Analiza LC-MS ludzkich płytek krwi jako platforma do badania metabolizmu mitochondrialnego
4 kwietnia 2016
Tutaj pokazujemy, że izolowane ludzkie płytki krwi mogą być używane jako dostępny model ex vivo do badania adaptacji metabolicznych w odpowiedzi na inhibitor kompleksu I rotenon. Podejście to wykorzystuje śledzenie izotopowe i względną kwantyfikację za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas i może być stosowane w różnych projektach badawczych.
Ogólnym celem tej procedury jest określenie, w jaki sposób leczenie ksenobiotykami lub stan chorobowy zmienia metabolizm komórkowy. Metoda ta pozwala na odkrycie, jak stan chorobowy lub zastosowana toksyna wpływa na metabolizm komórek. Gdy zostanie to ustalone, nasza metoda umożliwia sprawdzenie, czy określona interwencja może skorygować ten defekt.
Główną zaletą tej techniki jest to, że nie opiera się ona na zmodyfikowanych liniach komórkowych, dzięki czemu istnieje większe prawdopodobieństwo uzyskania wyników bezpośrednio istotnych dla zdrowia ludzi. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować 10 mM roztwór zapasu rotenonu w dimetylosulfoksydzie. Wykonać rozcieńczenia seryjne 10 mM roztworu zapasu rotenonu, aby otrzymać roztwory o stężeniach rotenonu w zakresie od 1 nM do 100 µM.
Następnie dodaj 50 µL każdego roztworu zapasowego do pięciu mililitrów wcześniej przygotowanego wzbogaconego buforu Tyrode'a, aby przygotować roztwory z koncentracjami rotenonu w zakresie od 10 pM do 1 µM. Do jednej z próbek roztworu buforowego dodaj 50 µL DMSO, aby służyła jako kontrola nośnika. W celu wyizolowania płytek krwi z krwi pełnej, odwiruj próbki krwi pełnej przy 175 ×g przez 15 minut bez przerw.
Po zakończeniu przenieś 1 mL górnej warstwy osocza bogatego w płytki do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Podczas przenoszenia osocza bogatego w płytki należy uważać, aby nie naruszyć warstwy leukocytowej (buffy coat), aby osad z płytek nie został zanieczyszczony limfocytami. Odwiruj warstwę osocza bogatego w płytki przy 400 ×g przez 5 minut.
Następnie odessać supernatant. Wykorzystując nie mniej niż trzy powtórzenia biologiczne dla każdego wariantu, resuspender osad płytkowych w jednym mililitrze każdego z wcześniej przygotowanych roztworów rotenonu. Następnie inkubować resuspendowane płytki w inkubatorze z dwutlenkiem węgla z płaszczem wodnym, ustawionym na 95% wilgotności i 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.
Na tym etapie należy zpelletować płytki krwi, odwirowując próbki przy 3000 x g przez trzy minuty. Po odprowadzeniu supernatantu należy dodać odpowiedni wewnętrzny standard znakowany stabilnym izotopem. Następnie płytki krwi resuspendTime w 750 microliters lodowatego 10% kwasu trichlorooctowego.
Każdą próbkę poddaj sonikacji pulsacyjnej 30 razy, stosując impulsy o długości 0,5 sekundy. Po odwirowaniu zamocuj kolumny do ekstrakcji do fazy stałej C18 w manifoldzie próżniowym. Przygotuj kolumny, przepuszczając przez nie jeden mililitr metanolu.
Następnie przeprowadź równoważenie kolumn za pomocą 1 mL wody dwukrotnie destylowanej. Przepuść nadnadkład uzyskany z próbki przez kolumny. Po zakończeniu przemyj kolumny 1 mL wody.
Następnie umieść szklane probówki wirówkowe o objętości 10 ml w kolektorze próżniowym w celu zebrania frakcji elucji. Eluuj kolumny za pomocą jednego mililitra 25 mM octanu amonu i metanolu. Po wysuszeniu eluatu pod strumieniem azotu, resuspenduj wysuszone pozostałości w 50 µl 5% kwasu 5-sulfosalicylowego i przenieś próbki do fiolek HPLC do analizy.
Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami dotyczącymi komórek SH-SY5Y, przypuszcza się, że zmiany w względnych poziomach tioestrów acylo-CoA w odpowiedzi na rotenon wynikają z inhibicji kompleksu I. W szczególności odnotowano zależny od dawki spadek poziomu CoA bursztyniowego przy jednoczesnym wzroście poziomu beta-hydroksymaślanu-CoA, podczas gdy poziomy acetylo-CoA pozostały bez zmian. Analiza ludzkich płytek krwi leczonych rotenonem wykazuje wysoce spójne wyniki i dostarcza unikalnego zestawu danych eksperymentalnych.
Warto zauważyć, że obserwacja ta podkreśla mitochondrialną zależność odpowiedzi na rotenon, ponieważ płytki krwi nie posiadają jąder. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak śledzenie metaboliczne (metabolic tracing), aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład: W jaki sposób ta terapia lub stan chorobowy wpływa na wykorzystanie substratów? Jeśli zidentyfikujemy zmiany w poziomach niektórych metabolitów, to dlaczego one zachodzą?
Które etapy szlaku są zaburzone i w jaki sposób? Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak izolować płytki krwi z krwi pełnej, przeprowadzać kontrolowaną stymulację ex-vivo oraz ekstrahować tioestry acylo-CoA do analizy LCMS.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie demonstruje wykorzystanie wyizolowanych ludzkich płytek krwi jako modelu ex vivo do badania adaptacji metabolicznych w odpowiedzi na rotenon, inhibitor kompleksu I. Metoda ta wykorzystuje śledzenie izotopowe oraz chromatografię cieczową sprzężoną z spektrometrią mas do kwantyfikacji względnej, co czyni ją możliwą do zastosowania w różnych schematach badawczych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Metabolizm komórkowy
- Farmakologia
- Znaczenie dla zdrowia człowieka
Wstęp
- Zrozumienie wpływu ksenobiotyków na metabolizm komórkowy jest kluczowe.
- Izolowane ludzkie płytki krwi stanowią bardziej odpowiedni model w porównaniu do przekształconych linii komórkowych.
- Podejście to może pomóc w identyfikacji potencjalnych interwencji w przypadku defektów metabolicznych.
- Rotenon jest stosowany jako inhibitor kompleksu I w celu badania zmian metabolicznych.
Cel badania
- Określenie wpływu traktowania ksenobiotykami na metabolizm komórkowy.
- Zbadanie, w jaki sposób stany chorobowe zmieniają procesy metaboliczne.
- Ocena potencjału interwencji w korygowanie defektów metabolicznych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie 10 mM roztworu stokowego rotenonu w dimetylosulfoksydzie.
- Rozcieńczenia szeregowe roztworu stokowego rotenonu w celu uzyskania różnych stężeń.
- Znakowanie izotopowe do analizy metabolicznej.
- Chromatografia cieczowa sprzężona z spektrometrią mas w celu ilościowego oznaczenia.
Główne wyniki
- Izolowane płytki krwi skutecznie modelują odpowiedzi metaboliczne na rotenon.
- Śledzenie izotopowe ujawnia istotne adaptacje metaboliczne.
- Chromatografia cieczowa sprzężona z spektrometrią mas zapewnia dokładną kwantyfikację.
- Metoda jest stosowalna w różnych schematach eksperymentalnych.
Wnioski
- Izolowane ludzkie płytki krwi stanowią wartościowy model do badania metabolizmu.
- Podejście to może prowadzić do lepszego zrozumienia mechanizmów chorobowych oraz potencjalnych terapii.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć tę metodę w celu zbadania innych szlaków metabolicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ludzkie płytki krwi stanowią klinicznie istotny, nietransformowany model do badania metabolizmu mitochondrialnego oraz efektów ksenobiotyków, eliminując ograniczenia wynikające z wykorzystania linii komórek nowotworowych w badaniach metabolicznych. Platforma ta umożliwia powtarzalną, specyficzną dla dawcy analizę zmian w szlakach metabolicznych, co wspiera walidację celów terapeutycznych oraz redukcję ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Skalowalność dzięki pozyskiwaniu materiału z banków krwi ułatwia ciągłość translacyjną od podstawowych odkryć po badania przedkliniczne i kliniczne.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez badanie odpowiedzi mitochondriów na inhibitory kompleksu I, takie jak rotenon.
- Wartość operacyjna: Zapewnia system istotny dla człowieka, który redukuje zmienne zakłócające wynikające z reprogramowania metabolicznego w przekształconych liniach komórkowych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera biologiczną redukcję ryzyka dzięki spójnemu wykrywaniu kompensacyjnych przesunięć metabolicznych, takich jak zwiększone utlenianie kwasów tłuszczowych po zahamowaniu glikolizy.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe odczyty LC-MS tioestrów acylo-CoA, umożliwiając kwantyfikację względną i znakowanie izotopowe w celu oceny aktywności specyficznej dla danej ścieżki metabolicznej.
- Wartość operacyjna: Dostarcza powtarzalne profile metabolitów w powtórzeniach biologicznych, co wspiera standaryzację testów w kampaniach przesiewowych ksenobiotyków.
- Skalowalność: Izolacja płytek krwi od poszczególnych dawców lub z banków krwi umożliwia skalowalną produkcję metabolicznie aktywnych próbek do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy odpowiedzi płytek krwi ex vivo z adaptacjami metabolicznymi in vivo, wspierając przedkliniczną walidację zgodną z biomarkerami.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Pozwala wyjaśnić, czy obserwowane zmiany metaboliczne są zależne od mitochondriów, co potwierdzają odpowiedzi w bezjądrowych płytkach krwi.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia ocenę skuteczności interwencji w cofaniu defektów metabolicznych, co dostarcza informacji dla decyzji go/no-go w procesie optymalizacji wiodących związków.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną, w szczególności w przypadku związków ukierunkowanych na mitochondria oraz modulatorów metabolicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących wpływu ksenobiotyków na metabolizm komórkowy poprzez izolację odpowiedzi płytek krwi na zależne od dawki traktowanie rotenonem.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie płytek krwi do analizy LC-MS w formie gotowej do testów, zapewniając powtarzalne wyniki ilościowe dla przesiewania bibliotek związków.
- Analityka: Zapewnia względną kwantyfikację tioestrów acetylu-CoA, succinylu-CoA i beta-hydroksymaślanilu-CoA, umożliwiając porównanie strumienia metabolicznego w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez modelowanie adaptacji metabolicznych istotnych dla stanów chorobowych i interwencji terapeutycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia standaryzowany protokół izolacji płytek krwi i ekstrakcji metabolitów, który można zastosować w wielu projektach i obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez zastosowanie fizjologicznie istotnego modelu ludzkiego, który pozwala uniknąć artefaktów charakterystycznych dla linii komórkowych nowotworów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanym protokołom izolacji płytek krwi, stymulacji ex vivo oraz ekstrakcji metabolitów.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnego wykrywania wad metabolicznych, co redukuje odsetek niepowodzeń na późnych etapach badań wynikających z nieprzewidzianej toksyczności mitochondrialnej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację związków skorygowaną o ryzyko, w oparciu o ich wpływ na kluczowe szlaki metaboliczne w systemie istotnym dla organizmu ludzkiego.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w izolacji płytek krwi, sterylnej pracy z komórkami oraz w metabolomice LC-MS/MS.
- Zależne od dostępu do wirówek, manifoldów próżniowych do ekstrakcji do fazy stałej oraz systemów HPLC-MS.
- Wymaga standaryzacji przygotowania osocza bogatopłytkowego oraz dawkowania rotenonu w różnych laboratoriach i u różnych dawców.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania procedur do różnych ksenobiotyków i schematów znakowania izotopowego.
- Ograniczone przez żywotność płytek krwi ex vivo oraz konieczność natychmiastowego przetworzenia materiału po izolacji w celu zachowania integralności metabolicznej.
