Dwuetapowe podejście do badania wczesnych i późnych etapów powstawania narządów w modelu ptasim: paradygmat organogenezy grasicy i przytarczyc

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie dwuetapowego podejścia do badania wczesnych i późnych etapów organogenezy poprzez połączenie manipulacji in vitro tkanek embrionalnych z technikami szczepienia in ovo z wykorzystaniem modelu ptasiego. W tej metodzie terytorium zarodka zawierające prospektywny zaczątek narządu izoluje się i hoduje w systemie organotypowym przez 48 godzin. Naśladując prawidłowy rozwój, to podejście in vitro umożliwia łatwy dostęp do terytoriów embrionalnych bez konieczności stosowania specyficznych markerów molekularnych i umożliwia eksperymentalną manipulację wczesnymi etapami rozwoju narządów, które opierają się na wysoce dynamicznych modyfikacjach przestrzennych i złożonych interakcjach tkankowych.

Następnie wyhodowane tkanki są szczepione na błonę kosmówkowo-omocznikową zarodka kurczaka. Błona kosmówkowo-omoczniowa zachowuje się jak naczyniowy dostawca składników odżywczych i umożliwia wymianę gazową do przeszczepionych tkanek, umożliwiając jej rozwój w jajolecznictwie. Ten etap jest szczególnie przydatny do badania późnych etapów organogenezy, ponieważ w pełni uformowane narządy można uzyskać po 10 dniach rozwoju in ovo.

Ponadto środki farmakologiczne mogą być podawane wraz z rozwojem in vitro i in ovo, co pozwala na modulację szlaków sygnałowych w sposób specyficzny dla danego etapu rozwoju. Ostatecznie rozwijające się tkanki mogą być pobierane w dowolnym oknie czasowym w celu oceny postępu organogenezy i analizy pod kątem ekspresji genów i cech morfologicznych. Śledząc proces tworzenia się narządów poza zarodkiem ptaka, metoda ta może pomóc w wyjaśnieniu kluczowych kwestii z zakresu biologii rozwoju, takich jak identyfikacja sygnałów związanych z różnymi etapami tworzenia się narządów.

Ta eksperymentalna procedura zostanie zilustrowana poprzez badanie organogenezy grasicy i przytarczyc. U ptaków nabłonek tych narządów wywodzi się z endodermalnej wspólnej zawiązki trzeciego i czwartego woreczka gardłowego i wyłania się jako odrębne domeny około czwartego dnia zarodka u przepiórki i czterech/pięciu u kurcząt. W miarę rozwoju podstawy narządu indywidualizują się i oddzielają od gardła.

W późniejszym rozwoju nabłonek grasicy jest kolonizowany przez hematopoetyczne komórki progenitorowe. Przedstawiona tutaj metoda rozpoczyna się od wyizolowania terytorium embrionalnego przepiórki zawierającego przypuszczalne terytorium tych narządów, czyli obszar gardła zawierający trzeci i czwarty łuk w trzecim dniu embrionalnym. Zapłodnione jaja przepiórcze inkubowano z komorą powietrzną skierowaną do góry przez trzy dni w temperaturze 38 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze.

Na początek wyjmij jaja przepiórcze z inkubatora. Wykonuj procedury manipulacji jajami w sterylnych warunkach przy użyciu poziomego okapu z przepływem laminarnym oraz wysterylizowanych narzędzi i materiałów. Przygotuj dużą miskę z Pyrexu wypełnioną zimnym PBS.

Zakrzywionymi nożyczkami otwórz jajo przepiórcze, stukając w skorupkę i wycinając okrągły otwór po przeciwnej stronie komory powietrznej. Ostrożnie wlej zarodek do naczynia. Trzymaj zarodek w cienkich kleszkach i za pomocą zakrzywionych nożyczek wykonaj nacięcie w błonie witeliny otaczającej jarzmo.

Przeciąć dookoła i na zewnątrz do obwodu dodatkowych naczyń zarodkowych w ciągłym ruchu. Przenieś zarodek do małej miski z zimnym PBS. Następnie za pomocą skimmera przenieś zarodek na szalkę Petriego Pyrex z czarną podstawą zawierającą zimny PBS.

Pod mikroskopem stereoskopowym przytrzymaj zarodek do dna płytki za pomocą cienkich szpilek na owady. Umieść cztery szpilki tworzące kwadratowy kształt w dodatkowym obszarze zarodkowym. Za pomocą kleszczy usuń dodatkowe błony embrionalne okolicy głowowej i umieść tam piątą szpilkę.

Teraz zarodek jest prawidłowo ustawiony i widoczny jest pęcherzyk uszny, rurka serca oraz pierwszy, drugi i trzeci łuk gardłowy. Zacznij preparować obszar zainteresowania, czyli trzeci i czwarty obszar łuku gardła, za pomocą nożyczek do oczu Weckera. Wykonaj cięcie wzdłużnie i równolegle do osi zarodka między obszarem somitów i cewy nerwowej a łukami gardłowymi.

Następnie usuń brzusznie umieszczoną rurkę serca, przecinając ją. Trzymaj nożyczki w tej samej pozycji, obracaj szalkę Petriego, aby zmienić położenie zarodka zgodnie z kierunkiem cięcia. Aby zakończyć, wykonaj cięcie między drugim a trzecim łukiem gardłowym i poniżej czwartego łuku gardłowego.

Odessać wyizolowane tkanki i przenieść je do szklanego naczynia wypełnionego zimnym PBS za pomocą sterylnej plastikowej pipety. Przechowywać go na lodzie podczas przygotowywania testu in vitro. Napełnij jedną studzienkę z płytki sześciodołkowej 5 ml pożywki hodowlanej i umieść w niej wkładkę z membrany poliwęglanowej.

Pod mikroskopem stereoskopowym przenieś eksplantat delikatnie przesuwając za pomocą szpatułki i kleszczyków ze szklanego naczynia na powierzchnię membrany. Alternatywnie eksplantaty mogą być hodowane w pływających filtrach membranowych. Do tej procedury należy przygotować 35-milimetrową szalkę Petriego z 5 ml pożywki hodowlanej.

Użyj kleszczyków, aby unosić filtr membranowy, utrzymując suchą powierzchnię w kontakcie z powietrzem. Tak jak poprzednio, przenieś eksplant ze szklanego naczynia na powierzchnię membrany, delikatnie przesuwając. Eksplantaty należy umieszczać brzuszną stroną do góry, a stroną grzbietową stykającą się z błoną.

Dodaj do ośmiu eksplantatów na filtr membranowy. Ostrożnie umieść sześciodołkową płytkę i szalkę Petriego zawierającą eksplantaty w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentową zawartością dwutlenku węgla. Po 48-godzinnym okresie inkubacji wyjąć płytkę i szalkę Petriego z inkubatora.

Aby zebrać wyhodowane eksplantaty z płytki sześciodołkowej, dodaj PBS w temperaturze pokojowej do wkładki membranowej. Odłącz wyhodowane eksplantaty od membrany przez energiczne przepłukanie za pomocą sterylnej plastikowej pipety. Za pomocą szpatułki i kleszczyków przenieś wyhodowane eksplantaty do szklanego naczynia wypełnionego PBS w temperaturze pokojowej.

Podobnie zbierz hodowane eksplantaty z pływającego filtra membranowego. W takim przypadku przenieść filtr membranowy za pomocą kleszczyków na nową szalkę Petriego wypełnioną PBS w temperaturze pokojowej. Odłączyć eksplantaty od filtra membranowego przez energiczne pipetowanie.

Rozładuj filtr membranowy bez eksplantacji po upewnieniu się, że nie pozostały do niego podłączone żadne eksplantaty. Za pomocą szpatułki i kleszczyków ostrożnie przenieś eksplantaty do 1 ml odczynnika do izolacji całkowitego RNA w celu przeprowadzenia badań ekspresji genów. Hodowane eksplantaty mogą być alternatywnie uprawiane in ovo, aby konkurować w tworzeniu narządów.

Najpierw przygotuj błonę kosmówkową omocznikową. W tym celu wyjmij z inkubatora jaja kurze z ośmiodniowym rozwojem. Jaja wysiadywano z komorą powietrzną skierowaną do góry w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 38 stopni Celsjusza.

Przykryj koniec jajka przezroczystą plastikową taśmą, aby zapobiec wpadaniu kawałków skorupki do komory powietrznej. Postukaj w skorupkę i wytnij okrągły otwór w jajku zakrzywionymi nożyczkami. Komora powietrzna powinna stać się widoczna.

Powoli usuń białą membranę komory powietrznej za pomocą kleszczy. Błona kosmówkowo-omoczniowa jest wtedy widoczna i dostępna do przeszczepu tkanek ektopowych. Nie należy używać PBS do nawadniania błony kosmówkowo-omoczniowej przed lub po przeszczepie, ponieważ PBS sprzyja przesuwaniu się i nieprawidłowemu przemieszczeniu eksplantatów.

Zacznij od wykonania małych zmian naczyniowych w mniejszych naczyniach błony. Do tej procedury użyj mikroskalpela w uchwycie. W przypadku nadmiernego krwawienia z rany należy usunąć krew kapilarnie za pomocą końcówki pipety Pasteura.

Przenieś eksplant na zraniony obszar błony za pomocą szpatułki i kleszczy. Wytnij kawałek bibuły filtracyjnej o nieco większym rozmiarze niż eksplant i połóż go na eksplantacie. Bibuła filtracyjna pomaga śledzić lokalizację eksplantatu po jego rozwoju w błonie kosmówkowo-omoczniowej.

W razie potrzeby bibuła filtracyjna umożliwia również codzienne dostarczanie leku do eksplantatu podczas rozwoju in ovo. Uszczelnij okienko jajka przezroczystą plastikową taśmą i zidentyfikuj je za pomocą ołówka węglowego. Plastikowa taśma chroni zarodek przed odwodnieniem w okresie inkubacji.

Wysiaduj zmanipulowane jajo w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 38 stopni Celsjusza. Po 10 dniach inkubacji zbierz jajo i ostrożnie usuń plastikową taśmę. Przeciąć błonę kosmówkowo-omoczniową wokół obszaru filtra za pomocą zakrzywionych nożyczek i przenieść eksplant z bibułą filtracyjną do małej miski z Pyrexu wypełnionej zimnym PBS.

Za pomocą kleszczy przenieś eksplant do 100 milimetrowego naczynia z czarną podstawą wypełnionego PBS. Delikatnie usuń bibułę filtracyjną i nadmiar membrany za pomocą nożyczek do oczu i kleszczyków firmy Wecker. Za pomocą skimmera przenieś przeszczepy do roztworu utrwalającego i oceń tworzenie się narządów w skrawkach parafinowych za pomocą konwencjonalnej histologii, immunohistochemii.

Tutaj przedstawiono projekt eksperymentalny używany do badania wczesnych etapów powstawania grasicy i przytarczyc. Na przykład ekspresję genów, o których wiadomo, że są zaangażowane w rozwój obszaru łuku gardłowego, oceniano podczas normalnego rozwoju za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Transkrypty trzech genów Tbx1, Six1 i Bmp4 wykryto w świeżo wyizolowanych tkankach i po 48 godzinach hodowli.

Aby zbadać rolę szlaków sygnałowych Notch i Hedgehog, do pożywki hodowlanej dodano inhibitory farmakologiczne podczas opracowywania in vitro. Poziomy ekspresji trzech genów były znacznie zmniejszone w trzecim i czwartym regionie łuku gardła hodowanym przez 48 godzin w obecności inhibitora Notch w porównaniu z warunkami kontrolowanymi. I odwrotnie, tylko transkrypty Bmp4 były znacznie zmniejszone w hodowanych tkankach, gdy sygnalizacja Hedgehog była zablokowana.

Aby zbadać późne etapy organogenezy grasicy i przytarczyc, wyhodowane tkanki przeszczepiono na błonę kosmówkowo-omoczniową i pozostawiono do podwojenia przez kolejne dziesięć dni. Analizę morfologiczną narządów przeprowadzono za pomocą konwencjonalnej histologii i immunohistochemii. Niektóre reprezentatywne wyniki są następujące:Przeszczepy wykazały w pełni uformowaną chimeryczną grasicę z dodatnimi komórkami nabłonka grasicy pochodzącymi z QCPN, pochodzącymi z przepiórek i komórkami limfoidalnymi pochodzącymi od dawcy kurczaka.

Dodatkowo nabłonek grasicy i paratyfusu wykazywał prawidłowe cechy morfologiczne po wykryciu cytokeratyny. Nabłonek grasicy wykazywał architekturę siatkowatą, podczas gdy komórki miąższowe przytarczyc miały kształt kulisty, ułożony w skupiska i otoczony licznymi naczyniami włosowatymi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak korzystać z dwuetapowego podejścia do rozwoju in vitro i in ovo z wykorzystaniem modelu ptasiego w celu zbadania roli szlaków sygnałowych zaangażowanych w różne etapy tworzenia narządów.