Name: Opracowanie urządzeń mikroprzepływowych do badania zdolności wydłużania komórek roślinnych rosnących wierzchołkowo w ekstremalnie małych przestrzeniach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Poznaj metodę mikroprzepływową do badania wydłużania komórek roślinnych rosnących wierzchołkowo przez szczeliny o szerokości jednego mikrometra. Technika umożliwia obserwację rurków pyłkowych i protonem groniasteczka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy H. Tsutsui i D. Kurihara za dostarczenie nam roślin transgenicznych, w tym odpowiednio linii T. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato i linii A. thaliana UBQ10pro::H2B-mClover. Prace te były wspierane przez Instytut Transformacyjnych Biomolekuł Uniwersytetu w Nagoi oraz Japońską Sieć Zaawansowanych Nauk o Roślinach. Wsparcia finansowego dla tych prac udzieliły granty Japońskiej Agencji ds. Nauki i Technologii (grant projektu ERATO nr 1). JPMJER1004 dla T.H.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (nr JP16H06465 i JP16H06464 dla T.H.) oraz Grants-in-Aid Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (JSPS) na kwestionowanie badań eksploracyjnych (grant nr 26600061 dla Nowego Jorku oraz grant nr 25650075 i 15K14542 dla Y.S.).

1. Wykonanie mikrourządzenia PDMS do badania rosnących łagiewek pyłkowych i protonematów mchu
UWAGA: Użyliśmy bezmaskowego instrumentu fotolitograficznego do przygotowania form PDMS na płytkach krzemowych. Szczegóły dotyczące działania systemu zostały pominięte w niniejszym manuskrypcie. Standardowa technika fotolitografii9 przy użyciu fotomaski może być również użyta do stworzenia form PDMS opisanych w tym manuskrypcie.
<ol>
	<li>Wlej 11 g mieszaniny prepolimerowej PDMS (baza elastomerowa: utwardzacz w stosunku 10:1) do każdej 4-calowej formy.</li>
	<li>Formę przygotowaną w kroku 1.1 odgazować przez 20 minut w komorze próżniowej.</li>
	<li>Po utwardzeniu w temperaturze 65 °C przez 90 minut w piecu bez konwekcji, oderwij warstwę PDMS od formy i przebij otwory dostępowe w kanałach płynnych za pomocą stempli do biopsji. 
	UWAGA: W przypadku łagiewki pyłkowej rozmiar otworu należy dostosować tak, aby odzwierciedlał średnicę słupka. Wartość ta będzie się zatem różnić w zależności od gatunku. W tym eksperymencie wykraliśmy otwór o średnicy 1 mm na wloty słupków i otwory o średnicy 1,5 mm na zbiorniki ciekłego medium. W przypadku urządzenia protonemata z mchu użyto otworu o średnicy 4 mm na zbiornik próbki.</li>
	<li>Wystaw warstwę PDMS i szklane naczynie dolne (o średnicy 3,5 - 5 cm) na działanie plazmy powietrznej przez 50 s.</li>
	<li>Wciśnij warstwę PDMS do naczynia ze szklanym dnem i podgrzewaj w temperaturze 65 °C przez 30 minut w piecu niekonwekcyjnym, aby całkowicie uszczelnić sieć mikroprzepływową.</li>
</ol>
2. Produkcja mikrourządzenia PDMS do włośników
<ol>
	<li>Powtórz kroki 1.1 - 1.3, używając foremek, aby przygotować dwie warstwy PDMS dla mikrourządzeń z korzeniami i włosami. 
	UWAGA: Zastosowaliśmy otwór o średnicy 2 mm na zbiorniki płynnego podłoża w mikrourządzeniu korzeniowym.</li>
	<li>Wystaw obie warstwy PDMS na działanie plazmy powietrznej przez 50 s.</li>
	<li>Zmontuj dwie warstwy PDMS pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą specjalnie zaprojektowanego alignera biurkowego. 
	UWAGA: Mikrokanały na tych warstwach PDMS muszą być zwrócone do siebie. Przed montażem upewnij się, że znaczniki wyrównania na obu warstwach są zgodne.</li>
	<li>Podgrzewać w temperaturze 65 °C przez 30 minut w piecu bez konwekcji, aby całkowicie uszczelnić sieć mikroprzepływową.</li>
	<li>Usuń szkiełko nakrywkowe ze zbudowanego mikrourządzenia i umieść urządzenie na szklanym naczyniu o średnicy 5 cm.</li>
</ol>
3. Przygotowanie pożywki do hodowli komórkowych in vitro dla łagiewek pyłkowych (Torenia fournieri)
<ol>
	<li>Przygotować zmodyfikowaną pożywkę Nitscha zgodnie z wcześniejszym opisem15 i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 min. 
	UWAGA: Skład zmodyfikowanej pożywki Nitscha jest następujący: NH4NO3 (80 mg/L), KNO3 (125 mg/L), Ca(NO3)2‧4H2O (500 mg/L), MgSO4‧7H2O (125 mg/L), KH2PO4 (125 mg/L), MnSO4‧4H2O (3 mg/L), ZnSO4‧7H2O (0,5 mg/L), H3BO3 (10 mg/L), CuSO4‧5H2O (0,025 mg/L), Na2MoO4‧2H2O (0,025 mg/L), sacharoza (50 000 mg/L) i kazeina (500 mg/L). Tak przygotowane podłoże można przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 4 miesiące.</li>
	<li>Przygotować 26% (w/v) glikolu polietylenowego przy użyciu autoklawowanej wody dejonizowanej i przefiltrować roztwór za pomocą filtra porowego 0,3 μm. 
	UWAGA: Przygotowaną pożywkę można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.</li>
	<li>Wymieszać odczynniki przygotowane w krokach 3.1 i 3.2 w stosunku 1:1 (v/v). 
	UWAGA: To podłoże powinno być przygotowywane świeże do każdego użycia.</li>
</ol>
4. Przygotowanie pożywki do hodowli komórkowych in vitro dla włośników (Arabidopsis thaliana)
<ol>
	<li>Przygotować roztwór 0,215% (w/v) Murashige & Skoog Medium, 0,05% (w/v) MES, 1% (w/v) sacharozy i 1% (w/v) agaru w wodzie dejonizowanej. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 min.</li>
</ol>
5. Przygotowanie pożywki do hodowli komórkowych in vitro dla mchu Protonemata (Physcomitrella patens)
<ol>
	<li>Wstępnie inkubuj protonemata mchu w BCDAT medium16 na szalce Petriego. 
	UWAGA: Skład pożywki BCDAT to 1 mM MgSO4, 10 mM KNO3, 45 μM FeSO4, 1,8 mM KH2PO4 (pH dostosowane do 6,5 z KOH), roztwór pierwiastka śladowego (0,22 μM CuSO4, 0,19 μM ZnSO4, 10 μM H3BO3, 0,1 μM Na2MoO4, 2 μM MnCl2, 0,23 μM CoCl2 i 0,17 μM KI), 1 mM CaCl2 i 5 mM winianu diamonu(+).</li>
	<li>Hodowla mchu w pożywce BCDATG w mikrourządzeniu. 
	UWAGA: Pożywka BCDATG to pożywka BCDAT o zawartości 0,5% (w/v) glukozy. Tak przygotowane podłoże można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.</li>
</ol>
6. Hodowla in vitro łagiewek pyłkowych T. fournieri w mikrourządzeniu
<ol>
	<li>Umieść mikrourządzenie w komorze pyłkowej i odgazowuj przez 20 minut.</li>
	<li>Wyjąć mikrourządzenie z komory próżniowej i wprowadzić pożywkę wzrostową do wlotu słupka za pomocą mikropipety z bardzo cienką końcówką. Napełnij pozostałe studzienki po ich wierzchołki tym samym podłożem. Poczekaj kilka minut, aż wszystkie mikrokanaliki zostaną wypełnione medium przez próżnię wytworzoną wewnątrz mikrokanalików.</li>
	<li>Umieść mokry ręcznik papierowy w naczyniu ze szklanym dnem, aby utrzymać wilgotność w naczyniu.</li>
	<li>Przenieść ziarna pyłku z dzikiego kwiatu T. fournieri "niebiesko-białego" na jego znamię za pomocą igły do preparacji. 
	UWAGA: Przeprowadziliśmy również ten eksperyment z transgenicznym kwiatem T. fournieri 'Crown violet' (RPS5Ap::H2B-tdTomato line17), z łagiewkami pyłkowymi zawierającymi fluorescencyjnie znakowane plemniki i jądra wegetatywne.</li>
	<li>Wytnij zapylony styl (1 cm długości) za pomocą ostrza.</li>
	<li>Wstaw styl cięcia do wlotu urządzenia, jak pokazano na rysunku Rysunek 2.</li>
	<li>Nałóż pokrywkę na naczynie i uszczelnij ją taśmą.</li>
	<li>Umieścić urządzenie w inkubatorze w temperaturze 28 °C na 5 - 6 godzin w ciemności.</li>
</ol>
7. Hodowla in vitro włośników A. thaliana w mikrourządzeniu
UWAGA: Kroki 7.1 - 7.9 (z wyjątkiem 7.3 i 7.5) powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym.
<ol>
	<li>Nasiona A. thaliana Columbia (Col-0) i linii transgenicznej UBQ10pro::H2B-mClover (zawierającej fluorescencyjny marker jądrowy) sterylizować przez 5 min w sterylnym płynie (5% (v/v) wybielacza domowego i 0,02% (v/v) Triton X-100).</li>
	<li>Dokładnie opłucz wysterylizowane nasiona wodą w autoklawie.</li>
	<li>Opłukane nasiona należy przechowywać w wodzie przez 2 dni w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Wysterylizuj mikrourządzenie w świetle UV przez noc.</li>
	<li>Umieść mikrourządzenie w komorze próżniowej i odgazowuj przez 20 minut.</li>
	<li>Wprowadzić pożywkę wzrostową do studzienek w urządzeniu za pomocą mikropipety. Odczekaj kilka minut, aż próżnia wypełni wszystkie mikrokanaliki medium.</li>
	<li>Umieść autoklawowany mokry ręcznik papierowy w naczyniu ze szklanym dnem, aby utrzymać wilgotność w naczyniu.</li>
	<li>Przenieś wysterylizowane nasiona do wlotu urządzenia.</li>
	<li>Nałóż pokrywkę na naczynie i uszczelnij ją taśmą.</li>
	<li>Umieścić urządzenie pionowo w inkubatorze w temperaturze 22 °C w ciągłym białym świetle.</li>
	<li>Sprawdź wzrost włosów u nasady po 4 - 10 dniach inkubacji. Uzyskaj zarówno obrazy jasnego pola, jak i obrazy fluorescencyjne za pomocą mikroskopu odwróconego.</li>
</ol>
8. Hodowla in vitro Protonemata P. patens (mech) w urządzeniu mikroprzepływowym
UWAGA: Kroki 8.2 - 8.6 (z wyjątkiem 8.3) powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym.
<ol>
	<li>Prekultura szczepu P. patens Gransden 200418 na podłożu BCDAT pokrytym celofanem na szalce Petriego przez tydzień w ciągłym białym świetle w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Wysterylizuj mikrourządzenie w świetle UV przez noc w okapie z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Umieść mikrourządzenie w komorze próżniowej i odgazowuj przez 20 minut.</li>
	<li>Wprowadzić pożywkę wzrostową do studzienek za pomocą mikropipety. Odczekaj kilka minut, aż próżnia wypełni wszystkie mikrokanaliki medium.</li>
	<li>Dodaj autoklawowaną wodę do naczynia otaczającego mikrourządzenie, aby utrzymać wilgotność w naczyniu.</li>
	<li>Przenieść mały kawałek tkanki protonematy mchu do wlotu mikrourządzenia i hodować tkankę w inkubatorze w temperaturze 25 °C w ciągłym białym świetle.</li>
	<li>Sprawdź wzrost protonematy mchu po 2-3 tygodniach inkubacji. Uzyskuj obrazy w jasnym polu za pomocą mikroskopu.</li>
</ol>
9. Obrazowanie poklatkowe wzrostu łagiewki pyłkowej T. fournieri 
<ol>
	<li>Umieść mikrourządzenie na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w sprzęt do akwizycji obrazu (np. kamerę CCD) i oprogramowanie. Znajdź lokalizacje mikroluk. 
	UWAGA: Do oprogramowania do akwizycji obrazu użyliśmy dostępnego na rynku produktu (Tabela materiałów). Oprogramowanie do mikroskopii typu open source, takie jak μManager, jest również dostępne online (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager). Zalecamy zainstalowanie kondensora mikroskopu na mikroskopie, aby uzyskać obrazy o wyższej rozdzielczości.</li>
	<li>Rejestruj obrazy w jasnym polu co 10 s za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazów mikroskopowych.</li>
	<li>Aby zaobserwować znakowane fluorescencyjnie plemniki i jądro wegetatywne w łagiewce pyłkowej linii RPS5Ap::H2B-tdTomato, należy naświetlić próbkę laserem o długości fali 561 nm i użyć pasmowego filtra optycznego (578/105 nm). 
	UWAGA: Chociaż zdjęcia poklatkowe wzrostu łagiewki pyłkowej były często wykonywane, obrazowanie nie wydawało się wpływać na wzrost. Jednak zawsze zaleca się zminimalizowanie intensywności lasera, czasu ekspozycji i interwału poklatkowego, aby zminimalizować fototoksyczność i fotowybielanie fluoroforu.</li>
	<li>Dostosuj jasność i kontrast obrazów i przygotuj plik wideo za pomocą oprogramowania ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).</li>
</ol>

<ol><li>Higashiyama, T., Takeuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanism+and+Key+Molecules+Involved+in+Pollen+Tube+Guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance.</a> Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).</li>
<li>Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. J., Grossniklaus, U. Measuring cytomechanical forces on growing pollen tubes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVogler%2C+H+%22Pollen+Tip+Growth%22">Pollen Tip Growth</a>. Obermeyer, G., Feijó, J. , Springer. 65-85 (2017).</li>
<li>Kehr, J., Wagner, C., Willmitzer, L., Fisahn, J. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jxb/article/50/334/565/525736">Effect of modified carbon allocation on turgor, osmolality, sugar and potassium content and membrane potential in the epidermis of transgenic potato (Solanum tuberosum L.) plants.</a> J. Exp. Bot. 50 (334), 565-571 (1999).</li>
<li>Benkert, R., Obermeyer, G., Bentrup, F. W. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF01282125">The turgor pressure of growing lily pollen tubes.</a> Protoplasma. 198, 1-8 (1997).</li>
<li>Vogler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pollen+tube%3A+a+soft+shell+with+a+hard+core%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The pollen tube: a soft shell with a hard core.</a> Plant J. 73 (4), 617-627 (2013).</li>
<li>Shamsudhin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallelized+pollen+tube+guidance+and+mechanical+measurements+on+a+Lab-on-a-Chip+platform%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Massively parallelized pollen tube guidance and mechanical measurements on a Lab-on-a-Chip platform.</a> PloS one. 11 (12), e0168138(2016).</li>
<li>Cheung, A. Y., Boavida, L. C., Aggarwal, M., Wu, H. M., Feijó, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pollen+tube+journey+in+the+pistil+and+imaging+the+in+vivo+process+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">The pollen tube journey in the pistil and imaging the in vivo process by two-photon microscopy.</a> J Exp Bot. 61 (7), 1907-1915 (2010).</li>
<li>Metzner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+MRI+and+X-ray+CT+technologies+for+3D+imaging+of+root+systems+in+soil%3A+Potential+and+challenges+for+root+trait+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: Potential and challenges for root trait quantification.</a> Plant Methods. 11 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Angew Chemie Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+root-bacteria+interactions+in+a+microfluidics+setup%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup.</a> P Natl Acad Sci. 114 (17), 4549-4554 (2017).</li>
<li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+Fluorescence+Imaging+of+Arabidopsis+Root+Growth+with+Rapid+Manipulation+of+The+Root+Environment+Using+the+RootChip%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using the RootChip.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high-throughput+live+imaging+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression.</a> Nature Methods. 9, 1101-1106 (2012).</li>
<li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="https://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.3604788">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> Appl. Phys. Lett. 98, 263703(2011).</li>
<li>Bascom, C. S., Wu, S. -Z., Nelson, K., Oakey, J., Bezanilla, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27406170">Long-Term Growth of Moss.</a> in Microfluidic Devices Enables Subcellular Studies in Development. Plant Physiol. 172 (1), 28-37 (2016).</li>
<li>Higashiyama, T., Kuroiwa, H., Kawano, S., Kuroiwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+in+vitro+of+the+pollen+tube+to+the+naked+embryo+sac+of+Torenia+fournieri%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidance in vitro of the pollen tube to the naked embryo sac of Torenia fournieri.</a> Plant Cell. 10, 2019-2032 (1998).</li>
<li>Nishiyama, T., Hiwatashi, Y., Sakakibara, K., Kato, M., Hasebe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagged+mutagenesis+and+gene-trap+in+the+moss%2C+Physcomitrella+patens+by+shuttle+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">Tagged mutagenesis and gene-trap in the moss, Physcomitrella patens by shuttle mutagenesis.</a> DNA Res. 7, 9-17 (2000).</li>
<li>Maruyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+Control+by+Each+Female+Gamete+Prevents+the+Attraction+of+Multiple+Pollen+Tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Independent Control by Each Female Gamete Prevents the Attraction of Multiple Pollen Tubes.</a> Dev. Cell. 25 (3), 317-323 (2013).</li>
<li>Rensing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Physcomitrella+genome+reveals+evolutionary+insights+into+the+conquest+of+land+by+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants.</a> Science. 319, 64-69 (2008).</li>
<li>Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Arata, H., Higashiyama, T., Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capability+of+tip-growing+plant+cells+to+penetrate+into+extremely+narrow+gaps%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Capability of tip-growing plant cells to penetrate into extremely narrow gaps.</a> Sci. Rep. 7 (1), 1403(2017).</li>
<li>Dolan, L., et al. <a target="_blank" href="http://dev.biologists.org/content/120/9/2465">Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis.</a> Development. 120, 2465-2474 (1994).</li>
<li>Denais, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+envelope+rupture+and+repair+during+cancer+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration.</a> Science. 352 (6283), 353-358 (2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Aby uzyskać przedstawione powyżej wyniki, należy dokładnie wykonać kilka krytycznych kroków w protokole. Po pierwsze, zarówno warstwa PDMS, jak i powierzchnie naczynia ze szklanym dnem muszą być traktowane plazmą przez wystarczająco długi czas przed klejeniem. W przeciwnym razie warstwa PDMS może lokalnie oderwać się od powierzchni szkła, podczas gdy komórki rosnące w końcówce przechodzą przez mikroszczeliny. Kolejnym kluczowym krokiem w protonemata z włośnikami i mchem jest sterylizacja mikrourządzenia. Zwykle włośniki ...

Po wykiełkowaniu ziaren pyłku na znamieniu, każde ziarno wytwarza pojedynczą łagiewkę pyłkową, która przenosi plemniki do komórki jajowej i centralnej komórki w zalążku w celu podwójnego zapłodnienia. Łagiewki pyłkowe wydłużają się przez styl i ostatecznie docierają do zalążka, wyczuwając wiele wskazówek prowadzących na swojej drodze1. Podczas wydłużania łagiewki pyłkowe napotykają szereg barier fizycznych; tor transmisyjny jest wypełniony komórkami, a łagiewki pyłkowe muszą wejść w maleńki otwór mikropylarny zalążka, aby dotrzeć do celu (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1A)2. Dlatego łagiewki pyłkowe muszą mieć zdolność przenikania przez przeszkody fizyczne, jednocześnie tolerując naprężenia ściskające z otoczenia. Włośniki to kolejny rodzaj komórek roślinnych rosnących na wierzchołkach, które muszą wytrzymać fizyczne przeszkody w środowisku, w postaci upakowanych cząstek gleby (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).
Zbadano różne właściwości mechaniczne łagiewki pyłkowej, w tym ciśnienie turgoru i sztywność obszaru wierzchołkowego komórki, które można zmierzyć za pomocą metody początkowej plazmolizy3,4 i mikroskopia sił komórkowych (CFM)5,6odpowiednio. Jednak same te metody nie ujawniają, czy łagiewka pyłkowa jest zdolna do wydłużania się przez bariery fizyczne wzdłuż swoich ścieżek wzrostu. Alternatywną techniką, która pozwala na monitorowanie wydłużenia łagiewki pyłkowej in vivo, jest mikroskopia dwufotonowa7. Jednak przy tej metodzie trudno jest zaobserwować zmiany morfologiczne w poszczególnych łagiewkach pyłkowych w głębi tkanki zalążka. Dodatkowo wzrost włośników w glebie można uwidocznić za pomocą rentgenowskiej tomografii komputerowej (CT) i rezonansu magnetycznego (MRI)8, aczkolwiek z niską rozdzielczością. W tym miejscu przedstawiamy metodę, którą można wykorzystać do uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości procesu deformacji komórki pod konwencjonalnym mikroskopem.
Ogólnym celem opisanej tutaj metody jest wizualizacja zdolności do wydłużania komórek roślinnych rosnących na wierzchołkach, w tym łagiewek pyłkowych, włośników i protonematy mchu, na bardzo małych przestrzeniach. Ponieważ mikrourządzenia z polidimetylosiloksanu (PDMS) przedstawione w tym manuskrypcie są optycznie przezroczyste i przepuszczają powietrze, możemy hodować żywe komórki wewnątrz urządzenia i obserwować ich zachowanie wzrostu pod mikroskopem. Możliwe jest również tworzenie przestrzeni w skali mikro ~ nanometrowej techniką miękkiej litografii9 z użyciem form. Cechy te pozwalają nam badać zdolność do wydłużania komórek roślinnych rosnących wierzchołkowo w fizycznie ograniczonym środowisku.
W tej pracy zbudowaliśmy szczeliny o szerokości 1 μm (4 μm wysokości) w urządzeniach mikroprzepływowych i zbadaliśmy zdolność łagiewek pyłkowych do przenikania przez te sztuczne przeszkody, które są znacznie mniejsze niż średnica cylindrycznej łagiewki pyłkowej (około 8 μm). Ta eksperymentalna platforma pozwala nam zwizualizować reakcję łagiewki pyłkowej na mikroszczeliny i uchwycić poklatkowe obrazy odpowiedzi, które śledzą proces deformacji komórki. Opracowaliśmy również mikrourządzenia, które można wykorzystać do zbadania zdolności penetracji włośników i protonematy mchu. Do tej pory zgłoszono kilka mikrourządzeń, które umożliwiają wizualizację wzrostu korzeni roślin10,11,12,13 i mchu protonemata14 wzrostu w wysokiej rozdzielczości. W naszym urządzeniu szereg kanałów wzrostu włośników jest prostopadle połączonych z komorą wzrostu korzenia, a pojedyncze włośniki (o średnicy około 7 μm) są kierowane do kanałów płynowych ze szczeliną o szerokości 1 μm. Przeprowadziliśmy również hodowlę protonematów mchu (o średnicy około 20 μm) w mikrourządzeniu zawierającym mikroszczeliny, aby zbadać ich reakcje na te bariery fizyczne. Proponowane podejście oparte na mikroprzepływach pozwala nam zbadać zdolność różnych komórek roślinnych rosnących w wierzchołkach do wydłużania się w ekstremalnie małych przestrzeniach, czego nie można zbadać żadną inną obecnie dostępną metodą.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning Co.</td><td>Sylgard184</td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog Medium</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>392-00591</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Dojindo</td><td>345-01625</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie ze szklanym dnem 50 mm</td><td>Matsunami Glass</td><td>D210402</td><td></td></tr><tr><td>35 mm naczynie ze szklanym dnem</td><td>Iwaki&nbsp;</td><td>3971-035</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne</td><td>Pióro</td><td>nr 11</td><td></td></tr><tr><td>stemple do biopsji</td><td>Harris</td><td></td><td>Uni-Core</td></tr><tr><td>Końcówki do ładowania żelu</td><td>Bio-Bik</td><td>124-R-204</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric</td><td></td><td>Nr Numer katalogowy jest dostępny dla tego niestandardowego mikroskopu</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania MetaMorph</td><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie urządzeń mikroprzepływowych do badania zdolności wydłużania komórek roślinnych rosnących wierzchołkowo w ekstremalnie małych przestrzeniach

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, komórki roślinne rosnące na wierzchołkach muszą pokonać szereg barier fizycznych; jednak badaczom brakuje metodologii do wizualizacji zachowania komórek w tak restrykcyjnych warunkach. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy komory wzrostowe do wzrostu komórek roślinnych rosnących w końcówkach, które zawierają szereg wąskich, mikroprefabrykowanych szczelin (~1 μm) w podłożu z polidimetylosiloksanu (PDMS). Ten przezroczysty materiał pozwala użytkownikowi monitorować procesy wydłużania końcówek w poszczególnych komórkach podczas penetracji mikroszczelin za pomocą obrazowania poklatkowego. Korzystając z tej platformy eksperymentalnej, zaobserwowaliśmy zmiany morfologiczne w łagiewkach pyłkowych podczas penetracji mikroszczeliny. Podczas tego procesu uchwyciliśmy dynamiczne zmiany kształtu znakowanego fluorescencyjnie jądra wegetatywnego i plemników w łagiewce pyłkowej. Ponadto wykazaliśmy zdolność włośników i protonematów mchu do przenikania przez szczelinę 1 μm. Ta platforma in vitro może być wykorzystana do badania, w jaki sposób poszczególne komórki reagują na fizycznie ograniczone przestrzenie i może dostarczyć informacji na temat mechanizmów wzrostu końcówek.

Jak pokazano na Rysunku 1, komórki roślinne wykazujące wzrost wierzchołkowy napotykają szereg barier fizycznych na swoich ścieżkach wzrostu in vivo. Przedstawione w niniejszym badaniu mikrofluidyczne platformy do hodowli komórkowej in vitro umożliwiły badanie procesu wzrostu wierzchołkowego w trzech typach komórek roślinnych (przewodniach pyłkowych, włośnikach korzeniowych i protonemach mchów) poprzez sztuczne szczeliny o szerokości 1 µm (<s...

Opisujemy metodę badania zdolności komórek roślinnych rosnących na wierzchołkach, w tym łagiewek pyłkowych, włośników i protonematy mchu, do wydłużania się przez ekstremalnie wąskie szczeliny (~1 μm) w urządzeniu mikroprzepływowym.

Opracowanie urządzeń mikroprzepływowych do badania zdolności wydłużania komórek roślinnych rosnących wierzchołkowo w ekstremalnie małych przestrzeniach

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórek roślinnych, takie jak to, w jaki sposób komórki roślinne rosnące w wierzchołkach przenikają przez fizyczne bariery komórkowe. Główną zaletą tej techniki jest możliwość uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości, które odtwarzają proces deformacji komórki w szczelinie skali mikrometrycznej pod konwencjonalnym mikroskopem. Aby zrobić urządzenie do badania rosnących łagiewek pyłkowych i protonematy mchu, najpierw przygotuj około 11 gramów PDMS i załaduj go do czterocalowej formy.Następnie odgazowujemy formę przez 20 minut w komorze próżniowej. Następnie utwardź formę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 90 minut. Po utwardzeniu oderwij warstwę PDMS od formy i otwórz otwory dostępowe do kanału w PDMS za pomocą narzędzia do dziurkowania do biopsji.Następnie wystawiaj PDMS i pięciocentymetrową szklaną miskę na działanie plazmy powietrznej przez 50 sekund. Aby uszczelnić sieć mikroprzepływową, należy docisnąć warstwę PDMS do szklanego naczynia i utwardzać ją przez 30 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Aby stworzyć mikrourządzenie przeznaczone do badania włośników, ładuje się i utwardza dwie formy.Podczas wykrawania otworów kanałowych użyj dwumilimetrowego stempla. Po wystawieniu obu warstw na działanie plazmy powietrznej przez 50 sekund, połącz je ze sobą, łącznie z szkiełkiem nakrywkowym, pod mikroskopem stereoskopowym. Aby to osiągnąć, użyj specjalnie przygotowanego narzędzia do nakładek.Utwardzaj zespół przez 30 minut w piekarniku, aby uszczelnić sieć mikroprzepływową. Po utwardzeniu wyjmij szkiełko nakrywkowe z urządzenia i przenieś je do pięciocentymetrowego szklanego naczynia. Przed użyciem mikrourządzenia z łagiewką pyłkową należy je odgazować w komorze próżniowej przez 20 minut.Dodać pożywkę wzrostową do wlotu słupka za pomocą mikropipety z cienką końcówką. Załaduj inne studzienki tym samym medium. Odczekaj kilka minut, aż kanały się wypełnią.W międzyczasie umieść wilgotny ręcznik papierowy w naczyniu, aby utrzymać lokalną wilgotność. Teraz zbierz ziarna pyłku z niebiesko-białego kwiatu T.fournieri. Przenieś ziarna na znamię za pomocą igły preparującej.Następnie wytnij wzdłuż zapylany styl o długości jednego centymetra, a następnie włóż wycięty styl do wlotu urządzenia mikroprzepływowego. Kiedy wycięty styl jest wkładany do wlotu urządzenia mikroprzepływowego za pomocą pęsety, ważne jest, aby nie trzymać stylu zbyt mocno, ponieważ może to spowodować jego uszkodzenie. Następnie przymocuj pokrywkę do naczynia za pomocą taśmy i przenieś naczynie do inkubatora w temperaturze 28 stopni Celsjusza, gdzie musi pozostać w ciemności przez pięć do sześciu godzin.Pracując pod kapturem z przepływem laminarnym, zacznij od sterylizacji transgenicznych nasion A.thaliana Columbia. Namocz je w roztworze czyszczącym na pięć minut. Następnie dokładnie opłucz nasiona w autoklawie wodnym.Po wysterylizowaniu przechowuj nasiona w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności przez 48 godzin. Kilka dni później odgazuj mikrourządzenie na 20 minut przed użyciem. Następnie załaduj odpowiednią pożywkę wzrostową do studzienek urządzenia za pomocą pipety z cienką końcówką i odczekaj kilka minut, aż roztwór zostanie przeciągnięty przez wszystkie kanały.Załaduj również wilgotny ręcznik papierowy na naczynie, aby utrzymać wilgotność. Teraz przenieś przygotowane nasiona do wlotu urządzenia. Następnie przymocuj pokrywkę taśmą i przenieś naczynie do inkubatora o temperaturze 22 stopni Celsjusza z ciągłym światłem.Przed użyciem należy wysterylizować mikrourządzenie w świetle UV przez noc. Następnego dnia odgazuj mikrourządzenie na 20 minut. Po odgazowaniu załaduj mikrostudzienki odpowiednią pożywką wzrostową.Podczas gdy kanały stopniowo się wypełniają, otocz mikrourządzenie odrobiną autoklawizowanej wody, aby utrzymać wilgotność. Przenieś mały kawałek tkanki protonemata mchu do wlotu mikrourządzenia. Teraz hoduj urządzenie w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciągłym świetle.Po dwóch do trzech tygodniach wzrostu wykonaj zdjęcia wyników w jasnym polu pod mikroskopem. Komórki roślinne rosnące wierzchołkowo napotykają szereg barier fizycznych wzdłuż swoich ścieżek wzrostu in vivo, takich jak droga transmisyjna i mikropale, nie wspominając o ścieżce włośników w glebie. Zaprezentowane mikroprzepływowe platformy do hodowli komórkowych in vitro umożliwiają badanie procesu wzrostu wierzchołkowego w trzech typach komórek roślinnych: łagiewkach pyłkowych, włośnikach i protonematach mchu.Podgląd odbywa się przez jednomikronowe szczeliny w urządzeniach. Ponieważ mikroszczeliny tej wielkości są delikatne, czasami zamykają się, zwłaszcza po wielokrotnym użyciu. Dlatego ważne jest, aby przed wykonaniem eksperymentów sprawdzić, czy luki są nienaruszone.W badaniu łagiewki pyłkowej wykorzystano obrazowanie żywych komórek do monitorowania zmian morfologicznych w okolicy wierzchołkowej łagiewki pyłkowej, a także w jądrze wegetatywnym i plemnikach w odpowiedzi na napotkanie bardzo małej przestrzeni. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórek roślinnych do zbadania zdolności do wydłużania komórek roślinnych rosnących na wierzchołkach, takich jak łagiewki pyłkowe, włośniki i protonematy mchu na bardzo małej przestrzeni.

development-microfluidic-devices-to-study-elongation-capability-tip

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy protokół wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych, które umożliwiają wychwytywanie i hodowlę komórek. W tym podejściu wykorzystuje się ustrukturyzowane mikrostruktury, takie jak rowki wewnątrz kanałów mikrofluidycznych, aby stworzyć obszary o niskim naprężeniu ścinającym, w których komórki mogą zostać unieruchomione.

Urządzenie mikrofluidyczne z wzorami rowków do badania zachowania komórek

Przedstawiamy prostą metodę wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych zdolnych do stosowania podobnych warunków dynamicznych w odniesieniu do wielu odrębnych szczepów, bez konieczności korzystania z pomieszczeń typu clean room lub litografii miękkiej.

Urządzenie mikroprzepływowe do badania wielu odrębnych szczepów

Źródło: Cabeen, M. T. i in. Analiza mikrofluidyczna pojedynczych komórek Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)Film pokazuje użycie urządzenia mikrofluidycznego do obserwacji wzrostu bakterii na poziomie pojedynczych komórek. Pokazuje, jak nieruchome komórki bakteryjne, zamknięte w mikroskalowych rowach, są nieustannie odżywiane i obrazowane pod mikroskopem fluorescencyjnym. System ten umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym podziału komórek i śledzenia linii genealogicznej na przestrzeni...

Śledzenie wzrostu bakterii z rozdzielczością pojedynczych komórek w układzie mikrofluidowym

W tym protokole przedstawiono produkcję, konfigurację i podstawowe działanie mikroprzepływowego bioreaktora pikolitrowego (PLBR) do analizy pojedynczych komórek mikroorganizmów prokariotycznych. Mikroorganizmy istotne z przemysłowego punktu widzenia zostały przeanalizowane jako dowód zasadności, co pozwoliło na wgląd w tempo wzrostu, morfologię i niejednorodność fenotypową w określonych okresach czasu, co jest prawie niemożliwe przy użyciu konwencjonalnych metod.

Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

Pokazujemy test oparty na mikrofluidyce do pomiaru skali czasowej dla komórek do przejścia przez sekwencję zwężeń w skali mikronów.

Technika mikroprzepływowa do badania odkształcalności komórek

Mikro-prefabrykowane urządzenia zintegrowane z komponentami fluidycznymi stanowią platformę in vitro do badań komórkowych naśladujących mikrośrodowisko in vivo. Opracowaliśmy mikroprzepływowe chipy na bazie polimetakrylanu metylu do badania reakcji komórkowych pod wpływem pojedynczych lub współistniejących bodźców naprężeń chemicznych/elektrycznych/ścinających.

Projektowanie urządzeń mikroprzepływowych do badania odpowiedzi komórkowych pod wpływem pojedynczych lub współistniejących bodźców naprężeń chemicznych/elektrycznych/ścinających

Przedstawiamy metodę analizy mikroprzepływowej poszczególnych linii komórek bakteryjnych na przykładzie Bacillus subtilis. Metoda ta przezwycięża niedociągnięcia tradycyjnych metod analitycznych w mikrobiologii, umożliwiając obserwację setek generacji komórek w ściśle kontrolowanych i jednolitych warunkach wzrostu.

Jednokomórkowa analiza mikroprzepływowa Bacillus subtilis

Opisujemy metodę konstruowania urządzeń do hodowli 3D i eksperymentowania z komórkami i organoidami wielokomórkowymi. Urządzenie to umożliwia analizę odpowiedzi komórkowych na sygnały rozpuszczalne w mikrośrodowiskach 3D ze zdefiniowanymi gradientami chemoatraktantu. Organoidy są lepsze niż pojedyncze komórki w wykrywaniu słabych hałaśliwych sygnałów.

Analiza 3D wielokomórkowych odpowiedzi na gradienty chemoatraktantu

Tutaj dostarczamy chip mikroprzepływowy i automatycznie sterowany, wysoce wydajny system mikroprzepływowy krążenia, który podsumowuje początkowe mikrośrodowisko neowaskularyzacji, umożliwiając stymulację komórek śródbłonka (EC) przez wysokie naprężenie ścinające światło, fizjologiczny poziom przepływu przezśródbłonkowego i rozkład różnych czynników wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) jednocześnie.

Model mikroprzepływowy naśladujący początkowe zdarzenie neowaskularyzacji

Ze względu na nieprzezroczystość gleby, interakcje między jej składowymi mikroorganizmami nie mogą być łatwo zobrazowane za pomocą rozdzielczości komórkowej. Zaprezentowano tu dwa narzędzia mikroprzepływowe, które dają nowe możliwości badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych. Urządzenia są wszechstronne i proste w użyciu, umożliwiając wysoką kontrolę czasoprzestrzenną i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości na poziomie komórkowym.

Narzędzia mikroprzepływowe do badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych na poziomie komórkowym

Ten protokół szczegółowo opisuje projekt i wykonanie urządzenia mikroprzepływowego odpowiedniego do badania mechaniki polimerów mikrotubul. Synteza technik mikrowytwarzania, zautomatyzowanej kontroli przepływu i modelowania obliczeniowego umożliwia stworzenie elastycznego systemu idealnie nadającego się do sondowania cytoszkieletu komórkowego in vitro.

Opracowanie opartego na mikrofluidyce podejścia do badania mechaniki polimerów mikrotubul

Poznaj metodę mikroprzepływową do badania wydłużania komórek roślinnych rosnących wierzchołkowo przez szczeliny o szerokości jednego mikrometra. Technika umożliwia obserwację rurków pyłkowych i protonem groniasteczka.

Opracowanie urządzeń mikroprzepływowych do badania zdolności wydłużania komórek roślinnych rosnących wierzchołkowo w ekstremalnie małych przestrzeniach (Wideo) | JoVE Journal

Opracowanie urządzeń mikroprzepływowych do badania zdolności wydłużania komórek roślinnych rosnących wierzchołkowo w ekstremalnie małych przestrzeniach

Przeglądaj więcej filmów