Opracowanie urządzeń mikroprzepływowych do badania zdolności wydłużania komórek roślinnych rosnących wierzchołkowo w ekstremalnie małych przestrzeniach

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórek roślinnych, takie jak to, w jaki sposób komórki roślinne rosnące w wierzchołkach przenikają przez fizyczne bariery komórkowe. Główną zaletą tej techniki jest możliwość uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości, które odtwarzają proces deformacji komórki w szczelinie skali mikrometrycznej pod konwencjonalnym mikroskopem. Aby zrobić urządzenie do badania rosnących łagiewek pyłkowych i protonematy mchu, najpierw przygotuj około 11 gramów PDMS i załaduj go do czterocalowej formy.

Następnie odgazowujemy formę przez 20 minut w komorze próżniowej. Następnie utwardź formę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 90 minut. Po utwardzeniu oderwij warstwę PDMS od formy i otwórz otwory dostępowe do kanału w PDMS za pomocą narzędzia do dziurkowania do biopsji.

Następnie wystawiaj PDMS i pięciocentymetrową szklaną miskę na działanie plazmy powietrznej przez 50 sekund. Aby uszczelnić sieć mikroprzepływową, należy docisnąć warstwę PDMS do szklanego naczynia i utwardzać ją przez 30 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Aby stworzyć mikrourządzenie przeznaczone do badania włośników, ładuje się i utwardza dwie formy.

Podczas wykrawania otworów kanałowych użyj dwumilimetrowego stempla. Po wystawieniu obu warstw na działanie plazmy powietrznej przez 50 sekund, połącz je ze sobą, łącznie z szkiełkiem nakrywkowym, pod mikroskopem stereoskopowym. Aby to osiągnąć, użyj specjalnie przygotowanego narzędzia do nakładek.

Utwardzaj zespół przez 30 minut w piekarniku, aby uszczelnić sieć mikroprzepływową. Po utwardzeniu wyjmij szkiełko nakrywkowe z urządzenia i przenieś je do pięciocentymetrowego szklanego naczynia. Przed użyciem mikrourządzenia z łagiewką pyłkową należy je odgazować w komorze próżniowej przez 20 minut.

Dodać pożywkę wzrostową do wlotu słupka za pomocą mikropipety z cienką końcówką. Załaduj inne studzienki tym samym medium. Odczekaj kilka minut, aż kanały się wypełnią.

W międzyczasie umieść wilgotny ręcznik papierowy w naczyniu, aby utrzymać lokalną wilgotność. Teraz zbierz ziarna pyłku z niebiesko-białego kwiatu T.fournieri. Przenieś ziarna na znamię za pomocą igły preparującej.

Następnie wytnij wzdłuż zapylany styl o długości jednego centymetra, a następnie włóż wycięty styl do wlotu urządzenia mikroprzepływowego. Kiedy wycięty styl jest wkładany do wlotu urządzenia mikroprzepływowego za pomocą pęsety, ważne jest, aby nie trzymać stylu zbyt mocno, ponieważ może to spowodować jego uszkodzenie. Następnie przymocuj pokrywkę do naczynia za pomocą taśmy i przenieś naczynie do inkubatora w temperaturze 28 stopni Celsjusza, gdzie musi pozostać w ciemności przez pięć do sześciu godzin.

Pracując pod kapturem z przepływem laminarnym, zacznij od sterylizacji transgenicznych nasion A.thaliana Columbia. Namocz je w roztworze czyszczącym na pięć minut. Następnie dokładnie opłucz nasiona w autoklawie wodnym.

Po wysterylizowaniu przechowuj nasiona w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności przez 48 godzin. Kilka dni później odgazuj mikrourządzenie na 20 minut przed użyciem. Następnie załaduj odpowiednią pożywkę wzrostową do studzienek urządzenia za pomocą pipety z cienką końcówką i odczekaj kilka minut, aż roztwór zostanie przeciągnięty przez wszystkie kanały.

Załaduj również wilgotny ręcznik papierowy na naczynie, aby utrzymać wilgotność. Teraz przenieś przygotowane nasiona do wlotu urządzenia. Następnie przymocuj pokrywkę taśmą i przenieś naczynie do inkubatora o temperaturze 22 stopni Celsjusza z ciągłym światłem.

Przed użyciem należy wysterylizować mikrourządzenie w świetle UV przez noc. Następnego dnia odgazuj mikrourządzenie na 20 minut. Po odgazowaniu załaduj mikrostudzienki odpowiednią pożywką wzrostową.

Podczas gdy kanały stopniowo się wypełniają, otocz mikrourządzenie odrobiną autoklawizowanej wody, aby utrzymać wilgotność. Przenieś mały kawałek tkanki protonemata mchu do wlotu mikrourządzenia. Teraz hoduj urządzenie w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciągłym świetle.

Po dwóch do trzech tygodniach wzrostu wykonaj zdjęcia wyników w jasnym polu pod mikroskopem. Komórki roślinne rosnące wierzchołkowo napotykają szereg barier fizycznych wzdłuż swoich ścieżek wzrostu in vivo, takich jak droga transmisyjna i mikropale, nie wspominając o ścieżce włośników w glebie. Zaprezentowane mikroprzepływowe platformy do hodowli komórkowych in vitro umożliwiają badanie procesu wzrostu wierzchołkowego w trzech typach komórek roślinnych: łagiewkach pyłkowych, włośnikach i protonematach mchu.

Podgląd odbywa się przez jednomikronowe szczeliny w urządzeniach. Ponieważ mikroszczeliny tej wielkości są delikatne, czasami zamykają się, zwłaszcza po wielokrotnym użyciu. Dlatego ważne jest, aby przed wykonaniem eksperymentów sprawdzić, czy luki są nienaruszone.

W badaniu łagiewki pyłkowej wykorzystano obrazowanie żywych komórek do monitorowania zmian morfologicznych w okolicy wierzchołkowej łagiewki pyłkowej, a także w jądrze wegetatywnym i plemnikach w odpowiedzi na napotkanie bardzo małej przestrzeni. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórek roślinnych do zbadania zdolności do wydłużania komórek roślinnych rosnących na wierzchołkach, takich jak łagiewki pyłkowe, włośniki i protonematy mchu na bardzo małej przestrzeni.