokalizacji cząsteczek wody, a także jonów oddziałujących z ligandem i resztą białkowym.
W przypadku braku mapy apo-protein, teraz można korzystać z Servalcat22, który jest dostępny jako samodzielne narzędzie i został również zintegrowany z pakietem oprogramowania CCP-EM23,24 jako część udoskonalenia Refmac i w wydaniu CCP4 8.025,26. Servalcat umożliwia obliczenie mapy różnic ważonych FSC (Fo-Fc) przy użyciu niezaostrzonych półmap i modelu apoprotein jako danych wejściowych. Mapa pominięcia Fo-Fc reprezentuje rozbieżność między mapą eksperymentalną (Fo) a mapą uzyskaną na podstawie modelu (Fc). W przypadku braku liganda w modelu, dodatnia gęstość na mapie Fo-Fc, która pokrywa się z eksperymentalną mapą EM, zazwyczaj sugeruje obecność liganda. Założenie jest takie, że łańcuch białkowy jest dobrze dopasowany do mapy, a pozostała gęstość dodatnia wskazuje na lokalizację liganda. Ważne jest jednak, aby skrupulatnie zbadać, czy dodatnia gęstość nie wynika z niedokładności modelowania, takich jak niewłaściwy rotamer łańcucha bocznego białka.
Drugi krok polega na uzyskaniu lub stworzeniu pliku współrzędnych kartezjańskich liganda z dobrze zdefiniowaną geometrią na podstawie dostępnych informacji chemicznych. Standardowe ligandy (na przykład ATP i NADP+), które są już dostępne w bibliotece monomerów CCP4, można wykorzystać do udoskonalenia poprzez pobranie plików współrzędnych i geometrii za pomocą ich kodu dostępu do monomeru. Jednak w przypadku nieznanych lub niestandardowych ligandów dostępne są różne narzędzia do tworzenia plików geometrii. Niektóre z przykładów obejmują eLBOW27 - (electronic ligand builder and optimization workbench) w Phenix28, Lidia - wbudowane narzędzie w Coot29, JLigand/ACEDRG30,31, CCP-EM23,24, Ligprep32-moduł Glide w ramach pakietu Schrödinger. Plik współrzędnych liganda jest następnie dopasowywany do gęstości, prowadzony zarówno przez eksperymentalną mapę krioEM, jak i mapę różnic w Coot. Po tym następuje udoskonalenie w przestrzeni rzeczywistej w Phenix28 lub wzajemne udoskonalenie w Refmac33. Wymagana jest stacja robocza z systemem Linux lub laptop wyposażony w dobrą kartę graficzną i wyżej wymienione oprogramowanie. Większość z tych programów jest zawarta w różnych pakietach. CCP-EM24 i Phenix28 są swobodnie dostępne dla użytkowników akademickich i zawierają różne narzędzia używane w tym artykule, w tym Coot, Refmac533,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, itp. Podobnie, Chimera37 i ChimeraX38 udostępniają bezpłatne licencje użytkownikom akademickim.

<table><tbody><tr><td>CCP4-8.0</td><td>Konsorcjum kilku instytutów</td><td>https://www.ccp4.ac.uk</td><td>bezpłatne dla użytkowników akademickich i zawiera Coot oraz listę narzędzi opracowanych dla krystalografii rentgenowskiej</td></tr><tr><td>CCP-EM</td><td>Konsorcjum kilku instytutów</td><td>https://www.ccpem.ac.uk/download.php</td><td>Bezpłatne dla użytkowników akademickich i obejmuje Coot, Relion i wiele innych</td></tr><tr><td>Coot&nbsp;</td><td>Paul Emsley, LMB, Cambridge</td><td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td> <td>Ogólne oprogramowanie do budowania modeli, ale dostępne również z innymi pakietami opisanymi powyżej</td></tr><tr><td>DockinMap (Phenix)</td><td>Konsorcjum kilku instytutów</td><td>https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html</td><td>Oprogramowanie w pakiecie Phenix do dokowania modelu do map krioEM</td></tr><tr><td>Bank danych mikroskopii elektronowej&nbsp;</td><td>Konsorcjum kilku instytutów</td><td>https://www.ebi.ac.uk/emdb/</td> <td>Publiczne Repozytorium Map Mikroskopii Elektronowej</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf</td><td>Reklama, kamera firmy Thermo Fisher&nbsp;</td></tr><tr><td>Phenix&nbsp;</td><td>Konsorcjum kilku instytutów</td><td>https://phenix-online.org/download</td><td>bezpłatne dla użytkowników akademickich i obejmuje</td></tr><tr><td>Bank Danych Białka</td> Łyski <td>Konsorcjum kilku instytutów</td><td>https://rcsb.org</td><td>Publiczna baza danych struktur makromolekularnych</td></tr><tr><td>Pymol</td><td>Schrödinger</td><td>https://pymol.org/2/</td> <td>Narzędzie do wizalizacji molekularnej. Wersja edukacyjna jest bezpłatna, ale ma ograniczenia. Pełną wersję można uzyskać za niewielką opłatą.</td></tr><tr><td>Relion</td><td>MRC-LMB, Cambridge</td><td>https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html</td><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazów krioEM, dostępne również z CCP-EM</td></tr><tr><td>Titan Krios</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&amp; _source=1& gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE</td><td>Komercyjny, cryoTEM firmy Thermo Fisher</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF, USA</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</td><td>Oprogramowanie ogólnego przeznaczenia do wyświetlania, analizy i nie tylko</td></tr><tr><td>UCSF Chimera X</td><td>UCSF, USA</td><td></td> <td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/Oprogramowanie ogólnego przeznaczenia do wyświetlania, analizy i nie tylko</td></tr></tbody></table>

modelowanie ligandów na mapach pochodzących z kriomikroskopii elektronowej

Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy

Rozszyfrowanie interakcji białko-ligand w kompleksie makromolekularnym jest kluczowe dla zrozumienia mechanizmu molekularnego, leżących u podstaw procesów biologicznych i rozwoju leków. W ostatnich latach mikroskopia elektronowa próbek kriogenicznych (cryoEM) stała się potężną techniką określania struktur makrocząsteczek i badania sposobu wiązania ligandów w rozdzielczości bliskiej atomowi. Identyfikacja i modelowanie cząsteczek niebiałkowych na mapach krioEM jest często trudne ze względu na anizotropową rozdzielczość w cząsteczce będącej przedmiotem zainteresowania i nieodłączny szum w danych. W tym artykule czytelnicy zapoznają się z różnymi programami i metodami stosowanymi obecnie do identyfikacji ligandów, budowy modeli i doprecyzowywania współrzędnych atomowych przy użyciu wybranych makrocząsteczek. Jednym z najprostszych sposobów identyfikacji obecności liganda, jak pokazano na przykładzie enzymu enolazy, jest odjęcie dwóch map uzyskanych z ligandem i bez niego. Dodatkowa gęstość liganda prawdopodobnie będzie wyróżniać się na mapie różnic nawet przy wyższym progu. Zdarzają się przypadki, jak pokazano w przypadku metabotropowego receptora glutaminianu mGluglu5, kiedy takie proste mapy różnic nie mogą być wygenerowane. Niedawno wprowadzona metoda wyprowadzania mapy pominięć Fo-Fc może służyć jako narzędzie do walidacji i wykazywania obecności liganda. Wreszcie, na przykładzie dobrze przebadanej β-galaktozydazy, przeanalizowano wpływ rozdzielczości na modelowanie ligandów i cząsteczek rozpuszczalnika na mapach krioEM oraz przedstawiono perspektywę wykorzystania krioEM w odkrywaniu leków.

Ten protokół wprowadza dostępne narzędzia do modelowania ligandów małocząsteczkowych na mapach krioEM makromolekuł.

Modelowanie ligandów na mapach pochodzących z kriomikroskopii elektronowej

Deciphering the protein-ligand interactions in a macromolecular complex is crucial for understanding the molecular mechanism, underlying biological ...

Jesteśmy zainteresowani zrozumieniem procesów fizjologicznych zachodzących w całej komórce, szczególnie na granicy faz błony. Używamy cryoEM jako głównej techniki i pracujemy nad różnymi interesującymi i wymagającymi problemami biologicznymi, badając wiele kompleksów makromolekularnych. Określenie struktur białek błonowych i innych labilnych kompleksów było wyzwaniem kilka dekad temu.Jednak postęp techniczny w dziedzinie krioEM oraz nowatorskie środowiska detergentów i mimetyków lipidów utorowały drogę do szybkiego określenia struktury tych kompleksów. Struktury te można teraz uzyskać w wysokiej rozdzielczości i potencjalnie wykorzystać w odkrywaniu leków. W przypadku krioEM-u z pojedynczymi cząstkami wyzwania obejmują uzyskanie stabilnej i jednorodnej próbki, osadzenie próbki w losowej orientacji w cienkim lodzie, przetwarzanie dużej liczby obrazów przy niskim stosunku sygnału do szumu oraz dokładne określenie orientacji kątowej i klasyfikacji podczas rekonstrukcji 3D.Identyfikacja i modelowanie małych cząsteczek na mapach krioEM kompleksów białek ligandowych jest trudne ze względu na nieodłączny szum w danych oraz izotropową i niską rozdzielczość mapy, niejednorodność próbki i elastyczność ligandów. Protokół ten jest przewodnikiem krok po kroku dotyczącym identyfikacji i modelowania ligandów i cząsteczek rozpuszczalników na mapach krioEM o niskiej i średniej rozdzielczości. Zacznij od pobrania nienaostrzonych map połówkowych apo-enolazy z dodatkowych danych w EMDB.Następnie otwórz ChimeraX i kliknij Otwórz na pasku narzędzi. Wybierz mapy połówkowe apo-enolazy. Wpisz to w wierszu poleceń, aby połączyć połówki map i uzyskać niewyostrzoną mapę apo-enolase.Dostosuj próg mapy do 0,0595, aby zredukować szumy. Następnie wpisz to polecenie, aby zmienić nazwę połączonej mapy. Kliknij Otwórz.Wybierz PEP enolase niezaostrzone mapy połówkowe i wpisz to polecenie w wierszu poleceń. Dostosuj próg mapy do 0,0721, aby zredukować szum i zmienić nazwę mapy. Następnie wyświetl niewyostrzone mapy enolazy apo-enolase i PEP i kliknij Dopasuj w panelu mapy, aby obliczyć mapę różnic.Wpisz to polecenie w wierszu polecenia, aby odjąć mapę enolazy PEP od mapy apo-enolase i dostosować próg. Pokoloruj odjętą mapę na zielono, co oznacza gęstość dodatnią. Następnie otwórz PDB i pobierz współrzędne enolazy oktomerycznej Mycobacterium tuberculosis.Następnie w ChimeraX kliknij Otwórz na pasku narzędzi i wybierz nazwę pliku. Kliknij Wyświetlanie molekuł, Ukryj atomy i Pokaż kreskówkę. Wpisz to polecenie, aby zmienić nazwę modelu.Wybierz model z panelu modelu. Kliknij prawym przyciskiem myszy na pasku narzędzi. Następnie kliknij przycisk Przenieś model i umieść model w pobliżu mapy enolazy PEP.Wyrównaj model względem mapy. Dopasuj ten model do niewyostrzonej mapy enolazy PEP, wpisując to polecenie w wierszu polecenia. Sprawdź dopasowanie.Dostosuj reprezentację koloru i struktury. Otwórz Coot z terminala, wpisując coot Kliknij Plik, a następnie Otwórz współrzędne i wybierz Apo-enolase.pdb. Następnie pobierz mapę zaostrzoną enolazą związaną z PEP z EMDB.Wyświetl tę mapę w Coot, klikając Plik i Otwórz mapę. Przewiń środkowy przycisk myszy, aby ustawić próg na 7.00 sigma. Kliknij pozycję Weryfikuj, a następnie pozycję Niemodelowane obiekty blob.W nowym oknie wpisz 7.00 jako RMSD i kliknij Znajdź obiekty blob. Zlokalizuj niemodelowaną gęstość liganda w pobliżu reszt miejsca aktywnego seryny-42, lizyny-386 i argininy-364. Następnie kliknij Plik, Pobierz monomer i wprowadź PEP, aby pobrać plik modelu monomeru PEP z biblioteki monomerów Coot.Przesuń cząsteczkę PEP do gęstości za pomocą opcji obróć/przesuń cząsteczkę łańcucha strefy w menu paska bocznego. Następnie kliknij strefę uściślania w przestrzeni rzeczywistej w menu paska bocznego, aby dopasować cząsteczkę PEP do gęstości. Oceń dopasowanie i kliknij Akceptuj po zakończeniu.Użyj opcji Scal cząsteczkę na karcie Edycja, aby scalić dopasowany ligand z modelem apo-enolase i zapisać model jako pep-enolase.pdb. Następnie kliknij Oblicz, NCS narzędzia, a następnie NCS Ligandy, aby dodać ligandy do pozostałych monomerów w pliku współrzędnych. Dla opcji białka z NCS należy wybrać plik współrzędnych apo-enolaza.pdb i identyfikator łańcucha A jako główny łańcuch NCS. Następnie dla cząsteczki zawierającej ligand wybierz apo-enolazę. pdb jako plik współrzędnych, identyfikator łańcucha J i numer pozostałości od 1 do 1.Kliknij Znajdź stanowiska kandydatów. Kliknij na poszczególne kandydujące ligandy i przeanalizuj wizualnie dopasowanie. Następnie zamodeluj dwa jony magnezu w gęstości miejsca aktywnego, klikając na umieść atom na wskaźniku i wybierając Mg z listy typów atomów wskaźnika.Dodaj również jony magnezu w monomerach związanych z symetrią. Oceń dopasowanie dla atomów magnezu związanych z symetrią. Zapisz model, klikając Plik, a następnie Zapisz współrzędne, wybierz nazwę pliku i wpisując Enolase+PEP+Mg.pdb.Następnie otwórz Phenix GUI. Uruchom zadanie uściślania w czasie rzeczywistym przy użyciu parametrów domyślnych z zapisanym modelem i zaostrzoną mapą powiązaną z PEP. Aby zwizualizować modelowany ligand, otwórz PyMOL.Kliknij Plik i Otwórz, aby załadować udoskonalony model z zadania uściślania Phenix. Załaduj również zaostrzoną mapę z PEP. Zmień nazwę mapy na wyostrzoną PEP, klikając Akcje, a następnie zmień nazwę.Następnie wybierz ligandy, klikając Wyświetlacz, a następnie Sekwencja. Wpisz to w wierszu poleceń i naciśnij enter. Spowoduje to wyrzeźbienie gęstości mapy wokół zaznaczenia.Kliknij ostatnie pole, C, obok mesh_ligand obiektu, aby zmienić kolor siatki liganda na niebieski. Wyświetlanie reszt miejsca aktywnego oddziałujących z PEP i jonami magnezu w reprezentacji patyczków i kul oraz enzymu enolazy w reprezentacji kreskówki. Ustaw rozmiar siatki.Wpisz to w wierszu poleceń, aby wykonać śledzenie promieni i zapisać obraz jako plik PNG. Podczas glikolizy enolaza przekształca 2-fosfoglicerynian w fosfoenolopirogronian, niezbędny produkt pośredni dla różnych szlaków metabolicznych. Mapa różnic między apoenzymem a enzymem związanym z PEP wykazała wyraźną gęstość ligandów.Zaobserwowano również dodatkowe zagęszczenie w miejscu aktywnym modelowanego białka. Fosfoenolopirogronian i dwa jony magnezu modelowano w gęstości obserwowanej w pobliżu liganda. Fosfoenolopirogronian tworzył wiązania wodorowe z kilkoma resztami w miejscu aktywnym, takimi jak lizyna-386 i arginina-364.Jony magnezu tworzyły wiązania koordynacyjne metali z asparaginianem-241, glutaminianem-283, asparaginianem-310 i fosforanem fosfoenolopirogronianu.

modeling-ligands-into-maps-derived-from-electron-cryomicroscopy

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Analiza pojedynczych cząstek w mikroskopii krioelektronowej jest jedną z głównych technik używanych do określania struktury zespołów biologicznych w wysokiej rozdzielczości. Scipion dostarcza narzędzia do stworzenia całego procesu przetwarzania informacji uzyskanych przez mikroskop i uzyskania rekonstrukcji 3D próbki biologicznej.

Cryo-EM i analiza pojedynczych cząstek za pomocą Scipion

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Kluczową umiejętnością w modelowaniu biomolekularnym jest wyświetlanie i opisywanie aktywnych miejsc w białkach. Technika ta została zademonstrowana przy użyciu czterech popularnych darmowych programów do wizualizacji makromolekularnej: iCn3D, Jmol, PyMOL i UCSF ChimeraX.

Modelowanie miejsca aktywnego enzymu za pomocą darmowego oprogramowania do wizualizacji molekularnej

Ten artykuł przedstawia protokół do przetwarzania obrazów cryo-EM za pomocą pakietu oprogramowania SPHIRE. Obecny protokół może być stosowany do prawie wszystkich projektów EM pojedynczych cząstek, które są ukierunkowane na rozdzielczość bliską atomowi.

Analiza pojedynczych cząstek w wysokiej rozdzielczości na podstawie obrazów kriomikroskopii elektronowej przy użyciu SPHIRE

Przedstawiamy protokół do szybkiej charakterystyki biomolekularnych oddziaływań fałdowania i wiązania z termolabilnymi ligandami za pomocą różnicowej kalorymetrii skaningowej.

Pomiar biomolekularnych profili DSC za pomocą termolabilnych ligandów w celu szybkiego scharakteryzowania interakcji fałdowania i wiązania

Biblioteki wyświetlania bakterii w biopanowaniu to sprawdzona technika odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego, solidna alternatywa dla przeciwciał. Półautomatyczna metoda sortowania usprawniła biopanoramowanie w celu zmniejszenia występowania wyników fałszywie dodatnich. Poniżej ilustrujemy proces myślowy i techniki stosowane w ocenie kandydatów i minimalizacji dalszej analizy.

Półautomatyczne biopanowanie bakteryjnych bibliotek wyświetlających w celu odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego i analizy otrzymanych izolatów

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Przedstawione tutaj są dwie metody, które mogą być używane indywidualnie lub w połączeniu do analizy wpływu beta-amyloidu na strukturę skrzepu fibryny. W zestawie znajduje się protokół tworzenia skrzepu fibrynowego in vitro, a następnie metody zmętnienia skrzepu i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Analiza nieprawidłowości w strukturze skrzepu fibryny wywołanych przez β-amyloid za pomocą spektroskopii i skaningowej mikroskopii elektronowej

Ten protokół opisuje usuwanie endogennych lipidów z alergenów i zastępowanie ich określonymi przez użytkownika ligandami poprzez HPLC z odwróconą fazą w połączeniu z wyżarzaniem termicznym. Rozdział 31P-NMR i dichroizm kołowy pozwalają na szybkie potwierdzenie usunięcia/obciążenia liganda i odzyskanie natywnej struktury alergenu.

Usuwanie i zastępowanie endogennych ligandów z białek i alergenów związanych z lipidami

Tutaj opisujemy procedury opracowane w naszym laboratorium do przygotowywania proszków z małych kryształów molekularnych do eksperymentów z dyfrakcją elektronów mikrokrystalicznych (MicroED).

Mikrokrystaliczna dyfrakcja elektronów małych cząsteczek

Poznaj metody modelowania małocząsteczkowych ligandów w mapach kriomikroskopii elektronowej. Wykorzystaj narzędzia ChimeraX, Coot i Phenix do analizy struktur białek błonowych.

Modelowanie ligandów na mapach pochodzących z kriomikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów