Name: Generowanie roślin transgenicznych z insercją pojedynczej kopii przy użyciu wektora binarnego BIBAC-GW (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Poznaj metodę generowania roślin transgenicznych z pojedynczą kopią T-DNA przy użyciu wektora BIBAC-GW. Technologia Gateway umożliwia stabilną ekspresję genu w Arabidopsis, kukurydzy, ryżu i pomidorze.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania są wspierane przez Holenderską Fundację Technologiczną STW (12385), która jest częścią Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO), a która jest częściowo finansowana przez Ministerstwo Spraw Gospodarczych (OTP Grant 12385 dla MS). Dziękujemy Carol M. Hamilton (Cornell University, Stany Zjednoczone) za dostarczenie pCH20, szkieletu wektorów BIBAC-GW.

<ol><li>Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chalcone+synthase+cosuppression+phenotypes+in+petunia+flowers%3A+comparison+of+sense+vs.+antisense+constructs+and+single-copy+vs.+complex+T-DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences.</a> Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).</li>
<li>Stam, M., et al. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1046/j.1365-313X.1997.12010063.x">Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats.</a> Plant J. 12, 63-82 (1997).</li>
<li>Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position-dependent+methylation+and+transcriptional+silencing+of+transgenes+in+inverted+T-DNA+repeats%3A+implications+for+posttranscriptional+silencing+of+homologous+host+genes+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants.</a> Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).</li>
<li>Jin, Y., Guo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgene-induced+gene+silencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgene-induced gene silencing in plants.</a> Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).</li>
<li>Oltmanns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.plantphysiol.org/content/152/3/1158">Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA].</a> Plant Physiol. , (2010).</li>
<li>Ye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+production+of+single+copy+backbone-free+transgenic+plants+in+multiple+crop+species+using+binary+vectors+with+a+pRi+replication+origin+in+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens.</a> Transgenic Res. , (2011).</li>
<li>Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+binary-BAC+system+for+plant+transformation+with+high-molecular-weight+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA.</a> Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).</li>
<li>Frary, A., Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+and+stability+of+high+molecular+weight+DNA+transformation%3A+an+analysis+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato.</a> Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).</li>
<li>Vega, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+maize+%28Zea+mays%29+with+Cre-lox+site+specific+recombination+cassettes+in+BIBAC+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors.</a> Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).</li>
<li>Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BIBAC-GW-based+vectors+for+generating+reporter+lines+for+site-specific+genome+editing+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta.</a> Plasmid. 89, 27-36 (2017).</li>
<li>Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfer+of+intact+high+molecular+weight+DNA+into+plant+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).</li>
<li>Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+tandem+repeats+are+sufficient+for+paramutation-induced+trans-generational+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing.</a> PLoS Genet. 9 (10), e1003773(2013).</li>
<li>Shizuya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+stable+maintenance+of+300-kilobase-pair+fragments+of+human+DNA+in+Escherichia+coli+using+an+F-factor-based+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).</li>
<li>Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pair+of+new+BAC+and+BIBAC+vectors+that+facilitate+BAC%2FBIBAC+library+construction+and+intact+large+genomic+DNA+insert+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange.</a> Plant Methods. 7, 33(2011).</li>
<li>Woodman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+PCR+of+Intact+Bacteria+%28Colony+PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR).</a> Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).</li>
<li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mol+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mol Biol.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).</li>
<li>Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+method+for+the+preparation+of+plant+genomic+DNA+for+PCR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis.</a> Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349(1991).</li>
<li>Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cetyltrimethyl+ammonium+bromide+%28CTAB%29+DNA+miniprep+for+plant+DNA+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation.</a> Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923 (2012).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="https://www.cshlpress.com/default.tpl?cart=1522085010728111106&fromlink=T&linkaction=full&linksortby=oop_title&--eqSKUdatarq=934">Molecular Cloning</a>. , CSH Press. (2012).</li>
<li>Sosa, J. M. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac50056a031?journalCode=ancham">Chromatography with Sephadex Gels.</a> Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).</li>
<li>Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nopaline+synthase%3A+transcript+mapping+and+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Appl+Genet%22%5BJournal%5D)">Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence.</a> J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).</li>
<li>Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+BAC+and+BIBAC+libraries+from+sunflower+and+identification+of+linkage+group-specific+clones+by+overgo+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Theor+Appl+Genet%22%5BJournal%5D)">Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization.</a> Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).</li>
<li>Lee, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+plant-transformation-competent+BIBAC+library+and+genome+sequence+analysis+of+polyploid+Upland+cotton+%28Gossypium+hirsutum+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L).</a> BMC Genomics. 14, 208(2013).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+insert+Thellungiella+halophila+BIBAC+library+for+genomics+and+identification+of+stress+tolerance+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes.</a> Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+BAC-+and+BIBAC-based+physical+map+of+the+soybean+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome.</a> Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+physical+mapping+from+large-insert+clones+by+fingerprint+analysis+with+capillary+electrophoresis%3A+a+robust+physical+map+of+Penicillium+chrysogenum%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum.</a> Nucleic Acids Res. 33 (5), e50(2005).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+physical+mapping+of+polyploids%3A+a+BIBAC+physical+map+of+cultivated+tetraploid+cotton%2C+Gossypium+hirsutum+L%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L.</a> PLoS One. 7 (3), e33644(2012).</li>
<li>Frary, A., Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+and+stability+of+high+molecular+weight+DNA+transformation%3A+An+analysis+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato.</a> Transgenic Res. , (2001).</li>
<li>Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position-Dependent+Methylation+and+Transcriptional+Silencing+of+Transgenes+in+Inverted+T-DNA+Repeats%3A+Implications+for+Posttranscriptional+Silencing+of+Homologous+Host+Genes+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants.</a> Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).</li>
<li>Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+new+and+established+methods+to+determine+T-DNA+copy+number+and+homozygosity+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Environ%22%5BJournal%5D)">An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants.</a> Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).</li>
<li>Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+PCR+and+Quantitative+PCR+as+Alternative+Methods+to+Southern+Blotting+Analysis+to+Assess+Transgene+Copy+Number+and+Characterize+the+Integration+Site+in+Transgenic+Woody+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Genet%22%5BJournal%5D)">Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants.</a> Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych lub innych konfliktów interesów.

Kluczowe znaczenie dla generowania transgeników z pojedynczymi, nienaruszonymi integracjami transgenu ma wybór użytego wektora binarnego. Wektory z rodziny BIBAC zostały wykorzystane do dostarczenia sekwencji interesujących dla wielu gatunków roślin 23,24,25,26,27,28. Wektory BIBAC, w tym BIBAC-GW, dają całkowanie z jedną kop...

Podczas generowania roślin transgenicznych, zazwyczaj celem jest stabilna ekspresja zintegrowanego transgenu (transgenów). Można to osiągnąć poprzez nienaruszone integracje pojedynczej kopii transgenu. Wielokrotne integracje mogą prowadzić do zwiększonej ekspresji transgenu, ale także do wyciszenia genów. Wyciszenie transgenów jest bardziej prawdopodobne, jeśli wstawione sekwencje są ułożone w tandem lub odwrócone powtórzenia1,2,3,4. Wektory binarne są używane jako czółenka w eksperymentach transformacyjnych za pośrednictwem Agrobacterium w celu dostarczenia interesujących sekwencji do genomów roślin. Liczba integracji z genomem roślinnym zależy od liczby kopii wektora binarnego w Agrobacterium tumefaciens5,6. Wiele powszechnie używanych wektorów binarnych to wektory o wysokiej kopii, a zatem dają wysoką średnią liczbę kopii transgenu: od 3,3 do 4,9 kopii w Arabidopsis5.
Liczba integracji T-DNA może być zmniejszona za pomocą wektorów binarnych o niskiej liczbie kopii w A. tumefaciens, takich jak BIBAC7, lub poprzez uruchomienie T-DNA z chromosomu A. tumefaciens 5. Średnia liczba integracji transgenów w takich przypadkach jest mniejsza niż 25,8,9,10. Ze względu na to, że są jednokopijne u A. tumefaciens, a także u Escherichia coli, pochodne BIBAC mogą utrzymywać i dostarczać konstrukty o wielkości do 150 kb11.
Wektory BIBAC kompatybilne z GW10,12 umożliwiają łatwe wprowadzanie interesujących genów do wektora za pomocą klonowania Gateway. Zastosowanie technologii Gateway znacznie upraszcza procedurę klonowania, ale także pozwala przezwyciężyć typowe problemy związane z dużymi wektorami o niskiej liczbie kopii13,14, takie jak niska wydajność DNA i ograniczony wybór unikalnych miejsc restrykcyjnych dostępnych do klonowania7,11. Pochodne pBIBAC-GW są dostępne z odpornością na glufosynat amonowy (pBIBAC-BAR-GW) lub fluorescencję DsRed w okrywie nasiennej (pBIBAC-RFP-GW) do selekcji w roślinach (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)10,12. W przypadku obu wektorów gen oporności na kanamycynę jest używany jako marker selekcyjny u bakterii.
Wektory pBIBAC-GW łączą: (1) łatwe projektowanie i manipulację genetyczną u E. coli, oraz (2) nienaruszone integracje pojedynczych kopii w planta z wysoką wydajnością. Wektory pBIBAC-GW dają średnio 1,7 integracji u Arabidopsis, przy czym około połowa roślin transgenicznych ma pojedynczą zintegrowaną klasę T-DNA<sup="xref">10.
Stabilna ekspresja transgenów jest wymogiem dla większości generowanych transgenów. Stabilną ekspresję transgenu można osiągnąć poprzez nienaruszone integracje z jedną kopią. Praca z roślinami transgenicznymi przenoszącymi nienaruszone, jednokopijne integracje jest jednak jeszcze ważniejsza, jeśli na przykład celem jest zbadanie efektywności procesów opartych na chromatynie, takich jak mutageneza, rekombinacja lub naprawa, oraz zależności tych procesów od lokalizacji genomu i struktury chromatyny w miejscu insercji. Dla naszych zainteresowań, w celu zbadania zależności mutagenezy skierowanej oligonukleotydami (ODM) od lokalnego kontekstu genomowego, wygenerowano zestaw linii reporterowych z nienaruszonymi, jednokopijnymi integracjami genu reporterowego mutagenezy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2)10. Korzystając z tego zestawu linii, wykazano, że wydajność ODM różni się między transgenicznymi loci zintegrowanymi w różnych lokalizacjach genomu, mimo że poziomy ekspresji transgenu są raczej podobne.

<table><tbody><tr><td>Siarczan kanamycyny jednowodny</td><td>Duchefa</td><td>K0126</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny</td><td>Duchefa</td><td>G0124</td><td></td></tr><tr><td>Ryfampicyna</td><td>Duchefa</td><td>R0146</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tetracykliny</td><td>Sigma</td><td>T-3383</td><td></td></tr><tr><td>DB3.1 kompetentne komórki</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>11782-018</td><td>Zamiast tego można użyć One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) firmy Invitrogen lub innego szczepu odpornego na ccdB E. coli&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Kompetentne komórki DH10B</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>18290-015</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR clonase enzyme mix&nbsp;</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>11791-019</td><td></td></tr><tr><td>cytrynian trisodu dwuwodny</td><td>Merck</td><td>106432</td><td></td></tr><tr><td>Baza Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>EDTA dwuwodny disodowy</td><td>Duchefa</td><td>E0511</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Bacto trypton</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Honeywell Fluka</td><td>13423</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glukoza monohydrat</td><td>Merck</td><td>108346</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety do elektroporacji, odstęp 0,1 cm</td><td>Biorad</td><td></td><td></td>1652089</tr><tr><td>Electroporator Gene Pulser</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Calbiochem</td><td>442613</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Maltoza monohydrat 90%</td><td>Acros Organics</td><td>32991</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0138454</td><td></td></tr><tr><td>Murashige Skoog medium</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Glufosynat amonowy (Basta)</td><td>Bayer</td><td>79391781</td><td></td></tr><tr><td>Enzymy restrykcyjne</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Bio-Rad</td><td>1610433</td><td></td></tr><tr><td>System elektroforezy</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Merck</td><td>106498</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Merck</td><td>100316</td><td></td></tr><tr><td>Blotting nylonowa membrana Hybond N+</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15358</td><td>lub GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)</td></tr><tr><td>Bibuła Whatman 3MM Chr</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3030-931</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>Acetylowana BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2518</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Merck</td><td>805740</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50 Coarse</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17004401</td><td>lub Sephadex G-50 Medium (17004301)</td></tr><tr><td>Sól sodowa siarczanu dekstranu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan&nbsp;</td><td>US Biological</td><td>S5010</td><td></td></tr><tr><td>DNA plemników łososia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7656</td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat diwodorofosforanu sodu</td><td>Merck</td><td>106346</td><td></td></tr><tr><td>Przechowywanie Ekran i kaseta fosforowa</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9564-74</td><td></td></tr><tr><td>Imager luminoforowy</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Typhoon FLA 7000</td><td></td></tr><tr><td>UV Crossender</td> Folia spożywcza <td>Stratagene</td><td>Stratalinker 1800</td><td></td></tr><tr><td>(okład Saran)</td><td>Omnilabo</td><td>1090681</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Merck</td><td>100165</td><td></td></tr><tr><td>marker DNA ' Blauw"; Drabina DNA.</td><td>MRC Holland</td><td>MCT8070</td><td></td></tr><tr><td>marker DNA " Rood"; Drabinka DNA</td><td>MRC Holland MCT8080</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka heksanukleotydów</td><td>Roche</td><td>11277081001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do dużych konstrukcji</td><td>Qiagen</td><td>12462</td><td></td></tr><tr><td>Zgrzewalne rurki polietylenowe, przezroczyste</td><td>różnych dostawców</td><td></td><td>Szerokość rurki powinna być szersza niż szerokość membrany bibuły</td></tr><tr><td>Zgrzewarka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr membranowy dysk</td><td>Merck</td><td>VSWP02500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Merck</td><td>105833</td><td></td></tr><tr><td>Siatka hybrydyzacyjna</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>RPN2519</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie roślin transgenicznych z insercją pojedynczej kopii przy użyciu wektora binarnego bibac-gw

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

Podczas generowania roślin transgenicznych, zazwyczaj celem jest uzyskanie stabilnej ekspresji transgenu. Wymaga to pojedynczej, nienaruszonej integracji transgenu, ponieważ integracje wielokopijne są często poddawane wyciszaniu genów. Wektor binarny kompatybilny z Gateway oparty na sztucznych chromosomach bakteryjnych (pBIBAC-GW), podobnie jak inne pochodne pBIBAC, umożliwia insercję transgenów z pojedynczą kopią z wysoką wydajnością. Jako ulepszenie oryginalnego pBIBAC, kaseta Gateway została sklonowana do pBIBAC-GW, dzięki czemu interesujące sekwencje mogą być teraz łatwo włączone do transferu wektorów DNA (T-DNA) przez klonowanie Gateway. Zazwyczaj transformacja za pomocą pBIBAC-GW skutkuje wydajnością 0,2–0,5%, przy czym połowa transgeników ma nienaruszoną integrację T-DNA z jedną kopią. Wektory pBIBAC-GW są dostępne z odpornością na fluorescencję glufosynatu amonowego lub DsRed w okrywie nasiennej do selekcji roślin oraz z odpornością na kanamycynę jako selekcję u bakterii. W tym miejscu przedstawiono szereg protokołów, które prowadzą czytelnika przez proces generowania roślin transgenicznych przy użyciu pBIBAC-GW: począwszy od rekombinacji interesujących sekwencji do wybranego wektora pBIBAC-GW, po transformację roślin za pomocą Agrobacterium, wybór transgeników i testowanie roślin pod kątem nienaruszalności i liczby kopii insertów za pomocą blottingu DNA. Zwrócono uwagę na zaprojektowanie strategii blottingu DNA w celu rozpoznania integracji jedno- i wielokopijnych w jednym i wielu loci.

Z wykorzystaniem systemu BIBAC-GW wygenerowano konstrukty reporterowe do badania ODM w roślinach10. Konstrukty zaprojektowano w wektorze Gateway Entry pENTR-gm12, a następnie wprowadzono do pBIBAC-BAR-GW (Rysunek 1) za pomocą reakcji rekombinacji Gateway LR.
Rośliny Arabidopsis zostały przekształcone plazmidem pDM19, plazmidem typu BIBAC-BAR-GW z repor...

Korzystanie z wektora binarnego pBIBAC-GW sprawia, że generowanie roślin transgenicznych z nienaruszonymi pojedynczymi kopiami jest łatwym procesem. W tym miejscu przedstawiono szereg protokołów, które prowadzą czytelnika przez proces generowania transgenicznych roślin Arabidopsis oraz testowania roślin pod kątem nienaruszalności i liczby kopii wkładek.

Generowanie roślin transgenicznych z insercją pojedynczej kopii przy użyciu wektora binarnego BIBAC-GW

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

Ogólnym celem tej metodologii jest wygenerowanie roślin transgenicznych przenoszących nienaruszone, pojedyncze kopie, insercje transferowego DNA lub T-DNA, w efektywny sposób. Wektor BIBAC-Gateway jest cennym narzędziem do generowania roślin transgenicznych, które zawierają nienaruszone, pojedyncze insercje interesujących sekwencji, które wykazują stabilną ekspresję genów. Dzięki wektorowi BIBAC-Gateway można użyć technologii rekombinacji Gateway do wstawiania interesujących sekwencji przy minimalnym wysiłku.Wszystkie pochodne BIBAC, w tym wektory BIBAC-Gateway, nadają się do przenoszenia dużych, transgenicznych fragmentów DNA do genomów roślinnych. Wektory BIBAC-GW mogą być używane do wstawiania interesujących sekwencji do wielu systemów roślinnych, takich jak kukurydza, ryż i pomidor. Dostępne są dwa plazmidy BIBAC-GW.Plazmid BIBAC-RFP-GW zawiera gen DsRed, który ulega ekspresji w okrywach nasiennych. Plazmid BIBAC-BAR-GW zawiera gen zapewniający oporność na glufosynat. Oba wektory zawierają gen oporności na kanamycynę jako marker selekcyjny u bakterii.Aby wstawić interesujące sekwencje do wektora binarnego, najpierw przygotuj Gateway Entry i wektory binarne, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przeprowadzić reakcję Gateway, należy przygotować reakcję rekombinacji LR zgodnie z sugestiami dostawcy w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej w temperaturze pokojowej. Wymieszaj od 100 do 300 nanogramów superskręconego klonu Entry i 300 nanogramów wektora BIBAC-Gateway.Dostosuj objętość mieszaniny do 16 mikrolitrów za pomocą TE. Na koniec dodaj cztery mikrolitry mieszanki enzymów LR Clonase i wymieszaj przez wirowanie. Inkubować mieszaninę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez godzinę. Zakończyć reakcję LR, dodając do mieszaniny dwa mikrolitry roztworu proteinazy K.Wymieszać i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut przed przystąpieniem do przemiany w E. coli, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przygotować rośliny Arabidopsis do transformacji, uprawiaj rzodkiewnik w szklarni lub komorze wzrostu z kontrolowanym klimatem, aż zakwitną. Przypnij pierwsze, aby umożliwić pojawienie się większej liczby dodatkowych.Rośliny są gotowe do zanurzania od czterech do sześciu dni po strzyżeniu, kiedy rośliny mają wiele niedojrzałych główek kwiatowych i niewiele nawożonych krzemionek. Aby zanurzyć kwiaty, zanurz kwiatostany na pięć do 10 sekund w zawiesinie Agrobacterium. Używaj delikatnego mieszania.Owiń nadziemne części roślin folią spożywczą, aby utrzymać wysoką wilgotność, i przykryj doniczki pudełkiem, aby rośliny były w ciemności. Inkubuj rośliny przez dwa dni w szklarni lub komorze wzrostu. Po dwóch dniach wyjmij pudełko i folię spożywczą i wyhoduj rośliny do dojrzałości w szklarni lub komorze wzrostu.Aby zwiększyć efektywność transformacji, te same rośliny można ponownie zanurzyć siedem dni po pierwszym zanurzeniu. Następnie, gdy przekształcone rośliny osiągną dojrzałość i wyschną, zbierz nasiona. Zbierz i przeanalizuj nasiona roślin przekształconych za pomocą tego samego konstruktu jako pojedynczy zestaw.W przypadku, gdy rośliny są przekształcane za pomocą pochodnej plazmidu BIBAC-RFP-Gateway, zidentyfikuj rośliny transgeniczne, analizując nasiona za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Aby wykryć ekspresję DsRed w okrywach nasiennych, zobrazuj nasiona przy wzbudzeniu 560 nanometrów i emisji od 600 do 650 nanometrów. Oddziel nasiona fluorescencyjne od niefluorescencyjnych odpowiedników za pomocą kleszczy.Aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem roślin transgenicznych przekształconych pochodną plazmidu BIBAC-BAR-Gateway, wysiewaj nasiona na tacach wypełnionych ziemią. Zapewnij równomierne rozprowadzenie nasion na tacach, zawieszając nasiona w 0,1% agarze w 0,5x MS podłożu i rozprowadź nasiona za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra. Stymuluj nasiona do kiełkowania w sposób synchroniczny, inkubując nasiona przez co najmniej dwa dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Można to zrobić przed lub po wysianiu nasion. Dwa i trzy tygodnie po wysianiu nasion spryskaj sadzonki 0,5% roztworem glufosynatu amonowego. Użyj 500 mililitrów roztworu glufosynatu amonowego na jeden metr kwadratowy.Przenieś ocalałe sadzonki do doniczek. Przeanalizować rośliny odporne na glufosynat amonu za pomocą PCR pod kątem obecności interesującego konstruktu. Określ liczbę integracji T-DNA i ich integralność przez blotting DNA przy użyciu enzymów restrykcyjnych.Metoda ta pozwala na identyfikację pojedynczych, jak i powtarzających się integracji w tych samych lub różnych loci w genomie. Użyj serii trawień restrykcyjnych, aby zidentyfikować różne możliwe wzorce integracji. Wybierz enzym, który przecina raz środek T-DNA, aby móc niezależnie badać sekwencje przed i za miejscem restrykcji.Wybierz również enzym lub kombinację enzymów, wycinając jednocześnie całą sekwencję będącą przedmiotem zainteresowania. Należy uważać, aby używać tylko enzymów restrykcyjnych, które nie są wrażliwe na metylację cytozyny. Po wykonaniu blottingu DNA, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, wykonaj analizę blot.Analiza zależy od zastosowanej strategii restrykcji. Analizując plamę przy użyciu strategii z jednym miejscem restrykcyjnym w środku T-DNA, policz liczbę wykrytych fragmentów. W tej strategii liczba zhybrydyzowanych fragmentów sugeruje liczbę integracji T-DNA.Porównaj liczbę fragmentów wykrytych za pomocą sondy po lewej i prawej stronie T-DNA. Jeśli za pomocą dwóch sond zostanie wykryta inna liczba fragmentów hybrydyzujących, oznacza to, że występuje albo wiele integracji T-DNA w odwróconym powtórzeniu, albo nie w pełni zintegrowane T-DNA. Aby zidentyfikować tandemowe i odwrócone układy T-DNA, oszacuj rozmiary hybrydyzujących fragmentów na blot na podstawie wielkości pasm markerowych i porównaj szacowane rozmiary z oczekiwanymi rozmiarami fragmentów obliczonymi na podstawie strategii restrykcji.Aby zbadać, czy sekwencja transgeniczna będąca przedmiotem zainteresowania jest nienaruszona, przeanalizuj blot przygotowany zgodnie ze strategią z miejscami restrykcyjnymi na końcach sekwencji będącej przedmiotem zainteresowania. Oszacuj rozmiar fragmentów hybrydyzujących na plamie na podstawie wielkości pasm znaczników i porównaj go z oczekiwanym rozmiarem. Nienaruszona insercja daje pojedynczy fragment o określonej długości.Każde odchylenie od oczekiwanej długości wskazuje na niepełną integrację. Pokazano strategię ograniczania i blottingu DNA w celu określenia liczby i nienaruszoności integracji T-DNA. Miejsce ograniczenia ScaI dzieli sekwencję reporterową na proksymalne części lewej granicy, które są wykrywane podczas korzystania z sondy dla pręta, i prawe części proksymalne granicy, które są wykrywane podczas używania sondy dla eYFP.Miejsca restrykcyjne BglII i PciI znajdują się w T-DNA, poza konstruktem reporterowym. W wyniku podwójnego trawienia powstaje fragment o określonej wielkości, a każde odchylenie jest wskazówką do niepełnego wprowadzenia. Liczba zidentyfikowanych fragmentów hybrydyzujących odzwierciedla liczbę insercji T-DNA.Jedna plama zawierająca genomowe DNA dziewięciu transgeników trawionych za pomocą ScaI została zhybrydyzowana z sondami dla bar i eYFP. Kilka pasów wskazuje na transgeniki z pojedynczymi integracjami T-DNA. Tor czwarty wyświetla dwa fragmenty z paskiem i jeden z eYFP, co wskazuje albo na obcięcie sekwencji eYFP, albo na odwrócone powtórzenie wokół prawej krawędzi.Szósty pas wyświetla dwa fragmenty z paskiem i eYFP. Jeden fragment ma słabą intensywność z sondą prętową. Drugi fragment ma dużą intensywność, co wskazuje na dwie inserpcje T-DNA, z których jedna jest skrócona.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak włączyć interesującą Cię sekwencję DNA do wektora binarnego BIBAC-GW za pomocą rekombinacji Gateway, a następnie transformacji Arabidopsis, badań przesiewowych i oceny liczby integracji T-DNA i ich integralności. Generowanie i charakteryzowanie roślin transgenicznych jest czasochłonne. Używając BIBAC-Gateway jako wektora binarnego, proces identyfikacji transgeników z nienaruszonymi integracjami z pojedynczą kopią może zostać skrócony.Około połowa transgeników generowanych za pomocą pochodnych BIBAC zawiera nienaruszone, pojedyncze integracje. Ogólnie rzecz biorąc, ludzie nie zdają sobie sprawy, że wiele roślin transgenicznych generowanych przy użyciu powszechnych wektorów binarnych zawiera skrócone kopie transgenu lub transgenów, które wykazują wyciszenie genów. W przypadku pochodnych BIBAC, większość wygenerowanych roślin transgenicznych ma nienaruszone, pojedyncze integracje transgenu, które rzadko wykazują wyciszenie genów.W przypadku stosowania BIBAC-GW do generowania transgeników ważne jest, aby przekształcić wystarczającą liczbę materiałów roślinnych, ponieważ ogólna wydajność transformacji pochodnych BIBAC jest niższa niż w przypadku powszechnie stosowanych wektorów binarnych. Wydajność transformacji BIBAC-GW wynosi na ogół od 0,2% do 0,5%Po zidentyfikowaniu roślin transgenicznych przenoszących nienaruszone, jednokopijne integracje T-DNA, w razie potrzeby można przeprowadzić dalszą analizę w celu określenia dokładnej lokalizacji genomowej insercji T-DNA. Transgeniki z nienaruszonymi integracjami z pojedynczą kopią wykazują porównywalne poziomy ekspresji transgenów.Wskazuje to, że pozycja integracji T-DNA w genomie ma niewielki wpływ na poziom ekspresji transgenu.

generating-transgenic-plants-with-single-copy-insertions-using-bibac

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W tym filmie demonstrujemy generację transgenicznych roślin Arabidopsis wykazujących ekspresję stabilnego transgenu poprzez transformację binarnego sztucznego genu bakteryjnego opartego na chromosomach za pośrednictwem Agrobacterium.

Binarna transformacja genów oparta na sztucznym wektorze chromosomowym u roślin Arabidopsis: technika generowania roślin transgenicznych z insercją pojedynczej kopii

Agroinfiltracja i agroinfekcja PVX to rutynowe testy funkcjonalne dla przejściowej ektopowej ekspresji genów w roślinach. Metody te są skutecznymi testami w strategiach efektoromicznych (szybkie odkrywanie genów oporności i wirulencji) i mają kluczowe znaczenie dla nowoczesnych badań w zakresie molekularnej patologii roślin. Spełniają one zapotrzebowanie na solidną, wysokowydajną analizę funkcjonalną w zakładach.

Agroinfiltracja i agroinfekcja PVX u ziemniaka i Nicotiana benthamiana

Ta praca opisuje nowatorską metodę selektywnego celowania w organelle subkomórkowe u roślin, testowaną za pomocą BioRad Gene Gun.

Przejściowa ekspresja genów w tytoniu przy użyciu zespołu Gibsona i pistoletu genowego

Metodologie celowania w geny mogą być używane do generowania transgenicznych myszy z allelami knockout, knock-in i taged.  W tym miejscu opisujemy ulepszoną metodę rekombinacji u E. coli, którą nazywamy "subklonowaniem plus insercją", która może być wykorzystana do szybkiego generowania niestandardowych wektorów docelowych genów.

Subklonowanie plus insercja (SPI) - nowatorska metoda rekombinacji do szybkiej budowy wektorów celowania w geny

Tutaj prezentujemy protokół przekształcania lnu za pomocą transformacji roślin za pośrednictwem Agrobacterium za pomocą dipu kwiatowego. Protokół ten jest prosty do wykonania i niedrogi, a mimo to zapewnia wyższy współczynnik transformacji niż obecnie dostępne metody transformacji lnu.

Przemiana lnu w zanurzeniu kwiatowym (Linum usitatissimum) w celu wytworzenia transgenicznych potomków o wysokim współczynniku transformacji

Korzystając z montażu DNA, wiele wektorów CRISPR może być konstruowanych równolegle w jednej reakcji klonowania, co sprawia, że budowa dużej liczby wektorów CRISPR jest prostym zadaniem. Owłosione korzenie pomidora są doskonałym systemem modelowym do walidacji wektorów CRISPR i generowania zmutowanych materiałów.

Wysokoprzepustowa konstrukcja wektora CRISPR i charakterystyka modyfikacji DNA przez generowanie owłosionych korzeni pomidora

Tutaj prezentujemy metodę generowania specyficznych dla tkanek binarnych systemów transkrypcyjnych u Drosophila poprzez zastąpienie pierwszego kodującego eksonu genów sterownikami transkrypcji. Metoda oparta na CRISPR/Cas9 umieszcza sekwencję transaktywatora pod endogenną regulacją zastąpionego genu, a w konsekwencji ułatwia ekspresję transktywatora wyłącznie we wzorcach czasoprzestrzennych specyficznych dla genu.

Skuteczna strategia generowania specyficznych tkankowo binarnych systemów transkrypcyjnych u Drosophila poprzez edycję genomu

Tutaj prezentujemy protokoły wykorzystania systemu ekspresji białek komórek owadów i bakulowirusa do produkcji dużych ilości białek wydzielanych przez rośliny do krystalizacji białek. Wektor ekspresyjny bakulowirusa został zmodyfikowany za pomocą GP67 lub peptydu sygnałowego hemoliny owadów w celu ekspresji wydzielania białek roślinnych w komórkach owadów.

Modyfikowanie wektorów ekspresyjnych bakulowirusa w celu wytwarzania wydzielanych białek roślinnych w komórkach owadów

Tutaj opisujemy wytwarzanie i zastosowanie zestawu transgenicznych linii Arabidopsis thaliana umożliwiających indukowalną, specyficzną tkankowo ekspresję w trzech głównych merystemach, merystemie wierzchołkowym pędu, merystemie wierzchołkowym korzenia i kambium.

Indukowalna, specyficzna dla typu komórki ekspresja u Arabidopsis thaliana poprzez transaktywację za pośrednictwem LhGR

Udana transformacja linii zarodkowej u jesiennego robaka wojskowego, Spodoptera frugiperda, została osiągnięta przy użyciu mRNA nadpobudliwej transposazy piggyBac.

Nadpobudliwa transformacja linii zarodkowej za pośrednictwem transpozy piggyBac u jesiennego robaka wojskowego, Spodoptera frugiperda

W tym miejscu opisujemy protokół generowania matczynego mutanta, który łączy stabilną linię knock-in zpc: cas9 z dostarczaniem kaset ekspresyjnych sgRNA za pośrednictwem Tol2.

Generowanie matczynych mutantów przy użyciu zpc:cas9 Knock-in Danio pręgowanego

Poznaj metodę generowania roślin transgenicznych z pojedynczą kopią T-DNA przy użyciu wektora BIBAC-GW. Technologia Gateway umożliwia stabilną ekspresję genu w Arabidopsis, kukurydzy, ryżu i pomidorze.

Generowanie roślin transgenicznych z insercją pojedynczej kopii przy użyciu wektora binarnego BIBAC-GW

Przeglądaj więcej filmów