Wizualizacja dynamiki konformacyjnej receptorów błonowych za pomocą jednocząsteczkowego FRET

W tym przypadku zastosowaliśmy jednocząsteczkowy FRET i znakowanie białek specyficznych dla miejsca poprzez naturalną inkorporację aminokwasów, aby zbadać dynamikę konformacyjną mGluR2. Pozwala to na badanie dynamiki białek bez naruszania ich struktury. Struktura atomowa zapewnia statyczny obraz białka.

Jednak jednocząsteczkowy FRET umożliwia nam wizualizację pełnego zakresu ruchu białka w czasie rzeczywistym i roztworze. Metodę tę można zastosować do badania dynamiki dowolnego białka. Co więcej, naturalna inkorporacja aminokwasów może być wykorzystana do badania interakcji białko-białko oraz inżynierii syntetycznych receptorów.

Ładowanie próbek i optymalizacja obrazowania wymaga cierpliwości i praktyki. Aby rozpocząć, zaznacz markerem otwory do wywiercenia na szkiełku szkiełkowym. Użyj narzędzia Dremel, aby wywiercić małe otwory w szkiełku, gdy szkiełko jest zanurzone w wodzie.

Sonikować szkiełka i szkiełka nakrywkowe w acetonie przez 30 minut w sonikatorze kąpielowym w temperaturze 23 stopni Celsjusza. Wyrzuć aceton ze szkiełka i przykryj słoiki. Dokładnie spłucz wodą i sonikuj w pięciomolowym wodorotlenku potasu przez 30 minut.

Następnie spłucz szkiełka podstawowe i szkiełko nakrywkowe wodą i poddaj sonikacji w metanolu przez dwie minuty. Pozostaw słoiki wypełnione metanolem do etapu zasolenia aminokwasów. Wlej świeżo przygotowaną mieszaninę zasolenia aminokwasów do słoików z szkiełkiem podstawowym i przykrywką.

Inkubować, sonizować i ponownie inkubować szkiełka i szkiełka nakrywkowe w mieszaninie aminowego zasolenia przed odrzuceniem roztworu. Następnie umyj słoiki metanolem przed napełnieniem ich wodą. Następnie spłucz szkiełka wodą.

Wysusz je nadmuchem powietrza i umieść w skrzynkach montażowych. Nałóż 60 mililitrów roztworu PEGylacji na szkiełko podstawowe i umieść na nim szkiełko nakrywkowe. Zaznacz stronę niepegylowaną przed przechowywaniem.

Po inkubacji delikatnie zdemontuj i spłucz szkiełka podstawowe i nakrywkowe wodą. Następnie wysusz je przez nadmuch powietrza i umieść w sterylnej 50-mililitrowej probówce z pegylowaną powierzchnią skierowaną od siebie. Po pasażowaniu komórek HEK 293T 0,05% trypsyny-EDTA, zasiej komórki na szkiełkach nakrywkowych z poli-L / D-lizyny.

Umieść wzorcową pożywkę z pożywką uzupełnioną AZP do wzrostu komórek i metabotropowego receptora glutaminianu 2 lub ekspresji mGluR2. Następnie przetaczaj komórki odczynnikiem do transfekcji i inkubuj przez 24 godziny przed zmianą pożywki na świeżą pożywkę z dodatkiem AZP. 20 minut przed etykietowaniem barwnikami alkinocyjaninowymi umyj szkiełka okładkowe dwukrotnie ciepłym buforem nagrywającym lub RB i umieść je na ciepłym standardowym nośniku bez AZP.

Następnie wyjmij standardowe podłoże i umyj komórki RB przed dodaniem świeżo przygotowanego roztworu do etykietowania. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności. Po inkubacji usunąć roztwór do etykietowania.

Przemyć szkiełko nakrywkowe zawierające transfekowane komórki dwukrotnie za pomocą RB i ponownie zawiesić w tym samym podłożu. Następnie osadzaj komórki, wirując w temperaturze 1 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut i usuń supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w 80 do 130 mikrolitrach roztworu do lizy. Rozdrobnić granulkę przez pipetowanie.

Następnie zawiń go w folię i umieść na bujaku w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 30 minut do jednej godziny, aby zlizować komórki. Frakcję nierozpuszczalną osadzać przez odwirowanie w temperaturze 20 000 g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie przenieś supernatant do świeżej zimnej probówki i przechowuj go na lodzie.

Wyjmij szkiełko podstawowe i szkiełko nakrywkowe z zamrażarki i pozwól im ogrzać się w temperaturze pokojowej w ciemności. Zmontuj komorę, umieszczając paski taśmy dwustronnej między szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym, upewniając się, że powierzchnie PEGylowane tworzą wnętrze komory przepływowej. Za pomocą końcówki do pipet dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby upewnić się, że taśma styka się z szkiełkiem nakrywkowym i szkiełkiem.

Nałóż żywicę epoksydową na krawędzie szkiełka. Nałóż 40 mikrolitrów 500-nanomolowej NeutrAwidyny na każdą linię i inkubuj w nawilżonym ciemnym pudełku. Po dwóch minutach umyj każdy tor komory 100 mikrolitrami buforu T50.

Następnie dodać 20 nanomolowych roztworów przeciwciał biotynylowanych i inkubować przez 30 minut przed przemyciem 200 mikrolitrami buforu T50 na pas. Włącz komputer i mikroskop. Następnie włącz lasery, aby się rozgrzały.

Następnie włącz kamerę EMCCD i otwórz oprogramowanie. Zamontuj komorę na próbkę na stoliku mikroskopu i stopniowo dodawaj próbkę białka, aby uzyskać około 400 cząsteczek na pole widzenia. Przemyć komorę 100 mikrolitrami buforu obrazowego uzupełnionego 0,3 jednostki protokatechuianu 3, 4-dioksygenazy.

Dostosuj wzmocnienie, szybkość akwizycji i moce lasera, aby wykryć sygnały fluorescencji pojedynczej cząsteczki zarówno w kanale donorowym, jak i akceptującym. Następnie pobudź dawcę i uzyskaj ślady czasowe, aż 80% cząsteczek dawcy w polu widzenia zostanie wybielonych foto. Pod koniec filmu włącz laser 640 nm, aby bezpośrednio wzbudzić akceptanta, aż niektóre cząsteczki zostaną wybielone.

Zmień pole widzenia i powtórz kroki wzbudzenia dawcy i osoby akceptującej, aby zebrać trzy filmy na warunek. Aby wybrać jednocząsteczkowe ślady FRET wybierania cząstek, wybierz ślady, w których całkowita intensywność śladów donorowych i akceptujących jest stabilna w czasie. Następnie wybierz ślady z antyskorelowanymi zmianami intensywności dawcy i akceptora.

Wybierz cząsteczki dawcy i akceptora wykazujące jednoetapowe fotowybielanie i ślady dłuższe niż pięć sekund. Oblicz niedobór FRET. Na koniec zidentyfikuj stan konformacyjny za pomocą ukrytego modelowania Markowa lub HMM, wykonując kroki opisane w manuskrypcie.

Znakowanie AZP barwnikami cyjaninowymi osiągnięto w reakcji cykloaddycji katalizowanej miedzią i spowodowało skuteczne znakowanie błony plazmatycznej 548UAA z populacją powierzchni komórki znakowaną fluoroforami donorowymi i akceptującymi. W elektroforezie SDS-PAGE zaobserwowano pojedyncze pasmo o mocy 250 kilodaltonów w komórkach HEK 293T wykazujących ekspresję 548UAA, co zbiegło się z dimerykiem mGluR2 o pełnej długości. Przedstawiono tutaj reprezentatywne selektywne ślady dla wielu krótkotrwałych i długożyciowych zdarzeń bielenia dawcy i akceptanta.

Stany konformacyjne zidentyfikowano za pomocą analizy HMM. Przejścia między dyskretnymi stanami FRET zostały wyodrębnione z wyidealizowanych pasowań i wykreślone jako mapa cieplna gęstości przejścia. Wyidealizowane ślady FRET dostarczają również informacji o czasie przebywania dla każdego zidentyfikowanego potwierdzenia.

Ślady pojedynczej cząsteczki z kanałem donorowym i akceptorowym pokazano tutaj. Co więcej, pojedyncza cząsteczka FRET ujawnia cztery stany konformacyjne domeny bogatej w cysteinę mGluR2. Skuteczne zachowanie pików jest niezbędne do ściągania pojedynczych cząsteczek i należy zachować ostrożność podczas tego procesu.

Ponadto środek pochłaniający tlen należy dodać bezpośrednio przed obrazowaniem. Ta metoda znakowania i eksperymenty z pojedynczymi cząsteczkami FRET zostały zastosowane do wielu receptorów i dostarczyły nowych informacji na temat mechanizmu aktywacji receptora i modulacji funkcji receptora.