Name: Wizualizacja dynamiki konformacyjnej receptorów błonowych za pomocą jednocząsteczkowego FRET (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Poznaj dynamikę konformacyjną receptorów błonowych przy użyciu jednocząsteczkowego FRET i specyficznego znaczenia białek. Ta metoda umożliwia wizualizację ruchu białek mGluR2 w czasie rzeczywistym bez zakłócania ich struktury.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Reza Vafabakhsh za dyskusje. Prace te były wspierane przez R01GM140272 grantowe National Institutes of Health (dla R.V.), przez The Searle Leadership Fund for the Life Sciences na Northwestern University oraz przez Chicago Biomedical Consortium przy wsparciu Searle Funds w The Chicago Community Trust (do R.V.). B.W.L. był wspierany przez National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Training Grant T32GM-008061.

<ol><li>Smock, R. G., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sending+signals+dynamically%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sending signals dynamically.</a> Science. 324 (5924), 198-203 (2009).</li>
<li>Changeux, J. P., Christopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+modulation+as+a+unifying+mechanism+for+receptor+function+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation.</a> Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).</li>
<li>Tang, X. -l, Wang, Y., Li, D. -l, Luo, J., Liu, M. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orphan+G+protein-coupled+receptors+%28GPCRs%29%3A+biological+functions+and+potential+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).</li>
<li>Chung, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+the+G+protein+Gs+induced+by+the+%CE%B22+adrenergic+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor.</a> Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).</li>
<li>Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dynamics+of+a+class+C+G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor.</a> Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).</li>
<li>Niswender, C. M., Conn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+glutamate+receptors%3A+Physiology%2C+pharmacology%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).</li>
<li>Pin, J. P., Bettler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+functions+of+mGlu+and+GABA%28B%29+receptor+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes.</a> Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).</li>
<li>Kniazeff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closed+state+of+both+binding+domains+of+homodimeric+mGlu+receptors+is+required+for+full+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).</li>
<li>Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence resonance energy transfer.</a> Methods. 25 (1), 78-86 (2001).</li>
<li>Schuler, B., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+studied+by+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein folding studied by single-molecule FRET.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).</li>
<li>Liauw, B. W. -H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+rearrangement+during+activation+of+a+metabotropic+glutamate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor.</a> Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).</li>
<li>Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+site-specific+incorporation+of+unnatural+amino+acids+into+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins.</a> Science. 244 (4901), 182-188 (1989).</li>
<li>Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper-catalyzed+azide-alkyne+click+chemistry+for+bioconjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).</li>
<li>Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unnatural+amino+acid+mutagenesis+of+GPCRs+using+amber+codon+suppression+and+bioorthogonal+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22G+Protein+Coupled+Receptors%3A+Structure%22%5BJournal%5D)">Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling.</a> G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).</li>
<li>Serfling, R., Coin, I. Chapter Four - Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSerfling%2C+R+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. Pecoraro, V. 580, Academic Press. Cambridge, MA. 89-107 (2016).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).</li>
<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li>
<li>Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+Trolox+as+antiblinking+and+antibleaching+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).</li>
<li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+short+chain+nonionic+detergents+destabilize+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).</li>
<li>Cao, A. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+modulators+enhance+agonist+efficacy+by+increasing+the+residence+time+of+a+GPCR+in+the+active+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).</li>
<li>Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -H., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+cross-correlation+filtering+of+one-and+two-color+single+molecule+localization+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data.</a> Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769(2021).</li>
<li>Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+locus+specific+chromatin+structure+and+dynamics+with+correlative+conventional+and+super-resolution+imaging+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells.</a> Nucleic Acids Research. , (2022).</li>
<li>Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+FRET+efficiency+and+ratio+of+donor+to+acceptor+concentration+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells.</a> Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).</li>
<li>Gopich, I. V., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+efficiency+distributions+of+multistate+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">FRET efficiency distributions of multistate single molecules.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).</li>
<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
<li>Hellenkamp, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+and+accuracy+of+single-molecule+FRET+measurements-A+multi-laboratory+benchmark+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study.</a> Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).</li>
<li>Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+rates+and+states+from+biophysical+time+series%3A+A+Bayesian+approach+to+model+selection+and+single-molecule+FRET+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data.</a> Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+structural+elements+of+the+T-box+riboswitch+drive+the+two-step+binding+of+the+tRNA+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand.</a> Elife. 7, 39518(2018).</li>
<li>Goodman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+analysis+based+on+a+certain+multivariate+complex+Gaussian+distribution+%28an+introduction%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Mathematical+Statistics%22%5BJournal%5D)">Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction).</a> The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).</li>
<li>Brown, R. B., Audet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+techniques+for+single-cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Current techniques for single-cell lysis.</a> Journal of the Royal Society Interface. 5, Suppl 2 131-138 (2008).</li>
<li>Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+sensitivity+modulation+in+the+calcium-sensing+receptor+via+electrostatic+tuning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning.</a> Nature Communications. 13 (1), 2194(2022).</li>
<li>Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+pull-down+for+studying+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-molecule pull-down for studying protein interactions.</a> Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).</li>
<li>Huang, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineating+the+conformational+landscape+of+the+adenosine+A%282A%29+receptor+during+G+protein+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling.</a> Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).</li>
<li>Wingler, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+analogs+with+divergent+bias+stabilize+distinct+receptor+conformations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations.</a> Cell. 176 (3), 468-478 (2019).</li>
<li>Gordon, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivity+of+biarylazacyclooctynones+in+copper-free+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).</li>
<li>Kim, E., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+applications+of+copper-free+click+chemistry%3A+In+vitro%2C+in+vivo%2C+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo.</a> Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).</li>
<li>Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations%2C+challenges%2C+and+limitations+of+bioconjugation+via+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).</li>
<li>Geng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+of+ligand+activation+in+human+calcium-sensing+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor.</a> Elife. 5, 13662(2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

GPCR to białka, które działają na błonę komórkową w celu zainicjowania transdukcji sygnału. Wiele GPCR składa się z wielu domen, przy czym sygnalizacja jest zależna od kooperacyjnej interakcji między domenami. Aby modulować właściwości tych receptorów błonowych, konieczne jest zrozumienie dynamicznego zachowania wielu domen. Transfer energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) to technika fluorescencyjna, która umożliwia pomiar konformacji i dynamiki białek w czasie rzeczywistym11,32...

Transfer informacji przez błonę plazmatyczną jest silnie zależny od funkcji receptorów błonowych1. Wiązanie liganda z receptorem prowadzi do zmiany konformacyjnej i aktywacji receptora. Proces ten ma często charakter allosteryczny2. Liczące ponad 800 członków receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) są największą rodziną receptorów błonowych u ludzi3. Ze względu na ich rolę w prawie wszystkich procesach komórkowych, GPCR stały się ważnymi celami rozwoju terapeutycznego. W kanonicznym modelu sygnalizacji GPCR aktywacja agonistyczną powoduje zmiany konformacyjne receptora, które następnie aktywują heterotrimeryczny kompleks białka G poprzez wymianę GDP na GTP w kieszeni wiążącej nukleotydyα G. Aktywowane podjednostki Gα-GTP i Gβγ kontrolują następnie aktywność dalszych białek efektorowych i propagują kaskadę sygnalizacyjną4,5. Ten proces sygnalizacji zasadniczo zależy od zdolności ligandów do zmiany trójwymiarowego kształtu receptora. Mechanistyczne zrozumienie, w jaki sposób ligandy to osiągają, ma kluczowe znaczenie dla opracowywania nowych terapii oraz projektowania syntetycznych receptorów i czujników.
Metabotropowe receptory glutaminianu (mGluRs) należą do rodziny GPCR klasy C i są ważne dla powolnego neuromodulacyjnego działania glutaminianu i dostrajania pobudliwości neuronalnej6,7. Spośród wszystkich GPCR, GPCR klasy C są strukturalnie unikalne, ponieważ działają jako obligatoryjne dimery. mGluRs zawierają trzy domeny strukturalne: domenę muchołówki (VFT), domenę bogatą w cysteinę (CRD) i domenę transbłonową (TMD)8. Zmiany konformacyjne podczas procesu aktywacji są złożone i obejmują lokalne i globalne sprzężenie konformacyjne, które rozchodzą się na odległość 12 nm, a także kooperatywność dimerów. Pośrednie konformacje, czasowy porządek stanów i tempo przejścia między stanami są nieznane. Śledząc konformację poszczególnych receptorów w czasie rzeczywistym, możliwe jest zidentyfikowanie przejściowych stanów pośrednich i sekwencji zmian konformacyjnych podczas aktywacji. Można to osiągnąć, stosując transfer energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki9,10 (smFRET), tak jak zostało to ostatnio zastosowane do wizualizacji propagacji zmian konformacyjnych podczas aktywacji mGluR211. Kluczowym krokiem w eksperymentach FRET jest wygenerowanie czujników FRET poprzez specyficzną dla miejsca insercję fluoroforów donorowych i akceptorowych do białka będącego przedmiotem zainteresowania. Przyjęto strategię inkorporacji nienaturalnych aminokwasów (UAA)12,13,14,15 w celu przezwyciężenia ograniczeń typowych technologii znakowania fluorescencyjnego specyficznych dla danego miejsca, które wymagają stworzenia mutantów bez cysteiny lub wprowadzenia dużego znacznika zakodowanego genetycznie. Pozwoliło to na zaobserwowanie konformacyjnego przegrupowania niezbędnego kompaktowego łącznika allosterycznego, który połączył domeny wiążące ligandy i sygnalizacyjne mGluR2. W tym protokole przedstawiono przewodnik krok po kroku dotyczący przeprowadzania eksperymentów smFRET na mGluR2, w tym podejście do specyficznego dla miejsca znakowania mGluR2 za pomocą UAA w celu przyłączenia fluoroforów za pomocą katalizowanej miedzią reakcji cyklizacji azydku. Ponadto protokół ten opisuje metodologię bezpośredniego wychwytywania białek błonowych i analizy danych. Przedstawiony tutaj protokół ma również zastosowanie do badania dynamiki konformacyjnej innych białek błonowych.

<table><tbody><tr><td>(+)-Askorbinian sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat # 11140-250G</td><td></td></tr><tr><td>4-azydo-L-fenyloalanina</td><td>Chem-Impex International</td><td>Cat # 06162</td><td></td></tr><tr><td>548UAA</td><td>Liauw i in. 2021</td><td></td><td>Transfekowany konstrukt</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Fisher Chemical</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Chemical</td><td>67-64-1</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator (2022)</td><td>https://www.adobe.com/</td> <td>RRID:SCR_010279</td><td>Oprogramowanie, algorytm</td></tr><tr><td>Aminoguanidyna (chlorowodorek)</td><td>Cayman Chemical</td><td>81530</td><td></td></tr><tr><td>Aminosilan</td><td>Aldrich</td><td>919-30-2</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator do kąpieli 2,8 L</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Kąpiel ultradźwiękowa 2,8 l</td></tr><tr><td>Biotyna-PEG</td><td>Laysan Bio Inc</td><td>Pozycja# Biotyna-PEG-SVA-5000-100mg</td><td></td></tr><tr><td>BTTES</td><td>Click Narzędzia chemiczne</td><td>1237-500</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan miedzi (II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat # 451657-10G</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>16004-306</td><td>Komora na próbki</td></tr><tr><td>Cy3 Alkine</td><td>Click Narzędzia chemiczne</td><td>TA117-5</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 Alkine</td><td>Click Narzędzia chemiczne</td><td>TA116-5</td><td></td></tr><tr><td>DDM</td><td>Anatrace</td><td>Część # D310 1 GM</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>DDM-CHS (10:1)</td><td>Anatrace</td><td>Część # D310-CH210 1 ML</td><td>Detergent z cholekterolem</td></tr><tr><td>Zdefiniowana płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Di01-R405/488/561/635</td><td>Filtr wycinający Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD</td><td>Kamera Andor</td><td>DU-897U</td><td></td></tr><tr><td>ET542lp</td> Filtr <td>długoprzepustowy</td><td>Chroma</td><td></td></tr><tr><td>FF640-FDi01</td><td>Semrock</td><td>Filtr dichroiczny emisji</td>FLAG-tag <td></td></tr><tr><td>przeciwciało</td><td>Genscript</td><td>A01429</td><td></td></tr><tr><td>Koralik fluorescencyjny</td><td>Invitrogen T7279</td><td>Mikrosfery TetraSpeck</td><td>Koralik sferyczny</td></tr><tr><td>Szkiełka</td><td>szklane Fisherfinest</td><td>12-544-4</td><td>komora na próbki</td></tr><tr><td>Glutaminian</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat # 6106-04-3</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat # 12022001</td><td>Linia komórkowa</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>FisherBioReagents</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Rozdzielacz obrazu</td><td>OptoSplit II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fluka</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>Laser</td><td>Oxxius</td><td></td><td>4-liniowy łącznik laserowy</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Odczynnik do transfekcji</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000015</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikroskop Olympus</td><td>Olympus IX83</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q dejonizator</td><td>wody</td><td>Barnstead</td><td></td></tr><tr><td>m-PEG</td><td>Laysan Bio Inc</td><td>Pozycja# MPEG-SIL-5000-1g</td><td></td></tr><tr><td>NF03-405/488/532/635</td><td>Lustro dichroiczne</td><td>Semrock</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51985091</td><td>Zredukowane podłoże w surowicy</td></tr><tr><td>OptiMEM/Zredukowane podłoże w surowicy Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OriginPro (2020b)</td><td>https://www.originlab.com/</td> <td>RRID:SCR_014212</td><td>Oprogramowanie do analizy danych i tworzenia wykresów</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pIRE4-Azi</td><td></td><td>Addgene Plazmid # 105829</td><td>Transfekowany konstrukt</td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-L-lizyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat # P2636</td><td></td></tr><tr><td>Kwas protokatechowy (PCA)</td><td>HWI grupa</td><td>99-50-3</td><td></td></tr><tr><td>smCamera (wersja 1.0)</td><td>http://ha.med.jhmi.edu/resources/</td><td></td> <td>Camera oprogramowanie</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>FisherBioReagents</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>Whatman UNIFLO</td><td>Cat#9914-2502</td><td>Filtracja cieczy</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma</td><td>53188-07</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja dynamiki konformacyjnej receptorów błonowych za pomocą jednocząsteczkowego fret

Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET

Zdolność komórek do reagowania na sygnały zewnętrzne jest niezbędna dla rozwoju, wzrostu i przetrwania komórek. Aby zareagować na sygnał z otoczenia, komórka musi być w stanie go rozpoznać i przetworzyć. Zadanie to opiera się głównie na funkcji receptorów błonowych, których rolą jest przekształcanie sygnałów w język biochemiczny komórki. Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) stanowią największą rodzinę białek receptorów błonowych u ludzi. Wśród GPCR metabotropowe receptory glutaminianu (mGluR) są unikalną podklasą, która działa jako obligatoryjne dimery i posiada dużą domenę zewnątrzkomórkową, która zawiera miejsce wiązania ligandu. Niedawne postępy w badaniach strukturalnych mGluR pozwoliły lepiej zrozumieć proces ich aktywacji. Jednak propagacja wielkoskalowych zmian konformacyjnych przez mGluRs podczas aktywacji i modulacji jest słabo poznana. Transfer energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) jest potężną techniką wizualizacji i ilościowego określania dynamiki strukturalnej biomolekuł na poziomie pojedynczego białka. Aby zobrazować dynamiczny proces aktywacji mGluR2, opracowano fluorescencyjne czujniki konformacyjne oparte na inkorporacji nienaturalnych aminokwasów (UAA), które umożliwiły znakowanie białek specyficznych dla miejsca bez zaburzeń natywnej struktury receptorów. Opisany tutaj protokół wyjaśnia, jak przeprowadzać te eksperymenty, w tym nowatorskie podejście do etykietowania UAA, przygotowanie próbki oraz pozyskiwanie i analizę danych smFRET. Strategie te można uogólnić i rozszerzyć w celu zbadania dynamiki konformacyjnej różnych białek błonowych.

Ekspresja i znakowanie fluorescencyjne sensora FRET opartego na UAA 
W niniejszym rozdziale omówiono przykładowe wyniki wprowadzania oraz znakowania fluorescencyjnego UAA (AZP) w obrębie domeny CRD receptora mGluR2 (548UAA)1. Jak wspomniano wcześniej, aby wprowadzić AZP do mGluR2, konieczna jest koekspresja zmodyfikowanego aparatu translacyjnego, obejmującego zmodyfikowaną syntetazę tRNA i komplementarne tRNA (pIRE4-Azi), oraz mGluR2 zawierającego kodon bursztynowy w pozycji ...

To badanie przedstawia szczegółową procedurę przeprowadzania eksperymentów z transferem energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) na receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR) przy użyciu znakowania specyficznego dla miejsca poprzez inkorporację nienaturalnych aminokwasów (UAA). Protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący przygotowania próbek, eksperymentów i analizy danych smFRET.

Wizualizacja dynamiki konformacyjnej receptorów błonowych za pomocą jednocząsteczkowego FRET

The ability of cells to respond to external signals is essential for cellular development, growth, and survival. To respond to a signal from the ...

W tym przypadku zastosowaliśmy jednocząsteczkowy FRET i znakowanie białek specyficznych dla miejsca poprzez naturalną inkorporację aminokwasów, aby zbadać dynamikę konformacyjną mGluR2. Pozwala to na badanie dynamiki białek bez naruszania ich struktury. Struktura atomowa zapewnia statyczny obraz białka.Jednak jednocząsteczkowy FRET umożliwia nam wizualizację pełnego zakresu ruchu białka w czasie rzeczywistym i roztworze. Metodę tę można zastosować do badania dynamiki dowolnego białka. Co więcej, naturalna inkorporacja aminokwasów może być wykorzystana do badania interakcji białko-białko oraz inżynierii syntetycznych receptorów.Ładowanie próbek i optymalizacja obrazowania wymaga cierpliwości i praktyki. Aby rozpocząć, zaznacz markerem otwory do wywiercenia na szkiełku szkiełkowym. Użyj narzędzia Dremel, aby wywiercić małe otwory w szkiełku, gdy szkiełko jest zanurzone w wodzie.Sonikować szkiełka i szkiełka nakrywkowe w acetonie przez 30 minut w sonikatorze kąpielowym w temperaturze 23 stopni Celsjusza. Wyrzuć aceton ze szkiełka i przykryj słoiki. Dokładnie spłucz wodą i sonikuj w pięciomolowym wodorotlenku potasu przez 30 minut.Następnie spłucz szkiełka podstawowe i szkiełko nakrywkowe wodą i poddaj sonikacji w metanolu przez dwie minuty. Pozostaw słoiki wypełnione metanolem do etapu zasolenia aminokwasów. Wlej świeżo przygotowaną mieszaninę zasolenia aminokwasów do słoików z szkiełkiem podstawowym i przykrywką.Inkubować, sonizować i ponownie inkubować szkiełka i szkiełka nakrywkowe w mieszaninie aminowego zasolenia przed odrzuceniem roztworu. Następnie umyj słoiki metanolem przed napełnieniem ich wodą. Następnie spłucz szkiełka wodą.Wysusz je nadmuchem powietrza i umieść w skrzynkach montażowych. Nałóż 60 mililitrów roztworu PEGylacji na szkiełko podstawowe i umieść na nim szkiełko nakrywkowe. Zaznacz stronę niepegylowaną przed przechowywaniem.Po inkubacji delikatnie zdemontuj i spłucz szkiełka podstawowe i nakrywkowe wodą. Następnie wysusz je przez nadmuch powietrza i umieść w sterylnej 50-mililitrowej probówce z pegylowaną powierzchnią skierowaną od siebie. Po pasażowaniu komórek HEK 293T 0,05% trypsyny-EDTA, zasiej komórki na szkiełkach nakrywkowych z poli-L / D-lizyny.Umieść wzorcową pożywkę z pożywką uzupełnioną AZP do wzrostu komórek i metabotropowego receptora glutaminianu 2 lub ekspresji mGluR2. Następnie przetaczaj komórki odczynnikiem do transfekcji i inkubuj przez 24 godziny przed zmianą pożywki na świeżą pożywkę z dodatkiem AZP. 20 minut przed etykietowaniem barwnikami alkinocyjaninowymi umyj szkiełka okładkowe dwukrotnie ciepłym buforem nagrywającym lub RB i umieść je na ciepłym standardowym nośniku bez AZP.Następnie wyjmij standardowe podłoże i umyj komórki RB przed dodaniem świeżo przygotowanego roztworu do etykietowania. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności. Po inkubacji usunąć roztwór do etykietowania.Przemyć szkiełko nakrywkowe zawierające transfekowane komórki dwukrotnie za pomocą RB i ponownie zawiesić w tym samym podłożu. Następnie osadzaj komórki, wirując w temperaturze 1 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut i usuń supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w 80 do 130 mikrolitrach roztworu do lizy. Rozdrobnić granulkę przez pipetowanie.Następnie zawiń go w folię i umieść na bujaku w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 30 minut do jednej godziny, aby zlizować komórki. Frakcję nierozpuszczalną osadzać przez odwirowanie w temperaturze 20 000 g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie przenieś supernatant do świeżej zimnej probówki i przechowuj go na lodzie.Wyjmij szkiełko podstawowe i szkiełko nakrywkowe z zamrażarki i pozwól im ogrzać się w temperaturze pokojowej w ciemności. Zmontuj komorę, umieszczając paski taśmy dwustronnej między szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym, upewniając się, że powierzchnie PEGylowane tworzą wnętrze komory przepływowej. Za pomocą końcówki do pipet dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby upewnić się, że taśma styka się z szkiełkiem nakrywkowym i szkiełkiem.Nałóż żywicę epoksydową na krawędzie szkiełka. Nałóż 40 mikrolitrów 500-nanomolowej NeutrAwidyny na każdą linię i inkubuj w nawilżonym ciemnym pudełku. Po dwóch minutach umyj każdy tor komory 100 mikrolitrami buforu T50.Następnie dodać 20 nanomolowych roztworów przeciwciał biotynylowanych i inkubować przez 30 minut przed przemyciem 200 mikrolitrami buforu T50 na pas. Włącz komputer i mikroskop. Następnie włącz lasery, aby się rozgrzały.Następnie włącz kamerę EMCCD i otwórz oprogramowanie. Zamontuj komorę na próbkę na stoliku mikroskopu i stopniowo dodawaj próbkę białka, aby uzyskać około 400 cząsteczek na pole widzenia. Przemyć komorę 100 mikrolitrami buforu obrazowego uzupełnionego 0,3 jednostki protokatechuianu 3, 4-dioksygenazy.Dostosuj wzmocnienie, szybkość akwizycji i moce lasera, aby wykryć sygnały fluorescencji pojedynczej cząsteczki zarówno w kanale donorowym, jak i akceptującym. Następnie pobudź dawcę i uzyskaj ślady czasowe, aż 80% cząsteczek dawcy w polu widzenia zostanie wybielonych foto. Pod koniec filmu włącz laser 640 nm, aby bezpośrednio wzbudzić akceptanta, aż niektóre cząsteczki zostaną wybielone.Zmień pole widzenia i powtórz kroki wzbudzenia dawcy i osoby akceptującej, aby zebrać trzy filmy na warunek. Aby wybrać jednocząsteczkowe ślady FRET wybierania cząstek, wybierz ślady, w których całkowita intensywność śladów donorowych i akceptujących jest stabilna w czasie. Następnie wybierz ślady z antyskorelowanymi zmianami intensywności dawcy i akceptora.Wybierz cząsteczki dawcy i akceptora wykazujące jednoetapowe fotowybielanie i ślady dłuższe niż pięć sekund. Oblicz niedobór FRET. Na koniec zidentyfikuj stan konformacyjny za pomocą ukrytego modelowania Markowa lub HMM, wykonując kroki opisane w manuskrypcie.Znakowanie AZP barwnikami cyjaninowymi osiągnięto w reakcji cykloaddycji katalizowanej miedzią i spowodowało skuteczne znakowanie błony plazmatycznej 548UAA z populacją powierzchni komórki znakowaną fluoroforami donorowymi i akceptującymi. W elektroforezie SDS-PAGE zaobserwowano pojedyncze pasmo o mocy 250 kilodaltonów w komórkach HEK 293T wykazujących ekspresję 548UAA, co zbiegło się z dimerykiem mGluR2 o pełnej długości. Przedstawiono tutaj reprezentatywne selektywne ślady dla wielu krótkotrwałych i długożyciowych zdarzeń bielenia dawcy i akceptanta.Stany konformacyjne zidentyfikowano za pomocą analizy HMM. Przejścia między dyskretnymi stanami FRET zostały wyodrębnione z wyidealizowanych pasowań i wykreślone jako mapa cieplna gęstości przejścia. Wyidealizowane ślady FRET dostarczają również informacji o czasie przebywania dla każdego zidentyfikowanego potwierdzenia.Ślady pojedynczej cząsteczki z kanałem donorowym i akceptorowym pokazano tutaj. Co więcej, pojedyncza cząsteczka FRET ujawnia cztery stany konformacyjne domeny bogatej w cysteinę mGluR2. Skuteczne zachowanie pików jest niezbędne do ściągania pojedynczych cząsteczek i należy zachować ostrożność podczas tego procesu.Ponadto środek pochłaniający tlen należy dodać bezpośrednio przed obrazowaniem. Ta metoda znakowania i eksperymenty z pojedynczymi cząsteczkami FRET zostały zastosowane do wielu receptorów i dostarczyły nowych informacji na temat mechanizmu aktywacji receptora i modulacji funkcji receptora.

visualizing-conformational-dynamics-membrane-receptors-using-single

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opiszemy metodę służącą do pomiaru kinetyki transportu jonów przez białka błonowe wraz z analizą zmian konformacyjnych w konkretnych miejscach z wykorzystaniem fluorescencji w pojedynczych komórkach. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku kanałów jonowych, transporterów i pomp jonowych, a także może być wykorzystana do określenia ograniczeń odległości między podjednostkami białek.

Badanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych in situ z wykorzystaniem ukierunkowanego znakowania fluorescencyjnego

Mikroskopia oparta na transferze energii fluorescencji (FRET) jest potężną techniką monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach z wykorzystaniem różnych biosensorów jako reporterów. W niniejszej pracy opisujemy sposób budowy spersonalizowanego systemu obrazowania FRET w epifluorescencji z komponentów dostępnych w handlu oraz sposób jego wykorzystania w eksperymentach FRET.

Mikroskopia FRET do monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach przy użyciu unimolekularnych biosensorów

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Proste metody wykrywania selektywnej aktywacji białek G przez receptory sprzężone z białkiem G pozostają wyjątkowym wyzwaniem w sygnalizacji komórkowej. W tym przypadku biosensory rezonansowego transferu energii (FRET) Fӧrster zostały opracowane poprzez parowanie peptydów GPCR z białkiem G w celu zbadania zmian konformacyjnych w kontrolowanych stężeniach w żywych komórkach.

Selektywne dla białka G konformacje GPCR mierzone za pomocą czujników FRET w teście fluorometrycznym zawiesiny żywych komórek

Protokół dla wysoce precyzyjnych eksperymentów FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki jest przedstawiony tutaj. Ponadto metodologia ta może być wykorzystana do identyfikacji trzech stanów konformacyjnych w domenie wiążącej ligand receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA). Wyznaczanie precyzyjnych odległości jest pierwszym krokiem w kierunku budowy modeli konstrukcyjnych w oparciu o eksperymenty FRET.

Wysoka precyzja FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki do określania struktury biomolekuły

Tutaj prezentujemy protokół jednoczesnego użycia czujników napięcia opartych na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru obciążenia białkami i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu w celu pomiaru dynamiki białek, umożliwiając pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach.

Pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu kombinacji technik fluorescencyjnych

Ten artykuł przedstawia metodę analizy czasoprzestrzennej mobilnych, jednocząsteczkowych sond opartych na transferze energii rezonansu Förstera (smFRET) przy użyciu szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej. Nowo opracowany zestaw narzędzi programowych umożliwia wyznaczanie śladów czasowych smFRET poruszających się sond, w tym prawidłowej wydajności FRET i pozycji molekularnych, jako funkcji czasu.

Zautomatyzowana dwuwymiarowa analiza czasoprzestrzenna mobilnych jednocząsteczkowych sond FRET

Badanie szczegółowo opisuje metodologię mapowania FRET, w tym wybór miejsc etykietowania, wybór barwników, akwizycję i analizę danych. Metodologia ta jest skuteczna w określaniu miejsc wiązania, zmian konformacyjnych i ruchów dynamicznych w układach białkowych i jest najbardziej użyteczna, jeśli jest wykonywana w połączeniu z istniejącymi informacjami strukturalnymi 3D.

Mapowanie transferu energii rezonansu Förster: nowa metodologia wyjaśniająca globalne cechy strukturalne

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Funkcje białek nadrodziny dynamin zależą od zmian konformacyjnych sprzężonych z hydrolizą GTP. System opisano za pomocą techniki jednocząsteczkowego FRET (smFRET) do monitorowania dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy w różnych stanach obciążenia nukleotydami.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek FRET do obserwacji dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy

Poznaj dynamikę konformacyjną receptorów błonowych przy użyciu jednocząsteczkowego FRET i specyficznego znaczenia białek. Ta metoda umożliwia wizualizację ruchu białek mGluR2 w czasie rzeczywistym bez zakłócania ich struktury.

Wizualizacja dynamiki konformacyjnej receptorów błonowych za pomocą jednocząsteczkowego FRET

Przeglądaj więcej filmów