Wysuszone plamy krwi i surowicy jako przydatne narzędzie do przechowywania próbek w celu oceny biomarkerów raka

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach translacyjnych, takie jak możliwość badania biomarkerów u pacjentów z krajów rozwijających się. Główną zaletą tej techniki jest możliwość przechowywania próbek krwi i surowicy przez co najmniej dwa tygodnie bez zamrażania oraz zapewnienie wysokiej jakości materiału do dalszych analiz, takich jak qPCR i ELISA. Implikacje tej techniki rozciągają się na diagnostykę chorób, takich jak rak i choroby zakaźne.

Metoda ta może być również stosowana w dziedzinach diagnostycznych lub badawczych, takich jak badanie chorób prenatalnych lub analiza patologii zakaźnej, takiej jak HIV. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zaczęliśmy porównywać biomarkery między seriami przypadków rasy kaukaskiej i afrykańskiej, dla których zamrożone próbki nie były dostępne. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy plamienia krwi są trudne do nauczenia.

W tej procedurze trzy mililitry próbki krwi pobiera się do trzymililitrowej probówki z 5,4 miligramami EDTA. Wpisz numer kodu pacjenta w prawym dolnym rogu karty oszczędnościowej. Ostrożnie ponownie zawiesić krew za pomocą pięciomililitrowej pipety.

Następnie odpipetuj i przenieś jeden punkt krwi na kartę oszczędnościową. Używając nowej końcówki dla każdej porcji krwi, powtórz plamienie, aby uzyskać w sumie od trzech do pięciu plamek krwi. Pozostaw wysuszone plamy krwi lub DBS do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej z otwartą pokrywą karty oszczędnościowej w pozycji poziomej na otwartej, niechłonnej powierzchni i unikając bezpośredniego światła słonecznego.

Następnego dnia przechowuj kartę w temperaturze pokojowej w plastikowej torbie ze środkiem osuszającym do czasu użycia. DNA zostanie wyekstrahowane z trzech wysuszonych plam krwi z karty oszczędnościowej. Zacznij od wycięcia każdego z DBS z karty i oddzielenia ich od karty.

Pokrój oddzielony DBS na małe kawałki o średnicy około jednego milimetra. Umieść małe kawałki z jednego DBS w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej. Aby roztrawić próbki, dodaj do probówki 180 mikrolitrów buforu do lizy jeden z dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji DNA, a następnie dodaj 20 mikrolitrów proteinazy K.Mix przez wirowanie.

Umieścić probówkę w inkubatorze termicznym i inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 60 minut. Pod koniec inkubacji krótko odwirować probówkę, aby usunąć krople z pokrywki. Rozpocznij pranie, dodając 200 mikrolitrów buforu do lizy dwa i wirując przez 10 sekund.

Umieść probówkę w termomikserze i inkubuj w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut. Umieść kolumnę eliuacyjną w nowej dwumililitrowej probówce zbiorczej i wyrzuć starą. Dodaj 500 mikrolitrów buforu do płukania i odwiruj pod ciśnieniem 6000 razy większym niż grawitacja przez jedną minutę.

Umieść kolumnę w nowej dwumililitrowej probówce zbiorczej i wyrzuć starą. Dodaj 500 mikrolitrów buforu do płukania dwa i odwiruj przy 6000-krotności grawitacji przez jedną minutę. Umieść kolumnę w nowej dwumililitrowej probówce zbiorczej i wyrzuć starą.

Wirować przy 20 000 razy grawitacji przez trzy minuty, aby wysuszyć membranę. Aby wymyć DNA, umieść kolumnę w nowej 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej i wyrzuć probówkę zbiorczą. Umieść 50 mikrolitrów wody destylowanej na środku membrany i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Odwirować probówkę pod ciśnieniem 20 000 razy większym niż grawitacja przez jedną minutę. Zbierz elucję i ponownie umieść na środku membrany. Ponownie odwirować probówkę przy 20 000 razy większej grawitacji przez jedną minutę.

Wyrzuć membranę. Po zmierzeniu stężenia DNA za pomocą spektrofotometru, przechowuj DNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia. W tej procedurze najpierw pobiera się siedem mililitrów próbki krwi obwodowej w siedmiomililitrowej probówce bez EDTA.

Pozostaw próbkę krwi do koagulacji w temperaturze pokojowej na 30 minut. Wpisz numer kodu pacjenta w prawym dolnym rogu karty oszczędnościowej. Odwirować próbkę krwi w temperaturze 1100-krotności grawitacji w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Usunąć supernatant z probówki i przenieść go do nowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Ostrożnie ponownie zawiesić krew za pomocą pięciomililitrowej pipety. Odpipetować i przenieść jeden punkt surowicy na kartę oszczędnościową.

Powtórz plamienie, aby uzyskać w sumie od trzech do pięciu plam krwi. Pozostaw wysuszone plamy sero do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej z otwartą pokrywą karty oszczędnościowej. Następnego dnia przechowuj kartę w temperaturze pokojowej w plastikowej torbie ze środkiem osuszającym do czasu użycia.

Jeśli przechowywanie jest dłuższe niż 14 dni, przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Przygotować się do testu ELISA, rozmrażając DSS dla każdej próbki, jeśli to konieczne. Aby wymyć białko z DSS, pokrój jeden DSS na małe kawałki o średnicy około jednego milimetra i umieść kawałki w probówce o pojemności 1,5 mililitra.

Następnie dodaj cztery mikrolitry PBS. Wstrząsnąć próbkami z małą prędkością w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia należy użyć odpowiedniego rozcieńczenia eluowanego białka jako próbki surowicy do analizy wydzielanego białka lub czynnika wzrostu przy użyciu dostępnego w handlu zestawu.

W tym protokole próbki krwi i surowicy przechowywano jako wysuszone plamy na bibule filtracyjnej w temperaturze pokojowej. Reprezentatywna karta oszczędzania białka jest pokazana przed i po pobraniu krwi. W celu potwierdzenia, że przechowywanie na bibule filtracyjnej i procedura elucji krwi nie wpływają na jakość próbki, testy ELISA na poziom białka wiążącego witaminę D lub DBP przeprowadzono na ośmiu próbkach surowicy zebranych w probówce o pojemności dwóch mililitrów i natychmiast przechowywanych w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza lub zebranych jako wysuszone plamki surowicy.

Współczynnik zmienności (CV) między dopasowanymi próbkami wahał się od 2% do 24%, a średnia CV wynosiła 9,6%Po opanowaniu tej techniki można wykonać w 10, 15 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można przeprowadzić dalsze metody biologii molekularnej lub analizę białek. Po opracowaniu technika ta umożliwia prowadzenie badań w zakresie badań translacyjnych i analizy biomarkerów współpracę z instytutami z całego świata, które nie dysponują sprzętem laboratoryjnym do przechowywania próbek biologicznych w standardowych warunkach.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak prawidłowo przechowywać próbki krwi w wysuszonych plamach krwi i surowicy. Nie zapominaj, że praca z krwią i odczynnikami chemicznymi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartucha laboratoryjnego.