Opracowanie urządzeń mikroprzepływowych do badania zdolności wydłużania komórek roślinnych rosnących wierzchołkowo w ekstremalnie małych przestrzeniach
22 maja 2018
Opisujemy metodę badania zdolności komórek roślinnych rosnących na wierzchołkach, w tym łagiewek pyłkowych, włośników i protonematy mchu, do wydłużania się przez ekstremalnie wąskie szczeliny (~1 μm) w urządzeniu mikroprzepływowym.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórek roślinnych, takie jak to, w jaki sposób komórki roślinne rosnące w wierzchołkach przenikają przez fizyczne bariery komórkowe. Główną zaletą tej techniki jest możliwość uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości, które odtwarzają proces deformacji komórki w szczelinie skali mikrometrycznej pod konwencjonalnym mikroskopem. Aby zrobić urządzenie do badania rosnących łagiewek pyłkowych i protonematy mchu, najpierw przygotuj około 11 gramów PDMS i załaduj go do czterocalowej formy.
Następnie odgazowujemy formę przez 20 minut w komorze próżniowej. Następnie utwardź formę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 90 minut. Po utwardzeniu oderwij warstwę PDMS od formy i otwórz otwory dostępowe do kanału w PDMS za pomocą narzędzia do dziurkowania do biopsji.
Następnie wystawiaj PDMS i pięciocentymetrową szklaną miskę na działanie plazmy powietrznej przez 50 sekund. Aby uszczelnić sieć mikroprzepływową, należy docisnąć warstwę PDMS do szklanego naczynia i utwardzać ją przez 30 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Aby stworzyć mikrourządzenie przeznaczone do badania włośników, ładuje się i utwardza dwie formy.
Podczas wykrawania otworów kanałowych użyj dwumilimetrowego stempla. Po wystawieniu obu warstw na działanie plazmy powietrznej przez 50 sekund, połącz je ze sobą, łącznie z szkiełkiem nakrywkowym, pod mikroskopem stereoskopowym. Aby to osiągnąć, użyj specjalnie przygotowanego narzędzia do nakładek.
Utwardzaj zespół przez 30 minut w piekarniku, aby uszczelnić sieć mikroprzepływową. Po utwardzeniu wyjmij szkiełko nakrywkowe z urządzenia i przenieś je do pięciocentymetrowego szklanego naczynia. Przed użyciem mikrourządzenia z łagiewką pyłkową należy je odgazować w komorze próżniowej przez 20 minut.
Dodać pożywkę wzrostową do wlotu słupka za pomocą mikropipety z cienką końcówką. Załaduj inne studzienki tym samym medium. Odczekaj kilka minut, aż kanały się wypełnią.
W międzyczasie umieść wilgotny ręcznik papierowy w naczyniu, aby utrzymać lokalną wilgotność. Teraz zbierz ziarna pyłku z niebiesko-białego kwiatu T.fournieri. Przenieś ziarna na znamię za pomocą igły preparującej.
Następnie wytnij wzdłuż zapylany styl o długości jednego centymetra, a następnie włóż wycięty styl do wlotu urządzenia mikroprzepływowego. Kiedy wycięty styl jest wkładany do wlotu urządzenia mikroprzepływowego za pomocą pęsety, ważne jest, aby nie trzymać stylu zbyt mocno, ponieważ może to spowodować jego uszkodzenie. Następnie przymocuj pokrywkę do naczynia za pomocą taśmy i przenieś naczynie do inkubatora w temperaturze 28 stopni Celsjusza, gdzie musi pozostać w ciemności przez pięć do sześciu godzin.
Pracując pod kapturem z przepływem laminarnym, zacznij od sterylizacji transgenicznych nasion A.thaliana Columbia. Namocz je w roztworze czyszczącym na pięć minut. Następnie dokładnie opłucz nasiona w autoklawie wodnym.
Po wysterylizowaniu przechowuj nasiona w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności przez 48 godzin. Kilka dni później odgazuj mikrourządzenie na 20 minut przed użyciem. Następnie załaduj odpowiednią pożywkę wzrostową do studzienek urządzenia za pomocą pipety z cienką końcówką i odczekaj kilka minut, aż roztwór zostanie przeciągnięty przez wszystkie kanały.
Załaduj również wilgotny ręcznik papierowy na naczynie, aby utrzymać wilgotność. Teraz przenieś przygotowane nasiona do wlotu urządzenia. Następnie przymocuj pokrywkę taśmą i przenieś naczynie do inkubatora o temperaturze 22 stopni Celsjusza z ciągłym światłem.
Przed użyciem należy wysterylizować mikrourządzenie w świetle UV przez noc. Następnego dnia odgazuj mikrourządzenie na 20 minut. Po odgazowaniu załaduj mikrostudzienki odpowiednią pożywką wzrostową.
Podczas gdy kanały stopniowo się wypełniają, otocz mikrourządzenie odrobiną autoklawizowanej wody, aby utrzymać wilgotność. Przenieś mały kawałek tkanki protonemata mchu do wlotu mikrourządzenia. Teraz hoduj urządzenie w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciągłym świetle.
Po dwóch do trzech tygodniach wzrostu wykonaj zdjęcia wyników w jasnym polu pod mikroskopem. Komórki roślinne rosnące wierzchołkowo napotykają szereg barier fizycznych wzdłuż swoich ścieżek wzrostu in vivo, takich jak droga transmisyjna i mikropale, nie wspominając o ścieżce włośników w glebie. Zaprezentowane mikroprzepływowe platformy do hodowli komórkowych in vitro umożliwiają badanie procesu wzrostu wierzchołkowego w trzech typach komórek roślinnych: łagiewkach pyłkowych, włośnikach i protonematach mchu.
Podgląd odbywa się przez jednomikronowe szczeliny w urządzeniach. Ponieważ mikroszczeliny tej wielkości są delikatne, czasami zamykają się, zwłaszcza po wielokrotnym użyciu. Dlatego ważne jest, aby przed wykonaniem eksperymentów sprawdzić, czy luki są nienaruszone.
W badaniu łagiewki pyłkowej wykorzystano obrazowanie żywych komórek do monitorowania zmian morfologicznych w okolicy wierzchołkowej łagiewki pyłkowej, a także w jądrze wegetatywnym i plemnikach w odpowiedzi na napotkanie bardzo małej przestrzeni. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórek roślinnych do zbadania zdolności do wydłużania komórek roślinnych rosnących na wierzchołkach, takich jak łagiewki pyłkowe, włośniki i protonematy mchu na bardzo małej przestrzeni.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę badania zdolności do wydłużania komórek roślin o rosnącym końcu, takich jak rurki pyłkowe i protonemata mchu, przez wąskie szczeliny w urządzeniu mikrofluidycznym. Technika ta umożliwia wysokiej rozdzielczości obrazowanie procesów odkształcenia komórek w skali mikrometrów.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia komórki roślinnej
- Mikrofluidyka
- Mechanika komórkowa
Tło
- Komórki roślin o rosnącym końcu odgrywają kluczową rolę w rozwoju roślin.
- Zrozumienie, jak te komórki przenikają przez fizyczne bariery, jest niezbędne dla rozwoju biologii roślin.
- Urządzenia mikrofluidyczne mogą symulować wąskie środowiska do badania komórek.
- Techniki wysokiej rozdzielczości obrazowania są niezbędne do obserwacji procesów komórkowych.
Cel badania
- Badanie zdolności komórek roślin o rosnącym końcu do wydłużania się przez wąskie szczeliny.
- Dostarczenie informacji na temat mechanizmów przenikania komórek przez bariery.
- Opracowanie niezawodnej metody badania odkształcenia komórek w kontrolowanych środowiskach.
Zastosowane metody
- Przygotowanie urządzenia mikrofluidycznego z PDMS.
- Odgazowywanie formy w komorze próżniowej.
- Utwardzanie PDMS w 65 stopniach Celsjusza.
- Tworzenie otworów dostępowych w PDMS za pomocą narzędzi do biopsji.
Główne wyniki
- Metoda z powodzeniem umożliwia obserwację rurek pyłkowych i protonemat mchu.
- Wysokiej rozdzielczości obrazy ujawniają procesy odkształcenia komórek.
- Komórki mogą wydłużać się przez szczeliny o szerokości nawet 1 µm.
- Technika dostarcza cennych danych do zrozumienia zachowania komórek w ograniczonych przestrzeniach.
Wnioski
- Ta metoda poprawia rozumienie komórek roślin o rosnącym końcu.
- Oferuje nowe podejście do badania mechaniki komórkowej w biologii roślin.
- Wyniki mogą mieć znaczenie dla badań rolniczych i biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Studying tip-growing plant cell behavior in physically constrained environments provides mechanistic insights into cellular adaptation under mechanical stress, relevant for understanding growth regulation in complex tissues. This microfluidic platform enables high-resolution visualization of subcellular dynamics during barrier penetration, supporting hypothesis testing in cellular mechanics and predictive modeling of growth responses. The approach offers a scalable in vitro system to de-risk target validation in plant developmental pathways by linking physical constraints to molecular readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of how physical constraints influence tip growth dynamics and subcellular reorganization in live cells.
- Operational Value: Provides a reproducible platform to correlate gap size with elongation success rates across cell types.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by revealing whether cytoskeletal or nuclear positioning changes are required for barrier transit.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts on penetration efficiency and morphological changes under controlled micron-scale confinement.
- Operational Value: Standardizes gap dimensions (e.g., ~1 µm) to ensure assay consistency across experiments and laboratories.
- Scalability: Permits parallel testing of multiple cell lines or genetic variants in identical microfluidic networks.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects cellular responses to physical stress with potential biomarkers of growth adaptation or failure.
- Operational Value: Enables time-lapse tracking of fluorescently labeled components (e.g., nucleus, sperm cells) to correlate structural changes with functional outcomes.
- Predictive Confidence: Offers a disease-relevant system analog for studying how cells navigate restrictive microenvironments, analogous to extracellular matrix penetration in mammalian systems.
Pipeline & Workflow Integration
The microfluidic elongation assay fits within early discovery workflows where understanding cellular responses to physical cues informs target selection and pathway validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on how mechanical confinement alters tip growth kinetics and intracellular trafficking.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable outputs on cell deformation and transit success for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Enables measurement of elongation rates, nuclear displacement, and shape recovery as dependent variables for condition comparison.
- Translational Research: Provides a disease-relevant system to model how cells adapt to spatial constraints, supporting extrapolation to invasive growth phenotypes.
- Enterprise Reuse: Reusable PDMS-glass platforms allow longitudinal studies and cross-project standardization in mechanobiology screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces ambiguity in linking physical stimuli to cellular responses by enabling direct observation of deformation processes.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fabrication, plasma bonding, and gap verification steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target validation by clarifying whether observed growth defects stem from intrinsic capacity or extrinsic barrier resistance.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on their resilience to mechanical stress in confined microenvironments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic design, PDMS handling, and sterile cell culture techniques.
- Depends on access to vacuum degassing equipment, plasma treatment systems, and precision punch tools for channel formation.
- Necessitates standardized protocols for gap integrity verification prior to each experiment to prevent false-negative results.
- Involves adaptation considerations when transferring the system between pollen tubes, root hairs, and moss protonemata due to differing growth rates and medium needs.
- Limited by the fragility of sub-micron gaps, which may deform or close after repeated use, requiring routine inspection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:28
Fabricating the PDMS Microdevices
2:11
In Vitro Culturing of T. fournieri Pollen Tubes in the Microdevice
3:31
In Vitro Culturing of A. thaliana Root Hairs in the Microdevice
4:40
In Vitro Culturing of P. patens (moss) Protonemata in the Microfluidic Device
5:31
Results: Microfluidic Device Design and Time-lapse Imaging of Pollen Tube Growth
6:37
Conclusion
