Generowanie roślin transgenicznych z insercją pojedynczej kopii przy użyciu wektora binarnego BIBAC-GW

Ogólnym celem tej metodologii jest wygenerowanie roślin transgenicznych przenoszących nienaruszone, pojedyncze kopie, insercje transferowego DNA lub T-DNA, w efektywny sposób. Wektor BIBAC-Gateway jest cennym narzędziem do generowania roślin transgenicznych, które zawierają nienaruszone, pojedyncze insercje interesujących sekwencji, które wykazują stabilną ekspresję genów. Dzięki wektorowi BIBAC-Gateway można użyć technologii rekombinacji Gateway do wstawiania interesujących sekwencji przy minimalnym wysiłku.

Wszystkie pochodne BIBAC, w tym wektory BIBAC-Gateway, nadają się do przenoszenia dużych, transgenicznych fragmentów DNA do genomów roślinnych. Wektory BIBAC-GW mogą być używane do wstawiania interesujących sekwencji do wielu systemów roślinnych, takich jak kukurydza, ryż i pomidor. Dostępne są dwa plazmidy BIBAC-GW.

Plazmid BIBAC-RFP-GW zawiera gen DsRed, który ulega ekspresji w okrywach nasiennych. Plazmid BIBAC-BAR-GW zawiera gen zapewniający oporność na glufosynat. Oba wektory zawierają gen oporności na kanamycynę jako marker selekcyjny u bakterii.

Aby wstawić interesujące sekwencje do wektora binarnego, najpierw przygotuj Gateway Entry i wektory binarne, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przeprowadzić reakcję Gateway, należy przygotować reakcję rekombinacji LR zgodnie z sugestiami dostawcy w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej w temperaturze pokojowej. Wymieszaj od 100 do 300 nanogramów superskręconego klonu Entry i 300 nanogramów wektora BIBAC-Gateway.

Dostosuj objętość mieszaniny do 16 mikrolitrów za pomocą TE. Na koniec dodaj cztery mikrolitry mieszanki enzymów LR Clonase i wymieszaj przez wirowanie. Inkubować mieszaninę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez godzinę. Zakończyć reakcję LR, dodając do mieszaniny dwa mikrolitry roztworu proteinazy K.

Wymieszać i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut przed przystąpieniem do przemiany w E. coli, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przygotować rośliny Arabidopsis do transformacji, uprawiaj rzodkiewnik w szklarni lub komorze wzrostu z kontrolowanym klimatem, aż zakwitną. Przypnij pierwsze, aby umożliwić pojawienie się większej liczby dodatkowych.

Rośliny są gotowe do zanurzania od czterech do sześciu dni po strzyżeniu, kiedy rośliny mają wiele niedojrzałych główek kwiatowych i niewiele nawożonych krzemionek. Aby zanurzyć kwiaty, zanurz kwiatostany na pięć do 10 sekund w zawiesinie Agrobacterium. Używaj delikatnego mieszania.

Owiń nadziemne części roślin folią spożywczą, aby utrzymać wysoką wilgotność, i przykryj doniczki pudełkiem, aby rośliny były w ciemności. Inkubuj rośliny przez dwa dni w szklarni lub komorze wzrostu. Po dwóch dniach wyjmij pudełko i folię spożywczą i wyhoduj rośliny do dojrzałości w szklarni lub komorze wzrostu.

Aby zwiększyć efektywność transformacji, te same rośliny można ponownie zanurzyć siedem dni po pierwszym zanurzeniu. Następnie, gdy przekształcone rośliny osiągną dojrzałość i wyschną, zbierz nasiona. Zbierz i przeanalizuj nasiona roślin przekształconych za pomocą tego samego konstruktu jako pojedynczy zestaw.

W przypadku, gdy rośliny są przekształcane za pomocą pochodnej plazmidu BIBAC-RFP-Gateway, zidentyfikuj rośliny transgeniczne, analizując nasiona za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Aby wykryć ekspresję DsRed w okrywach nasiennych, zobrazuj nasiona przy wzbudzeniu 560 nanometrów i emisji od 600 do 650 nanometrów. Oddziel nasiona fluorescencyjne od niefluorescencyjnych odpowiedników za pomocą kleszczy.

Aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem roślin transgenicznych przekształconych pochodną plazmidu BIBAC-BAR-Gateway, wysiewaj nasiona na tacach wypełnionych ziemią. Zapewnij równomierne rozprowadzenie nasion na tacach, zawieszając nasiona w 0,1% agarze w 0,5x MS podłożu i rozprowadź nasiona za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra. Stymuluj nasiona do kiełkowania w sposób synchroniczny, inkubując nasiona przez co najmniej dwa dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Można to zrobić przed lub po wysianiu nasion. Dwa i trzy tygodnie po wysianiu nasion spryskaj sadzonki 0,5% roztworem glufosynatu amonowego. Użyj 500 mililitrów roztworu glufosynatu amonowego na jeden metr kwadratowy.

Przenieś ocalałe sadzonki do doniczek. Przeanalizować rośliny odporne na glufosynat amonu za pomocą PCR pod kątem obecności interesującego konstruktu. Określ liczbę integracji T-DNA i ich integralność przez blotting DNA przy użyciu enzymów restrykcyjnych.

Metoda ta pozwala na identyfikację pojedynczych, jak i powtarzających się integracji w tych samych lub różnych loci w genomie. Użyj serii trawień restrykcyjnych, aby zidentyfikować różne możliwe wzorce integracji. Wybierz enzym, który przecina raz środek T-DNA, aby móc niezależnie badać sekwencje przed i za miejscem restrykcji.

Wybierz również enzym lub kombinację enzymów, wycinając jednocześnie całą sekwencję będącą przedmiotem zainteresowania. Należy uważać, aby używać tylko enzymów restrykcyjnych, które nie są wrażliwe na metylację cytozyny. Po wykonaniu blottingu DNA, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, wykonaj analizę blot.

Analiza zależy od zastosowanej strategii restrykcji. Analizując plamę przy użyciu strategii z jednym miejscem restrykcyjnym w środku T-DNA, policz liczbę wykrytych fragmentów. W tej strategii liczba zhybrydyzowanych fragmentów sugeruje liczbę integracji T-DNA.

Porównaj liczbę fragmentów wykrytych za pomocą sondy po lewej i prawej stronie T-DNA. Jeśli za pomocą dwóch sond zostanie wykryta inna liczba fragmentów hybrydyzujących, oznacza to, że występuje albo wiele integracji T-DNA w odwróconym powtórzeniu, albo nie w pełni zintegrowane T-DNA. Aby zidentyfikować tandemowe i odwrócone układy T-DNA, oszacuj rozmiary hybrydyzujących fragmentów na blot na podstawie wielkości pasm markerowych i porównaj szacowane rozmiary z oczekiwanymi rozmiarami fragmentów obliczonymi na podstawie strategii restrykcji.

Aby zbadać, czy sekwencja transgeniczna będąca przedmiotem zainteresowania jest nienaruszona, przeanalizuj blot przygotowany zgodnie ze strategią z miejscami restrykcyjnymi na końcach sekwencji będącej przedmiotem zainteresowania. Oszacuj rozmiar fragmentów hybrydyzujących na plamie na podstawie wielkości pasm znaczników i porównaj go z oczekiwanym rozmiarem. Nienaruszona insercja daje pojedynczy fragment o określonej długości.

Każde odchylenie od oczekiwanej długości wskazuje na niepełną integrację. Pokazano strategię ograniczania i blottingu DNA w celu określenia liczby i nienaruszoności integracji T-DNA. Miejsce ograniczenia ScaI dzieli sekwencję reporterową na proksymalne części lewej granicy, które są wykrywane podczas korzystania z sondy dla pręta, i prawe części proksymalne granicy, które są wykrywane podczas używania sondy dla eYFP.

Miejsca restrykcyjne BglII i PciI znajdują się w T-DNA, poza konstruktem reporterowym. W wyniku podwójnego trawienia powstaje fragment o określonej wielkości, a każde odchylenie jest wskazówką do niepełnego wprowadzenia. Liczba zidentyfikowanych fragmentów hybrydyzujących odzwierciedla liczbę insercji T-DNA.

Jedna plama zawierająca genomowe DNA dziewięciu transgeników trawionych za pomocą ScaI została zhybrydyzowana z sondami dla bar i eYFP. Kilka pasów wskazuje na transgeniki z pojedynczymi integracjami T-DNA. Tor czwarty wyświetla dwa fragmenty z paskiem i jeden z eYFP, co wskazuje albo na obcięcie sekwencji eYFP, albo na odwrócone powtórzenie wokół prawej krawędzi.

Szósty pas wyświetla dwa fragmenty z paskiem i eYFP. Jeden fragment ma słabą intensywność z sondą prętową. Drugi fragment ma dużą intensywność, co wskazuje na dwie inserpcje T-DNA, z których jedna jest skrócona.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak włączyć interesującą Cię sekwencję DNA do wektora binarnego BIBAC-GW za pomocą rekombinacji Gateway, a następnie transformacji Arabidopsis, badań przesiewowych i oceny liczby integracji T-DNA i ich integralności. Generowanie i charakteryzowanie roślin transgenicznych jest czasochłonne. Używając BIBAC-Gateway jako wektora binarnego, proces identyfikacji transgeników z nienaruszonymi integracjami z pojedynczą kopią może zostać skrócony.

Około połowa transgeników generowanych za pomocą pochodnych BIBAC zawiera nienaruszone, pojedyncze integracje. Ogólnie rzecz biorąc, ludzie nie zdają sobie sprawy, że wiele roślin transgenicznych generowanych przy użyciu powszechnych wektorów binarnych zawiera skrócone kopie transgenu lub transgenów, które wykazują wyciszenie genów. W przypadku pochodnych BIBAC, większość wygenerowanych roślin transgenicznych ma nienaruszone, pojedyncze integracje transgenu, które rzadko wykazują wyciszenie genów.

W przypadku stosowania BIBAC-GW do generowania transgeników ważne jest, aby przekształcić wystarczającą liczbę materiałów roślinnych, ponieważ ogólna wydajność transformacji pochodnych BIBAC jest niższa niż w przypadku powszechnie stosowanych wektorów binarnych. Wydajność transformacji BIBAC-GW wynosi na ogół od 0,2% do 0,5%Po zidentyfikowaniu roślin transgenicznych przenoszących nienaruszone, jednokopijne integracje T-DNA, w razie potrzeby można przeprowadzić dalszą analizę w celu określenia dokładnej lokalizacji genomowej insercji T-DNA. Transgeniki z nienaruszonymi integracjami z pojedynczą kopią wykazują porównywalne poziomy ekspresji transgenów.

Wskazuje to, że pozycja integracji T-DNA w genomie ma niewielki wpływ na poziom ekspresji transgenu.