Oparta na cytometrii przepływowej analiza aktywacji komórek dendrytycznych przy użyciu kompleksów immunologicznych

Zacznij od chemicznie utrwalonej zawiesiny komórek nowotworowych.

Dodaj optymalne stężenie immunoglobuliny G wiążącej nowotwór, która wiąże się z antygenami powierzchniowymi komórek nowotworowych, tworząc kompleksy immunologiczne lub IC.

Przenieść IC na płytkę hodowlaną zawierającą przylegające komórki dendrytyczne. Inkubować.

Komórka dendrytyczna rozpoznaje układ scalony, internalizuje go i przetwarza na fragmenty peptydowe.

Fragmenty są ładowane na cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy II lub MHC-II i prezentowane na powierzchni komórki wraz z cząsteczką kostymulującą CD86.

Usuń nośnik. Dodaj bufor dysocjacyjny komórek i energicznie pipetuj, aby odłączyć komórki.

Przenieś komórki do probówki.

Odwirować i ponownie zawiesić komórki w roztworze blokującym, aby zablokować niespecyficzne interakcje.

Nakładka z koktajlem przeciwciał znakowanych fluoroforem ukierunkowanym na MHC-II i CD86.

Dodaj barwnik wiążący DNA i krótko inkubuj, aby wybarwić martwe jądra komórkowe.

Za pomocą cytometrii przepływowej zidentyfikuj żywe komórki wykazujące współekspresję MHC-II i CD86, potwierdzając aktywację komórek dendrytycznych za pośrednictwem IC.

Najpierw utrwal komórki w 1,8% buforowanym paraformaldehydzie przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wysiewaj zawiesinę komórkową w każdym dołku 96-dołkowej płytki w kształcie litery U. Następnie dodaj różne rozcieńczenia przeciwciał wiążących nowotwór do każdej studzienki. Następnie inkubować komórki na lodzie przez 15 do 20 minut.

Po inkubacji przemyć komórki 150 mikrolitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, a następnie odwirować przy 400 razy g przez 5 do 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu usunąć supernatant i dwukrotnie umyć komórki. Rozpuść komórki w 100 mikrolitrach buforu FACS, zawierającego przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem. Następnie inkubuj płytkę na lodzie przez 15 do 20 minut.

Po 15 do 20 minutach dodaj 200 mikrolitrów buforu FACS, aby przepłukać komórki. Odwirować płytkę 400 razy g przez 5 do 10 minut. Zdekantować supernatant. Przeprowadź cytometrię przepływową w celu analizy wiązania guza i określenia minimalnego stężenia immunoglobuliny G wymaganego do pokrycia komórek.

Gdy komórki zostaną pokryte minimalnym stężeniem immunoglobuliny G, dodaj kompleks immunologiczny guza znakowany CFSE do komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów w stosunku 1:5. Następnie inkubować mieszaninę przez 12 do 16 godzin przez noc w kompletnym pożywce. Wykonaj analizę FACS aktywacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów.