Mikropróbkowanie w ukierunkowanej analizie białek o niskiej liczebności opartej na spektrometrii mas

Protokół ten zawiera przegląd krok po kroku, jak przygotować kulki do oczyszczania powinowactwa i proteolizy białek oraz jak ich używać do oznaczania białek o niskiej liczebności z suszonych mikropróbek. Główną zaletą jest to, że otrzymujesz narzędzia do przygotowania i przeprowadzenia wysoce wydajnego pobierania próbek złożonych próbek z bardzo małych objętości. Metodę tę można dostosować do innych biomarkerów białkowych, o ile masz dostęp do skutecznych przeciwciał do wychwytywania białka lub peptydu proteotypowego.

Musisz być bardzo ostrożny podczas dostosowywania pH do kwaśnego traktowania przeciwciała, zwłaszcza jeśli przygotowujesz małą objętość kulek. Na początek przenieś żądaną objętość roztworu przeciwciała do pięciomililitrowej probówki mikrowirówkowej o niskiej zawartości wiązania białek i dodaj mały magnetyczny pręt mieszający do roztworu przeciwciała. Użyj pH-metru z mikroelektrodą do pomiaru pH i dostosuj pH, dodając najpierw 10 mikrolitrów jednomolowego kwasu solnego, a następnie zmniejszając objętość, gdy pH zbliża się do 2,5.

Zanotować całkowitą objętość jednomolowego kwasu solnego niezbędną do dostosowania pH do 2,5. Usunąć mikroelektrodę i inkubować zakwaszone przeciwciało na lodzie, na mieszadle magnetycznym przez godzinę. Aby zneutralizować roztwór przeciwciała, zmierz pH i dostosuj je do siedmiu, najpierw dodając 10 mikrolitrów jednomolowego wodorotlenku sodu, a następnie zmniejszając objętość wodorotlenku sodu, gdy pH zbliża się do siedmiu.

Zanotować całkowitą objętość dodanego jednomolowego wodorotlenku sodu. Dokładnie wymieszaj zawiesinę kulek magnetycznych na mieszalniku wirowym i pobierz objętość zawierającą żądaną ilość zawiesiny kulek. Na przykład, aby przygotować jeden mililitr zawiesiny kulek, należy pobrać objętość zawierającą 20 miligramów kulek.

Umieść zawiesinę perełków na stojaku magnetycznym na jedną minutę i usuń supernatant. Umyj kulki dwukrotnie równą objętością wody typu I i wymieszaj za pomocą mieszadła wirowego po każdym dodaniu roztworu myjącego. Następnie ponownie umieść roztwór na stojaku magnetycznym na jedną minutę i usuń supernatant, jak pokazano wcześniej.

Dodaj przeciwciało poddane działaniu kwasu, 0,5-molowy bufor boranowy i bufor sprzęgający do sprzężenia przeciwciał z kulkami magnetycznymi. Wymieszać za pomocą mieszalnika wirowego i obracać w temperaturze otoczenia przez noc za pomocą mieszalnika do próbek typu end--over-end, najlepiej z ruchem posuwisto-zwrotnym i wibracjami. Następnie odwirować przez 10 minut w temperaturze 239 g.

Umieść probówkę na magnesie na dwie minuty i usuń supernatant. Po umyciu kulek ponownie umieść rurkę na magnesie na jedną minutę i postępuj zgodnie z tą samą procedurą, aby usunąć supernatant. Przechowuj go w żądanym buforze, używając żądanego stężenia bulionu w lodówce.

Pozwól, aby 10 mikrolitrów surowicy zostało zebrane w 10-mikrolitrowym wolumetrycznym chłonnym mikropróbkowaniu absorpcyjnym lub VAMS, zgodnie z wytycznymi producenta i wysusz na powietrzu w temperaturze otoczenia przez co najmniej dwie godziny. Wyjmij VAMS z uchwytu i umieść go w dwumililitrowej probówce wirówkowej o niskiej zawartości wiązania białek. Dodać 1 000 mikrolitrów 100-milimolowego roztworu wodorowęglanu amonu i ekstrahować VAMS przez godzinę w temperaturze 22 stopni Celsjusza za pomocą mieszalnika o kontrolowanej temperaturze przy 1 000 obr./min.

Przenieś ekstrakt do nowej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej o niskiej zawartości wiązania białek w celu proteolizy tryptycznej. Dodaj 30 mikrolitrów umytych kulek trypsyny do każdego ekstraktu VAMS, aby rozpocząć trawienie, i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 1000 obr./min za pomocą miksera o kontrolowanej temperaturze lub podobnego. Odwirować przy 2,655 g przez pięć minut i przenieść supernatant do nowej dwumililitrowej probówki do mikrowirówki o niskiej zawartości wiązania białek.

Dodać 25 mikrolitrów 14 nanogramów na mililitr roztworu wzorca wewnętrznego lub IS, zawierającego stabilny peptyd znakowany izotopem w 100-milimolowym roztworze wodorowęglanu amonu. Dodać dwa 20 mikrolitrów przemytej zawiesiny kulek magnetycznych do każdej probówki mikrowirówki o niskiej zawartości wiązania białek, zawierającej strawiony ekstrakt z VAMS i IS. Przeprowadzaj immunoekstrakcję przez jedną godzinę za pomocą mieszalnika próbek typu end-over-end w temperaturze otoczenia. Umyj kulki magnetyczne, dodając 500 mikrolitrów PBS z 0,05% polisorbatem 20.

Wyjmij probówkę mikrowirówki o niskiej zawartości wiązarek białkowych zawierającą kulki i roztwór do płukania ze stojaka magnetycznego i ostrożnie odwróć, aż do uzyskania jednorodności. Następnie umieść probówkę wirówkową o niskiej zawartości wiązań białkowych na magnesie na 30 sekund, odwróć ją na 30 sekund i ponownie umieść na magnesie na jedną minutę. Usuń roztwór myjący i ponownie umyj kulki magnetyczne PBS, kwasem solnym tris i wodorowęglanem amonu.

Dodać 15 mikrolitrów 2% kwasu mrówkowego w wodzie typu I do każdej próbki i inkubować przez pięć minut w temperaturze 22 stopni Celsjusza i 1 000 obr./min za pomocą mieszalnika o kontrolowanej temperaturze lub podobnego w celu wymycia wychwyconych peptydów. Po umieszczeniu eluatu na magnesie na jedną minutę, przenieś go do nowej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej o niskiej zawartości wiązań białkowych. Powtórz raz i przenieś drugi eluat do tej samej probówki mikrowirówkowej o niskiej wiązalności białek, co pierwszy eluat.

Dodaj 20 mikrolitrów 100-milimolowego wodorowęglanu amonu do każdego eluatu. Odwirować go i przenieść 40 mikrolitrów eluatu do mikrowkładek do fiolek HPLC. W oprogramowaniu przyrządu ustaw temperaturę pieca kolumnowego na 25 stopni Celsjusza, a natężenie przepływu na 50 mikrolitrów na minutę.

Następnie umieść próbki w automatycznym podajniku próbek. Przygotuj sekwencję zawierającą próbki do uruchomienia za pomocą oprogramowania dostępnego dla systemu LC-MS/MS i ustaw objętość wtrysku na 10 mikrolitrów. Naciśnij przycisk Uruchom sekwencję w oprogramowaniu urządzenia, aby rozpocząć sekwencję i zapisać obszar piku wychwyconego przez powinowactwo, specyficznego dla ProGRP, peptydu tryptycznego i jego IS. Spektrometria mas (MS), chromatogramy peptydu proteotypowego i IS po pobraniu próbek VAMS i wysuszonej plamki surowicy lub DSS, a także dla wzbogaconej próbki surowicy dodanej bezpośrednio do roztworu ekstrakcyjnego.

Reprezentatywne wyniki stosunku powierzchni piku proteotypowego peptydu ProGRP do IS dla próbek surowicy wzbogaconych ProGRP i nałożonych na VAMS, DSS lub bezpośrednio do roztworu ekstrakcyjnego przedstawiono na tym rysunku. Na podstawie tych wyników można zauważyć, że VAMS zapewnia podobne proporcje powierzchni jak próbka kontrolna, co wskazuje na brak strat w materiale do pobierania próbek, podczas gdy DSS zapewnia znacznie niższy stosunek powierzchni, co wskazuje na straty w materiale do pobierania próbek. Na rysunku przedstawiono porównanie chromatogramów pików bazowych po ekstrakcji nienaruszonych białek i ekstrakcji peptydów proteotypowych epitopów.

Kiedy samodzielnie przygotowujesz kulki pokryte przeciwciałami lub enzymami, możesz dostosować je do swoich konkretnych potrzeb. Jest to istotne dla celowanego oznaczania białek i globalnej analizy proteomicznej. Czułe metody oznaczania białek na podstawie VAMS i wysuszonych plamek krwi umożliwiają stosowanie podejść zorientowanych na pacjenta, takich jak badania pozaszpitalne, w obserwacji szerszego zakresu chorób.