Protokół izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów myszy i ich późniejsza aktywacja in vitro za pomocą nowotworowych kompleksów immunologicznych

Metoda ta ma na celu pomóc naukowcom w izolowaniu DC pochodzących z monocytów z krwi i guzów myszy z nowotworem w celu zbadania ich właściwości immunostymulujących. Myślę, że główną zaletą tej procedury w porównaniu z innymi metodami jest to, że uzyskane DC pochodzące z monocytów lepiej oddają swój stan aktywacji w guzie i krwi. Najtrudniejszą rzeczą jest prawdopodobnie upewnienie się, że wszystkie odczynniki i narzędzia są sterylne i że nie wprowadzisz zanieczyszczenia podczas tej procedury.

Izoluję komórki szpikowe i komórki dendrytyczne z guzów od ponad 15 lat i wpadłem na pomysł tej metody, gdy zauważyłem, że różne protokoły izolacji skutkują różnymi wzorcami aktywacji komórek. Procedurę zademonstruje pani Santana-Magal, która jest studentką w moim laboratorium.

Po eutanazji myszy za pomocą dwutlenku węgla wewnątrz okapu z przepływem laminarnym, wyekstrahuj guzy i umieść je w pożywce RPMI bez płodowej surowicy bydlęcej. Następnie użyj nożyczek chirurgicznych, aby pokroić guz na małe kawałki. Przenieś wszystkie kawałki guza z jednej myszy do 30-mililitrowej probówki z płaskim dnem zawierającej bufor HBSS uzupełniony kolagenazą IV i DNazą I wraz z magnetycznymi prętami mieszającymi.

Inkubuj probówkę z kawałkami guza na wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszadłem magnetycznym w środku z prędkością od 200 do 400 obrotów na minutę przez 20 do 30 minut. Następnie przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 70 mikrometrów. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 400 razy g przez pięć do 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po odwirowaniu dodać 1,5 mililitra roztworu podstawowego o średnim gradiencie gęstości do 8,5 mililitra HBSS. Następnie energicznie wymieszaj podłoże o gradiencie gęstości. Następnie odpipetuj mieszaninę do granulki.

Odwirować zawiesinę komórkową 400 razy g przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Zdekantować supernatant po zakończeniu wirowania. Po dwukrotnym przemyciu granulowanych komórek ponownie zawiesić w jednym mililitrze buforu izolacyjnego.

Dodaj zawiesinę komórkową do 30 mikrolitrów sprzężonych kulek magnetycznych CD11b. Następnie inkubuj mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Po odwirowaniu usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu izolacyjnego.

Nałóż zawiesinę komórek na wstępnie umytą kolumnę magnetyczną. Następnie użyj trzech mililitrów buforu izolacyjnego, aby dwukrotnie umyć kolumnę. Następnie zdejmij kolumnę z magnesu.

Następnie dodaj sześć mililitrów buforu izolacyjnego w kolumnie. Naciskać tłokiem, aby wypłukać magnetycznie oznakowane komórki w sterylnej probówce zbiorczej. Ponownie odwiruj komórki w temperaturze 400 razy g przez pięć do 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po ponownym wyparowaniu i zabarwieniu komórek, posortuj komórki, bramkując małe komórki, używając małego boku i małego rozproszenia do przodu. Po eutanazji myszy spryskaj ją 70% etanolem. Następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych usuń skórę pokrywającą serce pod kapturem laminarnym.

Następnie wyczyść nożyczki etanolem. Umyj jamę 20-milimolowym EDTA HBSS i użyj nożyczek, aby przeciąć prawy przedsionek serca. Następnie użyj 10-mililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 25, aby powoli przepłukać prawą komorę serca 20-milimolowym EDTA HBSS.

Następnie za pomocą sterylnej strzykawki należy pobrać krew z jamy opłucnej. Przenieść krew w probówce zawierającej siarczan heparanu i EDTA. Następnie odpipetuj krew na pożywce o gradiencie gęstości.

Odwirować krwinki z prędkością 400 g przez 15 minut w temperaturze pokojowej z niskim hamulcem. Po odwirowaniu zbierz komórki jednojądrzaste w probówce. Rozpuść komórki w 10 mililitrach buforu izolacyjnego, aby przepłukać komórki.

Ponownie odwiruj komórki w temperaturze 400 razy g przez pięć do 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby wybrać komórki CD11b, ponownie zawieś osad ogniwa w jednym mililitrze bufora izolacyjnego. Inkubować przez 15 minut z 50 mikrolitrami sprzężonych kulek magnetycznych CD11b w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odwirować 400 razy g przez pięć do 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. Następnie usunąć supernatant. Zawiesić osad w jednym mililitrze buforu izolacyjnego.

Następnie nałóż zawiesinę komórek na wstępnie umytą kolumnę magnetyczną. Dwukrotnie przemyć kolumnę buforem izolacyjnym. Wyjmij kolumnę z magnesu i dodaj sześć mililitrów buforu izolacyjnego na kolumnę.

Następnie wypłukać magnetycznie znakowane komórki w sterylnej probówce zbiorczej, naciskając tłok. Odwirować komórki z prędkością 400 razy g przez pięć do 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić komórki w izolacji, buforze i wybarwić przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem.

Sortuj komórki, bramkując małe komórki za pomocą małego boku i małego rozproszenia do przodu. Najpierw utrwal komórki w 1,8% buforowanym paraformaldehydzie przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wysiewaj zawiesinę komórkową w każdym dołku 96-dołkowej płytki w kształcie litery U.

Następnie dodaj różne rozcieńczenia przeciwciał wiążących nowotwór do każdej studzienki. Następnie inkubować komórki na lodzie przez 15 do 20 minut. Po inkubacji przemyć komórki 150 mikrolitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami.

Następnie odwirować w temperaturze 400 razy g przez pięć do 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu usunąć supernatant i dwukrotnie umyć komórki. Rozpuść komórki w 100 mikrolitrach buforu FACS zawierającego przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem.

Następnie inkubuj płytkę na lodzie przez 15 do 20 minut. Po 15 do 20 minutach dodaj 200 mikrolitrów buforu FACS, aby przepłukać komórki. Odwirować płytkę w temperaturze 400 razy g przez pięć do 10 minut.

Zdekantować supernatant. Przeprowadź cytometrię przepływową, aby przeanalizować wiązanie guza i określić minimalne stężenie immunoglobuliny G wymagane do pokrycia komórek. Gdy komórki zostaną pokryte minimalnym stężeniem immunoglobuliny G, dodaj znakowany CFSE kompleks immunologiczny guza do komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów w stosunku od jednego do pięciu.

Następnie inkubować mieszaninę przez 12 do 16 godzin przez noc w kompletnym pożywce. Wykonaj analizę FACS aktywacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów. Średnią intensywność fluorescencji oblicza się po analizie cytometrii przepływowej w celu zbadania obecności przeciwciał IgG i M, które wiążą komórki nowotworowe LMP ex vivo.

Wyniki pokazują, że przeciwciała IgG od myszy allogenicznych C57-Black / 6 wiążą komórki nowotworowe znacznie silniej niż przeciwciała myszy syngenicznych 129S1. Następnie oblicza się średnią intensywność fluorescencji zdolności wiązania komórek nowotworowych B16F10 z IgG. IgG uzyskane od myszy allogenicznych 129S1 wykazuje 10-krotnie wyższą intensywność barwienia guzem B16F10 w porównaniu do syngenicznej IgG z myszy C57-Black/6.

Następnie wykonywane są obrazy mikroskopowe DIC, aby pokazać związane z nowotworem, pochodzące z monocytów komórki dendrytyczne z guzów B16F10. W tym przypadku rejestrowane są obrazy DIC, aby pokazać zapalne i patrolujące komórki dendrytyczne pochodzące z monocytów wyizolowane z krwi myszy z guzem B16F10. Przeprowadza się również analizę cytometrii przepływowej w celu porównania wzorców aktywacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów ze śledziony i szpiku kostnego z guzem i krwią podczas inkubacji z kompleksem odpornościowym.

Wynik wskazuje na zwiększoną ekspresję CD86 i MHC II przez szpik kostny i komórki dendrytyczne śledziony z kompleksami immunologicznymi. Następnie przeprowadza się immunohistochemię konfokalną, która pokazuje wychwyt guza i ekspresję MHC II, gdy komórki dendrytyczne są inkubowane z kompleksem immunologicznym guza znakowanym CFSE. Po opanowaniu tej procedury można wykonać w ciągu kilku godzin, w zależności od liczby używanych myszy.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby wszystkie odczynniki i narzędzia były zawsze sterylne. Futro myszy jest głównym źródłem zanieczyszczeń. Upewnij się, że żaden z włosków nie dotyka tkanek.

Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu dobrze zrozumiesz, jak wyizolować DC pochodzące z monocytów z krwi myszy i guzów oraz jak następnie aktywować je za pomocą komórek kompleksu odpornościowego, unikając ich przedwczesnej aktywacji.