Wczesne niekierowane modelowanie niszy nerwowo-naczyniowej organoidu ludzkiego mózgu w permisywnej błonie moczowo-omoczniowej zarodka pisklęcia
16 lutego 2024
Tutaj prezentujemy protokół do wszczepiania organoidów ludzkiego mózgu na wielu etapach dojrzewania do błony kosmówkowo-omoczniowej pisklęcia (CAM). Organoidy mózgowe hodowano zgodnie z niekierowanymi standardowymi protokołami.
Kluczowe pytania, na które staram się odpowiedzieć, koncentrują się wokół mechanizmów i procesów zachodzących w procesie kształtowania się ludzkiego mózgu w kontekście prawidłowego rozwoju, a także różnych stanów patologicznych. Obejmuje to badanie czynników wpływających na rozwój mózgu, takich jak genetyka, wpływy środowiskowe i epigenetyczne. Uzyskanie organoidów mózgowych, które bardzo przypominają mózg dorosłego człowieka, w tym unaczynienie, funkcjonalność bariery krew-mózg, obecność mikrogleju i różnorodność komórkowa, jest wyzwaniem.
Przezwyciężenie tego problemu ma zasadnicze znaczenie dla opracowania bardziej fizjologicznie istotnych modeli organoidów mózgowych, które mogą skutecznie naśladować mózg dorosłego człowieka w celu zwiększenia zastosowań klinicznych. Dzięki naszym badaniom zapewniamy optymalne warunki do przeszczepiania organoidów ludzkiego mózgu do błony kosmówkowo-omoczniowej, aby zapewnić dobry rozwój mikrogleju. To kliniczne ulepszenie ma kluczowe znaczenie dla nadchodzących wysiłków w tej dziedzinie w celu wygenerowania syntetycznego unaczynionego środowiska dla organoidów mózgowych.
Przewaga naszego protokołu w porównaniu z innymi technikami polega na jego wysokiej skuteczności i efektywności kosztowej. Osiągnęliśmy wysoki wskaźnik sukcesu w przesadzaniu żywotnych organoidów przy użyciu płodnych jaj od kur hodowlanych. W przyszłości nasze laboratorium skupi się na przeprowadzaniu ocen funkcjonalnych neowaskulatury związanej z organoidami.
Badanie możliwości wykorzystania tego unaczynionego modelu do stosowania nanomedycyny podawanej dożylnie. Ponadto naszym celem jest ocena dystrybucji tych nanoleków w ośrodkowym układzie nerwowym człowieka. Na początek należy uzyskać organoidy mózgowe z embrionalnych komórek macierzystych H9 i uzyskać nowo zapłodnione jaja kurze.
Pierwszego dnia oczyść powierzchnię skorupki jajka 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia. Umieść bandaż samoprzylepny z papieru chirurgicznego na jajku. Za pomocą lampy określ najcieńszą powierzchnię skorupki jajka na górnym końcu.
Następnie za pomocą sterylnej igły delikatnie nakłuj skorupkę jajka, aby utworzyć otwór w komorze powietrznej, nie naruszając CAM pisklęcia. Aby chronić zarodek przed środowiskiem zewnętrznym, przykryj otwór komory powietrznej nowym bandażem i wysiaduj jajo w temperaturze 38 stopni Celsjusza. Siódmego dnia zdejmij bandaż i przetrzyj powierzchnię skorupki jajka 70% etanolem.
Następnie umieść nowy, większy bandaż zakrywający przedłużenie. Delikatnie przekłuj skorupkę jajka, aby powiększyć otwór do okienka do szczepienia o średnicy dwóch centymetrów. Za pomocą pęsety usuń krawędzie okienka skorupki jajka i odklej bandaż, aby usunąć pozostały kurz i kawałki skorupki jajka.
Za pomocą sterylnej końcówki o szerokim przekroju zbierz organoid w 50 mikrolitrach PBS i ostrożnie przenieś go do CAM naprzeciwko lokalizacji zarodka. Dodaj siedmiolitrową kroplę matrigelu wokół organoidu. Uszczelnij okno za pomocą parafolii i przymocuj je do skorupy za pomocą bandaża samoprzylepnego.
Inkubuj przeszczep w celu różnicowania CAM. Po pięciu dniach usuń bandaż samoprzylepny. Za pomocą nożyczek i cienkiej pęsety powiększ okienko, aby ułatwić pobieranie próbki.
Napraw go 4% aldehydem paraform przez dwie minuty i zbierz 1,5 centymetra kwadratowego odcinek CAM zawierający organoid. Aby potwierdzić pomyślne szczepienie, należy przeprowadzić barwienie hematoksyliną i eozyną wycinków tkanki CAM o grubości 20 mikrometrów za pomocą organoidu. Zabarwienie tkanki przeszczepu hematoksyliną i eozyną wykazało, że organoidy nadal dojrzewały obok naczyń CAM bez żadnych oznak naciekania naczyń krwionośnych.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół wszczepiania ludzkich organoidów mózgu na różnych etapach dojrzewania do błony chorioallantoicznej (CAM) zarodka kurczaka. Badania koncentrują się na zwiększeniu istotności fizjologicznej modeli organoidów mózgu w zastosowaniach klinicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwojowa
- Patologia
Wstęp
- Ludzkie organoidy mózgu są kluczowe dla badania rozwoju mózgu.
- Wyzwania obejmują uzyskanie unaczynienia i funkcjonalności zbliżonej do dorosłego ludzkiego mózgu.
- Obecność mikrogleju i różnorodność komórkowa są niezbędne dla uzyskania realistycznych modeli.
- Przeszczepianie organoidów do błony pozarcewniczej (CAM) może usprawnić ich rozwój.
Cel badania
- Zbadanie mechanizmów formowania się ludzkiego mózgu.
- Optymalizacja warunków transplantacji organoidów mózgu.
- Zwiększenie stopnia rozwoju mikrogleju w modelach organoidowych.
Zastosowane metody
- Przeszczepianie ludzkich organoidów mózgu do błony pozarczynowej kurczaka.
- Wykorzystanie ustandaryzowanych protokołów bez kierowania do wzrostu organoidów.
- Ocena rozwoju mikrogleju i unaczynienia.
- Ocena funkcjonalności bariery krew-mózg.
Główne wyniki
- Skuteczne przeszczepienie organoidów mózgu na wielu etapach dojrzewania.
- Zaobserwowano poprawę warunków rozwoju mikrogleju.
- Zwiększona istotność fizjologiczna modeli organoidowych w zastosowaniach klinicznych.
- Wnioski dotyczące syntetycznych środowisk unaczynionych dla organoidów mózgu.
Wnioski
- Badanie dostarcza wartościowego protokołu transplantacji organoidów mózgu.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia mechanizmów rozwoju mózgu.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych rezultatach w celu udoskonalenia modeli organoidów.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Modelowanie niszy naczyniowo-nerwowej z wykorzystaniem ludzkich organoidów mózgu wszczepionych do błony chorioallantoicznej (CAM) kurcząt pozwala wypełnić istotną lukę w odwzorowaniu rozwoju i unaczynienia ludzkiego mózgu w systemach przedklinicznych. Podejście to umożliwia badanie dojrzewania komórkowego, zmian cytoarchitektonicznych oraz rozwoju mikrogleju w sposób kosztowo efektywny, skalowalny i istotny fizjologicznie. Metoda ta wspiera wczesną walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w ramach portfeli badawczych dotyczących rozwoju układu nerwowego i naczyń krwionośnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie szlaków neurorozwojowych i oddziaływań komórkowych w kontekście istotnym dla organizmu ludzkiego.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez modelowanie wpływu środowisk unaczynionych na dojrzewanie organoidów.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów poprzez obserwację zależnych od etapu zmian cytoarchitektonicznych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia ustandaryzowaną, powtarzalną platformę do oceny żywotności organoidów i składu komórkowego po przeszczepieniu.
- Umożliwia ilościową ocenę markerów glejowych i neuronalnych na różnych etapach dojrzewania.
- Wspiera przygotowanie testów do przesiewu związków w unaczynionych systemach organoidów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelowaniem istotnym dla przebiegu chorób poprzez odwzorowanie kluczowych etapów rozwoju ludzkiego mózgu w warunkach zbliżonych do in vivo.
- Ułatwia odkrywanie translacyjnych biomarkerów dzięki analizom histologicznym i komórkowym.
- Wspiera optymalizację rozwoju celów naczyniowo-nerwowych poprzez dostarczanie danych prognostycznych dotyczących integracji i dojrzewania organoidów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wszczepiania stanowi pomost między wczesną fazą odkryć a walidacją przedkliniczną, umożliwiając weryfikację hipotez w unaczynionym, immunologicznie dopuszczalnym systemie.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badania mechanistyczne nad interakcjami naczyniowo-nerwowymi oraz dojrzewaniem komórkowym.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki dotyczące składu komórkowego i cytoarchitektury.
- Analityka: Zapewnia odczyty histologiczne i immunohistochemiczne do analizy porównawczej w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Oferuje ciągłość od rozwoju organoidów in vitro do modelowania typu in vivo w celu dopasowania biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy skalowalną, kosztowo efektywną platformę dostosowalną do różnorodnych potrzeb badawczych w zakresie rozwoju układu nerwowego.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w modelowaniu neurorozwojowym oraz walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów przeszczepiania organoidów.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez dostarczenie solidnych, fizjologicznie istotnych danych na wczesnym etapie procesu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów naczyniowo-nerwowych i neurorozwojowych z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli organoidów, embriologii oraz analizie histologicznej.
- Wymaga dostępu do sterylnych instrumentów, inkubatorów oraz infrastruktury obrazowania.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności wszczepiania i analizy.
- Może być dostosowany do różnych etapów dojrzewania organoidów i potencjalnie do innych typów tkanek.
- Ograniczony przez brak neowaskularyzacji wewnątrz organoidów, co zaobserwowano w aktualnych wynikach.
