Name: Dwuetapowe podejście do badania wczesnych i późnych etapów powstawania narządów w modelu ptasim: paradygmat organogenezy grasicy i przytarczyc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: Poznaj dwuetapową metodę badania organogenezy łączącą hodowlę in vitro z przeszczepem na błonę chorioallantoidalną. Technika umożliwia analizę wczesnych i późnych etapów powstawania narządów w modelu ptasim.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni António Cidadão, Isabel Alcobia i Leonor Parreira za krytyczną lekturę rękopisu, Padmie Akkapeddi za narrację wideo oraz Vitorowi Proa z Histology Service of the Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, za wsparcie techniczne. Jesteśmy szczególnie wdzięczni Paulo Caeiro i Hugo Silvie z Unidade de audiovisuais (Jednostka Audiowizualna), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa za ich wyjątkowe zaangażowanie w produkcję tego filmu. Dziękujemy firmie Leica Microsystems za udostępnienie stereoskopu wyposażonego w system wideo oraz firmie Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A. za pomoc w zakresie jaj zapłodnionych przepiórkami. Prace te były wspierane przez Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Wszystkie te eksperymenty są zgodne z zasadami etycznymi Centro Académico de Medicina de Lisboa.
1. Inkubacja zapłodnionych jaj przepiórczych i kurzych
<ol>
	<li>Wysiaduj jaja przepiórki japońskiej (Coturnix coturnix japonica) i kurczaka (Gallus gallus) odpowiednio przez 3 i 8 dni.
	<ol>
		<li>Umieścić jaja z komorą powietrzną (koniec jaja) skierowany do góry w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 38 °C.</li>
		<li>Do przeprowadzenia tego eksperymentu użyj około 20 jaj przepiórczych i 40 jaj kurzych. 
		UWAGA: Liczby te należy podwoić przy ustanawianiu tej procedury po raz pierwszy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Izolacja regionu embrionalnego przepiórki, zawierającego przypuszczalne terytorium zaczątków grasicy i przytarczyc
Uwaga: Wykonuj procedury manipulacji jajami w sterylnych warunkach, używając poziomego kaptura z przepływem laminarnym oraz sterylizowanych narzędzi i materiałów.
<ol>
	<li>Przygotuj dużą miskę ze szkła borokrzemianowego około 3/4 wypełnioną zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS).</li>
	<li>Otwórz jajo przepiórcze po 3 dniach inkubacji, stukając w skorupę i wycinając zakrzywionymi nożyczkami okrągły otwór po przeciwnej stronie jego końca. Ostrożnie usuń kawałki skorupy i przenieś zarodek do szklanej miski wypełnionej zimnym PBS.</li>
	<li>Przytrzymaj zarodek przepiórki (q) w E3 (qE3) (stadium przepiórki odpowiadające stopniowi HH 21 kurczaka) za pomocą cienkich kleszczy. Wykonaj nacięcie w błonie witeliny otaczającej żółtko za pomocą zakrzywionych nożyczek. Kontynuuj cięcie wokół i na zewnątrz do obwodu naczyń pozazarodkowych.</li>
	<li>Przenieś zarodek do małej miski wypełnionej około 3/4 zimnym PBS za pomocą cienkich kleszczy. Dokładnie umyj zarodek z pozostałego przyczepionego żółtka.</li>
	<li>Za pomocą skimmera przenieś zarodek na szklaną szalkę Petriego o średnicy 100 mm z czarną podstawą (patrz Tabela Materiałów) zawierającą 10 ml zimnego PBS.</li>
	<li>Umieścić szalkę Petriego pod mikroskopem stereoskopowym. 
	Uwaga: Od tego momentu należy wykonywać zabiegi mikrochirurgiczne pod mikroskopem stereoskopowym w celu uzyskania progresywnego powiększenia. Jako źródło oświetlenia zaleca się stosowanie lamp LED wbudowanych w stereomikroskop lub w światłowody, biorąc pod uwagę ograniczone obciążenie cieplne.</li>
	<li>Przytrzymaj zarodek do dna płytki za pomocą cienkich szpilek przeciw owadom. Umieść cztery szpilki tworzące kwadratowy kształt w obszarze pozazarodkowym.</li>
	<li>Usuń błony pozazarodkowe okolicy głowowej za pomocą cienkich kleszczy i umieść tam piątą szpilkę. 
	Uwaga: Jeśli zarodek jest prawidłowo ustawiony, pęcherzyk uszny, rurka serca oraz 1, 2i 3łuki gardłowe (PA) powinny być widoczne.</li>
	<li>Wypreparuj interesujący nas obszar embrionalny, tj. 3. i 4. obszar łuku gardłowego (3/4PAR), używając nożyczek do oczu Weckera.
	<ol>
		<li>Rozpocznij cięcie wzdłużne i równoległe do osi zarodka, między obszarem somitu/cewy nerwowej a PA.</li>
		<li>Usuń brzusznie umieszczoną rurkę serca, przecinając ją. Trzymając nożyczki w tej samej pozycji, obróć szalkę Petriego, aby zmienić położenie zarodka zgodnie z kierunkiem cięcia.</li>
		<li>Przeciąć między 2. i 3. PA i poniżej 4. PA.</li>
		<li>Odłącz pozostałe membrany od 3/4PAR za pomocą cienkich kleszczy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odessać wyizolowane tkanki (3/4PAR) i przenieść je do szklanego naczynia 3/4 wypełnionego zimnym PBS za pomocą sterylnej plastikowej pipety o pojemności 2 ml. 
	Uwaga: Następnie tkanki mogą być hodowane in vitro do 48 godzin lub natychmiast przeszczepiane do CAM zarodka kurcząt w E8.</li>
	<li>Szklane naczynie zawierające wyizolowane 3/4 PAR należy przechowywać na lodzie podczas przygotowywania testu in vitro.</li>
</ol>
3. Test organotypowy in vitro: hodowla regionu embrionalnego zawierającego przypuszczalne terytorium zaczątków grasicy i przytarczyc
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę hodowlaną z pożywką RPMI-1640 uzupełnioną 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny. 
	UWAGA: Do pożywki można dodać rozpuszczalne odczynniki farmakologiczne (na przykład LY-411.575 (Ly) i di-benzazepinę lub cyklopaminę i wismodegib, aby zahamować odpowiednio szlaki sygnałowe Notch i Hedgehog (Hh). Do tego testu użyj 50-200 nM Ly lub 5-15 μM Di-benzazepiny, aby zahamować sygnalizację Notch w 3/4PAR. Użyj 20 μM cyklopaminy lub 10 μM wismodegibu, aby zahamować sygnalizację Hh w klasie 3/4PAR<sup="xref">5.</li>
	<li>Przygotować kulturę in vitro eksplantatu 3/4PP na płytce 6-dołkowej.
	<ol>
		<li>Napełnij jedną studzienkę z płytki 6-dołkowej 5 ml pożywki hodowlanej. Umieść wkładkę z membrany poliwęglanowej o średnicy 24 mm (patrz tabela materiałów) na studni za pomocą cienkich kleszczy.</li>
		<li>Pod mikroskopem stereoskopowym przenieś eksplant 3/4PAR ze szklanego naczynia na powierzchnię membrany, delikatnie przesuwając za pomocą łyżki (lub szpatułki) do przeszczepu i cienkich kleszczy. Umieść eksplantaty brzuszną stroną do góry, a stroną grzbietową stykającą się z błoną. Dodaj do siedmiu eksplantatów na wkładkę membranową. Przejdź do kroku 3.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywnie, hodowla eksplantatów w pływających filtrach membranowych.
	<ol>
		<li>Przygotować szalkę Petriego o średnicy 35 mm z 5 ml pożywki hodowlanej. Za pomocą cienkich kleszczyków unieruchamić filtr membranowy (patrz Tabela materiałów) i utrzymuj suchą powierzchnię w kontakcie z powietrzem.</li>
		<li>Pod mikroskopem stereoskopowym przenieś eksplant 3/4PAR ze szklanego naczynia do filtra membranowego, delikatnie przesuwając za pomocą łyżki (lub szpatułki) do przeszczepu i cienkich kleszczyków. Umieść eksplantaty brzuszną stroną do góry, a stroną grzbietową stykającą się z błoną. Dodaj do 8 eksplantatów na filtr membranowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie umieścić eksplantaty przygotowane w krokach 3.2 i 3.3 w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Po 48-godzinnym okresie inkubacji wyjąć z inkubatora 6-dołkową płytkę i szalkę Petriego o średnicy 35 mm.
	<ol>
		<li>Zebrać wyhodowane eksplantaty z wkładki membranowej płytki 6-dołkowej.
		<ol>
			<li>Dodaj PBS w temperaturze pokojowej (RT) do wkładu membranowego.</li>
			<li>Odłącz eksplantaty od membrany przez energiczne przepłukanie za pomocą sterylnej plastikowej pipety o pojemności 2 ml.</li>
			<li>Za pomocą szpatułki i cienkich kleszczy przenieś wyhodowane eksplantaty do szklanego naczynia 3/4 wypełnionego PBS przy RT.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Podobnie, zebrać wyhodowane eksplantaty z pływającego filtra membranowego na szalce Petriego o średnicy 35 mm.
		<ol>
			<li>Przenieść filtr membranowy za pomocą cienkich kleszczyków na nową szalkę Petriego o średnicy 35 mm wypełnioną PBS w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Odłączyć eksplantaty od filtra membranowego przez energiczne pipetowanie za pomocą sterylnej plastikowej pipety o pojemności 2 ml.</li>
			<li>Za pomocą cienkich kleszczyków rozładuj filtr membranowy bez eksplantacji po upewnieniu się, że nie pozostały do niego przymocowane żadne eksplantaty.</li>
			<li>Za pomocą szpatułki i cienkich kleszczyków przenieś eksplantaty do szklanego naczynia wypełnionego PBS w temperaturze pokojowej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś wyhodowane eksplantaty za pomocą szpatułki do 1 ml odczynnika w celu całkowitej izolacji RNA i wykorzystania do badań ekspresji genów. 
	ostrożność: Narażenie na ten odczynnik (patrz Tabela materiałów) może stanowić poważne zagrożenie dla zdrowia. Nosić odpowiednie okulary ochronne, odzież i rękawice. Postępuj zgodnie z instrukcją obsługi i przeczytaj karty charakterystyki dostarczone przez producenta.</li>
	<li>Alternatywnie, przeszczepić wyhodowane tkanki na CAM zarodków kurczaków w E8. Przejdź do kroku 4.</li>
</ol>
4. Przygotowanie CAM
<ol>
	<li>Z inkubatora należy wyjąć jaja kurze w wieku 8 dni rozwoju embrionalnego. 
	UWAGA: Jaja inkubowano z komorą powietrzną skierowaną do góry w temperaturze 38 °C w wilgotnym inkubatorze.</li>
	<li>Przykryj koniec jajka przezroczystą plastikową taśmą, aby zapobiec wpadaniu kawałków skorupki do komory powietrznej. Postukaj w skorupkę i wytnij okrągły otwór w jajku zakrzywionymi nożyczkami. Komora powietrzna powinna być widoczna.</li>
	<li>Ostrożnie usuń białą membranę komory powietrznej cienkimi kleszkami. CAM jest wtedy widoczny i dostępny do przeszczepu tkanek ektopowych. 
	Uwaga: Nie należy używać PBS do nawodnienia CAM przed lub po przeszczepie, ponieważ PBS sprzyja przesuwaniu się i nieprawidłowemu umieszczaniu eksplantatów. Jeśli błona wyschnie, wyrzuć jajko.</li>
</ol>
5. Szczepienie hodowanych eksplantatów na CAM
<ol>
	<li>Tworzyć małe zmiany naczyniowe/rany w mniejszych naczyniach CAM za pomocą mikroskalpela w uchwycie. 
	Uwaga: Użyj końcówki pipety Pasteura, aby usunąć krew przez naczynia włosowate w przypadku nadmiernego krwawienia.</li>
	<li>Użyj szpatułki i cienkich kleszczy, aby przenieść wyhodowany eksplant do zranionego obszaru CAM.</li>
	<li>Wytnij kawałek bibuły filtracyjnej nieco większy niż eksplant i umieść go na wierzchu eksplantatu. 
	Uwaga: Bibuła filtracyjna pomaga śledzić lokalizację eksplantacji po jej opracowaniu w CAM. Umożliwia również codzienne dostarczanie leku do eksplantatu podczas opracowywania in ovo, jeśli to konieczne (opisano w kroku 5.6).</li>
	<li>Uszczelnij okienko jajka przezroczystą plastikową taśmą i zidentyfikuj je za pomocą ołówka węglowego. 
	Uwaga: Plastikowa taśma chroni zarodek przed odwodnieniem w okresie inkubacji.</li>
	<li>Inkubować zmodyfikowane jajo przez 10 dni w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 38 °C. Postępować zgodnie z krokiem 6.</li>
	<li>Krok opcjonalny: Codzienne podawanie leku w okresie inkubacji.
	<ol>
		<li>Aby uzyskać dostęp do filtra, częściowo podnieś plastikową taśmę. Dodaj 100 μl roztworu leku, kropla po kropli, na papier. Ponownie uszczelnić okienko i umieścić jajo z powrotem w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 38 °C. 
		Uwaga: W tym teście dawka 20 μM cyklopaminy hamuje sygnalizację Hh podczas rozwoju in ovo5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Formacja narządów ektopowych w CAM po 10 dniach rozwoju in ovo
<ol>
	<li>Po 10 dniach inkubacji wyjmij jajo z inkubatora i ostrożnie usuń plastikową taśmę.</li>
	<li>Przeciąć CAM wokół obszaru filtra za pomocą zakrzywionych nożyczek i przenieść eksplant pochodzący z CAM z bibułą filtracyjną do małej szklanej miski około 3/4 wypełnionej zimnym PBS.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy przenieś eksplant pochodzący z CAM na 100-milimetrową szalkę Petriego z czarną podstawą zawierającą 10 ml PBS. Delikatnie usuń bibułę filtracyjną i nadmiar membrany za pomocą nożyczek do oczu Wecker i cienkich kleszczyków.</li>
	<li>Przenieść eksplant CAM do roztworu utrwalającego (3,7% PFA w PBS) za pomocą skimmera. Eutanazja zarodków kurczaka bez usuwania ich z jaja poprzez wykonanie precyzyjnego nacięcia w okolicy szyi zarodka za pomocą dużych nożyczek.</li>
	<li>Oceń tworzenie się narządów w skrawkach parafinowych eksplantatów pochodzących z CAM za pomocą konwencjonalnej histologii i immunohistochemii.</li>
</ol>

<ol><li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nogent+Institute-50+years+of+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The Nogent Institute-50 years of embryology.</a> Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).</li>
<li>Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+stem+cells+into+organs%3A+topobiological+transformations+demonstrated+by+beak%2C+feather%2C+and+other+ectodermal+organ+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).</li>
<li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenet Genome Res. 117 (1-4), 231-239 (2007).</li>
<li>Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+chorioallantoic+membrane+model+in+biology%2C+medicine+and+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering.</a> Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).</li>
<li>Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+and+Hedgehog+in+the+thymus%2Fparathyroid+common+primordium%3A+Crosstalk+in+organ+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation.</a> Dev Biol. 418 (2), 268-282 (2016).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+6+-+Recent+Advances+in+Developmental+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Frontiers+in+Developmental+Toxicology+and+Risk+Assessment%22%5BJournal%5D)">Chapter 6 - Recent Advances in Developmental Biology.</a> Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. , The National Academies Press. Washington, DC. (2000).</li>
<li>Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0017660">FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies.</a> PLoS One. 6 (3), e17660(2011).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelio-mesenchymal+interactions+are+critical+for+Quox+7+expression+and+membrane+bone+differentiation+in+the+neural+crest+derived+mandibular+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme.</a> EMBO J. 10 (9), 2387-2393 (1991).</li>
<li>Maeda, Y., Noda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+development+of+embryonic+long+bone+on+chorioallantoic+membrane+in+ovo+prevents+perichondrium-derived+suppressive+signals+against+cartilage+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth.</a> Bone. 32 (1), 27-34 (2003).</li>
<li>Ishida, K., Mitsui, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bioengineered+feather+buds+on+a+reconstructed+chick+skin+from+dissociated+epithelial+and+mesenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells.</a> Dev Growth Differ. 58 (3), 303-314 (2016).</li>
<li>Le Douarin, N. M., Jotereau, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/239088">Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras.</a> J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).</li>
<li>Farley, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+thymus+organogenesis+and+colonization+in+early+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development.</a> Development. 140, 2015-2026 (2013).</li>
<li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal+pouch%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch.</a> Mech Dev. 103, 141-143 (2001).</li>
<li>Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Bmp4+signalling+in+the+epithelial-mesenchymal+interactions+that+take+place+in+early+thymus+and+parathyroid+development+in+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos.</a> Dev Biol. 361 (2), 208-219 (2012).</li>
<li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene%2C+Tbx1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nat Genet. 27 (3), 286-291 (2001).</li>
<li>Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Bmp4+from+the+Tbx1+expression+domain+causes+abnormal+pharyngeal+arch+artery+and+cardiac+outflow+tract+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling.</a> Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).</li>
<li>Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+of+the+third+pharyngeal+pouch+into+thymus%2Fparathyroid+by+Six+and+Eya1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1.</a> Dev Biol. 293 (2), 499-512 (2006).</li>
<li>Uematsu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+in+ovo.+chorioallantoic+membrane+engraftment+to+culture+testes+from+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice.</a> Comp Med. 64 (4), 264-269 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kluczowym aspektem dla powodzenia tej metody jest jakość zarówno jaj kurzych, jak i przepiórczych. Biorąc pod uwagę długie okresy inkubacji, szczególnie podczas testu in ovo , dobra jakość jaj kurzych poprawia wskaźniki żywotności (do 90%) pod koniec procedury. Aby to osiągnąć, przetestuj jaja od różnych dostawców. Wysiaduj niemanipulowane jaja przez długi czas (do 16-17 dni) i sprawdzaj ich rozwój. Aby można było uznać partię za partię dobrej jakości, ponad 80% zarodków powinno wykazywać prawidłowy rozwój. Ważn...

Ptasie embriony były szeroko wykorzystywane w badaniach nad biologią rozwojową. Do głównych zalet ptasiego modelu należy możliwość otwarcia komórki jajowej, stosunkowo łatwy dostęp do zarodka oraz możliwość wykonania mikromanipulacji. Niektóre przykłady obejmują klasyczny system chimery przepiórki i kurczaka do badania losu komórki1, zastosowanie specyficznych czynników wzrostu do zarodka2 oraz wzrost ektopowych struktur komórkowych w klasie CAM<sup="xref">1,3,4.
Aby uzyskać nowe informacje na temat różnych etapów tworzenia się narządów, niedawno opracowaliśmy metodę, która łączy techniki szczepienia z manipulacją in vitro tkanek embrionalnych5. Podejście dwuetapowe umożliwia rozróżnianie i badanie zarówno wczesnych, jak i późnych etapów organogenezy, które często są ograniczone ze względu na wysoce dynamiczne i złożone interakcje tkankowe2. Co więcej, brak odpowiednich markerów specyficznych dla tkanek często ogranicza stosowanie genetycznie modyfikowanych modeli zwierzęcych6. Ta nowatorska metoda podejścia dwuetapowego w dużej mierze przezwycięża takie ograniczenia.
Aby zbadać wczesne etapy tworzenia się organów, w pierwszym kroku izoluje się terytorium embrionalne przepiórki, na które składa się przyszły zaczątek narządu, i hoduje się je w systemie organotypowym in vitro przez 48 godzin. W tym okresie farmakologiczną modulację określonych szlaków sygnałowych można przeprowadzić, dodając leki do pożywki hodowlanej5,7. Dodatkowo, hodowane tkanki mogą być pobierane na dowolnym etapie wzrostu in vitro i badane pod kątem ekspresji genów (przy użyciu metod takich jak qPCR, mikromacierze itp.).
W drugim kroku, 48 tkanek hodowanych przez h jest następnie szczepionych na CAM zarodka kurczaka (c) w dniu embrionalnym (E) 8 (cE8) (Hamburger i Hamilton (HH)-etapy 33-35)8. CAM zachowuje się jak naczyniowy dostawca składników odżywczych i umożliwia wymianę gazową1,3,4 do przeszczepionych tkanek, umożliwiając jego rozwój in ovo przez dłuższy czas. Ten eksperymentalny etap jest szczególnie przydatny do badania późnych etapów organogenezy, ponieważ w pełni uformowane narządy można uzyskać po 10 dniach rozwoju in ovo 5,9,10,11. Analiza morfologiczna jest łatwo przeprowadzana przez konwencjonalną histologię w celu potwierdzenia, że prawidłowe tworzenie narządów i pochodzenie komórek dawcy można zidentyfikować za pomocą immunohistochemii przy użyciu przeciwciał specyficznych dla gatunku (tj. MAb Quail PeriNuclear (QCPN)). W okresie inkubacji CAM przeszczepy mogą być również hodowane w obecności środków farmakologicznych i pobierane na każdym etapie rozwoju w celu oceny postępu organogenezy.
Dwuetapowe podejście, opisane tutaj szczegółowo, zostało już zastosowane w Figueiredo et al.5, aby zbadać rozwój ptasich przytarczyc/grasicy. W związku z tym poniżej zostaną przedstawione nieodłączne cechy terytoriów embrionalnych i etapów rozwoju zaangażowanych w organogenezę grasicy i przytarczyc.
Nabłonek grasicy i przytarczyc, choć funkcjonalnie odrębny, wywodzi się z endodermy woreczków gardłowych (PP)12. U ptaków nabłonek tych narządów wywodzi się z trzeciej i czwartej endodermy PP (3/4PP)12, podczas gdy u ssaków nabłonek grasicy wywodzi się od 3PP, a nabłonek przytarczyc wywodzi się odpowiednio od 3PP i 3/4PP u myszy i człowieka13,14.
Jednym z najwcześniejszych etapów powstawania tych organów jest pojawienie się odrębnych domen grasicy i przytarczyc we wspólnym zawiązku. U kurczaków domeny te można zidentyfikować poprzez hybrydyzację in situ, ze specyficznymi markerami molekularnymi, w E4.515. W miarę postępu rozwoju te podstawy narządów indywidualizują się i oddzielają od gardła, podczas gdy otacza je cienka torebka mezenchymalna, utworzona przez komórki wywodzące się z grzebienia nerwowego (w E5; GG-scena 27). Później nabłonek grasicy jest kolonizowany przez hematopoetyczne komórki progenitorowe (w E6,5; GG-etap 30)<klasa sup="xref">12.
Podobnie jak w klasycznych badaniach nad kurczakami przepiórczymi1,12, podejście dwuetapowe jest szczególnie przydatne do badania powstawania narządów krwiotwórczych/limfatycznych, a mianowicie grasicy5. Ponieważ eksplant przepiórki, wraz z zaczątkiem narządu, jest szczepiony w zarodku kurczaka przed kolonizacją hematopoetycznych komórek progenitorowych, tworzy się chimeryczna grasica z komórkami progenitorowymi krwi kurczaka infiltrującymi nabłonek grasicy przepiórki. Metoda ta jest zatem użytecznym narzędziem do badania udziału komórek krwiotwórczych w rozwoju ptasiego układu krwiotwórczego/limfatycznego.

<table><tbody><tr><td>Jaja zapłodnione przez kury (Gallus gallus)</td><td>Pintobar, Portugalia</td><td></td><td>Ferma drobiu&nbsp;</td></tr><tr><td>Jaja zapłodnione przepiórcze (Coturnix coturnix)</td><td>Interaves, Portugalia</td><td></td><td>Ferma ptaków&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 15 ml PP</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe PP 50 ml</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia pyrexowe 60 x 20 mm</td><td>Grupa Duran 21</td><td>755 41</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia pyrex 100 x 20 mm</td> Grupa <td>Duran 21</td><td>755 48</td><td></td></tr><tr><td>Wkładka membranowa z poliwęglanu&nbsp;</td><td>Transwell Corning</td><td>3412</td><td>24 mm z wkładką z membrany poliwęglanowej o porach 0,4 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtr membranowy</td><td>Millipore</td><td>DTTP01300</td><td>0,6 mm Filtr membranowy Isopore</td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki hodowlane</td><td>Nunc, Thermo Fisher Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego, 35 x 10 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5112&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Miski z Pyrexu z supermarketu</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>2041S</td><td>Pipeta plastikowa 2 ml</td></tr><tr><td>Szklana pipeta Pasteura</td><td>normax</td><td>5426015</td><td></td></tr><tr><td>Whatman&nbsp; Jakościowa bibuła filtracyjna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1001090</td><td>Bibuła filtracyjna</td></tr><tr><td>Przezroczysta taśma</td><td></td><td></td> plastikowa <td>z supermarketu&nbsp;</td></tr><tr><td>Cytokeratyna (pan; kwaśna i zasadowa, cytokeratyny typu I i II), klon Lu-5</td><td>BMA Biomedicals</td><td>T-1302</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat cyklopaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4116</td><td>Farmakologiczny inhibitor sygnalizacji Hh</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Standart FBS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr>Badania rozwojowe<td>przeciwciał QCPN</td><td>Hybridoma Bank</td><td>QCPN</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, Suplement GlutaMAX&nbsp;</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Bluesil RTV141A/B Elastomer silikonowy 1,1 kg Zestaw</td><td>ELKEM/Silmid</td><td>RH141001KG</td><td>Do przygotowania tylnej podstawy pod szalkę</td></tr><tr><td>Petriego Stemolecule LY411575</td><td>Stemgent</td><td>04-0054</td><td>Farmakologiczny inhibitor sygnalizacyjnego</td></tr><tr><td>TRIzol</td> Notch <td>Odczynnik Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Odczynnik do całkowitej izolacji RNA</td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11251-30&nbsp;</td><td>Cienkie kleszcze</td></tr><tr><td>Bardzo cienkie nożyczki Bonn, zakrzywione</td><td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td>Nożyczki zakrzywione</td></tr><tr><td>Szpilki do owadów&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-30</td><td></td></tr><tr><td>Mikroszpatułka&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10087-12</td><td>Łyżka do przeszczepu</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>Mikroskalpel</td></tr><tr><td>Moria Niklowany uchwyt na szpilki</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td>Uchwyt</td></tr><tr><td>Moria Perforowana łyżka</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-17</td><td>Skimmer</td></tr><tr><td>Wecker Nożyczki do oczu</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Aparat</td><td>fotograficzny Leica Microsystems&nbsp;</td><td>MC170 HD</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop Leica Microsystems</td><td>&nbsp;</td><td>Mikroskop Leica M80</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>Zobacz materiał DM2500</td><td></td></tr></tbody></table>

dwuetapowe podejście do badania wczesnych i późnych etapów powstawania narządów w modelu ptasim: paradygmat organogenezy grasicy i przytarczyc

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

Ptasi embrion, jako model eksperymentalny, miał ogromne znaczenie dla przełomowych odkryć w biologii rozwojowej. Wśród kilku podejść, tworzenie chimer kur przepiórczych i wykorzystanie błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) do podtrzymywania rozwoju tkanek ektopowych sięga ubiegłego wieku. Obecnie połączenie tych klasycznych technik z najnowszymi metodologiami in vitro stwarza nowe perspektywy dalszego badania nad powstawaniem narządów.
Tutaj opisujemy dwuetapowe podejście do badania wczesnych i późnych etapów organogenezy. Krótko mówiąc, region embrionalny zawierający przypuszczalne terytorium narządu izoluje się z zarodków przepiórek i hoduje in vitro w systemie organotypowym (do 48 godzin). Wyhodowane tkanki są następnie szczepione na CAM zarodka kurczaka. Po 10 dniach rozwoju in ovo uzyskuje się w pełni uformowane narządy z przeszczepionych tkanek. Metoda ta pozwala również na modulację szlaków sygnałowych poprzez regularne podawanie środków farmakologicznych i manipulację genetyczną tkanek na wszystkich etapach rozwoju in vitro i in ovo. Dodatkowo, rozwijające się tkanki mogą być pobierane w dowolnym oknie czasowym w celu przeanalizowania ich profilu ekspresji genów (przy użyciu ilościowego PCR (qPCR), mikromacierzy itp.) i morfologii (ocenianej za pomocą konwencjonalnej histologii i immunochemii).
Opisana procedura eksperymentalna może być używana jako narzędzie do śledzenia procesu tworzenia się narządów poza zarodkiem ptaka, od wczesnych etapów organogenezy do w pełni ukształtowanych i funkcjonalnych organów.

Opisany powyżej protokół szczegółowo przedstawia metodę umożliwiającą badanie zarówno wczesnych, jak i późnych etapów organogenezy, które są często ograniczone przez złożone interakcje komórkowe i molekularne.
Metoda ta została wcześniej zastosowana przez Figueiredo et al.5 w celu wyjaśnienia roli sygnalizacji Notch i Hh w rozwoju wspólnego prymordium przytarczyc i grasicy u ptaków.
<p class=...

Ten artykuł przedstawia zaktualizowane podejście do klasycznego systemu chimery kury przepiórczej do badania formowania się narządów, poprzez połączenie nowatorskich procedur eksperymentalnych in vitro i in ovo.

Dwuetapowe podejście do badania wczesnych i późnych etapów powstawania narządów w modelu ptasim: paradygmat organogenezy grasicy i przytarczyc

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie dwuetapowego podejścia do badania wczesnych i późnych etapów organogenezy poprzez połączenie manipulacji in vitro tkanek embrionalnych z technikami szczepienia in ovo z wykorzystaniem modelu ptasiego. W tej metodzie terytorium zarodka zawierające prospektywny zaczątek narządu izoluje się i hoduje w systemie organotypowym przez 48 godzin. Naśladując prawidłowy rozwój, to podejście in vitro umożliwia łatwy dostęp do terytoriów embrionalnych bez konieczności stosowania specyficznych markerów molekularnych i umożliwia eksperymentalną manipulację wczesnymi etapami rozwoju narządów, które opierają się na wysoce dynamicznych modyfikacjach przestrzennych i złożonych interakcjach tkankowych.Następnie wyhodowane tkanki są szczepione na błonę kosmówkowo-omocznikową zarodka kurczaka. Błona kosmówkowo-omoczniowa zachowuje się jak naczyniowy dostawca składników odżywczych i umożliwia wymianę gazową do przeszczepionych tkanek, umożliwiając jej rozwój w jajolecznictwie. Ten etap jest szczególnie przydatny do badania późnych etapów organogenezy, ponieważ w pełni uformowane narządy można uzyskać po 10 dniach rozwoju in ovo.Ponadto środki farmakologiczne m

two-step-approach-to-explore-early-late-stages-organ-formation-avian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym filmie zaprezentowano technikę wycięcia i usunięcia grasicy płodowej, a także przygotowanie kultur ex vivo grasicy traktowanej 2-dGuo. <br...

Przygotowanie hodowli organowych grasicy traktowanych 2-dGuo

Ten protokół opisuje sekcję zarodkowego anlagenu tarczycy myszy i hodowlę eksplantatów na półporowatych filtrach lub na plastikowych szkiełkach mikroskopowych. System ten idealnie nadaje się do badania zdarzeń morfogenetycznych lub różnicowania zachodzących podczas rozwoju tarczycy zarodków typu dzikiego lub zarodków z nokautem i jest podatny na eksperymenty dotyczące przyrostu i utraty funkcji.

System hodowli ex vivo do badania rozwoju tarczycy

Tutaj prezentujemy protokół hodowli organotypowej do hodowli embrionalnych organów kurczaka in vitro. Za pomocą tej metody można badać rozwój zarodkowej tkanki kurczaka, przy zachowaniu wysokiego stopnia kontroli nad środowiskiem hodowli.

Metoda hodowli organotypowej do badania rozwoju zarodkowych tkanek kurczaka

Ten artykuł przedstawia metodę izolowania czystych tkanek embrionalnych z zarodków przepiórek i kurczaków, które mogą być łączone w celu utworzenia chimerycznych organów ex vivo.

Izolacja tkanek embrionalnych i tworzenie chimerycznych narządów przepiórki i kurczaka na przykładzie grasicy

Ta praca opisuje dwie metody badania rozwoju narządów, ulepszone ustawienie ksenotransplantacji na błonie kosmówkowo-omoczniowej (CAM) z ptasich embrionów, które pozwala na unaczynienie hodowanych narządów embrionalnych i organoidów oraz nowatorską metodę hodowli narządów w stałym kierunku z zmodyfikowanymi warunkami eksperymentalnymi, która pozwala na obrazowanie konfokalne w wysokiej rozdzielczości w trybie poklatkowym.

Optymalizacja organoidów nerkowych i hodowli organotypowych pod kątem unaczynienia, przedłużony rozwój i ulepszone obrazowanie mikroskopowe

Pisklę jest opłacalnym, dostępnym i szeroko dostępnym organizmem modelowym do różnych badań. W tym miejscu szczegółowo opisano szereg protokołów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i regeneracji ucha wewnętrznego ptaków.

Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół przeszczepu organoidów nerkowych w jamie celomicznej zarodków kurczaków. Metoda ta indukuje unaczynienie i przyspieszone dojrzewanie organoidów w ciągu 8 dni i może być wykorzystana do skutecznego badania tych procesów.

Skuteczne unaczynienie organoidów nerkowych poprzez docelomiczne przeszczepienie zarodków kurczaków

Tutaj opisujemy protokoły dla trzech typów hodowli eksplantatów skóry embrionalnej ptaków, które mogą być użyte do badania interakcji tkankowych, obrazowania 4D filmu poklatkowego (3D plus czas), globalnych lub lokalnych zaburzeń funkcji molekularnych oraz charakterystyki biologii systemów.

Wykorzystanie eksplantatów ze skóry ptaków do badania wzorców tkanek i organogenezy

Tutaj prezentujemy protokół do wszczepiania organoidów ludzkiego mózgu na wielu etapach dojrzewania do błony kosmówkowo-omoczniowej pisklęcia (CAM). Organoidy mózgowe hodowano zgodnie z niekierowanymi standardowymi protokołami.

Wczesne niekierowane modelowanie niszy nerwowo-naczyniowej organoidu ludzkiego mózgu w permisywnej błonie moczowo-omoczniowej zarodka pisklęcia

Zarodek Xenopus laevis nadal jest wyjątkowo przydatny w badaniach nad wczesnym rozwojem, ze względu na jego duży rozmiar i łatwość manipulacji.   Przewidziano uproszczony protokół hybrydyzacji całego montażu in situ, który można wykorzystać do identyfikacji określonych narządów w tym modelowym systemie.

Zrozumienie wczesnej organogenezy przy użyciu uproszczonego protokołu hybrydyzacji in situ u Xenopus

Poznaj dwuetapową metodę badania organogenezy łączącą hodowlę in vitro z przeszczepem na błonę chorioallantoidalną. Technika umożliwia analizę wczesnych i późnych etapów powstawania narządów w modelu ptasim.

Dwuetapowe podejście do badania wczesnych i późnych etapów powstawania narządów w modelu ptasim: paradygmat organogenezy grasicy i przytarczyc (Wideo) | JoVE Journal

Dwuetapowe podejście do badania wczesnych i późnych etapów powstawania narządów w modelu ptasim: paradygmat organogenezy grasicy i przytarczyc

Przeglądaj więcej filmów