Name: Analiza LC-MS ludzkich płytek krwi jako platforma do badania metabolizmu mitochondrialnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Poznaj analizę LC-MS płytek krwi do badania metabolizmu mitochondrialnego z użyciem rotenonu. Ta metoda izotopowego śledzenia pozwala badać adaptacje metaboliczne i potencjalne interwencje terapeutyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Doceniamy wsparcie ze strony P30ES013508 i T32ES019851 grantów NIH.

Oświadczenie etyczne: Wszystkie protokoły dotyczące postępowania z próbkami ludzkimi są zgodne z wytycznymi komitetu etyki badań na ludziach Uniwersytetu Pensylwanii.
1. Przygotowanie i 100x roztworów podstawowych
<ol>
	<li>Przygotuj 1 l buforu bazowego Tyrode. Połączyć 8,123 g NaCl, 1,428 g NaHCO3, 0,466 g CaCl2∙2 H2O, 0,224 g KCl i 0,095 g MgCl2. Dostosuj całkowitą objętość do 1 l za pomocą ddH2O. Filtruj wysterylizuj bazę bufora Tyrode.</li>
	<li>Przygotuj 100x roztwory podstawowe glukozy i kwasu palmitynowego. W przypadku 100-krotnych roztworów podstawowych glukozy rozpuścić 100 mg glukozy lub [13C6]-glukozy w 1 ml ddH2O. W przypadku 100x roztworów palmitynianu rozpuść 2,56 mg kwasu palmitynowego lub 2,72 mg [13C16]-kwasu palmitynowego w 1 ml etanolu. Filtruj sterylizuj 100x roztwory podstawowe.</li>
	<li>Przygotuj odpowiednie wzbogacone Tyrode'a
	<ol>
		<li>W przypadku badań nieznakujących dodać 1 ml 100 x roztworu podstawowego glukozy i 1 ml 100 x roztworu podstawowego kwasu palmitynowego do 98 ml buforu zasady Tyrode.</li>
		<li>W przypadku badań znakowania glukozą dodać 1 ml 100 x [13C6] -glukozowego roztworu podstawowego i 1 ml 100 x roztworu podstawowego kwasu palmitynowego do 98 ml buforu zasady Tyrode.</li>
		<li>W przypadku badań znakowania kwasem palmitynowym dodać 1 ml 100-krotnego roztworu podstawowego glukozy i 1 ml roztworu podstawowego [13C16]-kwasu palmitynowego do 98 ml buforu zasady Tyrode.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworów do leczenia rotenonem
	<ol>
		<li>Przygotować 10 mM roztwór podstawowy rotenonu w dimetylosulfotlenku (DMSO).</li>
		<li>W przypadku badań dawka-odpowiedź bez znakowania, należy przejść do punktu 1.4.3. W celu znakowania badań dotyczących pojedynczej dawki, należy przejść do punktu 1.4.5.</li>
		<li>Przeprowadzić seryjne rozcieńczanie 10 mM rotenonu w DMSO w celu uzyskania roztworów o stężeniach rotenonu w zakresie od 1 nM do 100 μM. Są to akcje 100x.</li>
		<li>Dodać 50 μl każdego bulionu do 5 ml buforu tyrolego + glukoza + kwas palmitynowy z 1.3.1 w celu przygotowania roztworów o stężeniach rotenonu w zakresie od 10 pM do 1 μM. Alternatywnie dodać 50 μl DMSO, aby służyło jako kontrola nośnika. Przejdź do punktu 2.1.</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy 10 mM 1,000 razy w DMSO, aby uzyskać roztwór roboczy 10 μM.</li>
		<li>Dodać po 50 μl tego bulionu do 5 ml każdego z buforu zasady Tyrode + [13C6]-glukoza + kwas palmitynowy z 1.3.2 i bufor zasady Tyrode + glukoza + [13C16]-kwas palmitynowy z 1.3.3. Końcowe stężenie wynosi 100 nM rotenonu. Alternatywnie, dodać 50 μl DMSO do każdego bufora, aby służył jako kontrola pojazdu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Izolacja płytek krwi
Uwaga: Ta metoda jest dostępna dla płytek krwi pochodzących zarówno z krwi pełnej, jak i z worków płytkowych. Przykładowe dane zawarte w niniejszym dokumencie zostały przygotowane przy użyciu płytek krwi pochodzących z worków płytkowych. Zobacz Basu i wsp.5, aby uzyskać więcej informacji na temat stosowania płytek krwi wyizolowanych z krwi pełnej.
<ol>
	<li>Izolacja płytek krwi z krwi pełnej 
	UWAGA: W przypadku izolowania płytek krwi z worka płytek krwi należy postępować zgodnie z ppkt 2.2.1.
	<ol>
		<li>Odwirować krew pełną o sile 175 x g przez 15 minut bez hamowania.</li>
		<li>Przenieść 1 ml górnej warstwy osocza bogatopłytkowego (PRP) do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Odwirować PRP przy 400 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Odessać supernatant i przejść do kroku 3.1 lub 3.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja płytek krwi z worka płytkowego
	<ol>
		<li>Przenieść 1 ml zawiesiny płytek krwi do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę o sile 400 x g przez 5 min.</li>
		<li>Odessać supernatant i przejść do kroku 3.1 lub 3.2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przeprowadzanie eksperymentu
<ol>
	<li>Aby określić wpływ leczenia ksenobiotykami (np. rotenonem) na poziomy metabolitu będącego przedmiotem zainteresowania (np. acetylo-CoA), należy przejść do ppkt 3.1.1. W celu określenia wpływu ksenobiotyku (np. rotenonu) na włączenie prekursora metabolicznego do metabolitu będącego przedmiotem zainteresowania, należy przejść do ppkt 3.2.1.
	<ol>
		<li>Stosując nie mniej niż trzy kontrpróby biologiczne dla każdego stanu, zawiesić osad płytek krwi z etapu 2.1.4 lub 2.2.3 w 1 ml każdego roztworu z kroku 1.4.4.</li>
		<li>Inkubować zawieszone płytki krwi w inkubatorze CO2 z płaszczem wodnym ustawionym na 95% wilgotności, 5% CO2 i 37 °C przez 1 godzinę. Przejdź do kroku 4.1 
		Uwaga: Poniżej opisujemy eksperyment z odpowiedzią na dawkę. Alternatywnie można przeprowadzić eksperyment z przepływem czasowym, w którym dawka była ustalona, a długość inkubacji zmieniana.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określenie wpływu leczenia ksenobiotykami na włączenie prekursora metabolicznego do dalszego metabolitu będącego przedmiotem zainteresowania.
	<ol>
		<li>Używając nie mniej niż trzech kontrprób biologicznych dla każdego schorzenia, ponownie zawiesić osad płytek krwi z kroku 2.1.4 lub 2.2.3 w 1 ml każdej postaci znakowanego buforu Tyrode'a z kroku 1.4.6.</li>
		<li>Zawiesinę płytek krwi należy inkubować w inkubatorze CO2 z płaszczem wodnym ustawionym na wilgotność 95%, 5% CO2 i temperaturę 37 °C przez 1 godzinę. Przejdź do kroku 4.1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Hartowanie i ekstrakcja CoA
<ol>
	<li>Płytki krwi osadek przez odwirowanie w stężeniu 3 000 x g przez 3 min.</li>
	<li>Aspirowany supernatant.</li>
	<li>Zawiesić płytki krwi w 750 μl lodowatego 10% kwasu trójchlorooctowego (w/v).</li>
	<li>Dodać odpowiedni stabilny wzorzec wewnętrzny znakowany izotopem. Na przykład, jeśli celem jest porównanie poziomów gatunków CoA w próbkach, należy użyć 100 μl mieszaniny tioestrów CoA znakowanych stabilnym izotopem otrzymanych z drożdży, jak opisano wcześniej (technika SILEC) 29.</li>
	<li>Wykonaj impulsową sonifikację każdej próbki 30 razy za pomocą impulsów 0,5 sekundy.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przymocuj kolumny do ekstrakcji fazy stałej (SPE) C18 do kolektora próżniowego.</li>
	<li>Kondycjonować kolumny 1 ml metanolu.</li>
	<li>Zrównoważyć kolumny z 1 ml ddH2O.</li>
	<li>Przepuścić supernatant z próbki (w tym przypadku około 850 μl) przez kolumny.</li>
	<li>Umyj kolumny 1 ml wody.</li>
	<li>Załadować szklane probówki wirówkowe o pojemności 10 ml do kolektora próżniowego w celu zebrania frakcji elucyjnej.</li>
	<li>Eluować kolumny 1 ml 25 mM octanu amonu w metanolu.</li>
	<li>Suchy eluat pod gazowym azotem.</li>
	<li>Zawiesić wysuszone pozostałości w 50 μl 5% (w/v) kwasu 5-sulfosalicylowego i przenieść do fiolek HPLC.</li>
</ol>
5. Konfiguracja HPLC
<ol>
	<li>Korzystając z oprogramowania sterującego systemu HPLC, utwórz metodę z warunkami HPLC zoptymalizowanymi dla docelowych analitów i wykorzystanej kolumny, jak podano w tabeli 1. 
	Uwaga: Temperatura kolumny użyta do wygenerowania tych danych wynosiła 25 °C, ale konkretne parametry będą się różnić w zależności od instrumentu i w odniesieniu do interesujących związków. W przypadku oznaczania ilościowego acylo-CoA opisano wiele metod analizy LC-MS i zwalidowano je dla różnych analitów w różnych warunkach LC 14,19,20.</li>
	<li>Pozwól, aby HPLC odpowiednio się zrównoważył. 
	Uwaga: Powinno to obejmować zarówno zalewanie rozpuszczalników przed dołączeniem kolumny, jak i równoważenie kolumny w warunkach początkowych rozpuszczalnika dla metody. Objętość równowagi powinna być zgodna ze wskazówkami producenta, a powstałe ścieki powinny być kierowane do odpadów. 
	Uwaga: Skonsultuj się z Basu i Blair 5, aby uzyskać więcej informacji na temat ustawień HPLC.</li>
</ol>
6. Ustawienia spektrometru masowego
<ol>
	<li>Korzystając z oprogramowania sterującego spektrometrem mas, stwórz ukierunkowaną metodę wykrywania zjonizowanych form interesujących związków. Parametry przedstawiono w tabeli 2. 
	Uwaga: Stabilne analogi izotopowe tych związków powinny być używane do określenia, czy tryb dodatni czy ujemny daje lepszą czułość oraz do optymalizacji stanu źródła i optyki pod kątem ich wykrywania. Całkowity czas wykrywania metodą spektrometru mas powinien odpowiadać składowej czasowej powiązanej metody HPLC. 
	Uwaga: Jak wcześniej wspomniano, opisano wiele metod analizy acylo-CoA, w tym tryby jonizacji dodatniej 14 i ujemnej jonizacji 15 oraz użycie spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości 17 zamiast instrumentu z potrójnym kwadrupolem 28.</li>
	<li>Oczyść i skalibruj przyrząd, umieść stabilny spray w spektrometrze i poczekaj, aż roztwór kalibracyjny odpowiednio rozproszy się ze źródła i układu optycznego zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Ustaw sekwencję dla wszystkich próbek za pomocą oprogramowania sterującego spektrometrem mas. Należy podać nazwę lub identyfikatory numeryczne oraz wskazać odpowiednią objętość wtrysku i metodę wstrzykiwania. Uruchom ślepą próbę przed pierwszą próbką i uruchom inne ślepe próby i rozmycia między próbkami w razie potrzeby, aby złagodzić efekty przeniesienia lub matrycy. 
	Uwaga: Metoda przetwarzania całkowania pików chromatogramów cieczowych wybranych analitów może być często ustawiona w tej sekwencji lub następnie zastosowana w przetwarzaniu danych.</li>
	<li>Rozpocznij sekwencję i okresowo monitoruj spektrometr mas i system HPLC pod kątem problemów, w tym wahań ciśnienia lub awarii systemu oraz utraty intensywności sygnału podczas pracy. 
	Uwaga: Poważne problemy lub uporczywe awarie przebiegu mogą wymagać przerwania pracy oraz oczyszczenia i ponownego zrównoważenia systemu HPLC, a także oczyszczenia i kalibracji spektrometru mas. Skonsultuj się z Basu i Blair 5, aby uzyskać więcej informacji na temat ustawień MS i przetwarzania danych.</li>
</ol>

<ol><li>Ault, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+utility+of+flow+cytometry+in+the+study+of+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">The clinical utility of flow cytometry in the study of platelets.</a> Semin. Hematol. 38 (2), 160-168 (2001).</li>
<li>Avila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+mitochondrial+dysfunction+is+evident+in+type+2+diabetes+in+association+with+modifications+of+mitochondrial+anti-oxidant+stress+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Clin.+Endocrinol.+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins.</a> Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120 (4), 248-251 (2012).</li>
<li>Basu, S. S., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotenone-mediated+changes+in+intracellular+coenzyme+A+thioester+levels%3A+implications+for+mitochondrial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Rotenone-mediated changes in intracellular coenzyme A thioester levels: implications for mitochondrial dysfunction.</a> Chem. Res. Toxicol. 24 (10), 1630-1632 (2011).</li>
<li>Basu, S. S., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SILEC%3A+a+protocol+for+generating+and+using+isotopically+labeled+coenzyme+A+mass+spectrometry+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">SILEC: a protocol for generating and using isotopically labeled coenzyme A mass spectrometry standards.</a> Nat. Protoc. 7 (1), 1-12 (2012).</li>
<li>Basu, S. S., Deutsch, E. C., Schmaier, A. A., Lynch, D. R., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelets+as+a+platform+to+monitor+metabolic+biomarkers+using+stable+isotopes+and+LC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS.</a> Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).</li>
<li>Berson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+experimental+buprenorphine+hepatotoxicity%3A+major+role+of+mitochondrial+dysfunction+versus+metabolic+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation.</a> J. Hepatol. 34 (2), 261-269 (2001).</li>
<li>Castell, J. V., Jover, R., Martinez-Jimenez, C. P., Gomez-Lechon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+cell+lines%3A+their+use%2C+scope+and+limitations+in+drug+metabolism+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies.</a> Expert. Opin. Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).</li>
<li>Ciccimaro, E., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable-isotope+dilution+LC-MS+for+quantitative+biomarker+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis.</a> Bioanalysis. 2 (2), 311-341 (2010).</li>
<li>Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Links+between+metabolism+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Links between metabolism and cancer.</a> Genes Dev. 26 (9), 877-890 (2012).</li>
<li>Darnell, M., Weidolf, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+xenobiotic+carboxylic+acids%3A+focus+on+coenzyme+A+conjugation%2C+reactivity%2C+and+interference+with+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Metabolism of xenobiotic carboxylic acids: focus on coenzyme A conjugation, reactivity, and interference with lipid metabolism.</a> Chem. Res. Toxicol. 26 (8), 1139-1155 (2013).</li>
<li>Des Rosiers, C., Fernandez, C. A., David, F., Brunengraber, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversibility+of+the+mitochondrial+isocitrate+dehydrogenase+reaction+in+the+perfused+rat+liver.+Evidence+from+isotopomer+analysis+of+citric+acid+cycle+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reversibility of the mitochondrial isocitrate dehydrogenase reaction in the perfused rat liver. Evidence from isotopomer analysis of citric acid cycle intermediates.</a> J. Biol. Chem. 269 (44), 27179-27182 (1994).</li>
<li>Ellis, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiling+detects+early+effects+of+environmental+and+lifestyle+exposure+to+cadmium+in+a+human+population%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Med%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiling detects early effects of environmental and lifestyle exposure to cadmium in a human population.</a> BMC. Med. 10, 61(2012).</li>
<li>Grevengoed, T. J., Klett, E. L., Coleman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acyl-CoA+metabolism+and+partitioning%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Acyl-CoA metabolism and partitioning.</a> Annu. Rev. Nutr. 34, 1-30 (2014).</li>
<li>Haynes, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+fatty+acyl-coenzyme+As+in+mammalian+cells+by+liquid+chromatography-electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitation of fatty acyl-coenzyme As in mammalian cells by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> J. Lipid Res. 49 (5), 1113-1125 (2008).</li>
<li>Ikegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cholyl-adenylate+in+rat+liver+microsomes+by+liquid+chromatography%2Felectrospray+ionization-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Characterization of cholyl-adenylate in rat liver microsomes by liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 266 (1), 125-132 (1999).</li>
<li>Kalghatgi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactericidal+antibiotics+induce+mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+damage+in+Mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Bactericidal antibiotics induce mitochondrial dysfunction and oxidative damage in Mammalian cells.</a> Sci. Transl. Med. 5 (192), 192ra85(2013).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Metabolomics+with+Acyl-CoA+Profiling+Reveals+Widespread+Remodeling+in+Response+to+Diet%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Metabolomics with Acyl-CoA Profiling Reveals Widespread Remodeling in Response to Diet.</a> Mol. Cell Proteomics. 14 (6), 1489-1500 (2015).</li>
<li>Lopez-Gallardo, E., Iceta, R., Iglesias, E., Montoya, J., Ruiz-Pesini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OXPHOS+toxicogenomics+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">OXPHOS toxicogenomics and Parkinson's disease.</a> Mutat. Res. 728 (3), 98-106 (2011).</li>
<li>Magnes, C., Sinner, F. M., Regittnig, W., Pieber, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC%2FMS%2FMS+method+for+quantitative+determination+of+long-chain+fatty+acyl-CoAs%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">LC/MS/MS method for quantitative determination of long-chain fatty acyl-CoAs.</a> Anal. Chem. 77 (9), 2889-2894 (2005).</li>
<li>Mauriala, T., Herzig, K. H., Heinonen, M., Idziak, J., Auriola, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+long-chain+fatty+acid+acyl-coenzyme+A+compounds+using+liquid+chromatography-electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B+Analyt.+Technol.+Biomed.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of long-chain fatty acid acyl-coenzyme A compounds using liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 808 (2), 263-268 (2004).</li>
<li>Murphy, T. A., Dang, C. V., Young, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopically+nonstationary+13C+flux+analysis+of+Myc-induced+metabolic+reprogramming+in+B-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">Isotopically nonstationary 13C flux analysis of Myc-induced metabolic reprogramming in B-cells.</a> Metab Eng. 15, 206-217 (2013).</li>
<li>Paglia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+analysis+of+platelets+during+storage%3A+a+comparison+between+apheresis-+and+buffy+coat-derived+platelet+concentrates%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Metabolomic analysis of platelets during storage: a comparison between apheresis- and buffy coat-derived platelet concentrates.</a> Transfusion. 55 (2), 301-313 (2015).</li>
<li>Patti, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+strategies+for+untargeted+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Separation strategies for untargeted metabolomics.</a> J. Sep. Sci. 34 (24), 3460-3469 (2011).</li>
<li>Robishaw, J. D., Neely, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+A+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Coenzyme A metabolism.</a> Am. J. Physiol. 248 (1 Pt 1), E1-E9 (1985).</li>
<li>Rodgers, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+platelet+physiology+and+laboratory+evaluation+of+platelet+function%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Obstet.+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Overview of platelet physiology and laboratory evaluation of platelet function.</a> Clin. Obstet. Gynecol. 42 (2), 349-359 (1999).</li>
<li>Salles, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+high-throughput+ELISA+assay+for+platelet+function+testing+using+platelet-rich+plasma+or+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Development of a high-throughput ELISA assay for platelet function testing using platelet-rich plasma or whole blood.</a> Thromb. Haemost. 104 (2), 392-401 (2010).</li>
<li>Snyder, N. W., Basu, S. S., Worth, A. J., Mesaros, C., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+propionic+acid+to+a+novel+acyl-coenzyme+A+thioester+by+mammalian+cell+lines+and+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Metabolism of propionic acid to a novel acyl-coenzyme A thioester by mammalian cell lines and platelets.</a> J. Lipid Res. 56 (1), 142-150 (2015).</li>
<li>Snyder, N. W., Basu, S. S., Zhou, Z., Worth, A. J., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+dilution+liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry+analysis+of+cellular+and+tissue+medium-+and+long-chain+acyl-coenzyme+A+thioesters%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Stable isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry analysis of cellular and tissue medium- and long-chain acyl-coenzyme A thioesters.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (16), 1840-1848 (2014).</li>
<li>Snyder, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+stable+isotope-labeled+acyl-coenzyme+A+thioesters+by+yeast+stable+isotope+labeling+by+essential+nutrients+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Production of stable isotope-labeled acyl-coenzyme A thioesters by yeast stable isotope labeling by essential nutrients in cell culture.</a> Anal. Biochem. 474, 59-65 (2015).</li>
<li>Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+diseases+in+man+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial diseases in man and mouse.</a> Science. 283 (5407), 1482-1488 (1999).</li>
<li>Wojtovich, A. P., Brookes, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+II+inhibitor+atpenin+A5+protects+against+cardiac+ischemia-reperfusion+injury+via+activation+of+mitochondrial+KATP+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">The complex II inhibitor atpenin A5 protects against cardiac ischemia-reperfusion injury via activation of mitochondrial KATP channels.</a> Basic Res. Cardiol. 104 (2), 121-129 (2009).</li>
<li>Worth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotopes+and+LC-MS+for+monitoring+metabolic+disturbances+in+Friedreich%27s+ataxia+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Stable isotopes and LC-MS for monitoring metabolic disturbances in Friedreich's ataxia platelets.</a> Bioanalysis. 7 (15), 1843-1855 (2015).</li>
<li>Worth, A. J., Basu, S. S., Snyder, N. W., Mesaros, C., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+neuronal+cell+mitochondrial+complex+I+with+rotenone+increases+lipid+beta-oxidation%2C+supporting+acetyl-coenzyme+A+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of neuronal cell mitochondrial complex I with rotenone increases lipid beta-oxidation, supporting acetyl-coenzyme A levels.</a> J. Biol. Chem. 289 (39), 26895-26903 (2014).</li>
<li>Zhou, L., Schmaier, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+aggregation+testing+in+platelet-rich+plasma%3A+description+of+procedures+with+the+aim+to+develop+standards+in+the+field%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field.</a> Am. J. Clin. Pathol. 123 (2), 172-183 (2005).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Tutaj pokazaliśmy użyteczność izolowanych płytek krwi jako platformy do badania zaburzonego metabolizmu mitochondrialnego. W szczególności scharakteryzowaliśmy adaptację metaboliczną w odpowiedzi na hamowanie kompleksu I przez rotenon.
Niniejsze badanie rozszerzyło wcześniej zgłoszone wyniki badań nad rolą hamowania kompleksu I przez rotenon w liniach komórkowych do ludzkich płytek krwi. Co ważne, okazało się, że rotenon hamował również tworzenie się sukcynylo-CoA płytek krwi, stymulował wzros...

Dysfunkcyjny metabolizm mitochondriów jest związany z wieloma chorobami, w tym neurodegeneracją, rakiem i chorobami układu krążenia 30. W związku z tym włożono wiele wysiłku w scharakteryzowanie defektów metabolicznych, które przyczyniają się do patogenezy choroby. Chromatografia cieczowa z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) jest uważana za złoty standard w oznaczaniu ilościowym analitów ze złożonych matryc biologicznych i jest często stosowana w badaniach metabolicznych 8. Jednak, jak to często bywa w przypadku badań biomedycznych, uzyskanie dostępnego i dobrze zdefiniowanego modelu istotnego dla chorób u ludzi jest wyzwaniem.
Wiele badań wykorzystuje przekształcone modele komórkowe do badania wpływu ksenobiotyków lub nieprawidłowości genetycznych na metabolizm komórkowy 7,9. Przeprogramowanie metaboliczne, które zachodzi w komórkach nowotworowych, może wprowadzać czynniki zakłócające 21 i dlatego nie jest idealne. Problemy te można obejść za pomocą pierwotnych modeli komórek, chociaż uzyskanie wystarczającej ilości biomasy do analiz metabolicznych może być trudne. Co więcej, wpływ dużych ilości antybiotyków stosowanych w hodowli został podkreślony jako potencjalnie mylący w badaniach mitochondrialnych 16.
Ludzkie płytki krwi dają możliwość wykorzystania pierwotnego modelu komórkowego o wystarczającej zawartości mitochondriów do badań metabolicznych 5,22,27,32. Po pierwsze, płytki krwi można łatwo pozyskać, pobierając krew od indywidualnych dawców lub w dużych ilościach z banków krwi, a tym samym stanowią model, w którym można łatwo kontrolować czynniki zewnętrzne. Po drugie, ze względu na ich niewielkie rozmiary, płytki krwi można łatwo wyizolować z innych składników krwi przy minimalnym nakładzie pracy przygotowawczej w nawet minimalnie wyposażonych laboratoriach 5. Warto zauważyć, że płytki krwi nie zawierają jąder i dlatego mogą być wykorzystywane do badania zmian w metabolizmie niezależnie od regulacji transkrypcji. Tutaj pokazujemy, że oprócz względnej kwantyfikacji tioestrów acylokoenzymu A (CoA), izolowany układ płytek krwi może być wykorzystany do badania metabolizmu węgla. W szczególności donosimy o zastosowaniu znakowania metabolicznego stabilnym izotopem (nieradioaktywnym) znakowanym [13C6] -glukozą i [13C16]-palmitynianem w celu zbadania włączenia znacznika [13C] do ważnego metabolitu acetylo-CoA poprzez glikolizę lub utlenianie kwasów tłuszczowych. Zapewnia to potężną, uogólnioną i wszechstronną platformę ze względu na rozległe zaangażowanie gatunków acylo-CoA w szlaki biochemiczne 13,24 oraz podatność tego systemu na testowanie innych zmiennych, takich jak hamowanie kompleksu I z rotenonem 3,33. Oprócz informacji zawartych w poniższym Protokole, obszerny opis metod stosowanych do znakowania izotopów oraz do analiz opartych na LC-MS można znaleźć w Basu i Blair 4.

<table><tbody><tr><td>Odczynnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2 * H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208337</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>13C6-Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>Kwas palmitynowy</td><td>Cayman</td><td>10006627</td><td></td></tr><tr><td>13C16-palmitynowy Kwas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>605573</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trichlorooctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 5-sulfosalicylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>390275</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitirle</td><td>Fischer Scientific</td><td>A996-4</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>Woda (H2O)</td><td>Fischer Scientific</td><td>W7-4</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Fischer Scientific</td><td>85171</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>A454-4</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Fischer Scientific</td><td>A639-500</td><td></td></tr><tr><td>2 ml probówki Eppendorf</td> Fiolki <td>BioExpress</td><td>C-3229-1</td><td></td></tr><tr><td>LC (plastikowe)</td><td>Wody</td><td>186002640</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Szklane probówki wirówkowe</td><td>Kimble Chase</td><td>73785-10</td><td></td></tr><tr><td>Oasis Kolumny do ekstraksji fazy stałej (SPE)</td><td>Wody</td><td>WAT094225</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pastuer</td><td>Fischer Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator z płaszczem wodnym</td><td>Nuaire</td><td>AutoFlow NU-8500</td><td></td></tr><tr><td>Potrójny kwadropolowy spektrometr masowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>Finnigan TSQ Quantum</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>Dionex Ultimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>Źródło</td><td>Thermo Scientific</td><td>HESI II</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Kolumna</td><td>Phenomenex</td><td>Luna C18</td><td>3 &mu; M Wielkość cząstek, 200 mm x 2 mm</td></tr></tbody></table>

analiza lc-ms ludzkich płytek krwi jako platforma do badania metabolizmu mitochondrialnego

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

Zaburzony metabolizm mitochondrialny zyskał ponowne zainteresowanie jako odgrywający przyczynową rolę w wielu chorobach. Badanie zmian w szlakach metabolicznych wymaga modelu, w którym czynniki zewnętrzne mogą być dobrze kontrolowane, co pozwala na uzyskanie powtarzalnych i znaczących wyników. Wiele badań wykorzystuje do tych celów przekształcone modele komórkowe; Jednak przeprogramowanie metaboliczne, które zachodzi w wielu liniach komórek nowotworowych, może wprowadzać zmienne zakłócające. Z tego powodu pożądane są komórki pierwotne, chociaż uzyskanie odpowiedniej biomasy do badań metabolicznych może być trudne. Tutaj pokazujemy, że ludzkie płytki krwi mogą być wykorzystane jako platforma do przeprowadzania badań metabolicznych w połączeniu z analizą chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas. Podejście to jest podatne na względną kwantyfikację i znakowanie izotopowe w celu zbadania aktywności określonych szlaków metabolicznych. Dostępność płytek krwi od indywidualnych dawców lub z banków krwi sprawia, że ten modelowy system ma zastosowanie w badaniach klinicznych i może być rozwijany. W tym przypadku wykorzystujemy izolowane płytki krwi, aby potwierdzić wcześniej zidentyfikowane kompensacyjne zmiany metaboliczne w odpowiedzi na inhibitor kompleksu I rotenon. Mówiąc dokładniej, spadkowi glikolizy towarzyszy wzrost utleniania kwasów tłuszczowych w celu utrzymania poziomu acetylo-CoA. Nasze wyniki pokazują, że płytki krwi mogą być wykorzystywane jako łatwo dostępny i istotny z medycznego punktu widzenia model do badania wpływu ksenobiotyków na metabolizm komórkowy.

Aby zademonstrować użyteczność tej metodologii, odtworzyliśmy ogólną zdolność do kompensacyjnej adaptacji metabolicznej wynikającej z ekspozycji na rotenon, opisaną w poprzednich badaniach. Zjawisko to zostało wcześniej zidentyfikowane w modelach hodowli komórkowych, a celem niniejszego badania było sprawdzenie, czy ta zmiana metaboliczna zachodzi również w płytkach krwi, które są bezzielone i nie są podatne na te same artefakty eksperymentalne co hodowle komórkowe. Prace przeprowadzono z...

Tutaj pokazujemy, że izolowane ludzkie płytki krwi mogą być używane jako dostępny model ex vivo do badania adaptacji metabolicznych w odpowiedzi na inhibitor kompleksu I rotenon. Podejście to wykorzystuje śledzenie izotopowe i względną kwantyfikację za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas i może być stosowane w różnych projektach badawczych.

Analiza LC-MS ludzkich płytek krwi jako platforma do badania metabolizmu mitochondrialnego

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Ogólnym celem tej procedury jest określenie, w jaki sposób leczenie ksenobiotykami lub stan chorobowy zmienia metabolizm komórkowy. Metoda ta pozwala na odkrycie, jak stan chorobowy lub zastosowana toksyna wpływa na metabolizm komórek. Gdy zostanie to ustalone, nasza metoda umożliwia sprawdzenie, czy określona interwencja może skorygować ten defekt.Główną zaletą tej techniki jest to, że nie opiera się ona na zmodyfikowanych liniach komórkowych, dzięki czemu istnieje większe prawdopodobieństwo uzyskania wyników bezpośrednio istotnych dla zdrowia ludzi. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować 10 mM roztwór zapasu rotenonu w dimetylosulfoksydzie. Wykonać rozcieńczenia seryjne 10 mM roztworu zapasu rotenonu, aby otrzymać roztwory o stężeniach rotenonu w zakresie od 1 nM do 100 µM.Następnie dodaj 50 µL każdego roztworu zapasowego do pięciu mililitrów wcześniej przygotowanego wzbogaconego buforu Tyrode'a, aby przygotować roztwory z koncentracjami rotenonu w zakresie od 10 pM do 1 µM. Do jednej z próbek roztworu buforowego dodaj 50 µL DMSO, aby służyła jako kontrola nośnika. W celu wyizolowania płytek krwi z krwi pełnej, odwiruj próbki krwi pełnej przy 175 ×g przez 15 minut bez prz

lc-ms-analysis-human-platelets-as-platform-for-studying-mitochondrial

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Fibroblasty pobrane od pacjentów z mutacjami w genach odpowiedzialnych za chorobę Parkinsona stanowią łatwo dostępny model ex vivo do badania fenotypów związanych z tą chorobą. Obrazowanie żywych komórek daje możliwość analizy parametrów morfologicznych i funkcjonalnych w żywych komórkach. W niniejszym opracowaniu opisujemy przygotowanie ludzkich fibroblastów oraz późniejsze monitorowanie fenotypów mitochondrialnych.

Wykorzystanie pierwotnych ludzkich fibroblastów do monitorowania fenotypów mitochondrialnych w badaniach nad chorobą Parkinsona

Leukocyty krwi i płytki krwi mogą być używane jako marker ogólnego zdrowia bioenergetycznego danej osoby, a więc mają potencjał do monitorowania procesów patologicznych i wpływu leczenia. Tutaj opisujemy metodę izolacji i pomiaru funkcji mitochondriów oraz wybuchu oksydacyjnego w tych komórkach.

Bioenergetyka i wybuch oksydacyjny: protokoły izolacji i oceny ludzkich leukocytów i płytek krwi

To badanie przedstawia nowatorskie podejście do pomiaru wielu parametrów funkcjonalnych mitochondriów na podstawie cytometrii przepływowej i podwójnego barwienia dwoma fluorescencyjnymi reporterami lub przeciwciałami w celu wykrycia zmian w objętości mitochondriów, potencjale błony mitochondrialnej, poziomie reaktywnych form tlenu, składzie mitochondrialnego łańcucha oddechowego i mitochondrialnym DNA.

Analiza cytometryczna przepływowa wielu parametrów mitochondrialnych w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach macierzystych oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych

Sieć mitochondrialna jest niezwykle złożona, co czyni ją bardzo trudną do analizy. Nowatorskie narzędzie MATLAB analizuje na żywo mitochondria zobrazowane konfokalnie na zdjęciach poklatkowych, ale skutkuje dużą objętością wyjściową wymagającą indywidualnej uwagi ręcznej. Aby rozwiązać ten problem, opracowano rutynową optymalizację, która pozwala na szybką analizę plików.

Zoptymalizowana zautomatyzowana analiza modulacji homeostazy mitochondriów neuronalnych w żywych organizmach neuronalnych przez specyficzne dla izoform receptory kwasu retinowego

Ten protokół opisuje technikę analizy superkompleksów oddechowych, gdy dostępne są tylko małe ilości próbek.

Izolacja mitochondriów do analizy superkompleksów mitochondrialnych z próbek małych tkanek i kultur komórkowych

Metody badania bioenergetyki mitochondriów pod fizjologicznie istotnymi stężeniami substratów w komórkach odpornościowych są ograniczone. Zapewniamy szczegółowy protokół, który wykorzystuje fluorespirometrię o wysokiej rozdzielczości do oceny zmian w odpowiedzi potencjału błony mitochondrialnej na zapotrzebowanie na energię w ludzkich limfocytach T, monocytach i obwodowych komórkach jednojądrzastych.

Fluorespirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny dynamicznych zmian potencjału błony mitochondrialnej w ludzkich komórkach odpornościowych

Metabolizm płytek krwi jest interesujący, szczególnie w odniesieniu do roli nadmiernej i hipoaktywności płytek krwi w krwawieniach i zaburzeniach zakrzepowych. Izolowanie płytek krwi z osocza jest konieczne w przypadku niektórych testów metabolicznych; Przedstawiono metodę izolacji metabolitów wewnątrzkomórkowych z przemytych płytek krwi.

Przygotowanie przemytych ludzkich płytek krwi do ilościowych badań przepływu metabolicznego

Obecny protokół dostarcza obszerny zestaw procedur niezbędnych do analizy prokoagulacyjnych płytek krwi, które wykazują nakładające się cechy martwicy, apoptozy i aktywacji płytek krwi.

Kompleksowa analiza płytek krwi prokoagulantów wykazujących cechy martwicy, apoptozy i aktywacji płytek krwi

Udostępniamy technikę zachowania nienaruszonego łyka drzewnego i przygotowania go do obserwacji.  Tworzymy aparat zwany kanapką łyka, który pozwala na wprowadzenie i obserwację stawonogów, drobnoustrojów i innych organizmów zasiedlających tkanki łyka.

Technika badania zbiorowisk stawonogów i mikroorganizmów w tkankach drzew

Ta praca opisuje nowatorską metodę selektywnego celowania w organelle subkomórkowe u roślin, testowaną za pomocą BioRad Gene Gun.

Przejściowa ekspresja genów w tytoniu przy użyciu zespołu Gibsona i pistoletu genowego

Poznaj analizę LC-MS płytek krwi do badania metabolizmu mitochondrialnego z użyciem rotenonu. Ta metoda izotopowego śledzenia pozwala badać adaptacje metaboliczne i potencjalne interwencje terapeutyczne.

Analiza LC-MS ludzkich płytek krwi jako platforma do badania metabolizmu mitochondrialnego

Przeglądaj więcej filmów