Name: Mikropróbkowanie w ukierunkowanej analizie białek o niskiej liczebności opartej na spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Poznaj metodę mikropróbkowania w analizie białek o niskiej liczebności z użyciem magnetycznych kulek powlekanych przeciwciałami i spektrometrii mas LC-MS/MS. Protokół umożliwia wykrywanie biomarkerów z małych objętości próbek surowicy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bardzo dziękujemy prof. Elisabeth Paus z Norweskiego Szpitala Radowego (Szpital Uniwersytecki w Oslo, Oslo, Norwegia) za dostarczenie standardu ProGRP i przeciwciała monoklonalnego anty-ProGRP, M18. Honorarium za publikację zostało pokryte z grantu Apotekera Haralda Conrada Thaulowsa. Trine Grønhaug Halvorsen i Léon Reubsaet są partnerami w konsorcjum National Network of Advanced Proteomics Infrastructure (NAPI), które jest finansowane przez Norweską Radę ds. Badań Naukowych w ramach programu INFRASTRUKTUR (numer projektu: 295910).

Surowica od zdrowych dawców krwi została użyta do przygotowania roztworów wzorcowych. Stosowanie surowicy od zdrowych dawców krwi odbywało się w ścisłej zgodności z norweskim prawem. Uzyskano świadomą zgodę od wszystkich uczestników. Próbki surowicy analizowano metodami zgodnymi z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. Opisany protokół jest zmodyfikowaną wersją metody opisanej w poprzednim work14. Przegląd składu i roztworów oraz sposobu ich przygotowania znajduje się w tabeli uzupełniającej S1, natomiast tabela materiałów zawiera materiały, sprzęt i odczynniki stosowane w tym protokole.
1. Przygotowanie kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami
<ol>
	<li>Oblicz ilość przeciwciała niezbędną do przygotowania żądanej liczby koralików. Stosować 1 mg przeciwciała na 50 mg kulek magnetycznych. 
	UWAGA: Zazwyczaj w kolejnych doświadczeniach stosuje się 20 μl zawiesiny kulek o stężeniu 20 mg/ml na próbkę (patrz krok 5.1).</li>
	<li>Oblicz objętość przeciwciała niezbędną do przygotowania żądanej liczby kulek. 
	UWAGA: Objętość przeciwciała zależy od stężenia przeciwciał i należy ją obliczyć dla każdego przeciwciała.</li>
	<li>Przenieść żądaną objętość roztworu przeciwciała do probówki wirówkowej o pojemności 5 ml o niskiej zawartości wiązań białkowych. Na przykład, jeśli roztwór przeciwciała zawiera 1 mg/ml przeciwciała, użyj 0,4 ml do przygotowania 1,0 ml zawiesiny kulek (20 mg kulek/ml z 1 mg przeciwciała/50 mg kulek). 
	UWAGA: Przeciwciała powinny znajdować się w buforze wolnym od amin. Do wszystkich roztworów zawierających białka należy używać probówek wirówkowych o niskiej wiązalności białek, aby uniknąć utraty analitu w wyniku adsorpcji.</li>
	<li>Dodaj małe mieszadło magnetyczne do roztworu przeciwciała i dostosuj pH do 2,5 przy ciągłym mieszaniu. Użyj pH-metru z mikroelektrodą, aby zmierzyć pH i dostosować pH poprzez stopniowe dodawanie określonych objętości 1,0 M HCl (zacznij od dodania 10 μl porcji 1,0 M HCl i zmniejszaj objętość, gdy pH zbliża się do 2,5). Zanotować całkowitą objętość 1,0 M HCl niezbędną do dostosowania pH do 2,5.</li>
	<li>Wyjąć mikroelektrodę i inkubować zakwaszone przeciwciało na lodzie na mieszadle magnetycznym przez 1 h. 
	UWAGA: Kwasowe traktowanie przeciwciała przeprowadza się w celu promowania prawidłowej orientacji przeciwciał na kulce. Stężenie HCl można zmniejszyć do 0,5 M lub 0,2 M HCl, w zależności od stężenia buforu w roztworze przeciwciała.</li>
	<li>Zneutralizować roztwór przeciwciała. Użyj pH-metru z mikroelektrodą do pomiaru pH i dostosuj pH do 7 poprzez stopniowe dodawanie określonych objętości 1,0 M NaOH (zacznij od porcji 10 μl i zmniejszaj objętość, gdy pH zbliża się do 7). Zapisać całkowitą objętość 1,0 M Dodanego NaOH. 
	UWAGA: Stężenie NaOH powinno być takie samo jak stężenie HCl użyte w kroku 1.4. NaOH jest silnie; Używaj sprzętu ochronnego, w tym rękawic i odpowiedniej ochrony oczu.</li>
	<li>Oblicz żądaną objętość kulek magnetycznych aktywowanych tozylem, które należy zastosować. 
	UWAGA: Zazwyczaj zaleca się stosowanie kulek 20 mg/ml podczas łączenia na małą skalę. Należy użyć co najmniej 5 mg kulek.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj zawiesinę kulek magnetycznych na mieszalniku wirowym i pobierz objętość zawierającą żądaną ilość zawiesiny kulek. Na przykład, aby przygotować 1 ml zawiesiny kulek, należy pobrać objętość zawierającą 20 mg kulek (667 μl, jeśli stężenie kulek wynosi 30 mg/ml).</li>
	<li>Umieść zawiesinę ściegu na stojaku magnetycznym na 1 minutę i usuń supernatant. Umyj kulki 2x równą objętością Typ1 H2O (667 μL, jeśli stosuje się roztwór kulek o stężeniu 30 mg/ml do przygotowania 1 ml kulek pokrytych przeciwciałami o stężeniu 20 mg/ml). Wymieszać za pomocą mieszadła wirowego po każdym dodaniu roztworu myjącego i umieścić na ruszcie magnetycznym na 1 minutę przed usunięciem supernatantu.</li>
	<li>Do kulek magnetycznych dodać następujące elementy: przeciwciało poddane działaniu kwasu, 0,5 M buforu boranowego (pH 9,5) (1/5 całkowitej objętości, ponieważ końcowe stężenie powinno wynosić 0,1 M; odpowiada to 0,2 ml w celu przygotowania 1 ml zawiesiny kulek) i bufor sprzęgający do sprzężenia przeciwciał (aby przygotować 1 ml kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałem, objętość buforu sprzęgającego powinna być równa 1 ml - objętość przeciwciała poddanego działaniu kwasu - 0,2 ml buforu boranowego). Wymieszać za pomocą mieszalnika wirowego. 
	UWAGA: Objętość przeciwciała potraktowanego kwasem jest równa objętości roztworu przeciwciała (0,4 ml w przygotowaniu 1 ml zawiesiny kulek przy użyciu 1 mg/ml roztworu przeciwciała) + objętość 1,0 M HCl użytej do dostosowania pH do 2,5 + objętość 1,0 M NaOH użytej do dostosowania pH do 7). 
	UWAGA: Skład 0,5 M buforu boranowego (pH 9,5) i buforu sprzęgającego do sprzęgania przeciwciał można znaleźć w tabeli uzupełniającej S1.</li>
	<li>Obracać w temperaturze otoczenia przez noc za pomocą mieszalnika próbek typu end-over-end, najlepiej z obrotem posuwisto-zwrotnym i wibracjami.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut w temperaturze 239 × g. Umieść rurkę na magnesie na 2 minuty i usuń supernatant.</li>
	<li>Przemyć kulki 2 x 2 godziny i raz na noc, obracając je w buforze do przechowywania kulek przeciwciał w temperaturze otoczenia za pomocą mieszalnika do próbek typu "koniec po końcu". Użyj tego samego woluminu, co całkowity wolumin w kroku 1.10. Umieść probówkę na magnesie na 1 minutę i usuń supernatant między każdym praniem. 
	UWAGA: Skład buforu do przechowywania kulek przeciwciał znajduje się w tabeli uzupełniającej S1.</li>
	<li>Przechowywać w żądanym buforze (np. tym samym buforze, co w kroku 1.13), używając żądanego stężenia kulek (zwykle 20 mg/ml). Przechowywać w lodówce.</li>
</ol>
2. Przygotowanie 2 ml kulek immobilizowanych trypsyną (20 mg/mL kulek)
<ol>
	<li>Dodaj 20 ml 1 mM HCl do 2 ml kulek agarozy aktywowanych przez NHS, aby umyć kulki.</li>
	<li>Mieszać i odwirowywać w stężeniu 2,655 × g przez 5 minut. Usunąć supernatant.</li>
	<li>Dodać 20 ml 0,1 M buforu fosforanowego (pH 7,8). Mieszać za pomocą mieszalnika wirowego i odwirowywać w ilości 2 655 × g przez 5 minut. Usunąć supernatant. 
	UWAGA: Skład 0,1 M buforu fosforanowego (pH 7,8) można znaleźć w tabeli uzupełniającej S1.</li>
	<li>Dodać 2 ml 20 mg/ml trypsyny (rozpuszczonej w zimnym buforze sprzęgającym do sprzęgania trypsyny). 
	UWAGA: Skład bufora sprzęgającego do sprzęgania trypsyny można znaleźć w tabeli uzupełniającej S1. Przechowuj bufor w lodówce.</li>
	<li>Inkubować przez 25 minut w temperaturze 22 °C i prędkości 1 100 obr./min przy użyciu mieszalnika o kontrolowanej temperaturze. Wirować przy 2 655 × g przez 5 min. Usunąć supernatant.</li>
	<li>Dodać 2 ml buforu modyfikującego do przygotowania kulek trypsyny i inkubować przez 20 minut w temperaturze 22 °C i 1 100 obr./min przy użyciu mieszalnika o kontrolowanej temperaturze. Wirować przy 2 655 × g przez 5 min. Usunąć supernatant. 
	UWAGA: Skład buforu modyfikującego do otrzymywania kulek trypsyny znajduje się w tabeli uzupełniającej S1. Przechowuj bufor w lodówce.</li>
	<li>Dodać 10 ml buforu blokującego do przygotowania kulek trypsyny i inkubować przez 10 minut w temperaturze 22 °C i 1 100 obr./min przy użyciu mieszalnika o kontrolowanej temperaturze. Wirować przy 2 655 × g przez 5 min. Usunąć supernatant. 
	UWAGA: Skład buforu blokującego do przygotowania kulek trypsyny znajduje się w tabeli uzupełniającej S1. Przechowuj bufor w lodówce.</li>
	<li>Dodaj 2 ml bufora do przechowywania, wymieszaj za pomocą miksera wirowego i przechowuj w lodówce do czasu użycia. 
	UWAGA: Skład bufora do przechowywania kulek trypsyny można znaleźć w tabeli uzupełniającej S1. Przechowuj bufor w lodówce.</li>
</ol>
3. Pobieranie próbek DSS/VAMS i późniejsza ekstrakcja wysuszonej surowicy
<ol>
	<li>Przygotuj wzorce, dodając do surowicy ProGRP (lub interesujące Cię białko) na odpowiednim poziomie. Utrzymuj objętość skoku ≤ 1% całkowitej objętości. 
	UWAGA: W tym przypadku do przygotowania wzorców surowicy z dodatkiem wzbogaconych użyto roztworu podstawowego 295 μg/ml ProGRP w wodzie.</li>
	<li>Wymieszaj standardy na mieszalniku wirowym.</li>
	<li>Nanieść 10 μl surowicy (wzorce z dodatkami) na karty DBS lub pozwolić na zebranie 10 μl surowicy za pomocą VAMS (10 μL) zgodnie z wytycznymi producenta. W przypadku DSS upewnij się, że miejsce znajduje się w przerywanym okręgu.</li>
	<li>Pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze otoczenia przez co najmniej 2 godziny.</li>
	<li>Wyciąć całe miejsce i przenieść je do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml o niskiej zawartości wiązania białek lub wyjąć VAMS z uchwytu i umieścić je w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml o niskiej zawartości białka wiążącej białka.</li>
	<li>Dodać 1 000 μl 100 mM roztworu wodorowęglanu amonu (ABC). Ekstrahować wysuszoną surowicę z miejsca/VAMS przez 1 godzinę w temperaturze 22 °C za pomocą mieszalnika o regulowanej temperaturze przy 1 000 obr./min.</li>
	<li>Przenieś ekstrakt do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml o niskiej zawartości wiązań białkowych w celu proteolizy tryptycznej.</li>
</ol>
4. Trawienie ekstraktów DSS/VAMS
<ol>
	<li>Na próbkę należy użyć 30 μl kulek trypsyny (przygotowanych w sekcji 2). Przenieść objętość zawierającą kulki trypsyny dla wszystkich próbek do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml o niskiej zawartości wiązania białek, odwirować przy 2,655 × g przez 5 minut i usunąć supernatant.</li>
	<li>Przemyj kulki trypsyny 2x 1 ml zimnego 50 mM ABC, a następnie ponownie wymieszaj w tej samej objętości, która została odpipetowana. Odwirować przy 2,655 × g przez 5 minut i usunąć supernatant między etapami.</li>
	<li>Dodaj 30 μl umytych kulek trypsyny do każdego ekstraktu DSS/VAMS, aby zainicjować trawienie.</li>
	<li>Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i prędkości obrotowej 1 000 obr./min przy użyciu mieszalnika o kontrolowanej temperaturze lub podobnego urządzenia. Odwirować przy 2,655 × g przez 5 minut i przenieść supernatant (nie kulki) do nowej probówki wirówkowej o pojemności 2,0 ml o niskiej zawartości wiązań białkowych.</li>
	<li>Dodać 25 μl roztworu wzorca wewnętrznego (IS) o stężeniu 14 ng/ml zawierającego peptyd ALGNQQPSWDSEDSSSNF[K_13C6_15N2] w 100 mM roztworze ABC.</li>
</ol>
5. Wychwyt proteotypowego peptydu ProGRP za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami
<ol>
	<li>Użyć 20 μl kulek pokrytych przeciwciałem (20 mg/ml, jak przygotowano w sekcji 1) na ekstrakcję. Przenieś wszystkie kulki pokryte przeciwciałami do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml o niskiej zawartości wiązania białek, umieść na magnesie na 1 minutę i wyjmij bufor do przechowywania.</li>
	<li>Przemyć kulki pokryte przeciwciałami magnetycznymi 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) o pH 7,4 i 2 x 1 ml PBS przed ponownym wymieszaniem w tej samej objętości, która została odpipetowana. Wymieszać na mieszalniku wirowym i umieścić na magnesie na 1 minutę między wymianami. 
	UWAGA: PBS zawiera 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 i 1,8 mM KH2PO4. Zaleca się przygotowanie roztworu o stężeniu 10x w celu zwiększenia stabilności. Skład 100 ml 10x PBS znajduje się w tabeli uzupełniającej S1. Rozcieńczenie 10x PBS 10x pozwoli osiągnąć pH ~7,4.</li>
	<li>Dodać 20 μl przemytej zawiesiny kulek magnetycznych do każdej probówki mikrowirówki o niskiej zawartości wiązania białek, zawierającej strawiony ekstrakt DSS/VAMS i IS. Przeprowadzać immunoekstrakcję przez 1 godzinę przy użyciu mieszalnika próbek typu end-over-end w temperaturze otoczenia.</li>
	<li>Umyj kulki magnetyczne za pomocą następujących roztworów: 500 μL PBS z 0,05% (v/v) polisorbatem 20, 400 μL PBS, 300 μL 10 mM Tris HCl (pH 7,4) i 300 μL 100 mM ABC.
	<ol>
		<li>Po dodaniu każdego roztworu do mycia wyjąć rurkę wirówkową z kulkami i roztworem myjącym o niskiej zawartości białek ze stojaka magnetycznego i ostrożnie odwrócić, aż do uzyskania jednorodności. Następnie umieść probówkę mikrowirówkową o niskiej zawartości wiązania białek na magnesie na 30 s, odwróć na 30 s i umieść na magnesie na 1 min. Usuń roztwór myjący.</li>
		<li>Pozostałą zawiesinę odwirować za pomocą mikrowirówki. Umieść na magnesie na 1 minutę i usuń pozostały roztwór myjący.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 15 μl 2% (v/v) kwasu mrówkowego w typie 1 H2O do każdej próbki i inkubować przez 5 minut w temperaturze 22 °C i 1 000 obr./min przy użyciu mieszalnika o kontrolowanej temperaturze lub podobnego, w celu wymycia wychwyconych peptydów. Umieść na magnesie na 1 minutę i przenieś eluat do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml o niskiej zawartości wiązań białkowych. Powtórzyć raz i przenieść drugi eluat do tej samej probówki mikrowirówkowej o niskiej wiązalności białek, co pierwszy eluat.</li>
	<li>Dodać 20 μl 100 mM ABC do każdego eluatu (całkowita objętość 50 μl).</li>
	<li>Odwirować (mikrowirówkę) i przenieść 40 μl eluatu do mikrowkładek do fiolek z wysokosprawną chromatografią cieczową (HPLC).</li>
</ol>
6. Analiza przez LC-MS/MS
<ol>
	<li>Użyj mikro LC potrójny kwadrupol MS z jonizacją elektrorozpylającą, aby uzyskać wysoką wytrzymałość.</li>
	<li>Przygotować system LC-MS/MS do analizy, przepłukując pompy fazą ruchomą A (20 mM FA wH2Oi MeCN, 95:5 v/v) i B (20 mM FA wH2Oi MeCN, 5:95 v/v).</li>
	<li>Włożyć kolumnę analityczną (C18, średnica wewnętrzna 50 mm x 1 mm [ID], cząstki 3 μm).</li>
	<li>Należy kontynuować przygotowanie instrumentu do analizy, postępując zgodnie z procedurami uruchamiania dla danego instrumentu.</li>
	<li>W oprogramowaniu przyrządu ustaw temperaturę pieca kolumnowego na 25 °C, a natężenie przepływu na 50 μl/min (100% ruchoma faza A).</li>
	<li>Równoważyć kolumnę z fazą ruchomą A przez co najmniej 15 minut.</li>
	<li>Umieść próbki w automatycznym podajniku próbek.</li>
	<li>Przygotuj metodę instrumentu do analizy specyficznego dla ProGRP, tryptycznego peptydu ALGNQQPSWDSEDSSSNFK i jego IS. 
	UWAGA: Kilka parametrów metody jest specyficznych dla danego instrumentu i należy je zoptymalizować pod kątem konkretnego używanego instrumentu. Szczegółowe informacje na temat parametrów metody zastosowanych w tym miejscu opisano w krokach od 6.9 do 6.11.</li>
	<li>Dla programu gradientu w LC należy użyć następujących ustawień: natężenie przepływu: 50 μl/min; od czasu 0,0 do 3,0 min: 100% ruchoma faza A; od czasu 3,0 do 18,0 min: uruchomić gradient liniowy od 0% do 50% ruchomej fazy B; od czasu 18,0 do 18,1 min: zwiększyć ruchomą fazę B z 50% do 100%; od czasu 18,1 do 20,0 min: W 100% mobilna faza B; od czasu 20,0 do 20,1 min: zmniejsz ruchomą fazę B ze 100% do 0%; od czasu 20,1 do 30 min: 100% ruchoma faza A w celu ponownego wyrównania kolumny (użyj co najmniej 10 objętości kolumny).</li>
	<li>W przypadku ustawień MS/MS uruchom MS/MS w trybie dodatnim, korzystając z ustawień urządzenia, które zapewniają wydajną jonizację. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, należy użyć napięcia rozpylania +4 000 V, temperatury podgrzanej kapilary 270 °C, azotu jako gazu arkuszowego (5 dowolnych jednostek) i argonu (2 mTorr) do fragmentacji dysocjacji wywołanej zderzeniem (CID). Jeśli przyrząd na to pozwala, skieruj przepływ LC tak, aby zmarnować pierwsze 2 minuty (0-2 min) i ostatnią 1 minutę (29-30 minut) przebiegu, zamiast do MS.</li>
	<li>Użyj wybranych przejść monitorowania reakcji (SRM) dla (A) peptydu sygnatury (ALGNQQPSWDSEDSSSNFK): 1 005,45→913,3, 1 005,45→1 028,3 i 1 005,45→1 398,5 oraz (B) peptydu IS SIL (ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6_15N2]): 1 009,45→921,3, 1 009,45→1 036,3 i 1 009,45→1 406,5. Użyj zoptymalizowanej energii zderzenia (35 V w tym protokole) dla wszystkich monitorowanych przejść.</li>
	<li>Przygotuj sekwencję zawierającą próbki do uruchomienia za pomocą oprogramowania dostępnego dla systemu LC-MS/MS. Ustawić objętość wtrysku na 10 μl. 
	UWAGA: W razie potrzeby należy dodać puste próbki i próbki kontroli jakości.</li>
	<li>Naciśnij "Uruchom sekwencję" w oprogramowaniu instrumentu, aby rozpocząć sekwencję.</li>
	<li>Monitoruj obszar piku wychwyconego przez powinowactwo, specyficznego dla ProGRP, peptydu tryptycznego ALGNQQPSWDSEDSSSNFK i jego peptydu IS SIL. 
	UWAGA: Wybór i potwierdzenie peptydu sygnatury, ALGNQQPSWDSEDSSNFK, jest opisane w innym miejscu14.</li>
</ol>

<ol><li>Bang, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fresenius%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+analytische+Chemie%22%5BJournal%5D)">Fresenius.</a> Zeitschrift für analytische Chemie. 52 (7), 521-523 (1913).</li>
<li>Guthrie, R., Susi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+phenylalanine+method+for+detecting+phenylketonuria+in+large+populations+of+newborn+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">A simple phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants.</a> Pediatrics. 32 (3), 338-343 (1963).</li>
<li>Laurell, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screening+test+for+%CE%B11-antitrypsin+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Clinical+and+Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">A screening test for α1-antitrypsin deficiency.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 29 (3), 247-248 (1972).</li>
<li>Thielmann, K., Aquino, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+blood+samples+dried+and+stored+on+filter+paper+as+substrate+for+the+electrophoretic+separation+on+hemoglobin+S+from+hemoglobin+A.+A+screening+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Whole blood samples dried and stored on filter paper as substrate for the electrophoretic separation on hemoglobin S from hemoglobin A. A screening procedure.</a> Clinica Chimica Acta. 35 (1), 237-238 (1971).</li>
<li>Wada, Y., Fujita, T., Kidoguchi, K., Hayashi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+hemoglobin+variants+in+80%2C000+Japanese+neonates%3A+High+prevalence+of+Hb+F+Yamaguchi+%28A%CE%B3T+80+Asp%E2%86%92Asn%29%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Fetal hemoglobin variants in 80,000 Japanese neonates: High prevalence of Hb F Yamaguchi (AγT 80 Asp→Asn).</a> Human Genetics. 72 (3), 196-202 (1986).</li>
<li>Halvorsen, T. G., McKitterick, N., Kish, M., Reubsaet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+capture+in+bottom-up+protein+analysis-overview+of+current+status+of+proteolytic+peptide+capture+using+antibodies+and+molecularly+imprinted+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Affinity capture in bottom-up protein analysis-overview of current status of proteolytic peptide capture using antibodies and molecularly imprinted polymers.</a> Analytica Chimica Acta. 1182, 338714(2021).</li>
<li>Halvorsen, T. G., Reubsaet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+based+affinity+capture+LC-MS%2FMS+in+quantitative+determination+of+proteins+in+biological+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22TrAC+Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Antibody based affinity capture LC-MS/MS in quantitative determination of proteins in biological matrices.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 95, Supplement C 132-139 (2017).</li>
<li>Neubert, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+biomarker+quantification+by+immunoaffinity+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%3A+Current+state+and+future+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein biomarker quantification by immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Current state and future vision.</a> Clinical Chemistry. 66 (2), 282-301 (2020).</li>
<li>Pan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+based+targeted+protein+quantification%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry based targeted protein quantification: methods and applications.</a> Journal of Proteome Research. 8 (2), 787-797 (2008).</li>
<li>Enderle, Y., Foerster, K., Burhenne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+feasibility+of+dried+blood+spots%3A+Analytics%2C+validation%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Clinical feasibility of dried blood spots: Analytics, validation, and applications.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 130, 231-243 (2016).</li>
<li>Londhe, V., Rajadhyaksha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+obstacles+for+microsampling+techniques+in+bioanalysis%3A+Special+focus+on+DBS+and+VAMS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Opportunities and obstacles for microsampling techniques in bioanalysis: Special focus on DBS and VAMS.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 182, 113102(2020).</li>
<li>Denniff, P., Spooner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+hematocrit+on+assay+bias+when+using+dbs+samples+for+the+quantitative+bioanalysis+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">The effect of hematocrit on assay bias when using dbs samples for the quantitative bioanalysis of drugs.</a> Bioanalysis. 2 (8), 1385-1395 (2010).</li>
<li>Denniff, P., Spooner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+absorptive+microsampling%3A+A+dried+sample+collection+technique+for+quantitative+bioanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Volumetric absorptive microsampling: A dried sample collection technique for quantitative bioanalysis.</a> Analytical Chemistry. 86 (16), 8489-8495 (2014).</li>
<li>Levernæs, M. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocapture+sample+clean-up+in+determination+of+low+abundant+protein+biomarkers-a+feasibility+study+of+peptide+capture+by+anti-protein+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Immunocapture sample clean-up in determination of low abundant protein biomarkers-a feasibility study of peptide capture by anti-protein antibodies.</a> RSC Advances. 9 (60), 34902-34911 (2019).</li>
<li>Conradie, J. D., Govender, M., Visser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elisa+solid+phase%3A+Partial+denaturation+of+coating+antibody+yields+a+more+efficient+solid+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Elisa solid phase: Partial denaturation of coating antibody yields a more efficient solid phase.</a> Journal of Immunological Methods. 59 (3), 289-299 (1983).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Opisany protokół zawiera informacje o tym, jak przeprowadzić kilka ważnych etapów w analizie biomarkerów o niskiej liczebności z wysuszonych mikropróbek (DSS i VAMS), w tym przygotowanie kulek trypsyny i kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami. Opierając się na wcześniejszych doświadczeniach, zawsze traktujemy przeciwciało kwasem przed unieruchomieniem kulek, aby poprawić orientację przeciwciał15. 
Jednym z kluczowych etapów tej procedury jest wybór najbardziej odpowiedniego formatu mikropróbkowania. Po pierwsze, należy rozważyć, czy dany analit można oznaczyć z krwi pełnej, czy też na stężenie mają wpływ komórki krwi i należy je oznaczyć w surowicy lub osoczu (jak w przypadku analitu modelowego, ProGRP).
Zarówno podejście oparte na papierze, jak i polimerach ma swoje zalety i ograniczenia; w przypadku ProGRP VAMS zapewnia wyraźną przewagę w odniesieniu do odzysku analitu po ekstrakcji z próbnika. Można to jednak prawdopodobnie zoptymalizować przy użyciu innego roztworu ekstrakcyjnego dla próbek DSS. Niemniej jednak należy wziąć pod uwagę tę potencjalną interakcję między analitem a materiałem do pobierania próbek, ponieważ może ona skutkować zwiększoną zmiennością analityczną i wyższymi granicami wykrywalności. Ponieważ stosowany IS jest peptydem SIL i jest dodawany po raz pierwszy po mineralizacji, IS koryguje się o etapy następujące po mineralizacji (np. ekstrakcja powinowactwa i analiza LC-MS/MS). Korekcja IS nie jest możliwa w przypadku ekstrakcji z DSS/VAMS i etapu mineralizacji.
W zabiegu stosuje się dwa rodzaje kulek: kulki trypsynowe do trawienia po ekstrakcji próbki surowicy z próbnika oraz kulki magnetyczne pokryte przeciwciałami do wychwytywania peptydu proteotypowego po trawieniu. Głównym powodem stosowania kulek trypsyny, oprócz przyspieszenia trawienia, jest zminimalizowanie resztkowej aktywności trypsyny w próbce podczas wychwytywania powinowactwa. Jest to ważne, aby uniknąć tryptycznej proteolizy mAb podczas wychwytywania powinowactwa. 
Kulki agarozowe użyto do przygotowania kulek trypsyny, natomiast kulki magnetyczne użyto do przygotowania kulek pokrytych przeciwciałem. Koraliki agarozowe są tańsze niż kulki magnetyczne, ale mają ograniczenie polegające na tym, że oddzielenie kulek od roztworu wymaga odwirowania. To sprawia, że separacja kulek i supernatantu jest mniej wydajna niż w przypadku stosowania kulek magnetycznych. Ponadto automatyzacja przepływu pracy jest trudna przy użyciu koralików agarozowych. Dostępne są jednak kulki magnetyczne aktywowane przez NHS, które można wykorzystać do bardziej usprawnionego i zautomatyzowanego procesu przygotowywania próbek. 
Mikropobieranie próbek jest ważnym trendem w bioanalizie zarówno leków, jak i biomarkerów. Jednym z wyzwań związanych z obecnym podejściem jest ograniczona objętość próbki (10 μl), co może mieć szczególne znaczenie w oznaczaniu analitów o bardzo niskiej obfitości, takich jak ProGRP (pg/mL-niski poziom ng/ml). Wyzwanie to można jednak obejść za pomocą najnowocześniejszego sprzętu analitycznego. W przypadku tych analitów o niskiej liczebności wybór przygotowania próbki ma kluczowe znaczenie, a najczęściej konieczne jest selektywne oczyszczanie próbki poprzez wychwytywanie powinowactwa na podstawie przeciwciał. Ponieważ wykazano, że wychwytywanie peptydów zapewnia czystsze ekstrakty i niższe granice wykrywalności niż wychwytywanie białek (przy użyciu tego samego przeciwciała)14, niniejsza metoda koncentruje się na tym podejściu w połączeniu z mikropróbkowaniem. Kolejną zaletą podejścia opartego na wychwytywaniu peptydów jest to, że peptyd IS SIL koryguje również etap wychwytywania powinowactwa. 
W tej pracy do wychwytywania peptydów wykorzystano przeciwciało skierowane przeciwko białku. Jest to zaleta, ponieważ dostępność gotowych przeciwciał ukierunkowanych na białka jest wyższa niż gotowych przeciwciał skierowanych przeciwko peptydom proteotypowym. Jednak, aby przeciwciało antybiałkowe mogło skutecznie wychwycić peptyd proteotypowy, epitop musi być nienaruszony po strawieniu białka. Ponadto w przypadku wielu przeciwciał dokładny epitop nie jest znany, co sprawia, że poszukiwanie przeciwciała antybiałkowego jest żmudne. Ogranicza to liczbę dostępnych przeciwciał przeciwbiałkowych mających zastosowanie do wychwytywania peptydów. Opisaną procedurę demonstruje się przy użyciu surowicy jako matrycy i ProGRP jako docelowego analitu. Procedura ma być stosowana do innych matryc i innych docelowych analitów. Zamiast używać dostępnego na rynku przeciwciała antybiałkowego do wychwytywania powinowactwa peptydu proteotypowego, możliwe jest również użycie niestandardowych przeciwciał antypeptydowych. Skuteczność wychwytywania peptydów w porównaniu z wychwytywaniem białek przedstawiono na rysunku 5. Dzięki zamianie kulek agarozowych wykorzystywanych do przygotowania kulek trypsyny na kulki magnetyczne, procedura powinna być również kompatybilna z dostępnymi na rynku zrobotyzowanymi stanowiskami do przygotowywania próbek.

Mikropróbkowanie istnieje od ponad 100 lat, odkąd Ivar Bang opisał monitorowanie poziomu glukozy za pomocą DBS w 1913 roku1. Po tym, jak Guthrie i Susi wprowadzili DBS w 1963 roku do oznaczania fenyloalaniny u noworodków2, technika ta stała się coraz bardziej rozpowszechniona. Pierwsze doniesienia o DBS do pobierania próbek i przechowywania białek pojawiły się na początku lat siedemdziesiątych XX wieku3,4, a dekadę później, w latach 80., znaleźliśmy pierwszy raport ze spektrometrii mas (MS) do oznaczania białek z DBSs5. Pomimo tego wczesnego wprowadzenia, dopiero na przełomie wieków oznaczanie białek z DBS i inne techniki mikropróbkowania za pomocą stwardnienia rozsianego stały się bardziej rozpowszechnione.
W kontekście klinicznym, interesujące jest określenie białek w diagnozie i obserwacji chorób, jak również do monitorowania leczenia i celów dopingowych. To ukierunkowane oznaczanie analitów białkowych przez MS z małych ilości suszonych próbek jest nadal wyzwaniem i często wymaga intensywnego przygotowania próbki przed analizą.
Ukierunkowane ilościowe oznaczanie białek przez MS jest zwykle wykonywane poprzez zastosowanie podejścia oddolnego, trawiąc białka do peptydów przed analizą. Procedura ta wytwarza niezliczoną ilość peptydów, co sprawia, że bezpośrednia analiza strawionej próbki biologicznej jest wyzwaniem. Sposobem na obejście tego problemu jest zastosowanie selektywnego kroku oczyszczania powinowactwa przed analizą MS przed lub po trawieniu6,7,8. W ten sposób białko będące przedmiotem zainteresowania (lub jego peptyd proteotypowy, jeśli etap wychwytywania powinowactwa jest wykonywany po trawieniu) jest selektywnie izolowane z matrycy próbki przed analizą, co zapewnia niższe granice wykrywalności9.
Mikropróbkowanie za pomocą kart DBS ma pewne zalety w porównaniu z konwencjonalnymi próbkami krwi, w tym małą objętość próbki, mniej inwazyjne pobieranie próbek i zwiększoną stabilność przechowywania. Jednak matryca próbki jest inna i może wprowadzać inne wyzwania w analizie (np. sucha i płynna matryca próbki oraz krew włośniczkowa a surowica lub osocze)10,11. Innym wyzwaniem, które obserwuje się w przypadku DBS, jest tak zwany efekt hematokrytu, w którym hematokryt krwi wpływa na objętość próbki dalej przetwarzanej do analizy, a tym samym wprowadza zmienność międzyosobniczą w analizie12. Nowsze urządzenia do mikropróbkowania, takie jak VAMS wprowadzone w 2014 roku13, rozwiązują ten problem, pobierając stałą objętość krwi zamiast kropli krwi.
Ten protokół opisuje konfigurację do analizy biomarkerów o niskiej obfitości z suszonych mikropróbek. Po elucji wysuszona próbka jest trawiona, a następnie peptyd protetypowy jest izolowany przez wychwytywanie powinowactwa peptydowego. Analitem modelowym jest biomarker SCLC ProGRP. Ponieważ ProGRP nie można wiarygodnie oznaczyć z krwi pełnej, jako matrycę próbki użyto surowicy. Przedstawiono reprezentatywne wyniki zarówno dla DSS, jak i próbek surowicy pobranych za pomocą VAMS.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy N-hydroksysukcynimid</td><td>estr Carbosynt (Staad, Szwajcaria)</td><td>FA33719</td><td>Przechowywać w zamrażarce w temperaturze poniżej -20 stopni; C</td></tr><tr><td>ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6 _15N2] (&ge; 95%)</td><td>Innovagen (Lund, Szwecja)</td><td>Nie dotyczy</td><td>Przechowywać w zamrażarce w temperaturze poniżej -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu BioUltra (&ge; 99,5%) )</td> <td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td> <td>09830-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna Aquasil C18, 3 i mikro; m, 50 mm x 1 mm</td><td>Thermo scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>77503-051030</td><td>Kolumna analityczna kompatybilna ze 100% wodną fazą ruchomą</td></tr><tr><td>Benzamidyna (&ge; 95.0% )</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>12072</td><td>Przechowywać w lodówce w temperaturze 2-6 stopni Celsjusza; C</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny&nbsp; (&g; 99% )</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5804</td><td>Eppendorf (Hamburg, Tyskland)</td><td>5804000010</td><td></td></tr><tr><td>Sklonowana izoforma ProGRP 1</td><td>Szpital radowy, Szpital Uniwersytecki w Oslo (Oslo, Norwegia)</td><td>Nie dotyczy</td><td>Przechowywać w zamrażarce poniżej -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Wodorofosforan disodowy dwuwodny (analiza pro)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>30435-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dwunastowodny wodorofosforan disodowy (pro analiza)&nbsp;</td><td>Merck (Darmstadt, Tyskland)</td><td>1.06579.0500</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 tosylaktywowany 10 ml</td><td>Invitrogen (Carlsbad, USA)</td><td>14204</td><td>Przechowywać w lodówce w temperaturze 2-6 stopni; C</td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Invitrogen (Carlsbad, USA)</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>Etanoloamina (pro analiza, &ge; 99%)</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>#02400</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy (&ge; 99% ) dla LC-MS</td><td>VWR International (Radnor, PA, USA)</td><td>84865.260</td><td></td></tr><tr><td>Karta celulozowa FTA DMPK-C</td><td>Whatman (Kent, Wielka Brytania)</td><td>WB129243</td><td>Karta</td></tr> <tr><td>DBSFiolki HPLC, przezroczyste szkło, 1,5 mL, 32 x 11,6 mm, Clean Pack</td><td>Nerliens Meszansky (Oslo, Norge)</td><td>LPP 11 09 0519</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik próbek Hulamixer</td><td>Invitrogen (Carlsbad, USA)</td><td>101561503016</td><td>Mieszalnik próbek z mieszaniem end-over-end oraz odwrotnym obrotem i wibracjami</td></tr><tr><td>Surowica ludzka od zdrowych dawców krwi</td><td>Bank, Ullev&aring; l, Szpital Uniwersytecki w Oslo (Oslo, Norwegia)</td><td>Nie dotyczy</td><td>Przechowywać w zamrażarce poniżej -20 stopni C</td></tr><tr><td>Dymiący kwas solny 37% (Emsure do analizy)</td><td>Merck (Darmstadt, Tyskland)</td><td>1.00317.1000</td><td></td></tr><tr><td>System LC-MS/MS: System Ultimate 3000 (Autosampler, WPS-3000TRS; Mikropompa LPG-3400M; Menedżer przepływu, FLM-3300, MIC, 1X2P-10P) i TSQ Quantum dostęp. Kontrolowany przez Xcalibur 2.2 SP1.48</td><td>Thermo scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>LiChrosolv Acetonitryl hypergrade for LC-MS</td><td>Merck (Darmstadt, Tyskland)</td><td>1.00029.2500</td><td></td></tr><tr><td>LL Biotrode, Kombinowana elektroda szklana</td><td>Metrohm (Herisau, Sveits)</td><td>6.0224.100</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne, typ M10</td><td>Franz Morat KG (Eisenbach, Niemcy)</td><td>10236</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowkładki, szkło (31 x 6 mm, 0,1 ml)</td><td>VWR International (Radnor, PA, USA)</td><td>548-0006</td><td></td></tr><tr><td>Całka MilliQ 3 z Q-POD</td><td>Merck Millipore (Molsheim, Francja)</td><td>ZRXQ003T0</td><td>Do produkcji</td></tr><tr><td>wodnego przeciwciała monoklonalnego typu 1 M18</td><td>Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Norwegia)</td><td>Nie dotyczy</td><td>Przechowywać w lodówce w temperaturze 2-6 & C</td></tr><tr><td>Mikropróbnik Neoteryx Mitra (10 &mu; L) 4 próbniki</td><td>Clamshell Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>NC1382947</td><td></td></tr><tr><td>kulki sefarozy aktywowane przez NHS 4 szybkie przepływy</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>GE17-0906-01</td><td>Koraliki agarozowe, przechowywać w lodówce w temperaturze 2-6 stopni; C</td></tr><tr><td>Optifit, Końcówki do pipet do napełniania, 10 ml</td><td>Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)</td><td>613-2911</td><td></td></tr><tr><td>- Optifit, Końcówki do pipet do napełniania, 10 &mu; L</td><td>Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)</td><td>790012</td><td></td></tr><tr><td>Optifit, Końcówki do pipet uzupełniających, 1,000 &mu; L</td><td>Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)</td><td>791002</td><td></td></tr><tr><td>- Optifit, Końcówki do pipet uzupełniających, 200 &mu; L</td><td>Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)</td><td>790202</td><td></td></tr><tr><td>szklana elektroda pH</td><td>Metrohm (Herisau, Sveits)</td><td>6.0233.100</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr 744</td><td>Metrohm (Herisau, Sveits)</td><td>8.744.1003</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 10 mL</td><td>Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)</td><td>725090</td><td></td></tr><tr><td>Pipet m10 &micro; L&nbsp;</td><td>Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)</td><td>725020</td><td></td></tr><tr><td>Pipet m100 &micro; L</td><td>Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)</td><td>725050</td><td></td></tr><tr><td>Pipet m1,000 &micro; L</td><td>Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)</td><td>725070</td><td></td></tr><tr><td>Pipet m20 &micro; L</td><td>Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)</td><td>725030</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl &ge; 99,9%)</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>P-3911</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu (pro analiza)</td><td>Merck (Darmstadt, Tyskland)</td><td>1.04873.0250</td><td></td></tr><tr><td>Białko LoBind Eppendorf probówka 0,5 mL</td><td>Eppendorf (Hamburg, Tyskland)</td><td>525-0133 (0030 108.094)</td><td></td></tr><tr><td>Białko LoBind Eppendorf tubka 1,5 ml</td><td>Eppendorf (Hamburg, Tyskland)</td><td>525-0132 (0030 108.116)</td><td></td></tr><tr><td>Białko LoBind Eppendorf tubka 2,0 ml</td><td>Eppendorf (Hamburg, Tyskland)</td><td>525-0134 (0030 108.450)</td><td></td></tr><tr><td>Białko LoBind Eppendorf tubka 5,0 ml</td><td>Eppendorf (Hamburg, Tyskland)</td><td>525-0792 (0030108.302)</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>Z186716-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu (BioUltra; &ge; 99,5% )</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>71289-5G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (do analizy)</td><td>Merck (Darmstadt, Tyskland)</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan sodu jednowodny (pro analiza)</td><td>Merck (Darmstadt, Tyskland)</td><td>1.06346.0500</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (AnalaR NORMAPUR)</td><td>VWR International (Radnor, PA, USA)</td><td>28244.295</td><td></td></tr><tr><td>Dekahydrat tetraboranu sodu (&ge; 99. %)</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>S9640-500G S9640-500G</td><td></td></tr><tr><td>Miniwirówka spektraugowa</td><td>LABNET International (Edison, NJ, USA)</td><td>C1301</td><td></td></tr><tr><td>Magnes mieszający, 25 mm x 6 mm &Oslash;, okrągły</td><td>Leybold (Kolonia, Niemcy)</td><td>666&nbsp; 851</td><td></td></tr><tr><td>Stuart&nbsp; Scientific SA8 Vortex</td><td>Mixer Stuart (Staffordshire, Wielka Brytania)</td><td>Z648531-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe SuperClear (15 mL)</td><td>VWR International (Radnor, PA, USA)</td><td>525-0150</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe SuperClear (50 mL)</td><td>VWR International (Radnor, PA, USA)</td><td>525-0155</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer comfort 1,5 ml</td><td>Eppendorf (Hamburg, Tyskland)</td><td>53,55,27,831</td><td>Mieszalnik z kontrolowaną temperaturą</td></tr><tr><td>Baza trizma (klasa odczynnika, &ge; 99,0 %)</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>T6066</td><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan (tris)&nbsp;</td></tr><tr><td>Trizma HCl (klasa odczynnika, &ge; 99,0%)</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>T3253-100G</td><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan HCl (tris HCl)</td></tr><tr><td>Trypsyna (traktowana TCPK z trzustki bydlęcej, 10 000-15 000 jednostek BAEE / mg białka)</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>T8802</td><td>Przechowywać w zamrażarce poniżej -20 & stopni; C</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>P7949-500ML</td><td>polisorbat 20</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>TEM-78511-27</td><td></td></tr><tr><td>Nasadki na fiolki, białe, 9 mm</td><td>Nerliens Meszańki (Oslo, Norge)</td><td>LPP 09 15 0981</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosampler Mitra z technologią VAMS (wolumetryczne mikropróbkowanie adsorpcyjne), 10 i mikro; L, 4-próbnik z klapką</td><td>Neoteryx (Torrance, CA, Stany Zjednoczone)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mikropróbkowanie w ukierunkowanej analizie białek o niskiej liczebności opartej na spektrometrii mas

Microsampling in Targeted Mass Spectrometry-Based Protein Analysis of Low-Abundance Proteins

Ten artykuł przedstawia protokół ze szczegółowymi opisami do efektywnego oczyszczania próbek z białek o niskiej obfitości z suszonych próbek. Odbywa się to za pomocą proteolizy opartej na kulkach przed wychwytywaniem peptydów proteotypowych i oznaczaniem tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej (LC-MS / MS). Procedurę można zastosować zarówno do konwencjonalnych suszonych próbek przy użyciu kart papierowych (np. wysuszonych plamek krwi [DBS] i wysuszonych plam surowicy [DSS]), jak i próbek pobranych za pomocą nowszych metod pobierania próbek, takich jak wolumetryczne absorpcyjne mikropobieranie próbek (VAMS). Oprócz opisania tej procedury, w niniejszej pracy przedstawiono krok po kroku przygotowanie zarówno kulek trypsynowych, jak i kulek pokrytych przeciwciałami. Zaletami przedstawionej procedury są efektywna czasowo proteoliza przy użyciu kulek oraz selektywne, solidne oczyszczanie za pomocą wychwytywania powinowactwa peptydów. Obecna procedura opisuje oznaczanie biomarkera drobnokomórkowego raka płuca o niskiej liczebności (SCLC), peptydu uwalniającego progastrynę (ProGRP), w wysuszonej surowicy (zarówno DSS, jak i VAMS). Szczegółowe procedury przygotowania ściegu ułatwiają wdrożenie przepływu pracy w nowych aplikacjach lub innych laboratoriach. Wykazano, że wyniki mogą być zależne od materiału do pobierania próbek; W przypadku niniejszego projektu zaobserwowano wyższe natężenie sygnału w próbkach pobranych za pomocą VAMS w porównaniu z DSS.

Przegląd schematu analitycznego z wykorzystaniem zarówno próbkowania DSS, jak i VAMS przedstawiono na Rysunku 1. Z wyjątkiem różnic w metodzie pobierania próbek, procedury są identyczne. Obrazy surowicy pobranej dwiema metodami próbkowania znajdują się na Rysunku 2.
Obie formy pobierania próbek (VAMS i DSS) nadają się do pobierania surowicy zawierającej ProGRP. Można to zauważyć na Rysunku 3, gdzie przedstawiono chromatogramy MS peptydu proteotypowego oraz peptydu IS SIL z pobierania metodą DSS i VAMS. Dodatkowo dołączono chromatogram MS po analizie próbki kontrolnej składającej się z 10 µL wzbogaconej próbki płynnej surowicy, przetworzonej w ten sam sposób co próbki suszone. Ta ostatnia została rozcieńczona w tej samej objętości, co objętość roztworu do ekstrakcji DSS/VAMS, poddana trawieniu za pomocą kulek z trypsyną i oczyszczona przy użyciu wychwytu powinowactwa do peptydów.
Porównując pobieranie próbek metodą VAMS i DSS (Rysunek 4), VAMS zapewnia wyższy stosunek pola powierzchni peptydów proteotypowych do IS niż DSS. Wskazuje to na możliwą utratę docelowego białka ProGRP na papierze stosowanym w DSS (czystej celulozie). Porównanie z próbką kontrolną, w której surowica nie była suszona przed dalszą obróbką i analizą (Rysunek 4), wykazuje, że VAMS zapewnia podobne stosunki pól powierzchni co próbka kontrolna (obustronny test t, p≤ 0,65), co świadczy o braku utraty na materiale do pobierania próbek, podczas gdy DSS zapewnia znacznie niższy stosunek pól powierzchni (obustronny test t, p≤ 0,005), co wskazuje na utratę na materiale do pobierania próbek.
Przeprowadzono krótką ocenę z wykorzystaniem VAMS. Wykazano liniowość w zakresie od 10 do 1 000 ng/mL (R2 = 0,9996), przy granicy detekcji (LOD, S/N = 3) wynoszącej 6,7 ng/mL. Wartość LOD uznano za satysfakcjonującą, ponieważ analiza była wykonywana na dość starym spektrometrze potrójnego kwadrupolu (2008) z kolumną o średnicy wewnętrznej (ID) 1 mm. Powtarzalność wszystkich poziomów z S/N &gt; 10 również uznano za satysfakcjonującą, z RSD w przedziale od 7% do 17% (n = 3), przy zastosowaniu korekty IS.
Wychwyt powinowactwem można przeprowadzić zarówno przed, jak i po etapie trawienia, wychwytując albo białko docelowe, albo jego peptyd proteotypowy. Niniejsza procedura opisuje wychwyt powinowactwem peptydów. Zaletą tego podejścia w porównaniu z wychwytem białek jest to, że wychwytywany jest tylko interesujący nas peptyd, co pozwala na jeszcze bardziej efektywne oczyszczenie próbki. Jest to zilustrowane na Rysunku 5, który przedstawia bardziej złożony chromatogram pełnego skanowania z większym poziomem szumów po wychwycie białek w porównaniu do efektu po wychwycie peptydów. Próbki analizowane na Rysunku 5 nie zostały pobrane przy użyciu próbkowania DSS ani VAMS; jednak matrycą próbki jest również surowica, a wychwyt powinowactwem przeprowadzono przy użyciu tego samego przeciwciała, które stosuje się do wychwytu peptydów w opisanej procedurze.
<img alt="Schemat analizy peptydów z wysuszonych plamek surowicy z wykorzystaniem LC-MS/MS; trawienie, oczyszczanie powinowactwem, detekcja." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64473/64473fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd schematu analitycznego z wykorzystaniem pobierania próbek metodą DSS oraz VAMS. Skróty: DSS = wysuszona plamka surowicy; VAMS = wolumetryczne absorpcyjne mikropróbkowanie; LC-MS/MS = chromatografia cieczowa z tandemową spektrometrią mas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64473/64473fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces przeniesienia surowicy, schematy 10µL surowicy nanesionej i wchłoniętej przez urządzenia analityczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64473/64473fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Obrazy próbek surowicy pobranych różnymi metodami. (A) celulozowa karta DBS oraz (B) VAMS. Skróty: DBS = dried blood spot (wyschnięta plamka krwi); VAMS = volumetric absorptive microsampling (wolumetryczny absorpcyjny mikropróbkowanie). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64473/64473fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki chromatografii, analiza surowicy, porównanie metod, VAMS vs. DSS, wykres względnej obfitości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64473/64473fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywne chromatogramy MS peptydu proteotypowego i peptydu IS SIL po pobraniu próbek metodą DSS i VAMS, a także dla próbki surowicy z dodatkiem standardu wprowadzonego bezpośrednio do roztworu ekstrakcyjnego. Chromatogramy MS przedstawiają próbki 10 µL surowicy z dodatkiem 1,5 µg/mL ProGRP, naniesione na (A) VAMS, (B) celulozową kartę do pobierania próbek (dla DSS) lub (C) bezpośrednio do buforu ekstrakcyjnego (próbka kontrolna). Do wszystkich próbek przed powinowatejszym wychwytywaniem peptydów dodano dwadzieścia pięć mikrolitrów 14 ng/mL peptydu IS SIL. Skróty: DSS = dried serum spot (wysuszone punkty surowicy); VAMS = volumetric absorptive microsampling (wolumetryczne absorpcyjne mikropróbkowanie); MS = mass spectrometry (spektrometria mas); ProGRP = progastrin-releasing peptide (progastrynowy peptyd uwalniający); IS = internal standard (standard wewnętrzny); SIL = stable isotope-labeled (znakowany stabilnymi izotopami). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64473/64473fig03large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Porównanie metod pobierania surowicy; wykres słupkowy analizujący stosunek pól ALGNQQPSWDESDNFK/IS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64473/64473fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywne wyniki stosunku pól ALGNQQPSWDSEDSSNFK/IS dla próbek surowicy wzbogaconych ProGRP i naniesionych (10 µL) na VAMS, DSS lub bezpośrednio do roztworu do ekstrakcji (próbka kontrolna). Stężenie ProGRP wynosi 1,5 µg/mL, n = 4 dla każdego stanu; do wszystkich próbek przed powinowactwem peptydowym dodano 25 µL peptydu IS SIL o stężeniu 14 ng/mL. *oznacza, że stosunek pól różni się istotnie od próbek naniesionych na VAMS (dwustronny test t, p≤ 0,005). Słupki błędów oznaczają ± odchylenie standardowe. Skróty: DSS = dried serum spot (wyschnięta plamka surowicy); VAMS = volumetric absorptive microsampling (wolumetryczne absorpcyjne mikropróbkowanie); ProGRP = progastrin-releasing peptide (propeptyd uwalniający gastrynę); IS = internal standard (standard wewnętrzny); SIL = stable isotope-labeled (znakowany stabilnymi izotopami). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64473/64473fig04large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres chromatografii cieczowej sprzężonej z spektrometrią mas, analiza peptydów, pokazujący względną obfitość w funkcji czasu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64473/64473fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Porównanie chromatogramów podstawowych pików (pełny skan analizą Orbitrap) po ekstrakcji nienaruszonego białka (kolor niebieski) oraz ekstrakcji proteotypowego peptydowego epitopu (kolor czerwony). Po prawej stronie przedstawiono ekstrakcyjne chromatogramy jonów proteotypowego peptydowego epitopu (ALGNQQPSWDSEDSSNFK, m/z 1005.45). Jako próbkę wykorzystano surowicę wzbogaconą o 150 ng mL−1 ProGRP. Rycina ta została przedrukowana z pracy Levernæs et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64473/64473fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela uzupełniająca S1: Przegląd składu buforów i roztworów oraz instrukcja ich przygotowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64473/64473_Supp%20Table%20S1%20Buffers%20and%20solutions.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Przedstawiono protokół do oznaczania biomarkerów o niskiej obfitości z wysuszonych próbek surowicy, czego przykładem jest biomarker peptydu uwalniającego progastrynę (ProGRP). Kulki magnetyczne pokryte przeciwciałami są używane do selektywnego oczyszczania i wzbogacania proteotypowego peptydu ProGRP. Wychwycony peptyd jest następnie analizowany za pomocą chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas.

Mikropróbkowanie w ukierunkowanej analizie białek o niskiej liczebności opartej na spektrometrii mas

This paper presents a protocol with detailed descriptions for efficient sample cleanup of low-abundance proteins from dried samples. This is performed ...

Protokół ten zawiera przegląd krok po kroku, jak przygotować kulki do oczyszczania powinowactwa i proteolizy białek oraz jak ich używać do oznaczania białek o niskiej liczebności z suszonych mikropróbek. Główną zaletą jest to, że otrzymujesz narzędzia do przygotowania i przeprowadzenia wysoce wydajnego pobierania próbek złożonych próbek z bardzo małych objętości. Metodę tę można dostosować do innych biomarkerów białkowych, o ile masz dostęp do skutecznych przeciwciał do wychwytywania białka lub peptydu proteotypowego.Musisz być bardzo ostrożny podczas dostosowywania pH do kwaśnego traktowania przeciwciała, zwłaszcza jeśli przygotowujesz małą objętość kulek. Na początek przenieś żądaną objętość roztworu przeciwciała do pięciomililitrowej probówki mikrowirówkowej o niskiej zawartości wiązania białek i dodaj mały magnetyczny pręt mieszający do roztworu przeciwciała. Użyj pH-metru z mikroelektrodą do pomiaru pH i dostosuj pH, dodając najpierw 10 mikrolitrów jednomolowego kwasu solnego, a następnie zmniejszając objętość, gdy pH zbliża się do 2,5.Zanotować całkowitą objętość jednomolowego kwasu solnego niezbędną do dostosowania pH do 2,5. Usunąć mikroelektrodę i inkubować zakwaszone przeciwciało na lodzie, na mieszadle magnetycznym przez godzinę. Aby zneutralizować roztwór przeciwciała, zmierz pH i dostosuj je do siedmiu, najpierw dodając 10 mikrolitrów jednomolowego wodorotlenku sodu, a następnie zmniejszając objętość wodorotlenku sodu, gdy pH zbliża się do siedmiu.Zanotować całkowitą objętość dodanego jednomolowego wodorotlenku sodu. Dokładnie wymieszaj zawiesinę kulek magnetycznych na mieszalniku wirowym i pobierz objętość zawierającą żądaną ilość zawiesiny kulek. Na przykład, aby przygotować jeden mililitr zawiesiny kulek, należy pobrać objętość zawierającą 20 miligramów kulek.Umieść zawiesinę perełków na stojaku magnetycznym na jedną minutę i usuń supernatant. Umyj kulki dwukrotnie równą objętością wody typu I i wymieszaj za pomocą mieszadła wirowego po każdym dodaniu roztworu myjącego. Następnie ponownie umieść roztwór na stojaku magnetycznym na jedną minutę i usuń supernatant, jak pokazano wcześniej.Dodaj przeciwciało poddane działaniu kwasu, 0,5-molowy bufor boranowy i bufor sprzęgający do sprzężenia przeciwciał z kulkami magnetycznymi. Wymieszać za pomocą mieszalnika wirowego i obracać w temperaturze otoczenia przez noc za pomocą mieszalnika do próbek typu end--over-end, najlepiej z ruchem posuwisto-zwrotnym i wibracjami. Następnie odwirować przez 10 minut w temperaturze 239 g.Umieść probówkę na magnesie na dwie minuty i usuń supernatant. Po umyciu kulek ponownie umieść rurkę na magnesie na jedną minutę i postępuj zgodnie z tą samą procedurą, aby usunąć supernatant. Przechowuj go w żądanym buforze, używając żądanego stężenia bulionu w lodówce.Pozwól, aby 10 mikrolitrów surowicy zostało zebrane w 10-mikrolitrowym wolumetrycznym chłonnym mikropróbkowaniu absorpcyjnym lub VAMS, zgodnie z wytycznymi producenta i wysusz na powietrzu w temperaturze otoczenia przez co najmniej dwie godziny. Wyjmij VAMS z uchwytu i umieść go w dwumililitrowej probówce wirówkowej o niskiej zawartości wiązania białek. Dodać 1 000 mikrolitrów 100-milimolowego roztworu wodorowęglanu amonu i ekstrahować VAMS przez godzinę w temperaturze 22 stopni Celsjusza za pomocą mieszalnika o kontrolowanej temperaturze przy 1 000 obr./min.Przenieś ekstrakt do nowej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej o niskiej zawartości wiązania białek w celu proteolizy tryptycznej. Dodaj 30 mikrolitrów umytych kulek trypsyny do każdego ekstraktu VAMS, aby rozpocząć trawienie, i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 1000 obr./min za pomocą miksera o kontrolowanej temperaturze lub podobnego. Odwirować przy 2,655 g przez pięć minut i przenieść supernatant do nowej dwumililitrowej probówki do mikrowirówki o niskiej zawartości wiązania białek.Dodać 25 mikrolitrów 14 nanogramów na mililitr roztworu wzorca wewnętrznego lub IS, zawierającego stabilny peptyd znakowany izotopem w 100-milimolowym roztworze wodorowęglanu amonu. Dodać dwa 20 mikrolitrów przemytej zawiesiny kulek magnetycznych do każdej probówki mikrowirówki o niskiej zawartości wiązania białek, zawierającej strawiony ekstrakt z VAMS i IS. Przeprowadzaj immunoekstrakcję przez jedną godzinę za pomocą mieszalnika próbek typu end-over-end w temperaturze otoczenia. Umyj kulki magnetyczne, dodając 500 mikrolitrów PBS z 0,05% polisorbatem 20.Wyjmij probówkę mikrowirówki o niskiej zawartości wiązarek białkowych zawierającą kulki i roztwór do płukania ze stojaka magnetycznego i ostrożnie odwróć, aż do uzyskania jednorodności. Następnie umieść probówkę wirówkową o niskiej zawartości wiązań białkowych na magnesie na 30 sekund, odwróć ją na 30 sekund i ponownie umieść na magnesie na jedną minutę. Usuń roztwór myjący i ponownie umyj kulki magnetyczne PBS, kwasem solnym tris i wodorowęglanem amonu.Dodać 15 mikrolitrów 2% kwasu mrówkowego w wodzie typu I do każdej próbki i inkubować przez pięć minut w temperaturze 22 stopni Celsjusza i 1 000 obr./min za pomocą mieszalnika o kontrolowanej temperaturze lub podobnego w celu wymycia wychwyconych peptydów. Po umieszczeniu eluatu na magnesie na jedną minutę, przenieś go do nowej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej o niskiej zawartości wiązań białkowych. Powtórz raz i przenieś drugi eluat do tej samej probówki mikrowirówkowej o niskiej wiązalności białek, co pierwszy eluat.Dodaj 20 mikrolitrów 100-milimolowego wodorowęglanu amonu do każdego eluatu. Odwirować go i przenieść 40 mikrolitrów eluatu do mikrowkładek do fiolek HPLC. W oprogramowaniu przyrządu ustaw temperaturę pieca kolumnowego na 25 stopni Celsjusza, a natężenie przepływu na 50 mikrolitrów na minutę.Następnie umieść próbki w automatycznym podajniku próbek. Przygotuj sekwencję zawierającą próbki do uruchomienia za pomocą oprogramowania dostępnego dla systemu LC-MS/MS i ustaw objętość wtrysku na 10 mikrolitrów. Naciśnij przycisk Uruchom sekwencję w oprogramowaniu urządzenia, aby rozpocząć sekwencję i zapisać obszar piku wychwyconego przez powinowactwo, specyficznego dla ProGRP, peptydu tryptycznego i jego IS. Spektrometria mas (MS), chromatogramy peptydu proteotypowego i IS po pobraniu próbek VAMS i wysuszonej plamki surowicy lub DSS, a także dla wzbogaconej próbki surowicy dodanej bezpośrednio do roztworu ekstrakcyjnego.Reprezentatywne wyniki stosunku powierzchni piku proteotypowego peptydu ProGRP do IS dla próbek surowicy wzbogaconych ProGRP i nałożonych na VAMS, DSS lub bezpośrednio do roztworu ekstrakcyjnego przedstawiono na tym rysunku. Na podstawie tych wyników można zauważyć, że VAMS zapewnia podobne proporcje powierzchni jak próbka kontrolna, co wskazuje na brak strat w materiale do pobierania próbek, podczas gdy DSS zapewnia znacznie niższy stosunek powierzchni, co wskazuje na straty w materiale do pobierania próbek. Na rysunku przedstawiono porównanie chromatogramów pików bazowych po ekstrakcji nienaruszonych białek i ekstrakcji peptydów proteotypowych epitopów.Kiedy samodzielnie przygotowujesz kulki pokryte przeciwciałami lub enzymami, możesz dostosować je do swoich konkretnych potrzeb. Jest to istotne dla celowanego oznaczania białek i globalnej analizy proteomicznej. Czułe metody oznaczania białek na podstawie VAMS i wysuszonych plamek krwi umożliwiają stosowanie podejść zorientowanych na pacjenta, takich jak badania pozaszpitalne, w obserwacji szerszego zakresu chorób.

microsampling-targeted-mass-spectrometry-based-protein-analysis-low

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Metoda SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies) łączy wzbogacanie peptydów metodą powinowactwa z masową spektrometrią z rozcieńczeniem izotopem stabilnym (MRM-MS), aby zapewnić ilościowe pomiary peptydów jako substytutów odpowiadających im białek. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół z wykorzystaniem cząstek magnetycznych w formacie częściowo zautomatyzowanym.

Ilościowe oznaczanie białek z wykorzystaniem immunoafinityjnego wzbogacania peptydów sprzężonego ze spektrometrią mas

Opracowaliśmy technologię opartą na cienkiej warstwie krzemionki mezoporowatej do selektywnego odzyskiwania białek i peptydów o niskiej masie cząsteczkowej z surowicy ludzkiej. Właściwości fizykochemiczne naszych chipów mezoporowatych zostały precyzyjnie dostrojone, aby zapewnić znaczną kontrolę nad wzbogacaniem peptydów, a w konsekwencji umożliwić profilowanie proteomu surowicy do celów diagnostycznych.

Wzbogacanie białek o niskiej masie cząsteczkowej na cienkich warstwach mezoporowatej krzemionki w celu odkrywania biomarkerów

Technologia HaloTag to wielofunkcyjna technologia, która odniosła znaczący sukces w izolacji zarówno małych, jak i dużych kompleksów białkowych z komórek ssaków. Tutaj podkreślamy zalety tej technologii w porównaniu z istniejącymi alternatywami i pokazujemy jej użyteczność do badania wielu aspektów funkcji białek wewnątrz komórek eukariotycznych.

Odkrywanie interakcji białek i charakteryzowanie funkcji białek za pomocą technologii HaloTag

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać bezwzględne testy kwantyfikacyjne docelowych białek w złożonych próbkach biologicznych przy użyciu monitorowania wybranych reakcji. Wykorzystano go do dokładnego ilościowego określenia białek szlaku sygnałowego chemotaksji makrofagów myszy. Szczegółowo opisano wybór peptydów docelowych, opracowywanie testów oraz testy jakościowe i ilościowe.

Spektrometria mas do monitorowania wybranych reakcji do bezwzględnej kwantyfikacji białek

Tutaj opisujemy test chromatograficzny połączony z separacją ruchliwości jonów prekursorów peptydów, po której następuje detekcja MS w wysokiej rozdzielczości (~30 000) MS dla kwantyfikacji wzorców peptydów wzbogaconych w trawieniu przeciwciał monoklonalnych.

Test HS-MRM do oznaczania ilościowego białek komórek gospodarza w biofarmaceutykach białkowych za pomocą chromatografii cieczowej Mobilność jonów Spektrometria mas QTOF

Przedstawiono protokół kompleksowej ekstrakcji lipidów, metabolitów i białek z tkanek biologicznych przy użyciu jednej próbki.

Prosta metoda ekstrakcji frakcjonowanej do kompleksowej analizy metabolitów, lipidów i białek z pojedynczej próbki

Przedstawiono protokół kwantyfikacji białek w złożonych płynach biologicznych przy użyciu technologii automatycznego immuno-MALDI (iMALDI).

Kwantyfikacja peptydów i białek przy użyciu zautomatyzowanego immuno-MALDI (iMALDI)

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Opisany protokół zapewnia zoptymalizowaną ilościową analizę proteomiczną próbek tkanek przy użyciu dwóch podejść: ilościowego opartego na znacznikach i bez etykiety. Podejścia oparte na znacznikach mają tę zaletę, że zapewniają dokładniejszą ocenę ilościową białek, podczas gdy podejście bez znaczników jest bardziej opłacalne i służy do analizy setek próbek kohorty.

Kompleksowy przepływ pracy proteomiki próbek tkanek opartej na spektrometrii mas

Tutaj tworzymy metodę proteomiczną opartą na spektrometrii mas, używając izolowanych obszarów zainteresowania w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie skrawkach tkanki. Protokół ten służy do analizy proteomu z określonych obszarów tkanek w zarchiwizowanych odcinkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie.

Uproszczone podejście do proteomiki opartej na spektrometrii mas z wykorzystaniem wybranych regionów tkanek

Poznaj metodę mikropróbkowania w analizie białek o niskiej liczebności z użyciem magnetycznych kulek powlekanych przeciwciałami i spektrometrii mas LC-MS/MS. Protokół umożliwia wykrywanie biomarkerów z małych objętości próbek surowicy.

Mikropróbkowanie w ukierunkowanej analizie białek o niskiej liczebności opartej na spektrometrii mas

Przeglądaj więcej filmów