Prosta i skuteczna metoda testowania środków immunomodulujących do wytwarzania tolerogennych komórek dendrytycznych z ludzkich monocytów CD14⁺

Staramy się zrozumieć, jakie terapie immunomodulujące mogą generować tolerowane komórki dendrytyczne z już zróżnicowanych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów, a to jest bardzo cenne dla badań autoimmunologicznych i transplantacyjnych. Samoterapie stają się coraz bardziej praktyczne ze względu na postęp w produkcji, a tolerogenne komórki dendrytyczne okazały się obiecujące w badaniach przedklinicznych. Mogą generować tolerancję specyficzną dla antygenu. Najczęściej stosuje się cytometrię. Zapewnia to szybki i dostępny sposób analizy tolerowanych komórek. Wyzwaniem jest wytworzenie tolerogennych komórek dendrytycznych, które utrzymują się w obu tych funkcjach in vivo. Z tego powodu nie ma klinicznie zatwierdzonych terapii komórkami dendrytycznymi, które byłyby tolerowane. Zidentyfikowaliśmy nowe kombinacje związków immunomodulujących z dużych badań przesiewowych, które wykazują poprawę funkcjonalności tolerowanych komórek dendrytycznych. Opracowujemy również tolerancyjne preparaty nanocząstek.

[Instruktor] Na początek umieść 15-mililitrowe probówki zawierające wzbogacone ludzkie monocyty i limfocyty T w wirówce. Po zakończeniu wirowania użyć pipety, aby zassać supernatant z probówek. Dodaj jeden mililitr pożywki hodowlanej MODC do osadu monocytów, jeden mililitr pożywki do hodowli komórek T do probówki z limfocytami T i dobrze wymieszaj przed zliczeniem komórek. Następnie dodaj dziewięć mililitrów ciepłej pożywki hodowlanej MODC do zawiesiny monocytów, aby uzyskać ostateczną objętość 10 mililitrów. Następnie odpipetować po 100 mikrolitrów roztworów podstawowych GM-CSF i IL-4. Przenieść zawiesinę na oznakowaną szalkę Petriego, oznaczoną jako MODC, i rozpocząć inkubację. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki do zamrażania komórek T do zawiesiny komórek T. Podziel mieszaninę na dwie dwumililitrowe fiolki kriogeniczne. Umieść szczelnie zamknięte fiolki kriogeniczne w komorze zamrażania z rurkami równoważącymi w nieużywanych studzienkach. Czwartego dnia dodaj pięć mililitrów świeżej pożywki hodowlanej MODC do probówki monocytów. Następnie pipetować po 100 mikrolitrów roztworów podstawowych GM-CSF i IL-4 po siedem i inkubować do siódmego dnia. Siódmego dnia przenieś zróżnicowane komórki dendrytyczne pochodzące z monocytów lub MDOC do 50-mililitrowej probówki i odwiruj jak poprzednio. Dodaj jeden mililitr ciepłej pożywki hodowlanej MODC do osadu komórkowego i pipetuj w górę iw dół, aby dobrze wymieszać. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć zawiesinę ciepłą pożywką hodowlaną MODC zawierającą GM-CSF i IL4 aż do uzyskania pożądanego stężenia komórek. Dozować 100 mikrolitrów zawiesiny zawierającej 30 000 komórek do każdej studzienki płaskiej 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Dodaj jeden mikrolitr leków immunomodulujących do wyznaczonych studzienek i inkubuj. Następnego dnia odwirować płytkę MODC o sile 300 G przez pięć minut. Po delikatnym usunięciu supernatantu delikatnie dodaj 200 mikrolitrów ciepłego HBSS na bok płytki i odwiruj. Ponownie dodać 100 mikrolitrów ciepłej pożywki hodowlanej MODC zawierającej GM-CSF i IL4 po aspiracji supernatantu. Jeśli stosowana jest immunostymulacja, dodaj jeden mikrolitr 100-krotnego zapasu lipopolisacharydu do wyznaczonych dołków i inkubuj. Ósmego dnia rozmrozić dwie fiolki kriogeniczne w gorącej kąpieli kulkowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż zawartość zacznie się topić. Po częściowym rozmrożeniu przenieść fiolki do kaptura do hodowli komórkowych. Następnie dodaj jeden mililitr ciepłej pożywki do hodowli komórek T, aby szybko rozmrozić komórki. Przenieś zawartość do probówki o pojemności 50 mililitrów i przepłucz fiolki kriogeniczne dodatkowym mililitrem pożywki do hodowli komórek T, aby zebrać wszystkie komórki. Uzupełnij zawiesinę płynnym roztworem barwiącym do 15 mililitrów i odwiruj. Ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach przepływowego roztworu barwiącego i ponownie odwirować, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze ciepłej pożywki do hodowli komórek T po odpipetowaniu supernatantu. Dodaj dziewięć mililitrów ciepłej pożywki do hodowli komórek T, aby uzyskać końcową objętość 10 mililitrów. Przenieść zawiesinę na szalkę Petriego oznaczoną jako Rozmrożone limfocyty T i inkubować. W ósmym dniu odwirować płytkę MODC o stężeniu 300 G przez pięć minut. Po odpipetowaniu supernatantu dodać 200 mikrolitrów płynnego roztworu barwiącego do każdej studzienki i inkubować. Następnie pipetować w górę i w dół, aby usunąć przyczepione komórki i zawiesinę komórek na nową, 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V przed ponownym odwirowaniem. Odpipetować 50 mikrolitrów przeciwciała inhibitora wiązania receptora FC do każdej studzienki po zasysaniu supernatantu w celu zablokowania niespecyficznego wiązania. Po inkubacji płytki w temperaturze pokojowej przez 30 minut, dodać 50 mikrolitrów przygotowanego koktajlu przeciwciał z panelu walidacyjnego do każdej studzienki. Wymieszaj 50 mikrolitrów kulek kompensacyjnych z 50 mikrolitrami każdego rozcieńczonego przeciwciała w 1,5 mililitrowych probówkach i inkubuj. Odwirować płytkę o stężeniu 300 G przez pięć minut. Ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach płynnego roztworu barwiącego, aby umyć komórki. Po końcowym płukaniu i odwirowaniu ponownie zawieś komórki w 110 mikrolitrach roztworu do barwienia przepływowego do analizy cytometrycznej przepływowej. W przypadku tolerogennych MODC należy zastąpić koktajl przeciwciał koktajlem z panelem tolerancji. Dziewiątego dnia przenieś rozmrożoną szalkę Petriego z komórek T do 50-mililitrowej probówki i uzupełnij probówkę płynnym roztworem barwiącym. Użyj drugiej probówki zawierającej niebarwione limfocyty T do analizy trygonometrycznej. Wirować probówki z prędkością 250 G przez pięć minut. Po usunięciu supernatantu ponownie zawieś komórki w ciepłym pożywce do hodowli komórek. Policz limfocyty T i upewnij się, że uzyskano co najmniej 4 miliony komórek. Odwirować płytkę MODC o sile 300 G przez pięć minut. Po odessaniu supernatantów dodaj 200 mikrolitrów limfocytów T do każdej studzienki. Dodaj niebarwione limfocyty T do płytek do analizy trygonometrycznej. Dodaj 25 mikrolitrów na mililitr koktajlu przeciwciał anty-CD3 / CD28 do wszystkich grup z wyjątkiem studzienek kontroli ujemnej, aby stymulować limfocyty T i inkubować do 12 dnia. Następnie przenieś wszystkie zawiesiny komórek z 96-dołkowej płytki hodowlanej na płytkę z dnem w kształcie litery V z roztworem barwiącym przepływowym. Umyj komórki dwukrotnie w 200 mikrolitrach płynnego roztworu barwiącego. Odłóż na bok kilka komórek do kontroli kompensacji. Po drugim umyciu odwirować płytkę. Następnie dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała inhibitora wiązania receptora FC do każdej studzienki i inkubuj. Po zakończeniu inkubacji dodać 50 mikrolitrów przygotowanego koktajlu przeciwciał z panelem trygonometrycznym do każdej studzienki. W przypadku kontroli kompensacyjnych wymieszaj 50 mikrolitrów niebarwionych komórek kompensacyjnych z 50 mikrolitrami każdego pojedynczego barwionego przeciwciała. Inkubować płytkę i kontrole kompensacyjne w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę, a następnie przemyć roztworem barwiącym przed odwirowaniem. Teraz zabarwić komórki żywym/martwym barwnikiem bliskiej podczerwieni rozcieńczonym w HBSS w ilości 200 mikrolitrów na studzienkę przed inkubacją na zimno. Umyć i odwirować płytkę przed barwieniem za pomocą Fox P3 i analizy cytometrii przepływowej. W pierwszym dniu niezróżnicowane monocyty były głównie HLA-DR-minus z małym minusem CD14, podczas gdy zróżnicowane monocyty w siódmym dniu wykazywały większość komórek jako HLA-DR-plus CD14 minus, CD1c-plus, CD141 plus. Leczenie rapamycyną, zarówno z lipopolisacharydem, jak i bez niego, znacznie zmniejszyło populacje DC-SIGN-plus CD1c-plus i zahamowało regulację w górę markerów CD86 i CD40 obserwowaną podczas samego leczenia LPS. Populacje komórek regulatorowych T FOX P3-plus zostały zwiększone, gdy MDC były hodowane jednocześnie z komórkami T. Nie zaobserwowano jednak istotnych różnic między czterema grupami leczonymi MOPC. Proliferacja limfocytów T była zmniejszona zarówno w populacjach limfocytów T CD4-plus, jak i CD8 plus po jednoczesnej hodowli z MDOC traktowanymi Rapa. Próbki poddane działaniu interleukiny-10 znacznie zwiększały produkcję interleukiny-10 po 24 godzinach. MDOC leczone DEX znacznie zwiększyły produkcję interleukiny-10, ale dopiero po odpoczynku przez 72 godziny. Wstępne leczenie deksametazonem zmniejszyło średnie wytwarzanie TNF alfa po leczeniu LPS po 24 godzinach. Znaczące zwiększenie liczby MDOC PDL1-plus zaobserwowano w grupach leczonych Dex plus LPS i Rapa po 72 godzinach. Zahamowanie ekspresji CD86 obserwowano we wszystkich grupach leczonych immunomodulatorami zarówno po 24, jak i 72 godzinach. MDOC leczone immunomodulatorem nie zwiększały proliferacji limfocytów T CD4 plus.