Analiza LC-MS ludzkich płytek krwi jako platforma do badania metabolizmu mitochondrialnego

Ogólnym celem tej procedury jest określenie, w jaki sposób leczenie ksenobiotykami lub stan chorobowy zmienia metabolizm komórkowy. Metoda ta może potencjalnie ujawnić, w jaki sposób stan chorobowy lub zastosowana toksyna wpływa na metabolizm komórkowy. A kiedy już to wiemy, nasza metoda ma zdolność ujawnienia, czy jakaś interwencja może skorygować wadę.

Główną zaletą tej techniki jest to, że nie opiera się ona na przekształconych liniach komórkowych, więc jest bardziej prawdopodobne, że dostarczy odpowiedzi, które są bezpośrednio związane ze zdrowiem człowieka. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować 10-milimolowy roztwór podstawowy rotenonu w dimetylosulfotlenku. Przeprowadzić seryjne rozcieńczanie 10-milimolowego roztworu podstawowego rotenonu w celu otrzymania roztworów o stężeniach rotenonu w zakresie od jednego nanomola do 100 mikromolów.

Następnie dodać 50 mikrolitrów każdego roztworu podstawowego do pięciu mililitrów wcześniej przygotowanego wzbogaconego roztworu buforowego Tyrode, aby przygotować roztwory o stężeniach rotenonu w zakresie od 10 pikomolarów do jednego mikromola. Dodać 50 mikrolitrów DMSO do jednej z próbek roztworu buforowego, aby służyła jako kontrola pojazdu. Aby wyizolować płytki krwi z krwi pełnej, odwiruj próbki krwi pełnej o masie 175 x g przez 15 minut bez przerw.

Po zakończeniu przenieś jeden mililitr górnej warstwy osocza bogatopłytkowego do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Podczas przenoszenia osocza bogatopłytkowego należy uważać, aby nie naruszyć kożucha włosowego, aby osad płytkowy nie został zanieczyszczony limfocytami. Odwirować warstwę osocza bogatopłytkowego o sile 400 x g przez pięć minut.

Następnie odessać supernatent. Używając nie mniej niż trzech powtórzeń biologicznych dla każdego stanu, ponownie zawiesić osad płytek krwi w jednym mililitrze każdego wcześniej przygotowanego roztworu rotenonu. Następnie inkubuj zawieszone płytki krwi w inkubatorze dwutlenku węgla z płaszczem wodnym ustawionym na 95% wilgotności i 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę.

W tym momencie otoczkować płytki krwi, odwirowując próbki o masie 3000 x g przez trzy minuty. Po zasysaniu supernatentu dodać odpowiedni stabilny wzorzec wewnętrzny znakowany izotopem. Następnie ponownie zawieś płytki krwi w 750 mikrolitrach lodowatego 10% kwasu trójchlorooctowego.

Wykonaj sonikę pulsacyjną każdej próbki 30 razy za pomocą impulsów 0,5 sekundy. Po odwirowaniu umieścić kolumny ekstrakcyjne C18 do fazy stałej w kolektorze próżniowym. Kondycjonować kolumny jednym mililitrem metanolu.

Następnie zrównoważyć kolumny jednym mililitrem podwójnie destylowanej wody. Uruchom supernatent pochodzący z próbki przez kolumny. Po zakończeniu umyj kolumny jednym mililitrem wody.

Następnie załaduj 10-mililitrowe szklane probówki wirówkowe do kolektora próżniowego, aby zebrać frakcje elucyjne. Eluować kolumny jednym mililitrem 25-milimolowego octanu amonu i metanolu. Po wysuszeniu eluatu w gazowym azocie, wysuszone pozostałości należy ponownie zawiesić w 50 mikrolitrach kwasu 5%5-sulfosalicyklicznego i przenieść próbki do plików HPLC w celu analizy.

Jak wcześniej donoszono w komórkach SH-SY5Y, przypuszcza się, że zmiany względnych poziomów tioestrów aceylu CoA w odpowiedzi na rotenon wynikają z hamowania kompleksu jedności. W szczególności występuje zależny od dawki spadek sukcynylo-CoA przy jednoczesnym wzroście beta-hydroksybutyrylu-CoA, podczas gdy poziomy acetylo-CoA pozostały niezmienione. Analiza ludzkich płytek krwi leczonych rotenonem ujawnia bardzo spójne wyniki i dostarcza unikalnego zestawu danych eksperymentalnych.

Należy zauważyć, że obserwacja ta podkreśla mitochondrialną zależność odpowiedzi na rotenon, ponieważ płytki krwi nie mają jąder. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak śledzenie metaboliczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: Jak ten zabieg lub stan chorobowy wpływa na wykorzystanie substratu? Jeśli zidentyfikujemy zmiany w poziomach jakiegoś metabolitu, dlaczego się on zmienia?

Których etapów ścieżki to dotyczy i w jaki sposób? Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować płytki krwi z krwi pełnej, wykonać kontrolowaną prowokację ex vivo i wyekstrahować tioestry aceylu CoA do analizy LCMS.