Wczesne niekierowane modelowanie niszy nerwowo-naczyniowej organoidu ludzkiego mózgu w permisywnej błonie moczowo-omoczniowej zarodka pisklęcia
February 16th, 2024
Tutaj prezentujemy protokół do wszczepiania organoidów ludzkiego mózgu na wielu etapach dojrzewania do błony kosmówkowo-omoczniowej pisklęcia (CAM). Organoidy mózgowe hodowano zgodnie z niekierowanymi standardowymi protokołami.
Kluczowe pytania, na które staram się odpowiedzieć, koncentrują się wokół mechanizmów i procesów zachodzących w procesie kształtowania się ludzkiego mózgu w kontekście prawidłowego rozwoju, a także różnych stanów patologicznych. Obejmuje to badanie czynników wpływających na rozwój mózgu, takich jak genetyka, wpływy środowiskowe i epigenetyczne. Uzyskanie organoidów mózgowych, które bardzo przypominają mózg dorosłego człowieka, w tym unaczynienie, funkcjonalność bariery krew-mózg, obecność mikrogleju i różnorodność komórkowa, jest wyzwaniem.
Przezwyciężenie tego problemu ma zasadnicze znaczenie dla opracowania bardziej fizjologicznie istotnych modeli organoidów mózgowych, które mogą skutecznie naśladować mózg dorosłego człowieka w celu zwiększenia zastosowań klinicznych. Dzięki naszym badaniom zapewniamy optymalne warunki do przeszczepiania organoidów ludzkiego mózgu do błony kosmówkowo-omoczniowej, aby zapewnić dobry rozwój mikrogleju. To kliniczne ulepszenie ma kluczowe znaczenie dla nadchodzących wysiłków w tej dziedzinie w celu wygenerowania syntetycznego unaczynionego środowiska dla organoidów mózgowych.
Przewaga naszego protokołu w porównaniu z innymi technikami polega na jego wysokiej skuteczności i efektywności kosztowej. Osiągnęliśmy wysoki wskaźnik sukcesu w przesadzaniu żywotnych organoidów przy użyciu płodnych jaj od kur hodowlanych. W przyszłości nasze laboratorium skupi się na przeprowadzaniu ocen funkcjonalnych neowaskulatury związanej z organoidami.
Badanie możliwości wykorzystania tego unaczynionego modelu do stosowania nanomedycyny podawanej dożylnie. Ponadto naszym celem jest ocena dystrybucji tych nanoleków w ośrodkowym układzie nerwowym człowieka. Na początek należy uzyskać organoidy mózgowe z embrionalnych komórek macierzystych H9 i uzyskać nowo zapłodnione jaja kurze.
Pierwszego dnia oczyść powierzchnię skorupki jajka 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia. Umieść bandaż samoprzylepny z papieru chirurgicznego na jajku. Za pomocą lampy określ najcieńszą powierzchnię skorupki jajka na górnym końcu.
Następnie za pomocą sterylnej igły delikatnie nakłuj skorupkę jajka, aby utworzyć otwór w komorze powietrznej, nie naruszając CAM pisklęcia. Aby chronić zarodek przed środowiskiem zewnętrznym, przykryj otwór komory powietrznej nowym bandażem i wysiaduj jajo w temperaturze 38 stopni Celsjusza. Siódmego dnia zdejmij bandaż i przetrzyj powierzchnię skorupki jajka 70% etanolem.
Następnie umieść nowy, większy bandaż zakrywający przedłużenie. Delikatnie przekłuj skorupkę jajka, aby powiększyć otwór do okienka do szczepienia o średnicy dwóch centymetrów. Za pomocą pęsety usuń krawędzie okienka skorupki jajka i odklej bandaż, aby usunąć pozostały kurz i kawałki skorupki jajka.
Za pomocą sterylnej końcówki o szerokim przekroju zbierz organoid w 50 mikrolitrach PBS i ostrożnie przenieś go do CAM naprzeciwko lokalizacji zarodka. Dodaj siedmiolitrową kroplę matrigelu wokół organoidu. Uszczelnij okno za pomocą parafolii i przymocuj je do skorupy za pomocą bandaża samoprzylepnego.
Inkubuj przeszczep w celu różnicowania CAM. Po pięciu dniach usuń bandaż samoprzylepny. Za pomocą nożyczek i cienkiej pęsety powiększ okienko, aby ułatwić pobieranie próbki.
Napraw go 4% aldehydem paraform przez dwie minuty i zbierz 1,5 centymetra kwadratowego odcinek CAM zawierający organoid. Aby potwierdzić pomyślne szczepienie, należy przeprowadzić barwienie hematoksyliną i eozyną wycinków tkanki CAM o grubości 20 mikrometrów za pomocą organoidu. Zabarwienie tkanki przeszczepu hematoksyliną i eozyną wykazało, że organoidy nadal dojrzewały obok naczyń CAM bez żadnych oznak naciekania naczyń krwionośnych.
Przegląd
To badanie przedstawia protokół przeszczepiania ludzkich organoidalnych struktur mózgowych na różnych etapach dojrzewania do błony chorioallantois ptaka (CAM). Badania koncentrują się na zwiększeniu fizjologicznego znaczenia modeli organoidalnych mózgu dla zastosowań klinicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwojowa
- Patologia
Tło
- Ludzkie organoidalne struktury mózgowe są kluczowe dla badań rozwoju mózgu.
- Wyzwania obejmują osiągnięcie unaczynnowienia i funkcjonalności podobnej do dorosłego ludzkiego mózgu.
- Obecność mikrogleju i różnorodność komórkowa są istotne dla realistycznych modeli.
- Przesadzenie organoidalnych struktur do CAM może poprawić ich rozwój.
Cel badania
- Zbadać mechanizmy formowania się ludzkiego mózgu.
- Optymalizować warunki przeszczepiania organoidalnych struktur mózgowych.
- Zwiększyć rozwój mikrogleju w modelach organoidalnych.
Stosowane metody
- Przesadzenie ludzkich organoidalnych struktur mózgowych do błony chorioallantois ptaka.
- Wykorzystanie niekierowanych, standaryzowanych protokołów do wzrostu organoidalnego.
- Ocenianie rozwoju mikrogleju i unaczynnowienia.
- Ocenianie funkcjonalności bariery krew-mózg.
Główne wyniki
- Skuteczne przeszczepienie struktur mózgowych na wielu etapach dojrzewania.
- Poprawa warunków dla rozwoju mikrogleju zaobserwowana.
- Zwiększona fizjologiczna istotność modeli organoidalnych dla zastosowań klinicznych.
- Wgląd w syntetyczne unaczynnione środowiska dla organoidalnych struktur mózgowych.
Wnioski
- Badanie dostarcza cennnego protokołu do przeszczepiania organoidalnych struktur mózgowych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia mechanizmów rozwoju mózgu.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach, aby poprawić modele organoidalne.
