Oparta na cytometrii przepływowej analiza aktywacji komórek dendrytycznych przy użyciu kompleksów immunologicznych
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 3:35 min • July 8th, 2025
Zacznij od chemicznie utrwalonej zawiesiny komórek nowotworowych.
Dodaj optymalne stężenie immunoglobuliny G wiążącej nowotwór, która wiąże się z antygenami powierzchniowymi komórek nowotworowych, tworząc kompleksy immunologiczne lub IC.
Przenieść IC na płytkę hodowlaną zawierającą przylegające komórki dendrytyczne. Inkubować.
Komórka dendrytyczna rozpoznaje układ scalony, internalizuje go i przetwarza na fragmenty peptydowe.
Fragmenty są ładowane na cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy II lub MHC-II i prezentowane na powierzchni komórki wraz z cząsteczką kostymulującą CD86.
Usuń nośnik. Dodaj bufor dysocjacyjny komórek i energicznie pipetuj, aby odłączyć komórki.
Przenieś komórki do probówki.
Odwirować i ponownie zawiesić komórki w roztworze blokującym, aby zablokować niespecyficzne interakcje.
Nakładka z koktajlem przeciwciał znakowanych fluoroforem ukierunkowanym na MHC-II i CD86.
Dodaj barwnik wiążący DNA i krótko inkubuj, aby wybarwić martwe jądra komórkowe.
Za pomocą cytometrii przepływowej zidentyfikuj żywe komórki wykazujące współekspresję MHC-II i CD86, potwierdzając aktywację komórek dendrytycznych za pośrednictwem IC.
Najpierw utrwal komórki w 1,8% buforowanym paraformaldehydzie przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wysiewaj zawiesinę komórkową w każdym dołku 96-dołkowej płytki w kształcie litery U. Następnie dodaj różne rozcieńczenia przeciwciał wiążących nowotwór do każdej studzienki. Następnie inkubować komórki na lodzie przez 15 do 20 minut.
Po inkubacji przemyć komórki 150 mikrolitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, a następnie odwirować przy 400 razy g przez 5 do 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu usunąć supernatant i dwukrotnie umyć komórki. Rozpuść komórki w 100 mikrolitrach buforu FACS, zawierającego przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem. Następnie inkubuj płytkę na lodzie przez 15 do 20 minut.
Po 15 do 20 minutach dodaj 200 mikrolitrów buforu FACS, aby przepłukać komórki. Odwirować płytkę 400 razy g przez 5 do 10 minut. Zdekantować supernatant. Przeprowadź cytometrię przepływową w celu analizy wiązania guza i określenia minimalnego stężenia immunoglobuliny G wymaganego do pokrycia komórek.
Gdy komórki zostaną pokryte minimalnym stężeniem immunoglobuliny G, dodaj kompleks immunologiczny guza znakowany CFSE do komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów w stosunku 1:5. Następnie inkubować mieszaninę przez 12 do 16 godzin przez noc w kompletnym pożywce. Wykonaj analizę FACS aktywacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów.
Przegląd
W niniejszym artykule opisano metodę aktywacji komórek dendrytycznych z wykorzystaniem immunoglobulin G wiążących się z nowotworem oraz kompleksów immunologicznych. Proces ten polega na inkubacji komórek dendrytycznych z tymi kompleksami, a następnie przeprowadzeniu analizy metodą cytometrii przepływowej w celu potwierdzenia aktywacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Badania nad rakiem
Wstęp
- Komórki dendrytyczne odgrywają kluczową rolę w odpowiedzi immunologicznej.
- Aktywacja komórek dendrytycznych może nasilić odporność przeciwnowotworową.
- Kompleksy immunologiczne mogą ułatwiać pobieranie antygenów przez komórki dendrytyczne.
- Cytometria przepływowa jest kluczową techniką analizy markerów powierzchniowych komórek.
Cel badania
- Opracowanie protokołu aktywacji komórek dendrytycznych przy użyciu przeciwciał wiążących się z nowotworem.
- Ocena skuteczności kompleksów immunologicznych w stymulacji komórek dendrytycznych.
- Analiza ekspresji MHC-II i CD86 jako markerów aktywacji.
Zastosowane metody
- Przygotowanie zawiesiny komórek nowotworowych i kompleksów immunologicznych.
- Inkubacja komórek dendrytycznych z kompleksami immunologicznymi.
- Cytometria przepływowa w celu analizy markerów powierzchniowych komórek.
- Zastosowanie przeciwciał znakowanych fluoroforami do detekcji.
Główne wyniki
- Skuteczna internalizacja kompleksów immunologicznych przez komórki dendrytyczne.
- Zwiększona ekspresja MHC-II i CD86 na aktywowanych komórkach dendrytycznych.
- Cytometria przepływowa potwierdziła status aktywacji komórek dendrytycznych.
Wnioski
- Metoda ta skutecznie aktywuje komórki dendrytyczne przy użyciu przeciwciał wiążących się z nowotworem.
- Cytometria przepływowa jest niezawodną techniką oceny aktywacji komórek dendrytycznych.
- Podejście to może usprawnić strategie immunoterapii raka.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia funkcjonalną walidację aktywacji komórek dendrytycznych poprzez pobieranie antygenu za pomocą kompleksów immunologicznych, zapewniając odczyt mechanistyczny do oceny kandydatów immunomodulujących. Poprzez powiązanie przetwarzania antygenu z ekspresją powierzchniową MHC-II i CD86, protokół ten wspiera ograniczanie ryzyka związanego z celem w programach immunoonkologicznych. Odczyt oparty na cytometrii przepływowej dostarcza ilościowych, powtarzalnych danych niezbędnych do podejmowania decyzji go/no-go we wczesnej fazie odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Analiza szlaków aktywacji komórek dendrytycznych poprzez internalizację i prezentację antygenu.
- Wartość operacyjna: Wykorzystanie koekspresji MHC-II i CD86 jako funkcjonalnych biomarkerów kompetencji komórek prezentujących antygen.
- Wartość prognostyczna: Umożliwia mechanistyczną ocenę ryzyka immunomodulatorów poprzez potwierdzenie zdolności do przetwarzania antygenów.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Generuje zestandaryzowane odczyty aktywacji komórek dendrytycznych do przesiewania związków.
- Wynik ilościowy: Cytometria przepływowa mierzy koekspresję MHC-II i CD86 jako wskaźniki aktywacji.
- Powtarzalność: Określone protokoły inkubacji i barwienia umożliwiają przeniesienie analizy między zespołami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie kliniczne: Modeluje funkcję komórek prezentujących antygen w kontekście immunologicznym guza.
- Ciągłość translacyjna: Łączy aktywację in vitro z potencjałem odpowiedzi immunologicznej adaptacyjnej.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o kompetencje funkcjonalne komórek dendrytycznych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć w dziedzinie immuno-onkologii – od walidacji celu po optymalizację wiodącego związku – gdzie aktywacja komórek dendrytycznych pozwala przewidzieć potencjał immunoterapeutyczny.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotez dotyczących poboru i przetwarzania antygenów w komórkach dendrytycznych.
- Przesiewanie: Dostarczanie powtarzalnych odczytów aktywacji do profilowania immunomodulatorów.
- Analityka: Dostarczanie danych o koekspresji MHC-II/CD86 w celu porównania efektów działania związków.
- Badania translacyjne: Łączenie aktywacji komórek dendrytycznych z potencjałem do primingu limfocytów T.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzenie platformy wielokrotnego użytku do charakteryzacji immunomodulatorów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Potwierdza zdolność do przetwarzania i prezentacji antygenu jako biomarker mechanistyczny.
- Wartość operacyjna: Zestandaryzowany schemat cytometrii przepływowej zapewnia powtarzalność analizy.
- Wartość strategiczna: Poprawia przewidywanie skuteczności immunomodulatorów w modelach przedklinicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów w oparciu o ryzyko przy zweryfikowanej aktywacji komórek dendrytycznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek dendrytycznych i cytometrii przepływowej.
- Zależne od dostępu do cytometru przepływowego i przeciwciał konjugowanych z fluoroforami.
- Wymaga standaryzacji przygotowania kompleksów immunologicznych oraz stosunków liczby komórek dendrytycznych.
- Adaptacja do modeli ludzkich lub specyficznych dla danej choroby może wymagać optymalizacji.
- Ograniczone do odczytów aktywacji; nie obejmuje późniejszych odpowiedzi limfocytów T.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Test in vitro w celu zbadania interakcji między guzem a makrofagami
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Stymulacja in vitro i wizualizacja uwalniania pułapek zewnątrzkomórkowych w zróżnicowanych ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Oznaczanie immunogenności szczepionki przy użyciu komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów bydlęcych
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
IP-FCM: Immunoprecypitacja wykrywana za pomocą cytometrii przepływowej
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Rozpoznawanie markerów CD ludzkich komórek zabójczych indukowanych cytokinami za pomocą cytometrii przepływowej
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Test cytometrii przepływowej w celu identyfikacji podzbiorów komórek odpornościowych w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Test cytometrii przepływowej opartej na komórkach do pomiaru aktywności cytotoksycznej
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Pomiar alloreaktywności limfocytów T za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Analiza jakościowa i ilościowa synapsy immunologicznej w organizmie człowieka z wykorzystaniem obrazowej cytometrii przepływowej
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Protokół izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów myszy i ich późniejsza aktywacja in vitro za pomocą nowotworowych kompleksów immunologicznych
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 29 sierpnia 2026