Name: Wysuszone plamy krwi i surowicy jako przydatne narzędzie do przechowywania próbek w celu oceny biomarkerów raka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Poznaj metodę przechowywania krwi i surowicy jako wysuszonych plam do analizy biomarkerów raka bez zamrażania. Technika umożliwia badania qPCR i ELISA przez co najmniej dwa tygodnie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Gráinne Tierney za pomoc redakcyjną.

Krew obwodowa i surowica zostały pobrane i przechowywane od zdrowych dawców i pacjentów, którzy wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział w badaniu. Protokół badania został zatwierdzony przez lokalną Komisję Etyki zgodnie ze standardami etycznymi określonymi w Deklaracji Helsińskiej z 1964 roku.
1. Przechowywanie krwi w DBS
<ol>
	<li>Pobieranie próbek krwi
	<ol>
		<li>Zebrać 3 ml próbki krwi obwodowej w probówce o pojemności 3 ml z 5,4 mg kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). 
		UWAGA: Krew obwodową należy przechowywać w postaci DBS tak szybko, jak to możliwe i w ciągu 8 godzin.</li>
		<li>Wpisz numer kodu pacjenta w prawym dolnym rogu karty oszczędnościowej.</li>
		<li>Ostrożnie ponownie wymieszać krew za pomocą pipety o pojemności 5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Plamienie krwi na DBS
	<ol>
		<li>Odpipetować i przenieść jedną plamkę krwi (50 μl) na kartę oszczędnościową (tabela materiałów) za pomocą końcówki o pojemności 50–200 μl.</li>
		<li>Powtórz krok 1.2.1, aby uzyskać w sumie 3–5 plamek krwi. Wyrzuć starą końcówkę i weź nową dla każdej porcji krwi.</li>
		<li>Pozostaw DBS do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej w pozycji poziomej na otwartej, niechłonnej powierzchni, unikając bezpośredniego światła słonecznego. Pozostaw otwartą pokrywę karty oszczędnościowej, aby ułatwić suszenie krwi. 
		UWAGA: Wszelkie cząstki stałe w powietrzu lub kurzu podczas tego etapu suszenia nie mają wpływu na dalsze zastosowania.</li>
		<li>Przechowuj kartę w temperaturze pokojowej w plastikowej torbie ze środkiem osuszającym do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekstrakcja DNA począwszy od DBS zgodnie z arkuszem danych zestawu do ekstrakcji DNA (sekcja dla suchych plam krwi)
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki
	<ol>
		<li>Użyj 3 zasuszonych plam krwi z karty. Wytnij każdą z wysuszonych plam krwi z karty i oddziel je od karty pęsetą. Pokrój oddzielone wysuszone plamy krwi na małe kawałki (średnica około 1 mm).</li>
		<li>Umieść małe kawałki w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mineralizacja próbki
	<ol>
		<li>Dodać 180 μl buforu do lizy 1 dostarczonego w zestawie (tabela materiałów) do probówki. Dodać 20 μl proteinazy K. Nie mieszać buforu do lizy 1 z proteinazą k przed pipetowaniem do probówki o pojemności 1,5 ml z kartą z plamami krwi. Wymieszaj przez wirowanie.</li>
		<li>Umieścić probówkę w termoinkubatorze i inkubować w temperaturze 56 °C przez 60 minut. Jeśli termoinkubator nie jest wyposażony w wytrząsarkę, należy mieszać próbkę co 10–15 minut przez co najmniej 10 sekund, uważając, aby nie dopuścić do spadku temperatury próbki. Krótko odwirować probówki, aby usunąć krople z pokrywki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Etap prania
	<ol>
		<li>Dodać 200 μl buforu do lizy 2 (tabela materiałów) i wirować przez 10 s.</li>
		<li>Umieścić probówki w termomikserze lub podgrzewanym inkubatorze orbitalnym i inkubować w temperaturze 70 °C przez 10 minut. Jeżeli termoinkubator nie jest wyposażony w wytrząsarkę, należy wirować próbki raz przez co najmniej 10 sekund, uważając, aby nie dopuścić do spadku temperatury próbek.</li>
		<li>Powtórz krok 2.3.1. Przenieść 400 μl lizatu z probówki o pojemności 1,5 ml do kolumny elucyjnej (tabela materiałów). Odwirować kolumnę o stężeniu 6 000 x g przez 1 min.</li>
		<li>Umieścić kolumnę elucyjną w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i wyrzucić starą.</li>
		<li>Dodać 500 μl buforu do przemywania 1 (tabela materiałów) i odwirowywać przy 6 000 x g przez 1 min.</li>
		<li>Umieścić kolumnę w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i wyrzucić starą.</li>
		<li>Dodać 500 μl buforu do płukania 2 (tabela materiałów) i odwirować przy 6 000 x g przez 1 min.</li>
		<li>Umieścić kolumnę w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i wyrzucić starą.</li>
		<li>Wirować przy 20 000 x g przez 3 minuty, aby wysuszyć membranę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Etap elucji
	<ol>
		<li>Umieścić kolumnę w nowej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i wyrzucić probówkę zbiorczą.</li>
		<li>Umieść 50 μl wody destylowanej na środku membrany. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odwirować probówkę o masie 20 000 x g przez 1 minutę. Zebrać eluat i ponownie umieścić go na środku membrany.</li>
		<li>Odwirować probówkę o stężeniu 20 000 x g przez 1 minutę. Wyrzucić membranę.</li>
		<li>Zmierzyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru.</li>
		<li>DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. 
		UWAGA: DNA wyekstrahowane z DBS można wykorzystać do wykonania kilku analiz, takich jak ocena SNP metodą Real Time PCR lub sekwencjonowanie DNA Sangera.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przechowywanie surowicy dla DSS
<ol>
	<li>Pobieranie próbek krwi
	<ol>
		<li>Zebrać 7 ml próbki krwi obwodowej w probówce o pojemności 7 ml bez EDTA. Pozostaw próbkę krwi do koagulacji na 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wpisz numer kodu pacjenta w prawym dolnym rogu karty oszczędnościowej.</li>
		<li>Odwirować próbkę krwi o masie 980 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Przechowuj serum w DSS tak szybko, jak to możliwe, w ciągu 8 godzin.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć sklarowany osad z probówki i przenieść go do nowej probówki o pojemności 15 ml. Ostrożnie ponownie wymieszać krew za pomocą pipety o pojemności 5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Plamienie surowicy w DSS
	<ol>
		<li>Odpipetować i przenieść jeden punkt surowicy (50 μl) na kartę oszczędnościową. Powtórz ten krok, aby uzyskać w sumie 3–5 plamek krwi. 
		UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność, aby odpipetować dokładnie 50 μl surowicy do każdego miejsca. Surowica nie powinna wychodzić poza linię przerywaną karty.</li>
		<li>Pozostaw DSS do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej. Pozostaw otwartą pokrywę karty oszczędnościowej, aby ułatwić suszenie krwi.</li>
		<li>Przechowuj kartę w temperaturze pokojowej w plastikowej torbie ze środkiem osuszającym do czasu użycia. Jeśli przechowywanie jest dłuższe niż 14 dni, przechowuj kartę w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Test ELISA Począwszy od DSS
<ol>
	<li>Białko elute z DSS.
	<ol>
		<li>W razie potrzeby rozmrozić DSS dla każdej próbki. Pokrój DSS na małe kawałki (o średnicy około 1 mm). Umieść kawałki w probówce o pojemności 1,5 ml z 400 μl PBS.</li>
		<li>Wytrząsać próbki przez noc w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Potrząśnij nimi z niską intensywnością. PBS nie powinien moczyć pokrywy probówki podczas potrząsania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyć eluatu białkowego jako próbki surowicy do analizy wydzielanego białka/czynnika wzrostu zgodnie z instrukcjami zestawu ELISA, po odpowiednich rozcieńczeniach. 
	UWAGA: Ta procedura działa dobrze w przypadku wykrywania DBP9. W przypadku innych testów ELISA może być konieczny etap optymalizacji.</li>
</ol>

<ol><li>Bertagnolio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+drug+resistance+surveillance+using+dried+whole+blood+spots%5BTitle%5D)+AND+%22Antivir+Ther%22%5BJournal%5D)">HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots.</a> Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).</li>
<li>Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+filter+paper+for+the+collection+and+analysis+of+human+whole+blood+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens.</a> J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).</li>
<li>Garrido, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype+variability%2C+virological+response+and+drug+resistance+assessed+on+dried+blood+spots+collected+from+HIV+patients+on+antiretroviral+therapy+in+Angola%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemoth%22%5BJournal%5D)">Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola.</a> J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).</li>
<li>Steegen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+of+detecting+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+in+DNA+extracted+from+whole+blood+or+dried+blood+spots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots.</a> J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).</li>
<li>Costenaro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+load+detection+using+dried+blood+spots+in+a+cohort+of+HIV-1-infected+children+in+Uganda%3A+correlations+with+clinical+and+immunological+criteria+for+treatment+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure.</a> J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).</li>
<li>Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+glutathione+and+glutathione+disulfide+in+the+blood+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase-deficient+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns.</a> BMC Pediatr. 20 (17), 172(2017).</li>
<li>Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practice+in+the+measurement+and+interpretation+of+lysosomal+acid+lipase+in+dried+blood+spots+using+the+inhibitor+Lalistat+2%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2.</a> Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).</li>
<li>Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+25+inflammatory+markers+and+neurotrophins+in+neonatal+dried+blood+spots+by+immunoassay+with+xMAP+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology.</a> Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).</li>
<li>Amadori, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D+receptor+polymorphisms+or+serum+levels+as+key+drivers+of+breast+cancer+development%3F+The+question+of+the+vitamin+D+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway.</a> Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).</li>
<li>Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+hepatitis+B+virus+from+dried+blood+spots+by+polymerase+chain+reaction+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification.</a> J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).</li>
<li>Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+commercial+ELISA+for+the+detection+of+measles-specific+immunoglobulin+G+%28IgG%29+in+dried+blood+spots+collected+from+children+living+in+low-resource+settings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings.</a> J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).</li>
<li>Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA-based+assay+for+IP-10+detection+from+filter+paper+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples.</a> Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).</li>
<li>St Julien, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+quality+genome-wide+genotyping+from+archived+dried+blood+spots+without+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification.</a> PLoS One. 8 (5), e64710(2013).</li>
<li>Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+fentanyl+analogs+in+dried+blood+spots+by+flow-through+desorption+coupled+to+online+solid+phase+extraction+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry.</a> Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W protokole tym bada się możliwość przechowywania krwi i surowicy na bibule filtracyjnej, gdy laboratoria nie dysponują personelem lub infrastrukturą potrzebną do prawidłowego obchodzenia się z próbkami krwi. W szczególności przy użyciu tej metody można przechowywać krew pełną lub surowicę pobraną w standardowych probówkach lub przez nakłucie palca i nie ma potrzeby zamrażania próbek w temperaturze -20 °C lub -80 °C bezpośrednio po pobraniu krwi. DBS/DSS może pozostawać w temperaturze pokojowej do 14 dni bez żadnych zmia...

Głównym celem badań nad biomarkerami raka jest identyfikacja nowych parametrów biologicznych, które mogą być wykorzystane do diagnozy, przewidywania rokowania pacjenta oraz do określenia, czy pacjent odpowie na określone leczenie. Ten obszar badań ma zasadnicze znaczenie dla odkrywania innowacyjnych metod leczenia nowotworów i odgrywa kluczową rolę w leczeniu dostosowanym do jego potrzeb.
Procedury przeprowadzane podczas każdego etapu identyfikacji i walidacji biomarkerów muszą być wiarygodne i powtarzalne. Podstawą sukcesu badań translacyjnych jest prawidłowe przechowywanie próbek biologicznych, takich jak krew i surowica. Jest to pierwszy krok w kierunku uzyskania wysokiej jakości materiału biologicznego, który można wykorzystać do przeprowadzania eksperymentów biologii molekularnej lub testów białek.
Często potrzebne są wieloośrodkowe badania, aby zrekrutować wystarczającą liczbę pacjentów, aby uzyskać solidne dane. Nie wszystkie instytuty są w stanie przechowywać próbki w temperaturze -80 °C lub wysyłać je w suchym lodzie do innych międzynarodowych ośrodków. Użycie bibuły filtracyjnej do pobierania krwi jest prostą metodą przechowywania krwi i surowicy i nie wymaga natychmiastowego zamrażania próbek1,2. Na papierze można dostrzec kroplę krwi lub surowicy, pozostawić do wyschnięcia na noc, a następnie przechowywać do 14 dni w temperaturze pokojowej1,2. Daje to naukowcom czas na wysłanie próbek do innych laboratoriów. Wykorzystanie suszonych plam krwi (DBS) i suszonych plam surowicy (DSS) mogłoby zatem uprościć współpracę między instytutami w krajach rozwiniętych i rozwijających się.
Biorąc pod uwagę łatwość użycia, próbkowanie DBS jest szeroko stosowane w kilku rodzajach testów do dalszych analiz serologicznych lub genetycznych. Na przykład w przeszłości DBS były często używane do badań przesiewowych w kierunku HIV w krajach rozwijających się1,2,3,4,5. Kolejną zaletą tej metody przechowywania jest to, że próbki krwi mogą być pobierane z nakłuć palców, co umożliwia jej wykorzystanie do badań przesiewowych noworodków 6,7,8. Łatwa obsługa i transport próbek to kolejne zalety DBS, zwłaszcza w przypadku próbek pobieranych w odległych lokalizacjach, w których nie ma sprzętu laboratoryjnego. W poprzedniej publikacji użyliśmy DBS i DSS do przetestowania witaminy D i białka wiążącego witaminę D (DBP) u szeregu pacjentów rasy kaukaskiej i afrykańskiej9. Nasi afrykańscy koledzy nie byli w stanie uzyskać suchego lodu. Aby porównać markery biologiczne w celu zrozumienia różnic w szlaku witaminy D między dwiema populacjami etnicznymi, udoskonaliliśmy procedurę, wykorzystując dopasowane próbki przechowywane w standardowych warunkach i na bibule filtracyjnej. Po zoptymalizowaniu procedury DBS/DSS byliśmy w stanie przeanalizować DBP i witaminę D w surowicy pacjentów w obu kohortach. Oceniliśmy również szereg polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) po ekstrakcji DNA z krwi pełnej dla osób rasy kaukaskiej i z DBS dla Afrykanów9. Obecny protokół pozwala na przechowywanie wysokiej jakości próbek krwi w temperaturze pokojowej bez wpływu na różne rodzaje dalszych analiz, od biologii molekularnej po testy ELISA. Jest zalecany do stosowania do zarządzania materiałem biologicznym w badaniach wieloośrodkowych lub dla ośrodków, które nie posiadają zaplecza do standardowych warunków przechowywania. Poniższy protokół stanowi kulminację tych zoptymalizowanych procedur.

<table><tbody><tr><td>Karty oszczędnościowe Whatman Protein Card 903 Karta oszczędnościowa Protein Card, 100/pk&lrm;</td><td>Sigma</td><td>Z761575</td><td>Przydatny do przechowywania próbek w temperaturze pokojowej do dalszych analiz</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne Falcon, 5 mL</td><td>Komórka macierzysta</td><td>#38003</td><td></td></tr><tr><td>50-200 &mikro; Końcówki L</td><td>Star-Lab</td><td>S1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówka wirówkowa</td><td>Eppendorf</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA microkit</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>Jest to zestaw do ekstrakcji DNA przeznaczony do izolowania małych ilości DNA&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Bufor ATL (zawarty w mikrozestawie QIAamp DNA)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Jest to zgłoszone jako Bufor do lizy 1 w tekście</td></tr><tr><td>Bufor AL (zawarty w mikrozestawie QIAamp DNA)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Jest to zgłoszone jako Bufor do lizy 2 w tekście</td></tr><tr><td>QIAamp mini kolumna elucyjna</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Jest to zgłaszane jako kolumna w tekście</td></tr><tr><td>AW1&nbsp; (zawarte w mikrozestawie QIAamp DNA)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Jest to zgłaszane jako Bufor myjący 1 W TEKŚCIE</td></tr><tr><td>AW2&nbsp; (zawarte w mikrozestawie QIAamp DNA)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Jest to zgłoszone jako Bufor płuczący 2 w tekście</td></tr><tr><td>Ludzka witamina D BP Quantikine ELISA Kit</td><td>R& D systemy</td><td>DVDBP0</td><td></td></tr></tbody></table>

wysuszone plamy krwi i surowicy jako przydatne narzędzie do przechowywania próbek w celu oceny biomarkerów raka

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

Jakość próbki krwi jest kluczowa dla zapewnienia dokładnych analiz, takich jak PCR w czasie rzeczywistym lub ELISA. Prawidłowe przechowywanie materiałów biologicznych jest punktem wyjścia do osiągnięcia powtarzalnych i wiarygodnych wyników. Wszystkie próbki powinny być traktowane w ten sam sposób od pobrania krwi do przechowywania. W zależności od analiz, które mają być wykonane, próbki krwi pełnej i surowicy powinny być przechowywane w temperaturze -20 °C lub -80 °C do czasu użycia. Próbki krwi/surowicy powinny być również porcjowane, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. Kolejną ważną kwestią są warunki pobierania próbek podczas transportu z jednego laboratorium do drugiego. Jeśli suchy lód nie jest dostępny lub wysyłka trwa dłużej niż kilka dni, potrzebne są alternatywne podejścia. Jedną z opcji jest użycie bibuły filtracyjnej do pobierania krwi. W tym miejscu proponujemy metodę pobierania próbek krwi i surowicy, która wykorzystuje suche plamki krwi (DBS) i wysuszone plamy surowicy (DSS). Opracowaliśmy procedurę ekstrakcji DNA z DBS w celu dalszej oceny niektórych polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Zoptymalizowaliśmy również test ELISA, zaczynając od białek eluowanych z DSS. Metoda ta może być stosowana z innymi testami ELISA lub procedurami oceniającymi białka.

Wykorzystaliśmy procedury DBS i DSS do przechowywania krwi i surowicy w temperaturze pokojowej bez wpływu na jakość materiału biologicznego. Rysunek 1 przedstawia przykład karty do konserwacji białek przed i po pobraniu krwi. Aby potwierdzić, że przechowywanie na papierze filtracyjnym oraz procedura elucji krwi nie wpływają na jakość próbek, przeprowadzono porównanie ze standardowymi metodami przechowywania. Wyizolowano DNA z 3 dopasowanych próbek krwi pełnej...

Ten protokół opisuje prostą i użyteczną metodę przechowywania krwi obwodowej i surowicy/osocza do dalszych analiz, takich jak ocena polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) i test ELISA.

Wysuszone plamy krwi i surowicy jako przydatne narzędzie do przechowywania próbek w celu oceny biomarkerów raka

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach translacyjnych, takie jak możliwość badania biomarkerów u pacjentów z krajów rozwijających się. Główną zaletą tej techniki jest możliwość przechowywania próbek krwi i surowicy przez co najmniej dwa tygodnie bez zamrażania oraz zapewnienie wysokiej jakości materiału do dalszych analiz, takich jak qPCR i ELISA. Implikacje tej techniki rozciągają się na diagnostykę chorób, takich jak rak i choroby zakaźne.Metoda ta może być również stosowana w dziedzinach diagnostycznych lub badawczych, takich jak badanie chorób prenatalnych lub analiza patologii zakaźnej, takiej jak HIV. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zaczęliśmy porównywać biomarkery między seriami przypadków rasy kaukaskiej i afrykańskiej, dla których zamrożone próbki nie były dostępne. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy plamienia krwi są trudne do nauczenia.W tej procedurze trzy mililitry próbki krwi pobiera się do trzymililitrowej probówki z 5,4 miligramami EDTA. Wpisz numer kodu pacjenta w prawym dolnym rogu karty oszczędnościowej. Ostrożnie ponownie zawiesić krew za pomocą pięciomililitrowej pipety.Następnie odpipetuj i przenieś jeden punkt krwi na kartę oszczędnościową. Używając nowej końcówki dla każdej porcji krwi, powtórz plamienie, aby uzyskać w sumie od trzech do pięciu plamek krwi. Pozostaw wysuszone plamy krwi lub DBS do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej z otwartą pokrywą karty oszczędnościowej w pozycji poziomej na otwartej, niechłonnej powierzchni i unikając bezpośredniego światła słonecznego.Następnego dnia przechowuj kartę w temperaturze pokojowej w plastikowej torbie ze środkiem osuszającym do czasu użycia. DNA zostanie wyekstrahowane z trzech wysuszonych plam krwi z karty oszczędnościowej. Zacznij od wycięcia każdego z DBS z karty i oddzielenia ich od karty.Pokrój oddzielony DBS na małe kawałki o średnicy około jednego milimetra. Umieść małe kawałki z jednego DBS w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej. Aby roztrawić próbki, dodaj do probówki 180 mikrolitrów buforu do lizy jeden z dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji DNA, a następnie dodaj 20 mikrolitrów proteinazy K.Mix przez wirowanie.Umieścić probówkę w inkubatorze termicznym i inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 60 minut. Pod koniec inkubacji krótko odwirować probówkę, aby usunąć krople z pokrywki. Rozpocznij pranie, dodając 200 mikrolitrów buforu do lizy dwa i wirując przez 10 sekund.Umieść probówkę w termomikserze i inkubuj w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut. Umieść kolumnę eliuacyjną w nowej dwumililitrowej probówce zbiorczej i wyrzuć starą. Dodaj 500 mikrolitrów buforu do płukania i odwiruj pod ciśnieniem 6000 razy większym niż grawitacja przez jedną minutę.Umieść kolumnę w nowej dwumililitrowej probówce zbiorczej i wyrzuć starą. Dodaj 500 mikrolitrów buforu do płukania dwa i odwiruj przy 6000-krotności grawitacji przez jedną minutę. Umieść kolumnę w nowej dwumililitrowej probówce zbiorczej i wyrzuć starą.Wirować przy 20 000 razy grawitacji przez trzy minuty, aby wysuszyć membranę. Aby wymyć DNA, umieść kolumnę w nowej 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej i wyrzuć probówkę zbiorczą. Umieść 50 mikrolitrów wody destylowanej na środku membrany i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.Odwirować probówkę pod ciśnieniem 20 000 razy większym niż grawitacja przez jedną minutę. Zbierz elucję i ponownie umieść na środku membrany. Ponownie odwirować probówkę przy 20 000 razy większej grawitacji przez jedną minutę.Wyrzuć membranę. Po zmierzeniu stężenia DNA za pomocą spektrofotometru, przechowuj DNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia. W tej procedurze najpierw pobiera się siedem mililitrów próbki krwi obwodowej w siedmiomililitrowej probówce bez EDTA.Pozostaw próbkę krwi do koagulacji w temperaturze pokojowej na 30 minut. Wpisz numer kodu pacjenta w prawym dolnym rogu karty oszczędnościowej. Odwirować próbkę krwi w temperaturze 1100-krotności grawitacji w temperaturze pokojowej przez 15 minut.Usunąć supernatant z probówki i przenieść go do nowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Ostrożnie ponownie zawiesić krew za pomocą pięciomililitrowej pipety. Odpipetować i przenieść jeden punkt surowicy na kartę oszczędnościową.Powtórz plamienie, aby uzyskać w sumie od trzech do pięciu plam krwi. Pozostaw wysuszone plamy sero do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej z otwartą pokrywą karty oszczędnościowej. Następnego dnia przechowuj kartę w temperaturze pokojowej w plastikowej torbie ze środkiem osuszającym do czasu użycia.Jeśli przechowywanie jest dłuższe niż 14 dni, przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Przygotować się do testu ELISA, rozmrażając DSS dla każdej próbki, jeśli to konieczne. Aby wymyć białko z DSS, pokrój jeden DSS na małe kawałki o średnicy około jednego milimetra i umieść kawałki w probówce o pojemności 1,5 mililitra.Następnie dodaj cztery mikrolitry PBS. Wstrząsnąć próbkami z małą prędkością w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia należy użyć odpowiedniego rozcieńczenia eluowanego białka jako próbki surowicy do analizy wydzielanego białka lub czynnika wzrostu przy użyciu dostępnego w handlu zestawu.W tym protokole próbki krwi i surowicy przechowywano jako wysuszone plamy na bibule filtracyjnej w temperaturze pokojowej. Reprezentatywna karta oszczędzania białka jest pokazana przed i po pobraniu krwi. W celu potwierdzenia, że przechowywanie na bibule filtracyjnej i procedura elucji krwi nie wpływają na jakość próbki, testy ELISA na poziom białka wiążącego witaminę D lub DBP przeprowadzono na ośmiu próbkach surowicy zebranych w probówce o pojemności dwóch mililitrów i natychmiast przechowywanych w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza lub zebranych jako wysuszone plamki surowicy.Współczynnik zmienności (CV) między dopasowanymi próbkami wahał się od 2% do 24%, a średnia CV wynosiła 9,6%Po opanowaniu tej techniki można wykonać w 10, 15 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można przeprowadzić dalsze metody biologii molekularnej lub analizę białek. Po opracowaniu technika ta umożliwia prowadzenie badań w zakresie badań translacyjnych i analizy biomarkerów współpracę z instytutami z całego świata, które nie dysponują sprzętem laboratoryjnym do przechowywania próbek biologicznych w standardowych warunkach.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak prawidłowo przechowywać próbki krwi w wysuszonych plamach krwi i surowicy. Nie zapominaj, że praca z krwią i odczynnikami chemicznymi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartucha laboratoryjnego.

dried-blood-serum-spots-as-useful-tool-for-sample-storage-to-evaluate

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Biomarkery są bezpośrednio mierzonymi biologicznymi wskaźnikami choroby lub zdrowia. W naukach populacyjnych i społecznych biomarkery muszą być łatwe do uzyskania, transportu i analizy. Pobieranie suszonych plam krwi (DBS) spełnia tę potrzebę, może być zbierane w terenie z wysokimi wskaźnikami odpowiedzi i analizowane pod kątem różnych biomarkerów.

Pobieranie biomarkerów zdrowotnych z wysuszonej kropli krwi w celu maksymalizacji udziału w badaniach populacyjnych

Tutaj opisujemy test wysokiej wydajności chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (HPLC-MS/MS) do ilościowego oznaczania immunosupresyjnego takrolimusu w wysuszonych plamach krwi przy użyciu prostego ręcznego etapu wytrącania białka i ekstrakcji kolumnowej online.

Oznaczanie ilościowe takrolimusu działającego immunosupresyjnie na wysuszonych plamkach krwi za pomocą LC-MS/MS

Przygotowanie i przetwarzanie wysuszonych plam krwi (DBS) do ich końcowej analizy jest nadal słabo ustandaryzowane dla większości zastosowań diagnostycznych. Aby przezwyciężyć to niedociągnięcie, sugeruje się kompleksowy protokół krok po kroku, a następnie ocenia się go pod kątem jego skuteczności w wykrywaniu markerów infekcji wirusowych.

Suszone plamy krwi - przygotowanie i przetwarzanie do stosowania w testach immunologicznych i technikach molekularnych

Guzy skórne są często usuwane po operacji mikrograficznej Mohsa. Opisano tutaj protokół, który umożliwia personelowi pomocniczemu klinicznemu skuteczne przetwarzanie i przechowywanie próbek guzów skóry (np. raka płaskonabłonkowego, raka podstawnokomórkowego i czerniaka) do dalszych zastosowań laboratoryjnych bez zakłócania operacji klinicznych.

Utworzenie klinicznego repozytorium biologicznego

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania mutacji somatycznych nowotworu w krążącym DNA obecnym w płynach biologicznych pacjenta (biofluidach). Nasza metoda oparta na kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) umożliwia ilościowe określenie częstości alleli mutacji nowotworowych (MAF), ułatwiając minimalnie inwazyjne uzupełnienie diagnozy i czasowego monitorowania odpowiedzi guza.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

Biobanki są kluczowymi zasobami dla badań biomedycznych, a Biobank dla Jednostki Medycyny Translacyjnej i Cyfrowej w Europejskim Instytucie Onkologii jest wzorem w tej dziedzinie. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis standardowych procedur operacyjnych biobanków w zakresie zarządzania różnymi rodzajami próbek biologicznych pobranych od ludzi.

Biobank medycyny translacyjnej: Standardowe procedury operacyjne dla optymalnego zarządzania próbkami

Płynna biopsja zrewolucjonizowała nasze podejście do badań translacyjnych w onkologii, a pobieranie, jakość i przechowywanie próbek są kluczowymi krokami dla jej udanego zastosowania klinicznego. W tym miejscu opisujemy ustandaryzowany i zwalidowany protokół dla dalszych zastosowań DNA wolnych od krążenia, który może być stosowany w większości laboratoriów badań translacyjnych.

Standaryzowany protokół przedanalityczny do biopsji płynnej do dalszych zastosowań DNA wolnych od krążenia

Ten artykuł opisuje zastosowanie zautomatyzowanego sprzętu do łatwego i efektywnego oddzielania i zbierania substancji, takich jak bezkomórkowe DNA i krążące komórki nowotworowe, z krwi pełnej.

Automatyczne oddzielanie i pobieranie substancji nowotworowych z próbek klinicznych

Przedstawiono protokół do oznaczania biomarkerów o niskiej obfitości z wysuszonych próbek surowicy, czego przykładem jest biomarker peptydu uwalniającego progastrynę (ProGRP). Kulki magnetyczne pokryte przeciwciałami są używane do selektywnego oczyszczania i wzbogacania proteotypowego peptydu ProGRP. Wychwycony peptyd jest następnie analizowany za pomocą chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas.

Mikropróbkowanie w ukierunkowanej analizie białek o niskiej liczebności opartej na spektrometrii mas

Ten protokół opisuje metodę ułatwiającą pobieranie próbek z próbek po radykalnej prostatektomii. Celem jest zmapowanie, scharakteryzowanie i mikro-makro wypreparowanie próbek tkanek z próbek w oparciu o kryteria anatomopatologiczne przed przechowywaniem ich w biobanku.

Zwiększenie wiarygodności biobankowania guzów gruczołu krokowego dzięki ulepszonej technice pobierania próbek i charakterystyce histologicznej

Protokół ten standaryzuje analizę SDS-PAGE do spersonalizowanego profilowania korona białek na nanocząstkach, umożliwiając powtarzalne, skalowalne i niskokosztowe wykrywanie sygnatur specyficznych dla raka. Zaprojektowany do wczesnej diagnozy gruczolakoraka przewodowego trzustki, oferuje praktyczną, PEWNĄ alternatywę dla złożonych metod proteomicznych zarówno w badaniach, jak i klinicznych.

Standaryzowany przepływ SDS-PAGE do spersonalizowanego profilowania koronawirusowego białka we wczesnym wykrywaniu nowotworów

Poznaj metodę przechowywania krwi i surowicy jako wysuszonych plam do analizy biomarkerów raka bez zamrażania. Technika umożliwia badania qPCR i ELISA przez co najmniej dwa tygodnie.

Wysuszone plamy krwi i surowicy jako przydatne narzędzie do przechowywania próbek w celu oceny biomarkerów raka

Przeglądaj więcej filmów