Analiza LC-MS ludzkich płytek krwi jako platforma do badania metabolizmu mitochondrialnego
4 kwietnia 2016
Tutaj pokazujemy, że izolowane ludzkie płytki krwi mogą być używane jako dostępny model ex vivo do badania adaptacji metabolicznych w odpowiedzi na inhibitor kompleksu I rotenon. Podejście to wykorzystuje śledzenie izotopowe i względną kwantyfikację za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas i może być stosowane w różnych projektach badawczych.
Ogólnym celem tej procedury jest określenie, w jaki sposób leczenie ksenobiotykami lub stan chorobowy zmienia metabolizm komórkowy. Metoda ta może potencjalnie ujawnić, w jaki sposób stan chorobowy lub zastosowana toksyna wpływa na metabolizm komórkowy. A kiedy już to wiemy, nasza metoda ma zdolność ujawnienia, czy jakaś interwencja może skorygować wadę.
Główną zaletą tej techniki jest to, że nie opiera się ona na przekształconych liniach komórkowych, więc jest bardziej prawdopodobne, że dostarczy odpowiedzi, które są bezpośrednio związane ze zdrowiem człowieka. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować 10-milimolowy roztwór podstawowy rotenonu w dimetylosulfotlenku. Przeprowadzić seryjne rozcieńczanie 10-milimolowego roztworu podstawowego rotenonu w celu otrzymania roztworów o stężeniach rotenonu w zakresie od jednego nanomola do 100 mikromolów.
Następnie dodać 50 mikrolitrów każdego roztworu podstawowego do pięciu mililitrów wcześniej przygotowanego wzbogaconego roztworu buforowego Tyrode, aby przygotować roztwory o stężeniach rotenonu w zakresie od 10 pikomolarów do jednego mikromola. Dodać 50 mikrolitrów DMSO do jednej z próbek roztworu buforowego, aby służyła jako kontrola pojazdu. Aby wyizolować płytki krwi z krwi pełnej, odwiruj próbki krwi pełnej o masie 175 x g przez 15 minut bez przerw.
Po zakończeniu przenieś jeden mililitr górnej warstwy osocza bogatopłytkowego do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Podczas przenoszenia osocza bogatopłytkowego należy uważać, aby nie naruszyć kożucha włosowego, aby osad płytkowy nie został zanieczyszczony limfocytami. Odwirować warstwę osocza bogatopłytkowego o sile 400 x g przez pięć minut.
Następnie odessać supernatent. Używając nie mniej niż trzech powtórzeń biologicznych dla każdego stanu, ponownie zawiesić osad płytek krwi w jednym mililitrze każdego wcześniej przygotowanego roztworu rotenonu. Następnie inkubuj zawieszone płytki krwi w inkubatorze dwutlenku węgla z płaszczem wodnym ustawionym na 95% wilgotności i 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę.
W tym momencie otoczkować płytki krwi, odwirowując próbki o masie 3000 x g przez trzy minuty. Po zasysaniu supernatentu dodać odpowiedni stabilny wzorzec wewnętrzny znakowany izotopem. Następnie ponownie zawieś płytki krwi w 750 mikrolitrach lodowatego 10% kwasu trójchlorooctowego.
Wykonaj sonikę pulsacyjną każdej próbki 30 razy za pomocą impulsów 0,5 sekundy. Po odwirowaniu umieścić kolumny ekstrakcyjne C18 do fazy stałej w kolektorze próżniowym. Kondycjonować kolumny jednym mililitrem metanolu.
Następnie zrównoważyć kolumny jednym mililitrem podwójnie destylowanej wody. Uruchom supernatent pochodzący z próbki przez kolumny. Po zakończeniu umyj kolumny jednym mililitrem wody.
Następnie załaduj 10-mililitrowe szklane probówki wirówkowe do kolektora próżniowego, aby zebrać frakcje elucyjne. Eluować kolumny jednym mililitrem 25-milimolowego octanu amonu i metanolu. Po wysuszeniu eluatu w gazowym azocie, wysuszone pozostałości należy ponownie zawiesić w 50 mikrolitrach kwasu 5%5-sulfosalicyklicznego i przenieść próbki do plików HPLC w celu analizy.
Jak wcześniej donoszono w komórkach SH-SY5Y, przypuszcza się, że zmiany względnych poziomów tioestrów aceylu CoA w odpowiedzi na rotenon wynikają z hamowania kompleksu jedności. W szczególności występuje zależny od dawki spadek sukcynylo-CoA przy jednoczesnym wzroście beta-hydroksybutyrylu-CoA, podczas gdy poziomy acetylo-CoA pozostały niezmienione. Analiza ludzkich płytek krwi leczonych rotenonem ujawnia bardzo spójne wyniki i dostarcza unikalnego zestawu danych eksperymentalnych.
Należy zauważyć, że obserwacja ta podkreśla mitochondrialną zależność odpowiedzi na rotenon, ponieważ płytki krwi nie mają jąder. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak śledzenie metaboliczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: Jak ten zabieg lub stan chorobowy wpływa na wykorzystanie substratu? Jeśli zidentyfikujemy zmiany w poziomach jakiegoś metabolitu, dlaczego się on zmienia?
Których etapów ścieżki to dotyczy i w jaki sposób? Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować płytki krwi z krwi pełnej, wykonać kontrolowaną prowokację ex vivo i wyekstrahować tioestry aceylu CoA do analizy LCMS.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie pokazuje wykorzystanie izolowanych ludzkich płytek jako modelu ex vivo do badania adaptacji metabolicznych w odpowiedzi na inhibitor zespołu I rotenon. Metoda wykorzystuje śledzenie izotopowe i chromatografię ciekłą z widmem mas dla ilościowej analizy względnej, co sprawia, że jest ona przydatna w różnych projektach badawczych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Metabolizm komórkowy
- Farmakologia
- Znaczenie dla zdrowia człowieka
Tło
- Zrozumienie, jak substancje obce wpływają na metabolizm komórkowy, jest kluczowe.
- Izolowanych ludzkich płytek dostarcza bardziej odpowiedniego modelu w porównaniu z przekształconymi liniami komórkowymi.
- To podejście może pomóc w identyfikacji potencjalnych interwencji w przypadku defektów metabolicznych.
- Rotenon stosuje się jako inhibitor zespołu I do badania zmian metabolicznych.
Cel badania
- Określić wpływ leczenia substancjami obcymi na metabolizm komórkowy.
- Zbadać, jak stany chorobowe zmieniają procesy metaboliczne.
- Ocenić potencjał interwencji w celu poprawy defektów metabolicznych.
Zastosowanie metod
- Przygotowanie 10 milimolarnego roztworu rotenonu w dimetylosulfonie.
- Szeregowe rozcieńczanie roztworu rotenonu w celu uzyskania różnych stężeń.
- Śledzenie izotopowe dla analizy metabolicznej.
- Chromatografia ciekła z widmem mas do ilościowej analizy.
Główne wyniki
- Izolowanych płytek skutecznie modeluje odpowiedzi metaboliczne na rotenon.
- Śledzenie izotopowe ujawnia znaczące adaptacje metaboliczne.
- Chromatografia ciekła z widmem mas zapewnia dokładne ilościowe określenie.
- Metoda jest przydatna w różnych projektach eksperymentalnych.
Wnioski
- Izolowanych ludzkich płytek są cennym modelem do badania metabolizmu.
- To podejście może prowadzić do wglądu w mechanizmy chorobowe i potencjalne terapie.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć tę metodę, aby zbadać inne szlaki metaboliczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Human platelets offer a clinically relevant, non-transformed model for studying mitochondrial metabolism and xenobiotic effects, addressing limitations of cancer cell lines in metabolic research. This platform enables reproducible, donor-specific analysis of metabolic pathway alterations, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. Scalability via blood bank sourcing facilitates translational continuity from basic discovery to preclinical and clinical studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by probing mitochondrial responses to complex I inhibitors like rotenone.
- Operational Value: Provides a human-relevant system that reduces confounding variables from metabolic reprogramming in transformed cell lines.
- Predictive Value: Supports biological de-risking through consistent detection of compensatory metabolic shifts, such as increased fatty acid oxidation upon glycolysis inhibition.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative LC-MS readouts of acyl-CoA thioesters, enabling relative quantification and isotopic labeling for pathway-specific activity assessment.
- Operational Value: Delivers reproducible metabolite profiles across biological replicates, supporting assay standardization for xenobiotic screening campaigns.
- Scalability: Platelet isolation from individual donors or blood banks allows scalable production of metabolically active samples for high-content screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects ex vivo platelet responses to in vivo metabolic adaptations, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed metabolic changes are mitochondria-dependent, as evidenced by responses in anucleate platelets.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables evaluation of intervention efficacy in reversing metabolic defects, informing go/no-go decisions in lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for mitochondrial-targeted compounds and metabolic modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of xenobiotic effects on cellular metabolism by isolating platelet responses to dose-dependent rotenone treatment.
- Screening: Enables assay-ready preparation of platelets for LC-MS analysis, yielding reproducible quantitative outputs for compound library screening.
- Analytics: Provides relative quantification of acetyl-CoA, succinyl-CoA, and beta-hydroxybutyryl-CoA thioesters, enabling comparison of metabolic flux across conditions.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by modeling metabolic adaptations relevant to disease states and therapeutic interventions.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platelet isolation and metabolite extraction workflow applicable across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by using a physiologically relevant human model that avoids cancer cell line artifacts.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized platelet isolation, ex vivo challenge, and metabolite extraction protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of metabolic liabilities, reducing late-stage attrition due to unforeseen mitochondrial toxicity.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on core metabolic pathways in a human-relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in platelet isolation, sterile cell handling, and LC-MS/MS metabolomics.
- Dependent on access to centrifugation equipment, vacuum manifolds for solid-phase extraction, and HPLC-MS systems.
- Necessitates standardization of platelet-rich plasma preparation and rotenone dosing across laboratories and donors.
- Involves adaptation considerations for different xenobiotics and isotopic labeling schemes.
- Limited by platelet viability ex vivo and the need for immediate processing post-isolation to maintain metabolic integrity.
