Name: Protokół izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów myszy i ich późniejsza aktywacja in vitro za pomocą nowotworowych kompleksów immunologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów myszy z krwi i guzów oraz ich aktywację kompleksami immunologicznymi. Protokół zapewnia zachowanie sterylności i dokładne odwzorowanie stanu aktywacji komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Poniższe protokoły odnoszą się do izolacji MoDC myszy, jednak ogólne zasady mogą mieć zastosowanie również do innych komórek podzbiorów DC. 12 - 16-tygodniowe myszy C57Bl/6j były utrzymywane w akredytowanym przez American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care obiekcie dla zwierząt. Wszystkie protokoły zostały zatwierdzone przez Uniwersytet Stanforda i Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu w Tel-Awiwie.
1. Izolacja DC pochodzącego z monocytów związanych z nowotworem
<ol>
	<li>W kapturze z przepływem laminarnym usuń guzy od myszy poddanych eutanazji CO2 i umieść guzy w pożywce RPMI bez płodowej surowicy bydlęcej (FBS). 
	UWAGA: Zdecydowanie zaleca się ogolenie myszy i spryskanie ich 70% etanolem przed usunięciem guzów, aby zminimalizować potencjalne zanieczyszczenia sierści. Upewnij się, że guz nie przekracza 25 - 40 mm2 , ponieważ większe guzy mają mniej DC, które są kruche i podatne na śmierć komórki. Jeśli potrzebna jest większa liczba DC, każdej myszy można wstrzyknąć komórki nowotworowe w wielu miejscach.</li>
	<li>Pod sterylnym kapturem laminarnym posiekaj guzy nożyczkami chirurgicznymi na małe kawałki (około 1 x 1 mm2).
	<ol>
		<li>Dodaj wszystkie fragmenty guza z jednej myszy do sterylnej probówki o płaskim dnie o pojemności 30 ml z magnetycznymi mieszadłami, która zawiera 5 ml zrównoważonego roztworu soli Hanka (HBSS), 2 mg / ml kolagenazy IV i 0,01 mg / ml DNazy I. 
		Uwaga: Komórki szpikowe wytwarzają energię poprzez glikozylację, nawet w stanie stacjonarnym. Dlatego należy używać tylko pożywek zawierających glukozę (np. HBSS, RPMI i DMEM), ponieważ głód glukozy przez zaledwie 10-15 minut spowoduje śmierć komórek i apoptozę w ciągu 24 godzin. Używaj tylko kolagenazy o niskiej zawartości endotoksyn IV, ponieważ kolagenaza jest wytwarzana przez bakterie Gram-dodatnie (Clostridium histolyticum).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mieszać z prędkością około 200 - 400 obr./min w inkubatorze o temperaturze 37 oC z mieszadłem magnetycznym przez 20-30 min.</li>
	<li>Dodać 5 ml kompletnej pożywki i energicznie zawiesić.</li>
	<li>Przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 70 μm. Wirować w temperaturze 4 oC 400 rcf przez 5 - 10 minut w celu osadzania komórek. 
	Uwaga: Nie próbuj izolować komórek bezpośrednio po trawieniu enzymatycznym, ponieważ niektóre nowotwory są martwicze i zawierają stosunkowo duże ilości szczątków komórkowych lub macierzy zewnątrzkomórkowej. Zastosuj komórki na podłożu o gradiencie gęstości 15%, aby uzyskać tylko komórki.</li>
	<li>Zawiesić 9 ml pożywki o gradiencie gęstości z 1 ml 10x PBS w celu dostosowania osmolalności i uzyskania 100% roztworu podstawowego Percollu. Wymieszaj 1,5 ml pożywki o gradientzie gęstości z 8,5 ml HBSS i energicznie wymieszaj z osadem komórek nowotworowych. Delikatnie ułóż 2 ml DMEM na wierzchu pożywki o gradiencie gęstości 15% i wiruj przy 400 rcf przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzuć supernatanty, ponieważ komórki utworzą osad na dnie probówki.
	<ol>
		<li>Umyj granulowane komórki dwukrotnie, ponownie zawieszając je w 10 ml HBSS zawierającym 2% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 10 mM EDTA (bufor izolacyjny) i odwiruj w temperaturze 4 oC 400 rcf przez 5-10 minut w celu osadzenia komórek.</li>
		<li>Policz komórki na hemocytometrze za pomocą błękitu trypanowego pod mikroskopem świetlnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie zawiesić 1 x 108 komórek w 1 ml buforze izolacyjnym i inkubować je w temperaturze 4 oC z 30 μl sprzężonych kulek magnetycznych CD11b+ przez 15 min. 
	Ostrzeżenie: Unikaj stosowania koralików sprzężonych z CD11c, ponieważ spowoduje to aktywację prądu stałego i wywołanie śmierci komórki. Nie próbuj blokować FcγRII i FcγRIII za pomocą przeciwciał anty-CD16/32. Przeciwciała blokujące licytują FcγR i indukują silną fosforylację kinaz MAP i pobudzają DC.
	<ol>
		<li>Usunąć nadmiar niezwiązanych kulek, dodając 9 ml buforu izolacyjnego i odwirować komórki w temperaturze 400 rcf przez 5-10 minut w temperaturze 4oC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforze izolacyjnym. Umieść komórki na wstępnie umytej kolumnie magnetycznej. Przemyć kolumnę dwukrotnie 3 ml buforu izolacyjnego.
	<ol>
		<li>Zdejmij kolumnę z magnesu. Odpipetować 6 ml buforu izolacyjnego na kolumnę i wypłukać znakowane magnetycznie komórki do sterylnej probówki zbiorczej, naciskając tłok. Odwirować komórki w temperaturze 400 rcf przez 5 - 10 minut w temperaturze 4 oC.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w ilości 100 μl na 1 x 107 komórek i wybarwić następującymi przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem: Linage ujemne (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI i Ly6G), MHCII, Ly-6C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sortuj komórki, bramkując małe komórki, używając rozpraszania bocznego (SSC) i rozpraszania do przodu (FSC) oraz hoduj w kompletnym pożywce uzupełnionej 5 ng / mL GM-CSF. Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 3-7 oC, aby umożliwić makrofagom przyleganie do płytki. Następnie przenieś luźno i nieprzylegające komórki do nowego naczynia hodowlanego. 
	UWAGA: Mysz MoDC jest zdefiniowana jako CD11b+/CD11c+/MHCIIhi/Ly6Clo/int 7,26,27. Ekspresja Ly6C może się znacznie różnić w zależności od modelu nowotworu, a w niektórych modelach (np. LMP) MoDC całkowicie nie mają ekspresji Ly6C. Ogólnie rzecz biorąc, jeden 100 mm3 B16F10 guz zwykle zawiera 5 x 104 DC, co daje około 4 - 5 x 106 całkowitych komórek. Spośród tych komórek 10 - 15% to komórki odpornościowe, a 8 - 10% to MoDC. Zwiększenie liczby DC można osiągnąć poprzez wstrzyknięcie myszom guzów w wielu miejscach. Sortuj tylko małe komórki SSC/FCS, ponieważ inne komórki szpiku mogą wyrażać markery, takie jak CD11c i Ly6C. 
	Opcjonalnie: Posortuj monocyt naciekający nowotwór jako małe komórki SSC / FSC, które wyrażają Ly6Chi i są ujemne dla MHCII. Następnie hoduj monocyty in vitro z 50 ng / mL GM-CSF w celu uzyskania DC.</li>
</ol>
2. Izolacja DC pochodzącego z monocytów z krwi obwodowej
UWAGA: Ponieważ dojrzałe MoDC są stosunkowo rzadkie we krwi myszy, poniższy protokół odnosi się do ich pochodzenia in vitro z posortowanych monocytów.
<ol>
	<li>Aby zwiększyć poziom monocytów we krwi, znieczulij myszy 4% izofluranem i wstrzyknij im podskórnie (s.c.) 1 μg GM-CSF w 50 μl PBS.</li>
	<li>Po 1-2 godzinach uśmierc myszy za pomocą CO2, 
	Uwaga: Nie składaj w ofierze myszy przez zwichnięcie szyjki macicy, ponieważ spowoduje to krwawienie wewnętrzne.</li>
	<li>Natychmiast po eutanazji spryskaj mysz 70% etanolem i usuń skórę pokrywającą serce za pomocą nożyczek chirurgicznych, pod sterylnym kapturem z przepływem laminarnym. Oczyść nożyczki etanolem i przetnij prawe przedsionek serca. Powoli przepłucz serce przez prawą komorę za pomocą 20 mM EDTA HBSS za pomocą strzykawki 10 ml i igły 25 G.
	<ol>
		<li>Pobrać krew za pomocą sterylnej strzykawki z jamy opłucnej do sterylnej probówki zawierającej siarczan heparanu i EDTA. Kontynuuj płukanie serca, aż wątroba i płuca staną się różowe lub białe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nanieść krew na podłoże o gradiencie gęstości i odwirować w temperaturze 400 rcf w temperaturze pokojowej przez 15 minut z niskim hamulcem. 
	Uwaga: Używaj pożywki o gradiencie gęstości wolnej od endotoksyn (zwykle mniej niż 0,12 UE na ml).
	<ol>
		<li>Zbierz komórki jednojądrzaste do nowej probówki. Przemyć komórki, ponownie zawieszając je w 10 ml HBSS zawierającym 2% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 10 mM EDTA (bufor izolacyjny), a następnie odwirowując w temperaturze 4 oC 400 rcf przez 5-10 minut w celu osadzenia komórek. 
		Uwaga: Używaj tylko pożywek, które zawierają co najmniej 1 g/l glukozy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku selekcji CD11b dodatniej należy ponownie zawiesić 1 x 108 komórek w 1 ml buforze izolacyjnym i inkubować je przez 15 minut z 50 μl kulek magnetycznych sprzężonych z CD11b w temperaturze 4 oC.
	<ol>
		<li>Przepłukać nadmiar kulek, dodając 9 ml buforu izolacyjnego i odwirowując w temperaturze 400 rcf przez 5-10 minut w temperaturze 4 oC. Odessać supernatanty i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforze izolacyjnym. Nałóż ogniwa na wstępnie umytą kolumnę magnetyczną zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Wyjmij kolumnę z magnesu, odpipetuj 6 ml buforu izolacyjnego na kolumnę i wypłucz magnetycznie znakowane komórki do sterylnej probówki zbiorczej, naciskając tłok. Odwirować komórki w temperaturze 400 rcf przez 5-10 minut w temperaturze 4 oC. Przemyć kolumnę dwukrotnie 3 ml buforu izolacyjnego.</li>
		<li>Ponownie zawieś komórki w buforze izolacyjnym 1 x 10 x10 komórek/100 μl i wybarwij następującymi przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem: 0,1 μg CD115, 0,25 μg MHCII i 0,1 μg Ly-6C/1 x 106 komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sortuj komórki, bramkując na małych komórkach rozproszenia bocznego (SSC) i małego rozproszenia do przodu (FSC). 
	UWAGA: Monocyty zapalne myszy są ogólnie definiowane jako CD115 + / MHCIIlo / neg / Ly6Chi, a monocyty patrolujące są definiowane jako CD115 + / MHCIIlo / neg / Ly6Cneg 4,5. W przypadkach, gdy nie jest wymagana separacja między dwoma podzbiorami, można posortowaćcałkowite komórki SSClo / FCSlo / CD115 + / MHCII. Zarówno myszy naiwne, jak i z nowotworem zawierają około 5 - 8 x 104 MoDC na 1 ml krwi i do 4 - 5 x 105 MoDC po wstrzyknięciu GM-CSF. Spośród nich około 70% to monocyty zapalne, a 30% to monocyty patrolujące.</li>
	<li>Umieść komórki w stężeniu 1 x 106 komórek/ml w kompletnym podłożu uzupełnionym 20 ng/mL GM-CSF. Po 1 dniu przenieś nieprzylegające i luźno przylegające komórki na nową płytkę i hoduj przez dodatkowe 4-5 dni. 
	Uwaga: Pożywki DC nie powinny być uzupełniane pirogronianem.</li>
</ol>
3. Przygotowanie kompleksów immunologicznych Guz-IgG
<ol>
	<li>Hodowla komórek nowotworowych w kolbie hodowlanej o średnicy 75 cm2 do 70% konfluencji w kompletnych pożywkach DMEM.
	<ol>
		<li>Dodaj 2 ml 0,25% trypsyny/EDTA, aby odłączyć komórki od kolby hodowlanej i monitorować morfologię komórek pod mikroskopem świetlnym, aby uniknąć nadmiernej trypsynizacji.</li>
		<li>Dodać 8 ml kompletnej pożywki hodowlanej (na 2 ml trypsyny), aby zahamować trawienie trypsyny, i odwirować w temperaturze 4 oC, 400 rcf przez 5-10 minut, aby osadzać komórki. 
		UWAGA: Upewnij się, że sprawdziłeś komórki nowotworowe pod kątem Mycoplasma za pomocą komercyjnego zestawu do PCR. Test na obecność bakterii Gram-ujemnych i endotoksyn grzybowych za pomocą testu Limulus Amebocyte Lysate (LAL)28). Surowica musi zostać przefiltrowana przez 0,22 μM i przetestowana na obecność wirusów 9 Kodeksu Przepisów Federalnych. Dodatkowo przetestuj pożywki hodowlane i surowice, upuszczając 100 - 200 μl na agar LB lub bulion i hoduj przez 2 dni w temperaturze 37 oC.</li>
		<li>Ponownie umyj komórki z trypsyny i resztek surowicy, ponownie zawieszając je w 10 ml PBS i odwiruj w temperaturze 400 rcf przez 5 - 10 minut. Odessać supernatant i powtórzyć płukanie jeszcze 2 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwal komórki w 1,8% buforowanym paraformaldehydzie przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Umyć komórki, ponownie zawieszając je w 10 ml PBS i odwirować w temperaturze 4 oC 400 rcf przez 5 - 10 minut.</li>
		<li>Odessać supernatanty i powtórzyć pranie jeszcze dwa razy. 
		Opcjonalnie: W przypadku testów wychwytu nowotworu komórki można znakować, inkubując je przez 5 minut w temperaturze 37 oC w PBS zawierającym 1 μM ester sukcynimidylowy karboksyfluoresceiny (CFSE). CFSE jest następnie hartowany z kompletnymi mediami przez 10 minut w lodzie. Komórki należy dokładnie przemyć w PBS zawierającym 2% surowicy w celu usunięcia resztek barwnika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w buforze FACS (PBS uzupełniony o 2% FCS + 5 mM EDTA) i 0,5 μg/ml anty-CD16/32 w celu zablokowania potencjalnych niespecyficznych interakcji białko-białko. Płytka w kształcie litery U, 96 dołków/płytka, o stężeniu 1 x 10,5 komórek na 100 μl.
	<ol>
		<li>Dodać różne rozcieńczenia przeciwciał wiążących nowotwór w zakresie od 5 μg do 5 ng / 1 x 105 komórek. Inkubować płytkę na lodzie przez 15-20 min. 
		UWAGA: Przeciwciała IgG wyizolowano z surowicy naiwnych samic myszy w wieku 20-24 tygodni na kolumnach białka A, zgodnie z opisem24.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemyć komórki, dodając 150 μl PBS i odwirowując płytkę w temperaturze 4 oC 400 rcf przez 5 - 10 minut.
	<ol>
		<li>Wyrzuć supernatanty i powtórz pranie dwukrotnie. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforze FACS zawierającym przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem. Inkubować płytkę na lodzie przez 20 minut.</li>
		<li>Przemyć komórki, dodając 200 μl buforu FACS i odwirowując płytkę w temperaturze 400 rcf przez 5 - 10 minut. Odrzucić supernatanty i powtórzyć mycie.</li>
		<li>Przeanalizuj wiązanie guza za pomocą cytometrii przepływowej i określ minimalne stężenie wymagane do pokrycia komórek. 
		UWAGA: Przeciwciała, które nie zwiększają średniej intensywności fluorescencji (MFI) barwionych komórek nowotworowych co najmniej pięciokrotnie w stosunku do kontroli izotypowej, nie powinny być stosowane w kolejnych testach funkcjonalnych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Aktywacja MoDC za pomocą układu scalonego Gumor-IgG
<ol>
	<li>Pokryć komórki nowotworowe minimalnym stężeniem IgG, jak opisano w sekcjach 3.1 do 3.4.3
	<ol>
		<li>Na dzień przed aktywacją MoDC za pomocą IC guza, zastąp pożywkę hodowlaną MoDC, która zawiera GM-CSF. W tym celu należy delikatnie zassać pożywkę i raz umyć komórki wstępnie podgrzaną, kompletną pożywką hodowlaną. 
		UWAGA: Izolowany dojrzały MoDC związany z nowotworem powinien być hodowany przez co najmniej 2 - 3 godziny (lub nawet przez noc) po sortowaniu w kompletnych pożywkach bez GM-CSF, a przed aktywacją ich za pomocą IC.</li>
		<li>W przypadku analiz wychwytu nowotworu dodaj IC guza znakowany CFSE do MoDC w stosunku 1:5 (IC:MoDC) i inkubuj przez noc przez 12 - 16 godzin w 1 ml kompletnej pożywki na 1 x 106 DC.</li>
		<li>W przypadku analiz FACS eksperymentów aktywacji MoDC, dodaj guz-IC w stosunku 1:1 (IC:MoDC) i inkubuj przez noc przez 12 - 16 h. 
		UWAGA: Zdecydowanie zaleca się włączenie studzienki kontroli pozytywnej, w której MoDC są stymulowane 1 μg/ml LPS lub innych agonistów TLR.</li>
		<li>Po aktywacji przez noc odessać supernatanty i delikatnie przemyć komórki trzykrotnie buforem izolacyjnym lub 10 mM EDTA HBSS.</li>
		<li>Aby odłączyć prąd stały od płytki, należy inkubować komórki przez 2 - 3 minuty w 1 ml HBSS zawierającym 10 mM EDTA, a następnie odłączyć komórki przez energiczne pipetowanie.</li>
		<li>Odwiruj komórki przy 400 rcf i ponownie zawiesij 1 x 106 DC w 90 μl PBS uzupełnionym 2% FCS, 5 mM EDTA (bufor FACS) i 0,5 μg przeciwciał blokujących. Inkubować na lodzie przez 5 - 10 minut.</li>
		<li>Dodać 10 μl mieszaniny przeciwciał barwiących do komórek i inkubować na lodzie przez 15 minut.</li>
		<li>Dodać 2 ml buforu FACS do komórek i odwirować w temperaturze 4 oC 400 rcf przez 5 - 10 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie zawieś ogniwa w buforze FACS o pojemności 200 μl.
	<ol>
		<li>Dodać 0,5 - 1 μg/ml DAPI 1 - 2 minuty przed uruchomieniem próbek, aby wykluczyć martwe komórki z analiz. Nie należy nadmiernie inkubować DAPI, ponieważ MoDC podejmie go w ciągu 10 - 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Steinman, R. M., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+dendritic+cells+into+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Taking dendritic cells into medicine.</a> Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).</li>
<li>Palucka, K., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic-cell-based+therapeutic+cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines.</a> Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).</li>
<li>Mildner, A., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+function+of+dendritic+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Development and function of dendritic cell subsets.</a> Immunity. 40 (5), 642-656 (2014).</li>
<li>Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dendritic+cell+lineage%3A+ontogeny+and+function+of+dendritic+cells+and+their+subsets+in+the+steady+state+and+the+inflamed+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting.</a> Annual review of immunology. 31, 563-604 (2013).</li>
<li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells%2C+monocytes+and+macrophages%3A+a+unified+nomenclature+based+on+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny.</a> Nature reviews. Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).</li>
<li>Spitzer, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Immunity+Is+Required+for+Effective+Cancer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy.</a> Cell. 168 (3), 487-502 (2017).</li>
<li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unsupervised+High-Dimensional+Analysis+Aligns+Dendritic+Cells+across+Tissues+and+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Unsupervised High-Dimensional Analysis Aligns Dendritic Cells across Tissues and Species.</a> Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).</li>
<li>Anguille, S., Smits, E. L., Lion, E., van Tendeloo, V. F., Berneman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+use+of+dendritic+cells+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinical use of dendritic cells for cancer therapy.</a> Lancet Oncol. 15 (7), e257-e267 (2014).</li>
<li>Wimmers, F., Schreibelt, G., Skold, A. E., Figdor, C. G., De Vries, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradigm+Shift+in+Dendritic+Cell-Based+Immunotherapy%3A+From+in+vitro+Generated+Monocyte-Derived+DCs+to+Naturally+Circulating+DC+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Paradigm Shift in Dendritic Cell-Based Immunotherapy: From in vitro Generated Monocyte-Derived DCs to Naturally Circulating DC Subsets.</a> Front Immunol. 5, 165(2014).</li>
<li>Banchereau, J., Palucka, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+as+therapeutic+vaccines+against+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer.</a> Nature reviews. Immunology. 5 (4), 296-306 (2005).</li>
<li>Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation of dendritic cells.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 7 (2001).</li>
<li>Greter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+controls+nonlymphoid+tissue+dendritic+cell+homeostasis+but+is+dispensable+for+the+differentiation+of+inflammatory+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells.</a> Immunity. 36 (6), 1031-1046 (2012).</li>
<li>Vremec, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor+on+dendritic+cell+levels+in+mouse+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The influence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell levels in mouse lymphoid organs.</a> Eur J Immunol. 27 (1), 40-44 (1997).</li>
<li>Helft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+Mouse+Bone+Marrow+Cultures+Comprise+a+Heterogeneous+Population+of+CD11c%28%2B%29MHCII%28%2B%29+Macrophages+and+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells.</a> Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).</li>
<li>Dong, M. B., Rahman, M. J., Tarbell, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+gating+for+spleen+monocyte+and+DC+subsets%3A+differences+in+autoimmune+NOD+mice+and+with+acute+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric gating for spleen monocyte and DC subsets: differences in autoimmune NOD mice and with acute inflammation.</a> J Immunol Methods. 432, 4-12 (2016).</li>
<li>Drutman, S. B., Kendall, J. C., Trombetta, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+spleen+monocytes+can+upregulate+CD11c+expression+without+converting+into+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory spleen monocytes can upregulate CD11c expression without converting into dendritic cells.</a> J Immunol. 188 (8), 3603-3610 (2012).</li>
<li>Hanada, K., Tsunoda, R., Hamada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF-induced+in+vivo+expansion+of+splenic+dendritic+cells+and+their+strong+costimulation+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">GM-CSF-induced in vivo expansion of splenic dendritic cells and their strong costimulation activity.</a> J Leukoc Biol. 60 (2), 181-190 (1996).</li>
<li>Gilboa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-based+cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">DC-based cancer vaccines.</a> J Clin Invest. 117 (5), 1195-1203 (2007).</li>
<li>Melief, C. J., van der Burg, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy+of+established+%28pre%29malignant+disease+by+synthetic+long+peptide+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines.</a> Nat Rev Cancer. 8 (5), 351-360 (2008).</li>
<li>Palucka, K., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy+via+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy via dendritic cells.</a> Nat Rev Cancer. 12 (4), 265-277 (2012).</li>
<li>Bol, K. F., Schreibelt, G., Gerritsen, W. R., de Vries, I. J., Figdor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Cell-Based+Immunotherapy%3A+State+of+the+Art+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Dendritic Cell-Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond.</a> Clin Cancer Res. 22 (8), 1897-1906 (2016).</li>
<li>Rafiq, K., Bergtold, A., Clynes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+complex-mediated+antigen+presentation+induces+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity.</a> J Clin Invest. 110 (1), 71-79 (2002).</li>
<li>Schuurhuis, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+complex-loaded+dendritic+cells+are+superior+to+soluble+immune+complexes+as+antitumor+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune complex-loaded dendritic cells are superior to soluble immune complexes as antitumor vaccine.</a> J Immunol. 176 (8), 4573-4580 (2006).</li>
<li>Carmi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+IgG+combined+with+dendritic+cell+stimuli+induce+antitumour+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity.</a> Nature. 521 (7550), 99-104 (2015).</li>
<li>Carmi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+and+SHP-1+are+DC-intrinsic+checkpoints+for+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity.</a> JCI Insight. 1 (18), e89020(2016).</li>
<li>Kenkel, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Immunosuppressive+Dendritic+Cell+Subset+Accumulates+at+Secondary+Sites+and+Promotes+Metastasis+in+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer.</a> Cancer Res. 77 (15), 4158-4170 (2017).</li>
<li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+Activation+of+CD103%28%2B%29+Dendritic+Cell+Progenitors+at+the+Tumor+Site+Enhances+Tumor+Responses+to+Therapeutic+PD-L1+and+BRAF+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition.</a> Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).</li>
<li>Roslansky, P. F., Novitsky, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+Limulus+amebocyte+lysate+%28LAL%29+to+LAL-reactive+glucans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of Limulus amebocyte lysate (LAL) to LAL-reactive glucans.</a> J Clin Microbiol. 29 (11), 2477-2483 (1991).</li>
<li>Jahr, H., Pfeiffer, G., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin-mediated+activation+of+cytokine+production+in+human+PBMCs+by+collagenase+and+Ficoll%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll.</a> J Mol Med (Berl). 77 (1), 118-120 (1999).</li>
<li>Zhang, X., Morrison, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+selective+priming+effects+on+tumor+necrosis+factor+alpha+and+nitric+oxide+production+in+mouse+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced selective priming effects on tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages.</a> J Exp Med. 177 (2), 511-516 (1993).</li>
<li>Hirohashi, N., Morrison, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+lipopolysaccharide+%28LPS%29+pretreatment+of+mouse+macrophages+modulates+LPS-dependent+interleukin-6+production+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro.</a> Infect Immun. 64 (3), 1011-1015 (1996).</li>
<li>Deng, H., Maitra, U., Morris, M., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+responsible+for+the+priming+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism responsible for the priming of macrophage activation.</a> J Biol Chem. 288 (6), 3897-3906 (2013).</li>
<li>Cella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inhibitory+receptor+%28ILT3%29+expressed+on+monocytes%2C+macrophages%2C+and+dendritic+cells+involved+in+antigen+processing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing.</a> J Exp Med. 185 (10), 1743-1751 (1997).</li>
<li>Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+limits+TNF-alpha+production+in+CD16-activated+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes.</a> Eur J Immunol. 39 (2), 561-570 (2009).</li>
<li>Rose, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+gamma+receptor+cross-linking+activates+p42%2C+p38%2C+and+JNK%2FSAPK+mitogen-activated+protein+kinases+in+murine+macrophages%3A+role+for+p42MAPK+in+Fc+gamma+receptor-stimulated+TNF-alpha+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fc gamma receptor cross-linking activates p42, p38, and JNK/SAPK mitogen-activated protein kinases in murine macrophages: role for p42MAPK in Fc gamma receptor-stimulated TNF-alpha synthesis.</a> J Immunol. 158 (7), 3433-3438 (1997).</li>
<li>Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation+of+CD11b+and+CD11c+beta%282%29+integrins+by+antibodies+or+soluble+CD23+induces+macrophage+inflammatory+protein+1alpha+%28MIP-1alpha%29+and+MIP-1beta+production+in+primary+human+monocytes+through+a+pathway+dependent+on+nuclear+factor-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB.</a> Blood. 97 (10), 2932-2940 (2001).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów i że nie mają nic do ujawnienia.

Biorąc pod uwagę dużą liczbę DC wymaganą do szczepienia myszy (około 2-4 x 106 DC na jedną mysz), większość strategii szczepień u myszy opiera się na izolacji DC od BM i śledziony, a następnie ich aktywacji ex vivo. Jednak próby aktywacji DC guza in vivo, przy użyciu tych samych warunków do aktywacji śledziony i BM DC, często kończyły się niepowodzeniem w wytwarzaniu skutecznej odporności. W dwóch kolejnych publikacjach Carmi i wsp. odkryli, że MoDC krwi i guza różnią się znacznie od...

Od momentu ich odkrycia, komórki dendrytyczne (DC) były przedmiotem szeroko zakrojonych badań ze względu na ich unikalną zdolność do wypaczania różnicowania limfocytów T1. W ciągu ostatnich kilku dekad szeroko zakrojone wysiłki badawcze miały na celu zdefiniowanie różnych podzbiorów DC i ich funkcji podczas progresji guza i odporności 2. DC składają się z heterogenicznych populacji komórek, które różnią się od siebie receptorami rozpoznawania wzorców, dystrybucją tkanek oraz zdolnościami migracyjnymi i prezentacją antygenów3,4,5. W porównaniu z innymi podzbiorami DC, DC pochodzące z monocytów (MoDC) są znacznie liczniejsze w nowotworach i mogą być łatwo generowane z krążących lub naciekających nowotwór monocytów6,7. Dlatego wiele badań klinicznych mających na celu wykorzystanie ich względnej częstości występowania opiera się na manipulacji autologicznym MoDC in vivo i ex vivo w celu wywołania odporności limfocytów T 8,9.
Podobnie, szczepienie eksperymentalnych modeli nowotworów oparte na DC wymaga 2-3 seryjnych wstrzyknięć, w odstępie 5-7 dni, po 1-2 x 106 aktywowanych DC pulsujących antygenami nowotworowymi. Dlatego, aby osiągnąć tak dużą liczbę DC, większość badań na myszach wykorzystywała przede wszystkim MoDC hodowany z prekursorów szpiku kostnego (BM) w GM-CSF przez 7-9 dni (IL-4 nie jest potrzebna w ustawieniu myszy)10,11. Niemniej jednak, biorąc pod uwagę, że myszy z nokautem GM-CSF mają ogólnie normalny przedział DC 12,13, oraz biorąc pod uwagę mieszane populacje uzyskane z tej hodowli,14, fizjologiczne znaczenie tych DC zostało zakwestionowane.
Alternatywnie, DC może być rutynowo izolowane z komórek śledziony. Jednak DC stanowi tylko około 0,3-0,8% wszystkich komórek śledziony (co daje około 7 x 105 DC/śledzionę), a spośród tych komórek tylko CD103 + DC i MoDC mogą migrować z powrotem do narządów limfatycznych. Ponieważ MoDC stanowią około 10-15% populacji DC śledziony15,16, większość protokołów izolacji daje około 1 x 105 MoDC na śledzionę. Ekspansję MoDC można osiągnąć poprzez wstrzyknięcie transfekowanych komórek B16, które wydzielają GM-CSF, co powoduje 100-krotny wzrost śledziony MoDC17. Jednak zastosowanie MoDC do opracowywania szczepionek DC jest ograniczone, ponieważ procedury tej nie można wykonać u ludzi, a uzyskane MoDC są już wysoce aktywowane.
Oprócz uzyskania odpowiedniej liczby DC, kolejnym wyzwaniem dla opracowania skutecznych szczepionek DC przeciwko autologicznym komórkom nowotworowym jest brak wystarczających sygnałów zagrożenia w otoczeniu guza, aby w pełni aktywować DC. Indukcja sygnałów kostymulujących jest zwykle osiągana poprzez aktywację receptorów rozpoznawania wzorców (PRR) lub szlaków sygnałowych lektyny typu c18,19,20,21. Dalsze podejście do aktywacji DC wykorzystuje ich zdolność do wychwytywania antygenów poprzez interakcje z powierzchniowymi receptorami Fcγ (FcγR). Rzeczywiście, wiele ważnych manuskryptów wykazało, że wstrzyknięcie MoDC z prekursorów BM aktywowanych za pomocą IC gumor-IgG może zapobiec wzrostowi guza w warunkach profilaktycznych i może prowadzić do wyeliminowania ustalonych nowotworów22,23.
W dwóch ostatnich artykułach, Carmi i wsp. odkryli, że w przeciwieństwie do BMDC i śledziony DC, MoDC z krwi i guzów nie może reagować na IgG IC bez dodatkowych bodźców. Stwierdzono, że jest to spowodowane obecnością wysokich wewnątrzkomórkowych poziomów fosfataz tyrozynowych regulujących sygnalizację FcγR24,25. Definiując krytyczny punkt kontrolny w DC, prace te dostarczyły ważnych informacji na temat wymagań dotyczących udanego szczepienia opartego na DC. Wymóg dodatkowych bodźców, aby umożliwić sygnalizację FcγR i przypuszczalnie sygnalizację z innych receptorów lektyny wykorzystujących podobną kaskadę fosforylacji, podkreśla zatem potrzebę unikania primingu DC podczas ich izolacji.
Dlatego obecny protokół opisuje izolację MoDC od krwi i guzów, które znacznie różnią się od BM i śledziony DC, i podkreśla środki ostrożności, które warto rozważyć podczas tego procesu.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM</td><td>GE-Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep</td><td>StemCell Technologies</td><td>07820</td><td></td></tr><tr><td>CD45 MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji monocytów EasySep</td><td>StemCell Technologies</td><td>19861</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Sigma</td><td>C9697-50MG</td><td>Przetestuj każdą partię na obecność endotoksyny</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25-10MG</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher</td><td>16140071</td><td>Przetestuj każdą partię na obecność endotoksyny</td></tr><tr><td>PE-CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117307</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101211</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 650 MHCII</td><td>Biolegend</td><td>107641</td><td></td></tr><tr><td>AF48- CD86</td><td>Biolegend</td><td>105017</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7-Ly-C6</td><td>Biolegend</td><td>108423</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7-CD15</td><td>Biolegend</td><td>135523</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów myszy i ich późniejsza aktywacja in vitro za pomocą nowotworowych kompleksów immunologicznych

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Komórki dendrytyczne (DC) to heterogeniczne populacje komórek, które różnią się markerami błony komórkowej, wzorcami migracji i dystrybucją, a także prezentacją antygenu i zdolnością aktywacji limfocytów T. Ponieważ większość szczepień eksperymentalnych modeli nowotworowych wymaga milionów DC, są one powszechnie izolowane ze szpiku kostnego lub śledziony. Jednak te DC znacznie różnią się od krwi i guza DC w ich odpowiedziach na kompleksy immunologiczne (IC) i przypuszczalnie na inne receptory lektyny sprzężone z Syk. Co ważne, biorąc pod uwagę wrażliwość DC na cząsteczki związane z niebezpieczeństwem, obecność endotoksyn lub przeciwciał, które sieciują receptory aktywacyjne w jednym z etapów izolacji, może powodować pobudzenie DC, a tym samym wpływać na parametry, a przynajmniej dawkę, wymaganą do ich aktywacji. Dlatego tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolowania MoDC od krwi i guzów przy jednoczesnym unikaniu ich przedwczesnej aktywacji. Ponadto zapewniony jest protokół aktywacji MoDC z IC guza i ich późniejszych analiz.

Wstępnie porównaliśmy zdolność przeciwciał pochodzących od naiwnych myszy syngenicznych i allogenicznych do wiązania się z komórkami nowotworowymi. W tym celu linie komórkowe nowotworów B16F10 i LMP utrwalono w paraformaldehydzie i dokładnie przemyto. B16F10 to linia komórkowa czerniaka, pierwotnie wyizolowana z przerzutów do płuc u myszy C57Bl/6. LMP to komórka nowotworu trzustki, wyizolowana z myszy KrasG12D/+, LSL-Trp53R172H/+ oraz Pdx-1-Cre, która wykazuje stały wzrost u myszy 129F1. ...

DC (MoDC) pochodzące z monocytów może wykrywać niewielkie ilości cząsteczek związanych z niebezpieczeństwem i dlatego jest łatwo zapoczątkowane. Przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji MoDC z krwi i nowotworów oraz ich aktywacji za pomocą kompleksów immunologicznych, podkreślając jednocześnie kluczowe środki ostrożności, które należy wziąć pod uwagę, aby uniknąć ich przedwczesnej aktywacji.

Protokół izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów myszy i ich późniejsza aktywacja in vitro za pomocą nowotworowych kompleksów immunologicznych

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Metoda ta ma na celu pomóc naukowcom w izolowaniu DC pochodzących z monocytów z krwi i guzów myszy z nowotworem w celu zbadania ich właściwości immunostymulujących. Myślę, że główną zaletą tej procedury w porównaniu z innymi metodami jest to, że uzyskane DC pochodzące z monocytów lepiej oddają swój stan aktywacji w guzie i krwi. Najtrudniejszą rzeczą jest prawdopodobnie upewnienie się, że wszystkie odczynniki i narzędzia są sterylne i że nie wprowadzisz zanieczyszczenia podczas tej procedury.Izoluję komórki szpikowe i komórki dendrytyczne z guzów od ponad 15 lat i wpadłem na pomysł tej metody, gdy zauważyłem, że różne protokoły izolacji skutkują różnymi wzorcami aktywacji komórek. Procedurę zademonstruje pani Santana-Magal, która jest studentką w moim laboratorium.Po eutanazji myszy za pomocą dwutlenku węgla wewnątrz okapu z przepływem laminarnym, wyekstrahuj guzy i umieść je w pożywce RPMI bez płodowej surowicy bydlęcej. Następnie użyj nożyczek chirurgicznych, aby pokroić guz na małe kawałki. Przenieś wszystkie kawałki guza z jednej myszy do 30-mililitrowej probówki z płaskim dnem zawierającej bufor HBSS uzupełniony kolagenazą IV i DNazą I wraz z magnetycznymi prętami mieszającymi.Inkubuj probówkę z kawałkami guza na wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszadłem magnetycznym w środku z prędkością od 200 do 400 obrotów na minutę przez 20 do 30 minut. Następnie przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 70 mikrometrów. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 400 razy g przez pięć do 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odwirowaniu dodać 1,5 mililitra roztworu podstawowego o średnim gradiencie gęstości do 8,5 mililitra HBSS. Następnie energicznie wymieszaj podłoże o gradiencie gęstości. Następnie odpipetuj mieszaninę do granulki.Odwirować zawiesinę komórkową 400 razy g przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Zdekantować supernatant po zakończeniu wirowania. Po dwukrotnym przemyciu granulowanych komórek ponownie zawiesić w jednym mililitrze buforu izolacyjnego.Dodaj zawiesinę komórkową do 30 mikrolitrów sprzężonych kulek magnetycznych CD11b. Następnie inkubuj mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Po odwirowaniu usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu izolacyjnego.Nałóż zawiesinę komórek na wstępnie umytą kolumnę magnetyczną. Następnie użyj trzech mililitrów buforu izolacyjnego, aby dwukrotnie umyć kolumnę. Następnie zdejmij kolumnę z magnesu.Następnie dodaj sześć mililitrów buforu izolacyjnego w kolumnie. Naciskać tłokiem, aby wypłukać magnetycznie oznakowane komórki w sterylnej probówce zbiorczej. Ponownie odwiruj komórki w temperaturze 400 razy g przez pięć do 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po ponownym wyparowaniu i zabarwieniu komórek, posortuj komórki, bramkując małe komórki, używając małego boku i małego rozproszenia do przodu. Po eutanazji myszy spryskaj ją 70% etanolem. Następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych usuń skórę pokrywającą serce pod kapturem laminarnym.Następnie wyczyść nożyczki etanolem. Umyj jamę 20-milimolowym EDTA HBSS i użyj nożyczek, aby przeciąć prawy przedsionek serca. Następnie użyj 10-mililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 25, aby powoli przepłukać prawą komorę serca 20-milimolowym EDTA HBSS.Następnie za pomocą sterylnej strzykawki należy pobrać krew z jamy opłucnej. Przenieść krew w probówce zawierającej siarczan heparanu i EDTA. Następnie odpipetuj krew na pożywce o gradiencie gęstości.Odwirować krwinki z prędkością 400 g przez 15 minut w temperaturze pokojowej z niskim hamulcem. Po odwirowaniu zbierz komórki jednojądrzaste w probówce. Rozpuść komórki w 10 mililitrach buforu izolacyjnego, aby przepłukać komórki.Ponownie odwiruj komórki w temperaturze 400 razy g przez pięć do 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby wybrać komórki CD11b, ponownie zawieś osad ogniwa w jednym mililitrze bufora izolacyjnego. Inkubować przez 15 minut z 50 mikrolitrami sprzężonych kulek magnetycznych CD11b w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odwirować 400 razy g przez pięć do 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. Następnie usunąć supernatant. Zawiesić osad w jednym mililitrze buforu izolacyjnego.Następnie nałóż zawiesinę komórek na wstępnie umytą kolumnę magnetyczną. Dwukrotnie przemyć kolumnę buforem izolacyjnym. Wyjmij kolumnę z magnesu i dodaj sześć mililitrów buforu izolacyjnego na kolumnę.Następnie wypłukać magnetycznie znakowane komórki w sterylnej probówce zbiorczej, naciskając tłok. Odwirować komórki z prędkością 400 razy g przez pięć do 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić komórki w izolacji, buforze i wybarwić przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem.Sortuj komórki, bramkując małe komórki za pomocą małego boku i małego rozproszenia do przodu. Najpierw utrwal komórki w 1,8% buforowanym paraformaldehydzie przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wysiewaj zawiesinę komórkową w każdym dołku 96-dołkowej płytki w kształcie litery U.Następnie dodaj różne rozcieńczenia przeciwciał wiążących nowotwór do każdej studzienki. Następnie inkubować komórki na lodzie przez 15 do 20 minut. Po inkubacji przemyć komórki 150 mikrolitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami.Następnie odwirować w temperaturze 400 razy g przez pięć do 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu usunąć supernatant i dwukrotnie umyć komórki. Rozpuść komórki w 100 mikrolitrach buforu FACS zawierającego przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem.Następnie inkubuj płytkę na lodzie przez 15 do 20 minut. Po 15 do 20 minutach dodaj 200 mikrolitrów buforu FACS, aby przepłukać komórki. Odwirować płytkę w temperaturze 400 razy g przez pięć do 10 minut.Zdekantować supernatant. Przeprowadź cytometrię przepływową, aby przeanalizować wiązanie guza i określić minimalne stężenie immunoglobuliny G wymagane do pokrycia komórek. Gdy komórki zostaną pokryte minimalnym stężeniem immunoglobuliny G, dodaj znakowany CFSE kompleks immunologiczny guza do komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów w stosunku od jednego do pięciu.Następnie inkubować mieszaninę przez 12 do 16 godzin przez noc w kompletnym pożywce. Wykonaj analizę FACS aktywacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów. Średnią intensywność fluorescencji oblicza się po analizie cytometrii przepływowej w celu zbadania obecności przeciwciał IgG i M, które wiążą komórki nowotworowe LMP ex vivo.Wyniki pokazują, że przeciwciała IgG od myszy allogenicznych C57-Black / 6 wiążą komórki nowotworowe znacznie silniej niż przeciwciała myszy syngenicznych 129S1. Następnie oblicza się średnią intensywność fluorescencji zdolności wiązania komórek nowotworowych B16F10 z IgG. IgG uzyskane od myszy allogenicznych 129S1 wykazuje 10-krotnie wyższą intensywność barwienia guzem B16F10 w porównaniu do syngenicznej IgG z myszy C57-Black/6.Następnie wykonywane są obrazy mikroskopowe DIC, aby pokazać związane z nowotworem, pochodzące z monocytów komórki dendrytyczne z guzów B16F10. W tym przypadku rejestrowane są obrazy DIC, aby pokazać zapalne i patrolujące komórki dendrytyczne pochodzące z monocytów wyizolowane z krwi myszy z guzem B16F10. Przeprowadza się również analizę cytometrii przepływowej w celu porównania wzorców aktywacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów ze śledziony i szpiku kostnego z guzem i krwią podczas inkubacji z kompleksem odpornościowym.Wynik wskazuje na zwiększoną ekspresję CD86 i MHC II przez szpik kostny i komórki dendrytyczne śledziony z kompleksami immunologicznymi. Następnie przeprowadza się immunohistochemię konfokalną, która pokazuje wychwyt guza i ekspresję MHC II, gdy komórki dendrytyczne są inkubowane z kompleksem immunologicznym guza znakowanym CFSE. Po opanowaniu tej procedury można wykonać w ciągu kilku godzin, w zależności od liczby używanych myszy.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby wszystkie odczynniki i narzędzia były zawsze sterylne. Futro myszy jest głównym źródłem zanieczyszczeń. Upewnij się, że żaden z włosków nie dotyka tkanek.Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu dobrze zrozumiesz, jak wyizolować DC pochodzące z monocytów z krwi myszy i guzów oraz jak następnie aktywować je za pomocą komórek kompleksu odpornościowego, unikając ich przedwczesnej aktywacji.

isolation-protocol-mouse-monocyte-derived-dendritic-cells-their

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejsza procedura opisuje detekcję i izolację leukocytów TH17 myszy, które po stymulacji aktywnie wydzielają IL-17.

Wykrywanie i izolacja żywych limfocytów T wydzielających IL-17 u myszy

Opisano metodę otrzymywania wysoce oczyszczonej preparacji komórek dendrytycznych z płuc myszy. Szczególny nacisk położono na izolację podgrupy konwencjonalnych komórek dendrytycznych.

Izolacja komórek dendrytycznych z płuc myszy

W niniejszym raporcie opisujemy protokół izolacji wysoko oczyszczonych populacji leukocytów infiltrujących guzy. Protokół ten został opracowany na podstawie metody firmy Miltenyi Biotech w celu zwiększenia wydajności i czystości izolacji komórek z złożonej tkanki nowotworowej.

Izolacja komórek odpornościowych z guzów pierwotnych

Ten film demonstruje protokół oceny aktywacji komórek dendrytycznych za pomocą komórek nowotworowych pokrytych immunoglobuliną G (IgG). Komórki dendrytyczne internalizują komórki nowotworowe pokryte IgG, przetwarzają antygeny nowotworowe i prezentują je na powierzchni za pomocą cząsteczek MHC-II, wraz z koekspresją cząsteczki kostymulującej CD86. Te komórki dendrytyczne są następnie poddawane immunobarwieniu ukierunkowanemu na MHC-II i CD86 oraz analizie cytometrii przepływowej w celu...

Oparta na cytometrii przepływowej analiza aktywacji komórek dendrytycznych przy użyciu kompleksów immunologicznych

Odrębne podzbiory komórek dendrytycznych istnieją jako rzadkie populacje w narządach limfoidalnych, dlatego są trudne do wyizolowania w wystarczającej liczbie i czystości do eksperymentów immunologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę o wysokiej skuteczności i wysokiej wydajności do izolacji wszystkich obecnie znanych głównych podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony myszy.

Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

Limfocyty są głównymi graczami w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania limfocytów w celu określenia funkcji fizjologicznych pożądanych cząsteczek w aktywacji limfocytów in vitro i in vivo. Opisane procedury doświadczalne są odpowiednie do porównania zdolności funkcjonalnych między limfocytami kontrolnymi a genetycznie zmodyfikowanymi.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

Tutaj prezentujemy protokół do określenia in vivo aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 naiwnych komórek T CD4 (limfocytów T) indukowanych przez komórki dendrytyczne (DC) pochodzące ze szpiku kostnego GM-CSF. Ponadto protokół ten opisuje izolację komórek BM i T, wytwarzanie prądu stałego oraz transfer adoptywny komórek DC i T.

Mysi model in vivo do pomiaru naiwnej aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 limfocytów T CD4 indukowanych przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego

Urządzenie lub płytka do transimmunizacji (TI) i związane z nim protokoły zostały opracowane w celu odtworzenia kluczowych cech pozaustrojowej fotochemoterapii (ECP), w warunkach eksperymentalnych, pozwalając na produkcję fizjologicznie aktywowanych, przestrajalnych komórek dendrytycznych (DC) do immunoterapii raka.

Nowy protokół generowania fizjologicznych immunogennych komórek dendrytycznych

Tutaj prezentujemy ekonomiczną i efektywną metodę izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego o wysokiej czystości od myszy po 7 dniach hodowli z 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Ekonomiczny i wydajny protokół izolacji i hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Opisujemy procedurę oceny zdolności środków farmakologicznych do generowania tolerogennych komórek dendrytycznych z naiwnych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów in vitro i walidacji ich siły poprzez autologiczne generowanie regulatorowych limfocytów T.

Prosta i skuteczna metoda testowania środków immunomodulujących do wytwarzania tolerogennych komórek dendrytycznych z ludzkich monocytów CD14+

Poznaj metodę izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów myszy z krwi i guzów oraz ich aktywację kompleksami immunologicznymi. Protokół zapewnia zachowanie sterylności i dokładne odwzorowanie stanu aktywacji komórek.

Protokół izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów myszy i ich późniejsza aktywacja in vitro za pomocą nowotworowych kompleksów immunologicznych (Wideo) | JoVE Journal

Protokół izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów myszy i ich późniejsza aktywacja in vitro za pomocą nowotworowych kompleksów immunologicznych

Przeglądaj więcej filmów