Name: 3 Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania końcowego za pomocą A-seq2 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Poznaj metodę A-seq2 do przygotowania biblioteki sekwencjonowania końców 3' mRNA, umożliwiającą analizę poliadenylacji i ilościowego określenia ekspresji genów w różnych typach komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Pani Béatrice Dimitriades za pomoc w hodowli komórek. Prace te były wspierane przez granty Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki #31003A_170216 i 51NF40_141735 (NCCR RNA & Disease).

<ol><li>Jan, C. H., Friedman, R. C., Ruby, J. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation%2C+regulation+and+evolution+of+Caenorhabditis+elegans+3%27UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation, regulation and evolution of Caenorhabditis elegans 3'UTRs.</a> Nature. 469 (7328), 97-101 (2011).</li>
<li>Spies, N., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27+UTR-isoform+choice+has+limited+influence+on+the+stability+and+translational+efficiency+of+most+mRNAs+in+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">3' UTR-isoform choice has limited influence on the stability and translational efficiency of most mRNAs in mouse fibroblasts.</a> Genome Res. 23 (12), 2078-2090 (2013).</li>
<li>Hoque, M., Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+alternative+cleavage+and+polyadenylation+by+3%27+region+extraction+and+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of alternative cleavage and polyadenylation by 3' region extraction and deep sequencing.</a> Nat. methods. 10 (2), 133-139 (2013).</li>
<li>Martin, G., Gruber, A. R., Keller, W., Zavolan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+pre-mRNA+3%E2%80%99+end+processing+reveals+a+decisive+role+of+human+cleavage+factor+I+in+the+regulation+of+3%27+UTR+length%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of pre-mRNA 3’ end processing reveals a decisive role of human cleavage factor I in the regulation of 3' UTR length.</a> Cell Rep. 1 (6), 753-763 (2012).</li>
<li>Gruber, A. R., Martin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+3%27+UTR+shortening+has+a+limited+effect+on+protein+abundance+in+proliferating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Global 3' UTR shortening has a limited effect on protein abundance in proliferating T cells.</a> Nat. Commun. 5, 5465(2014).</li>
<li>Kivioja, T., Vähärautio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+absolute+numbers+of+molecules+using+unique+molecular+identifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+methods%22%5BJournal%5D)">Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers.</a> Nat. methods. 9 (1), 72-74 (2011).</li>
<li>Gruber, A. J., Schmidt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+analysis+of+3%27+end+sequencing+data+sets+reveals+novel+polyadenylation+signals+and+the+repressive+role+of+heterogeneous+ribonucleoprotein+C+on+cleavage+and+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A comprehensive analysis of 3' end sequencing data sets reveals novel polyadenylation signals and the repressive role of heterogeneous ribonucleoprotein C on cleavage and polyadenylation.</a> Genome Res. 26 (8), 1145-1159 (2016).</li>
<li>Lingner, J., Keller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27-end+labeling+of+RNA+with+recombinant+yeast+poly%28A%29+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">3'-end labeling of RNA with recombinant yeast poly(A) polymerase.</a> Nucleic Acids Res. 21 (12), 2917-2920 (1993).</li>
<li>Quail, M. A., Kozarewa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+genome+center%27s+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+methods%22%5BJournal%5D)">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nat. methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).</li>
<li>Rahmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snakemake--a+scalable+bioinformatics+workflow+engine%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine.</a> Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).</li>
<li>Analytics, C. Anaconda Software Distribution. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://continuum.io">https://continuum.io</a> (2016).</li>
<li>Lab, H. FASTX-Toolkit - Hannon Lab. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/index.html">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/index.html</a> (2017).</li>
<li>Dobin, A., Davis, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Robinson, J. T., Thorvaldsdóttir, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Ozsolak, F., Platt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7265/full/nature08390.html">Direct RNA sequencing.</a> Nature. 461 (7265), 814-818 (2009).</li>
<li>Yao, C., Biesinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+analyses+of+CstF64-RNA+interactions+in+global+regulation+of+mRNA+alternative+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide analyses of CstF64-RNA interactions in global regulation of mRNA alternative polyadenylation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (46), 18773-18778 (2012).</li>
<li>Lin, Y., Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in-depth+map+of+polyadenylation+sites+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An in-depth map of polyadenylation sites in cancer.</a> Nucleic Acids Res. 40 (17), 8460-8471 (2012).</li>
<li>Shepard, P. J., Choi, E. -A., Lu, J., Flanagan, L. A., Hertel, K. J., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+and+dynamic+landscape+of+RNA+polyadenylation+revealed+by+PAS-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Complex and dynamic landscape of RNA polyadenylation revealed by PAS-Seq.</a> RNA. 17 (4), 761-772 (2011).</li>
<li>Fu, Y., Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+genome-wide+profiling+of+tandem+3%27+UTRs+among+human+breast+cancer+and+normal+cells+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Differential genome-wide profiling of tandem 3' UTRs among human breast cancer and normal cells by high-throughput sequencing.</a> Genome Res. 21 (5), 741-747 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Mnogość czynników rdzeniowych i pomocniczych, które są zaangażowane w przetwarzanie końcowe pre-mRNA 3', znajduje odzwierciedlenie w odpowiednio złożonym krajobrazie poliadenylacji. Ponadto poliadenylacja reaguje również na zmiany w innych procesach, takich jak transkrypcja i splicing. Końcowe miejsca cięcia 3' w pre-mRNA są zwykle identyfikowane na podstawie charakterystycznych ogonów poli(A), które są dodawane do produktów cięcia 5'. Większość metod wykorzystuje startery oligo(dT) o zmiennej długości, które umożliwiają specyficzną konwersję mRNA zawierających poli(A) do cDNA w reakcji odwrotnej transkrypcji. Częstym problemem tego podejścia jest wewnętrzne torowanie do sekwencji bogatych w A, co skutkuje sztucznymi miejscami cięcia. Zaproponowano dwie metody, które mają na celu obejście tego artefaktu na etapie przygotowania próbki. W metodzie 3P-seq 1 adaptery są specyficznie ligowane do końców ogonów poli(A) za pomocą oligo szyny, a następnie częściowe trawienie RNazy T1 i odwrotna transkrypcja z TTP w reakcji jako jedynym deoksynukleotydem. Powstałe heterodupleksy poli(A)-poli(dT) są następnie trawione za pomocą RNazy H, a pozostałe fragmenty RNA są izolowane, ligowane do adapterów i sekwencjonowane. Prostsza i bardziej elegancka metoda, 2P-seq, która wykorzystuje niestandardowy starter sekwencjonowania, pomijając pozostały odcinek oligo(dT) w reakcji sekwencjonowania, została opisana przez tych samych autorów 2. W pokrewnej metodzie, 3'READS 3, niezwykle długi starter składający się z 5 Us i 45 T, zawierający również biotynę, jest wyżarzany do rozdrobnionego RNA, a następnie poddawany rygorystycznym płukaniom w celu wyselekcjonowania cząsteczek RNA z ogonami poli(A) ponad 50 nukleotydów. Chociaż 3'READS drastycznie zmniejsza częstotliwość wewnętrznego gruntowania, nie eliminuje go całkowicie 3. Zaproponowano również protokoły bezpośredniego sekwencjonowania RNA, ale wynikowe odczyty są krótkie i mają wysoki poziom błędu, a podejście to nie było dalej rozwijane 18,19,20. Protokoły PolyA-Seq i skomercjalizowane Quant Seq łączą priming oparty na oligo(dT) z losowym etapem primingu do syntezy drugiej nici cDNA 20. Zastosowanie reakcji odwrotnej transkrypcji przełącznika matrycowego z odwrotną transkryptazą wirusa mysiej białaczki Moloneya (MMLV) prowadzi do wytworzenia cDNA z łącznikami w jednym kroku, a zatem w metodach PAS-Seq i SAPAS nie mogą pojawić się żadne dimery adapterowe 21,22.
Przedstawiona tutaj metoda A-seq2 wyróżnia się wykorzystaniem łupliwego nukleotydu (dU) w biotynylowanym starterze oligo(dT). Modyfikacja ta łączy w sobie użyteczność wzbogacania zhybrydyzowanych oligo(dT), poliadenylowanych celów z usunięciem większości sekwencji oligo (dT)25 z izolowanych fragmentów przed przygotowaniem bibliotek i zachowaniem trzech T, które wskazują na wcześniejszą obecność ogona poli(A). W przeciwieństwie do tego, metody, które wykorzystują RNazę H do usuwania poli(A) z cząsteczek RNA, losowo pozostawiają kilka As. Ponieważ w A-seq2 sekwencjonowanie odbywa się od końca 3' nici antysensownych, przewiduje się, że miejsca rozszczepienia będą zlokalizowane po odczytaniu motywu NNNNTTT na początku surowej sekwencji. Randomizowane tetramery służą nie tylko do umożliwienia wywoływania bazy, ale także do eliminacji artefaktów amplifikacji PCR. Można również pomieścić dłuższe moduły UMI. Możliwość wewnętrznego torowania pozostaje w A-seq2 i jest rozpatrywana obliczeniowo, najpierw poprzez odrzucenie końców 3' z zakodowaną genomowo, bogatą w A sekwencją dalszą, a następnie poprzez odrzucenie klastrów końcowych 3', które można wyjaśnić wewnętrznym torowaniem w samym sygnale poli(A) bogatym w A. Niedawna analiza miejsc poli(A) wywnioskowanych jednoznacznie przez dużą liczbę protokołów wskazuje, że miejsca, które są unikalne dla A-seq2, mają oczekiwaną dystrybucję nukleotydów i lokalizację w genach, podobnie jak inne protokoły sekwencjonowania końca 3'.
Krytycznym krokiem w A-seq2 jest selekcja poliadenylowanego RNA i usunięcie rybosomalnego RNA i różnych małych RNA. Najłatwiej jest to osiągnąć za pomocą zestawu do izolacji mRNA z kulkami magnetycznymi oligo (dT)25 . Zasadniczo całkowite RNA wyizolowane roztworami zawierającymi fenol daje również wysokiej jakości RNA, które można dalej poddawać selekcji za pomocą zestawu do izolacji mRNA lub agarozy oligo(dT). Etapem, który można zmieniać w A-seq2, jest leczenie hydrolizą alkaliczną, którą można skrócić lub wydłużyć w celu uzyskania fragmentów RNA o różnych rozmiarach. Kluczowe jest również to, że dodawanie 3'dATP do końców 3' fragmentów RNA przez polimerazę poli(A) jest wydajne. W opisanym tutaj protokole zabieg ten stosuje się do wszystkich fragmentów RNA, aby uniknąć konkategoryzacji podczas reakcji ligacji. Na koniec zauważamy, że chociaż ligaza RNA 1 jest zwykle używana jako ligaza RNA, skutecznie liguje również jednoniciowe DNA, tak jak zrobiliśmy to tutaj, aby podwiązać adapter do końca 5' cząsteczek cDNA.
Tak więc A-seq2 jest wydajnym i łatwym do wdrożenia protokołem do identyfikacji końcowych miejsc przetwarzania pre-mRNA 3'. Przyszłe rozwiązania mogą obejmować dalsze zmniejszanie złożoności protokołu i ilości wymaganego materiału. Powiązany zestaw narzędzi do obliczeniowej analizy danych umożliwia ponadto jednorodne przetwarzanie odczytów sekwencjonowania końca 3' uzyskanych za pomocą szerokiej gamy protokołów.

Wychwytywanie i sekwencjonowanie końcówek mRNA 3' pozwala na badanie przetwarzania mRNA i kwantyfikację ekspresji genów. Ze względu na swoje ogony poli(A), eukariotyczne mRNA mogą być skutecznie oczyszczane z całkowitych lizatów komórkowych za pomocą unieruchomionych cząsteczkami oligo-deoksytymidyny (oligo(dT)) unieruchomionymi kulkami, które mogą również inicjować syntezę cDNA. Takie podejście ma jednak dwie wady. Po pierwsze, odcinki A, które są wewnętrzne dla transkryptów, mogą również inicjować syntezę cDNA, co skutkuje fałszywymi miejscami poli(A). Po drugie, jednorodne odcinki poli(A) stanowią szczególne wyzwanie dla sekwencjonowania, oprócz tego, że nie dostarczają informacji do identyfikacji transkryptów. Zaproponowano różne podejścia w celu obejścia tych ograniczeń, takie jak odwrotna transkrypcja przez ogony poli(A), a następnie trawienie RNazy H (3P-seq 1), użycie niestandardowego startera sekwencjonowania kończącego się na 20 Ts (2P-seq 2), wstępna selekcja fragmentów RNA z ogonami poli(A) ponad 50 nukleotydów ze starterem CU5T45, a następnie trawienie RNazy H (3'READS 3) oraz użycie podkładu oligo-dT, który zawiera adapter 3' w spince do włosów (A-seq 4).
Niedawno opracowana metoda A-seq2 5 ma na celu ominięcie sekwencjonowania przez poli(A) i jednocześnie zminimalizowanie proporcji dimerów, które są generowane przez samoligaturację adapterów, szczególnie występujących, gdy stężenie molowe adapterów przeważa nad stężeniem insertu. Problem ten można wyeliminować, gdy oba adaptery są ligowane do tego samego typu końcówek polinukleotydowych, jak w A-seq2, gdzie adaptery 3' są ligowane do końca 5' fragmentów RNA, a adaptery 5' do końców 5' cDNA po odwrotnej transkrypcji. Metoda jest wygodniejsza niż nasza wcześniej proponowana sekwencja A-seq - w której sekwencjonowanie odbywało się w kierunku od 5' do 3', co wymagało precyzyjnie kontrolowanej fragmentacji RNA - przy zachowaniu wysokiej dokładności identyfikacji miejsca poli(A). Około 80% zsekwencjonowanych odczytów w typowych próbkach odwzorowuje jednoznacznie genom i prowadzi do identyfikacji ponad 20 000 klastrów poli(A), z których ponad 70% pokrywa się z adnotowanymi 3'UTR.
W skrócie, protokół A-seq2 zaczyna się od fragmentacji mRNA i ligacji adapterów 3' odwróconego dopełniacza do końców 5' fragmentów RNA. RNA zawierające poli(A) są następnie odwrotnie transkrybowane za pomocą startera oligo(dT) o długości 25 nukleotydów (nt), który zawiera nukleotyd kotwiczący na końcu 3', dU na pozycji 4 i biotynę na końcu 5', umożliwiając wiązanie cDNA z magnetycznymi kulkami streptawidyny. Większość startera, w tym biotyna, jest usuwana z cDNA przez rozszczepienie w dU przez mieszaninę enzymów USER, zawierającą glikozylazę DNA uracylu (UDG) i glikozylazę DNA Endonukleazę VIII. Ta reakcja pozostawia nienaruszone końce do podwiązania adaptera 5', a trzy T pozostałe po rozszczepieniu pozostają, aby zaznaczyć położenie ogona poli(A). Ponieważ zarówno adaptery 5', jak i 3' są przymocowane przez ligację do końcówek 5' odbiorcy, nie są generowane żadne dimery adaptera. Cztery losowe mery nukleotydowe wprowadzone na początku odczytów umożliwiają rozdzielczość klastra na najnowocześniejszych instrumentach sekwencjonowania, a także mogą służyć jako unikalny identyfikator molekularny (UMI) do wykrywania i usuwania artefaktów amplifikacji PCR. Rozmiar UMI można jeszcze bardziej zwiększyć, tak jak to miało miejsce w innych badaniach 6. Protokół generuje odczyty, które są odwrotnie komplementarne do końców mRNA 3', wszystkie zaczynające się od randomizowanego tetrameru, po którym następują 3 Ts. Przetwarzanie odczytów, które mają 3 diagnostyczne T na końcu 5', rozpoczyna się od korekcji artefaktów amplifikacji PCR poprzez wykorzystanie UMI, usunięcie sekwencji adaptera 3' i odwrotną komplementację. Odczyty, które mogły pochodzić z primingu oligo(dT) w wewnętrznych miejscach bogatych w A, są również identyfikowane obliczeniowo i odrzucane. Miejsca fałszywe na ogół nie mają jednego z 18 dobrze scharakteryzowanych i konserwatywnych sygnałów poli(A), które powinny znajdować się ~21 nukleotydów przed pozornym miejscem rozszczepienia 7.
Protokół wymaga około 8 godzin praktycznego czasu, nie licząc hodowli komórkowych i nocnych ligacji. Powiązane oprogramowanie do analizy odczytu umożliwia bardzo dokładną identyfikację lokalizacji poli(A). Z klastrów poli(A) utworzonych na podstawie 4 próbek szczegółowo opisanych w tym manuskrypcie (dwie biologiczne repliki kontrolnych komórek siRNA i komórek traktowanych si-HNRNPC) 84% pokrywa się z opisanym genem, a spośród nich 75% pokrywa się z 3' UTR, a 86% z 3' UTR lub końcowym eksonem. Współczynnik korelacji Pearsona końca 3' w próbkach powtórzonych wynosi 0,92, a za pomocą tej metody zwykle uzyskuje się wartości powyżej 0,9. Tak więc A-seq2 jest wygodną metodą, która daje bardzo powtarzalne wyniki.

<table><tbody><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroza, ultra czysty</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Trifosforan kordycepiny (3' dATP)</td><td>SIGMA</td><td>C9137</td><td></td></tr><tr><td>DNA fiolki o niskim poziomie wiązania, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo; s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>SIGMA</td><td>D8637</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA-DIRECT Kit</td><td>Ambion</td><td>AM61012</td><td></td></tr><tr><td>GR-Green barwnik</td><td>Excellgen</td><td>EG-1071</td><td>zastosowanie rozcieńczenia 1:10 000</td></tr><tr><td>HiSeq 2500 lub NextSeq 500 sekwencery nowej generacji</td><td>Illumina</td><td>zapytaj dostawcę</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hotstart Mieszanka polimerazy DNA</td><td>KAPA/Roche</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza poli(A), drożdże</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>74225Z25KU</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza poli(A), E.coli</td><td>New England Biolabs</td><td>M0276L</td><td></td></tr><tr><td>Kinaza polinukleotydowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EK0032</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu QIAEX II</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza RNA 1, wysokie stężenie</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M</td><td>zawiera zestaw do czyszczenia RNA PEG-8000</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>New England Biolabs</td><td>M0279</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus, inhibitor rybonukleazy</td><td>Promega</td><td>N2618</td><td></td></tr><tr><td>Indeks górny IV odwrotna transkryptaza</td><td>Thermo Fisher Scientiific</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>UŻYTKOWNIK mieszanka enzymów</td><td>New England Biolabs</td><td>M5505</td><td></td></tr><tr><td>Dyna-Mag-2 stojak magnetyczny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Podgrzewany mikser z podgrzewaną pokrywą</td></tr><tr><td>Kolumny MicroSpin</td><td>GE-Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaliczny bufor do hydrolizy, 1,5 x</td><td></td><td></td><td>Wymieszaj 1 część 0,1 M Na2CO3 i 9 części 0,1 M NaHCO3. Dodaj EDTA do 1 mM. Dostosuj pH do 9,2. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>5x bufor poli(A) polimerazy</td><td>Thermo Fisher Scientiific</td><td></td><td>100 mM Tris-HCl, pH 7,0, 3 mM MnCl2, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5 mg/ml acetylowany BSA, 50% glicerol</td></tr><tr><td>Bufor wiążący biotynę</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris&shy; Cl pH 7,5, 2 M NaCl, 0,1% NP&shy; 40</td></tr><tr><td>bufor</td><td></td><td></td> TEN <td>10 mM Tris&shy; Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,02% NP&shy; 40</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Sequence</td></tr><tr><td>Oligonukleotydy według zestawów do przygotowywania małych próbek RNA Illumina TruSeq, do sekwencerów GA-IIx i Hiseq2000/2500</td><td>Microsynth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>revRA3 (RNA)</td><td>Mikrosyntezator</td><td></td><td>5' aminowy & nieśmiały; CCUUGGCACCCGAGAAUUCCA&nieśmiały; 3'</td></tr><tr><td>revDA5</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' amino&nieśmiały; GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC GATCNNNN-3'</td></tr><tr><td>Bio-dU-dT25, RT starter</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3' (V = G, A lub C)</td></tr><tr><td>Starter PCR do przodu, RP1</td><td>Microsynth Microsynth</td><td></td><td>5' AATGATACGGGGCGGACCACCGAGA TCTACACGTGTGTTCTCTACAG TCCGA 3'PCR</td></tr> <tr><td>starter reverse, RPI1, kod kreskowy pogrubioną czcionką</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' CAAGCAGAAGGGCATACGAG 
ATCGTGATGTGACTGGAGTTCCT 
TGGCACCCGAGAATTCCA 3'</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</strong</td></tr><tr><td>>Oligonukleotydy według zestawów do przygotowywania próbek Illumina TruSeq HT-Small RNA, dla sekwencerów HiSeq2000/2500 i NextSeq500</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT-rev3A (DNA/RNA)</td><td>Mikrosyntezator</td><td></td><td>5'-amino-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTG 
CTCTTCCrGrAUrC-3'HT-rev5A</td></tr> <tr><td></td><td>Mikrosyntezator</td><td></td><td>5' amino-ACACTCTCTCCCTACACGACGCT 
CTTCCGATCTNNNN</td></tr> <tr><td>3'Bio-dU-dT25, RT starter</td><td>Microsynth</td><td></td> 5' Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN <td>3'PCR</td></tr> <tr><td>startery do przodu (D501-506)</td><td>Microsynth lub Illumina</td><td></td><td>5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACA CGACGCTCTCTCCCCGATCT -3'PCR</td></tr> <tr><td>startery odwrotne (D701-D712)</td><td>Microsynth lub Illumina</td><td></td><td>5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG A[i7]GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATC-3'Dokumentacja</td></tr> <tr><td>multipleksowania Illumina:</td><td>Illumina</td><td></td><td>https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/illumina-adapter-sequences_1000000002694-01.pdf</td></tr></tbody></table>

3' przygotowanie biblioteki sekwencjonowania końcowego za pomocą a-seq2

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Badania przeprowadzone w ostatniej dekadzie ujawniły złożoną i dynamiczną różnorodność reakcji rozszczepienia i poliadenylacji pre-mRNA. mRNA z długimi regionami nieulegającymi translacji 3' (UTR) są generowane w zróżnicowanych komórkach, podczas gdy komórki proliferujące preferencyjnie wyrażają transkrypty z krótkimi 3'UTR. Opisujemy protokół A-seq, obecnie w swojej drugiej wersji, który został opracowany w celu mapowania miejsc poliadenylacji w całym genomie i badania regulacji przetwarzania końcowego pre-mRNA 3'. Również ten obecny protokół wykorzystuje ogony poliadenylowe (poli(A)), które są dodawane podczas biogenezy większości mRNA ssaków w celu wzbogacenia na w pełni przetworzone mRNA. Adaptor DNA z deoksyuracylem w czwartej pozycji umożliwia precyzyjne przetwarzanie fragmentów końcowych mRNA 3' do sekwencjonowania. Nie wliczając hodowli komórkowej i ligacji przez noc, protokół wymaga około 8 godzin czasu praktycznego. Wraz z nim dostarczany jest łatwy w użyciu pakiet oprogramowania do analizy uzyskanych danych sekwencjonowania. A-seq2 i związane z nim oprogramowanie analityczne zapewniają wydajne i niezawodne rozwiązanie do mapowania końców pre-mRNA 3' w szerokim zakresie warunków, od 106 lub mniej komórek.

RNA zawierający poli(A) wyizolowano z hodowli komórkowych, poddano fragmentacji poprzez hydrolizę alkaliczną, a następnie otrzymano cDNA w procesie odwrotnej transkrypcji z użyciem starterów oligo(dT). Uzyskane cDNA unieruchomiono na kuleczkach z streptawidyną, dU usunięto w reakcji specyficznej wycinania uracylu, do końców 5' i 3' odciętego fragmentu przyłączono adaptery, a następnie zsekwencjonowano inserty. Rysunek 1 przedstawia graficzny schemat eksperymentu.
W przypadku komórek HeLa i HEK293, 106 komórek było wystarczającą liczbą, aby zidentyfikować miejsca poli(A) dla zdecydowanej większości genów kodujących białka pod koniec procedury. Jednak w przypadku innych typów komórek lub tkanek może być konieczne przetestowanie nasycenia liczby zidentyfikowanych miejsc poli(A) wraz ze wzrostem liczby komórek wykorzystanych w eksperymencie. Reprezentatywne wyniki etapu pilotażowego PCR oraz analizy fragmentów DNA próbki przed sekwencjonowaniem przedstawiono na Rysunku 2.
Rysunek 3 przedstawia etapy wstępnego przetwarzania analizy obliczeniowej, rozpoczynając od pliku fastq uzyskanego z sekwenatora, a kończąc na odczytach po kontroli jakości i przycięciu adapterów, które są gotowe do zmapowania do genomu. Rysunek 4 przedstawia kroki analizy, które zaczynają się od mapowania odczytów do odpowiedniego genomu i kończą na katalogu miejsc przetwarzania końców 3' mRNA zidentyfikowanych w konkretnej próbce. W przypadku analizy wielu próbek wykonywane są dodatkowe kroki w celu dopasowania miejsc przetwarzania końców 3' znalezionych w poszczególnych próbkach oraz określenia ich liczności w obrębie próbek. Kroki te przedstawiono na Rysunku 5.
Zatem po zsekwencjonowaniu próbek analiza wynikowych plików z odczytami sekwencjonowania (w formacie fastq) za pomocą dostępnego potoku przetwarzania jest prosta. Po dodaniu informacji o próbkach do pliku konfiguracyjnego wykonanie potoku spowoduje wygenerowanie dwóch głównych typów plików wyjściowych: 1) plików BED ze wszystkimi zidentyfikowanymi miejscami procesowania końca 3' w poszczególnych próbkach (np. "sample1.3pSites.noIP.bed.gz") oraz 2) pliku BED ze wszystkimi klastrami miejsc poli(A) (clusters.merged.bed) we wszystkich próbkach badania. Wyniki obejmują również współrzędne genomowe dla wszystkich odczytów z każdej poszczególnej próbki (np. "sample1.STAR_out/Aligned.sortedByCoord.out.bam"), które można później wyświetlić w przeglądarce genomu, takiej jak IGV16. Wizualna inspekcja profilu(ów) odczytów zazwyczaj pozwala na wstępny wgląd w rozkład miejsc poli(A) w genomie oraz zmiany zachodzące pod wpływem specyficznych perturbacji przeprowadzonych w badaniu. Na przykład na Rysunku 6 przedstawiono odpowiedź konkretnego genu na knock-down białka HNRNPC.
Dostarczono również podsumowania tych rozkładów w całej genomie (Tabela 1). W szczególności pliki wyjściowe w katalogu „counts/annotation_overlap” zawierają ułamki miejsc pokrywających się z określonymi adnotacjami cech (z pliku gtf dostarczonego jako dane wejściowe; adnotacje obejmują: 3' UTR, egzon terminalny, egzon, intron, region międzygenowy). Na koniec, dla każdej próbki zapisywane są również wyniki poszczególnych etapów przetwarzania (np. „sample1.summary.tsv”). Obejmuje to liczbę: surowych odczytów w każdej próbce, odczytów o oczekiwanej strukturze końca 5', odczytów pozostałych po usunięciu pełnych duplikatów PCR, odczytów wysokiej jakości zgodnie z kryteriami zdefiniowanymi w kroku 9.2, odczytów mapujących się unikalnie do genomu (po usunięciu tych wynikających z błędów sekwencjonowania, patrz krok 9.5), odczytów mapujących się wielokrotnie (po usunięciu tych wynikających z błędów sekwencjonowania, patrz krok 9.5), surowych (niezgrupowanych) miejsc przetwarzania końca 3' w każdej próbce, surowych miejsc przetwarzania końca 3' bez potencjalnych kandydatów na wewnętrzne inicjowanie syntezy (internal priming), unikalnych miejsc przetwarzania końca 3' ze wszystkich próbek bez kandydatów na wewnętrzne inicjowanie syntezy oraz końcowego zestawu klastrów miejsc poly(A).
<img alt="Schemat procesu sekwencjonowania RNA przedstawiający fragmentację, ligację adapterów, odwrotną transkrypcję i PCR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Główne etapy protokołu A-seq2. Poszczególne kroki są wskazane po lewej stronie ryciny. Wstawione fragmenty RNA przedstawiono jako zielone linie, które po odwrotnej transkrypcji zmieniają kolor na czerwony (cDNA); adaptery są oznaczone kolorem jasnoniebieskim lub pomarańczowym. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki amplifikacji PCR; schemat elektroforezy w żelu i wykres intensywności fluorescencji; analiza DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Pilotowy PCR i profil produktu końcowego. (a) Alikwoty z reakcji PCR pobrano w różnych cyklach i rozdzielono na 2% żelach agarozowych. Liczby po lewej stronie wskazują wielkość w nukleotydach odpowiadających prążków w drabinie DNA. W tym doświadczeniu dla reakcji PCR w dużej skali wybrano 12 cykli (*). (b) Przykład próbki po selekcji rozmiaru poddanej analizie w analizatorze wielkości fragmentów, wykazujący średnią wielkość około 280 nukleotydów. Liczby po lewej stronie [FU] wskazują względną intensywność sygnału. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces konwersji FASTQ na FASTA; schemat przepływu bioinformatycznego dla przetwarzania sekwencji i obsługi UMI." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Schemat wstępnego przetwarzania odczytów sekwencjonowania. Pliki fastq z odczytami generowanymi przez oprogramowanie powiązane z sekwenatorem są przetwarzane w celu zidentyfikowania wysokiej jakości odczytów, które zostaną zmapowane do odpowiedniego genomu. Rysunek przedstawia specyfikację wejść/wyjść poszczególnych kroków w potoku przetwarzania, wraz z odnośnikami do poszczególnych etapów protokołu opisanych w sekcji „Przetwarzanie danych”. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat przepływu sekwencjonowania RNA: mapowanie, konwersja BAM-do-BED, kolaps UMI, dane wyjściowe, miejsca inicjacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Schemat przetwarzania odczytów sekwencji, od etapu mapowania do genomu po wygenerowanie poszczególnych miejsc przetwarzania końców 3'. Rysunek przedstawia specyfikację danych wejściowych i wyjściowych poszczególnych kroków w potoku obliczeniowym wraz z odniesieniami do poszczególnych kroków protokołu opisanych w sekcji „Przetwarzanie danych”. Główny plik wyjściowy dostarczany użytkownikowi został zaznaczony pogrubieniem. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat przetwarzania miejsc poli(A), szczegółowo przedstawiający łączenie próbek, przypisywanie sygnałów oraz skrypty klastrowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Schemat kroków podejmowanych w celu wygenerowania klastrów współregulowanych miejsc sekwencjonowania końca 3'. Rycina przedstawia specyfikację wejścia/wyjścia poszczególnych etapów potoku przetwarzania, wraz z odnośnikami do poszczególnych kroków protokołu opisanych w sekcji „Przetwarzanie danych”. Główny plik wyjściowy został zaznaczony pogrubioną czcionką. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres analizy RNA-seq, kontrola vs HNRPNC-siRNA; porównanie ekspresji genów; adnotacja Ensembl." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Przykładowe wyniki profilu odczytów przetwarzania końca 3' wzdłuż egzonu końcowego genu NUP214, przedstawione w przeglądarce genomu IGV 16. Odczyty A-seq2 przygotowano z dwóch próbek komórek HEK 293, traktowanych odpowiednio kontrolnym siRNA lub siRNA przeciwko HNRNPC. Odczyty dokumentujące miejsca poli(A), które zostały zanotowane przez potok analizy, zapisano w formacie BAM i wykorzystano jako dane wejściowe do przeglądarki genomu IGV. Szczyty odczytów końców 3' mapują się do końców 3' mRNA zanotowanych w Ensembl. Profile wskazują na zwiększone wykorzystanie izoformy z długim 3' UTR po wyciszeniu HNRNPC. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>powtórzenie 1 si-Control</td>
			<td>replikacja 2 si-Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>id: 29765</td>
			<td>id: 32682</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liczba surowych odczytów</td>
			<td>44210258</td>
			<td>68570640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liczba poprawnych odczytów po przycinaniu i filtrowaniu</td>
			<td>14024538</td>
			<td>21211793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liczba odczytów z unikalnym mapowaniem</td>
			<td>6953674</td>
			<td>13946436</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liczba odczytów mapujących do wielu loci</td>
			<td>2040646</td>
			<td>2925839</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liczba poszczególnych miejsc procesowania końca 3'</td>
			<td>1107493</td>
			<td>1710353</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Przykładowy wynik potoku analizy. Podsumowania odczytów uzyskanych na poszczególnych etapach.

Ten protokół opisuje metodę mapowania końcowych miejsc przetwarzania pre-mRNA 3'.

3' Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania końcowego za pomocą A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Ogólnym celem tej metody jest wychwytywanie i sekwencjonowanie końców 3' mRNA, co umożliwia badanie procesowania mRNA, w szczególności cięcia końca 3' i poliadenylacji, a także kwantyfikację ekspresji genów. Przedstawiony tutaj protokół A-seq2 oraz pakiet do analizy danych mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące powstawania i funkcji izoform transkryptów w różnych typach komórek i tkankach. Głównymi zaletami metody A-seq2 są fakt, że pozwala ona uniknąć sekwencjonowania długich odcinków poly(A) oraz nie generuje dimerów adapterów.Do tej procedury wykorzystuje się komórki hodowane do 80% konfluencji. Należy usunąć pożywkę wzrostową i raz przemyć komórki roztworem PBS. Komórki należy lizować bezpośrednio na płytce, dodając jeden mililitr buforu do lizy na dołek i używając gumowej szpatułki, aby całkowicie oddzielić materiał komórkowy od powierzchni płytki.Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml przenieś lepki lizat z każdej studzienki do plastikowej probówki o pojemności 15 ml. Homogenizuj DNA, używając strzykawki 1 ml z przymocowaną igłą hipodermiczną o rozmiarze 23 G. Wykonaj kilka energicznych ruchów tłokiem w górę i w dół, aż lizat przestanie być lepki.Przenieś lizat do probówki o pojemności 1,5 ml. Wirować z prędkością 20 000 ×g w temperaturze 4 °C przez pięć minut w celu usunięcia resztek komórkowych. Zbierz przejrzysty nadsącz z lizatu.Dodaj magnetyczne kulki oligo d(T)25 i resuspenduj mieszaninę. Umieść probówki na wirującym statywie na 10 minut. Następnie umieść probówki na statywie magnetycznym na dwie minuty.Usunąć przeźroczysty płyn. Do każdej probówki dodać 0,8 milliliters buforu A i obrócić probówkę o 180 stopni dwa do trzech razy. Usunąć bufor A po drugim przemyciu.Do każdej probówki dodać 0,8 mililitra buforu B i pozostawić w statywie na dwie minuty. Aby eluować związane mRNA z kulek, usunąć bufor B, dodać do każdej probówki 33 mikrolitrów wody i resuspendować kulki. Podgrzewać do 75 stopni Celsjusza przez pięć minut na bloku grzewczym.Niezwłocznie odwiruj probówki przez jedną sekundę i umieść je na statywie magnetycznym. Przenieś nadsącz do nowej probówki. Do każdej probówki dodaj 66 µL buforu do hydrolizy alkalicznej, wymieszaj i inkubuj w temperaturze 95 °C przez dokładnie pięć minut na bloku grzejnym.Niezwłocznie schłodzić probówki na lodzie. Następnie przeprowadzić izolację RNA przy użyciu zestawu do oczyszczania RNA, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby rozpocząć tę procedurę, dodać do każdej próbki RNA 14 µL Master Mixu polinukleotydowej kinazy.Inkubować w temperaturze 37°C przez 30 minut. Po 30 minutach nałożyć reakcje kinazy na przygotowane kolumny wirowej. Wirować kolumny z prędkością 735 ×g przez dwie minuty.Odrzuć kolumny i umieść probówki z zebranymi reakcjami na lodzie. Aby zablokować trzy końce 3' fragmentów RNA i zapobiec ich konkatemeryzacji w następnych reakcjach ligacji, dodaj do każdej próbki 17,5 µL Master Mixu polimerazy poly(A). Wymieszaj i wiruj przez jedną sekundę.Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po 30 minutach dodać 32,5 µL wody do każdej reakcji i oczyścić RNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Rozpocząć tę procedurę od umieszczenia reakcji w koncentratorze próżniowym na 10 minut, aby zredukować objętość do 6 µL.Następnie do każdej reakcji dodaj 24 µL RNA ligase Master Mix. Inkubuj reakcje na mieszalniku termicznym w temperaturze 24 °C przez 16 godzin, stosując okresowe mieszanie z prędkością 1000 RPM. Następnego dnia do każdej reakcji dodaj 17 µL wody i wymieszaj.Oczyszczono RNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Eluaty umieszczono w koncentratorze próżniowym na trzy minuty, aby zredukować ich objętość do 11 µL. Przeniesiono reakcje do probówek PCR o pojemności 200 µL w celu przeprowadzenia reakcji odwrotnej transkrypcji.Dodaj 1 µL startera. Podgrzewaj w temperaturze 70 °C w termocyklerze PCR przez 5 minut, a następnie pozostaw w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Do każdej probówki dodaj 8 µL Master Mixu do odwrotnej transkrypcji i wymieszaj.Umieść probówki w cyklerze PCR. Podgrzewaj do 55 °C przez 10 minut, a następnie do 80 °C przez kolejne 10 minut. Przechowuj na lodzie.Przygotować kulki streptawidynowe zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodać mieszaninę reakcji odwrotnej transkrypcji do roztworu kulek i inkubować w temperaturze 4 °C na rotatorze przez 20 minut. Używając statywu magnetycznego, przemyć kulki dwukrotnie buforem do wiązania biotyny oraz dwukrotnie buforem TEN.Resuspenduj kuleczki w 50 µL buforu TEN. Dodaj 2 µL mieszaniny enzymu uracylu-DNA glikozylazy i inkubuj w 37 °C przez jedną godzinę w mikserze, z okresowym mieszaniem. Do każdej reakcji dodaj 50 µL wody, 11 µL buforu RNazy H oraz 1 µL RNazy H.Inkubować w temperaturze 37°C przez 20 minut. Umieścić probówki na statywie magnetycznym i przenieść ciecz zawierającą przecięte cDNA do nowej probówki. Oczyścić przecięte cDNA za pomocą zestawu do oczyszczania produktów PCR, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Umieść oczyszczone cDNA w koncentratorze próżniowym na osiem minut, aby skoncentrować je do objętości 7 µL. Aby przeprowadzić ligację adapterów 5' do końców 5' wyizolowanego cDNA, dodaj do każdej próbki 23 µL Master Mixu ligazy RNA i inkubuj w temperaturze 24 °C przez 20 godzin. Na koniec dodaj do każdej reakcji 70 µL wody.Wykonuje się pilotażową reakcję PCR w celu określenia optymalnej liczby cykli PCR niezbędnych do amplifikacji biblioteki w fazie wykładniczej. Do probówki PCR o pojemności 200 µL pipetuje się następujące składniki: 25 µL mieszaniny polimerazy DNA, 20 µL reakcji ligacji, 2 µL wody, 1,5 µL przedniego primera PCR oraz 1,5 µL tylnego primera indeksującego PCR. Termocykler uruchamia się z następującym programem: trzy minuty w 95 °C, a następnie 20 cykli obejmujących 20 sekund w 98 °C, 20 sekund w 67 °C oraz 30 sekund w 72 °C.Pobierz aliquoty o objętości 7 µL bezpośrednio z cyklera po wskazanych cyklach. Rozdziel produkty w 2% żelu agarozowym i zwizualizuj migrację produktów PCR. Wyznacz liczbę cykli na początku amplifikacji wykładniczej, w tym przykładzie 12 cykli, i wykorzystaj tę liczbę cykli do reakcji PCR w większej skali.Produkty z wielkoskalowej reakcji PCR należy rozdzielić na żelu agarozowym o stężeniu 2% i wyciąć fragmenty żelu zawierające produkty DNA o długości od 200 do 350 nukleotydów. Następnie DNA z wycinków żelu należy wyekstrahować za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W niniejszym filmie przedstawione zostaną jedynie najważniejsze kroki obliczeniowe.Więcej szczegółów znajduje się w protokole tekstowym. Rozpocznij od sklonowania repozytorium Git i przejścia do nowo utworzonego katalogu. Utwórz środowisko zawierające oprogramowanie, a następnie aktywuj to środowisko.Pobierz sekwencję genomu organizmu, z którego uzyskano dane A-seq2. Otwórz plik konfiguracyjny i ustaw parametry wejściowe zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole tekstowym. Uruchom analizę.Reakcję konkretnego genu, NUP214, na wyciszenie białka HNRNPC badano poprzez analizę odczytów a-seq2 z dwóch próbek komórek HEK-293, traktowanych odpowiednio kontrolnym małym interferującym RNA lub małym interferującym RNA przeciwko HNRNPC. Odczyty dokumentujące miejsca poly(A) adnotowane przez potok analityczny zapisano w formacie BAM, który posłużył jako dane wejściowe dla przeglądarki genomu IGD. Końce 3' szczytów odczytów zmapowano do końców 3' mMRNA adnotowanych w bazie Ensemble.Profile wskazują na zwiększone wykorzystanie izoformy z długim 3′ UTR po wyciszeniu HNRNCR. Po opanowaniu protokół A-seq wymaga ośmiu godzin pracy własnej lub około dwóch do trzech dni, nie licząc czasu potrzebnego na hodowlę komórek i ligacje nocne. Podczas wdrażania protokołu ważne jest, aby w pierwszej kolejności zaprojektować zestaw starterów zgodny z platformą sekwencjonowania wykorzystywaną w danej placówce.Po uzyskaniu końców 3' mRNA można przeprowadzić inne metody, takie jak sieciowanie i immunoprecypitacja, w celu zidentyfikowania regulatorów przetwarzania końców 3' pre-mRNA. Metoda A-seq2 utorowała drogę badaczom z dziedziny przetwarzania RNA do zgłębiania regulacji i konsekwencji alternatywnej poliadenylacji w poszczególnych typach komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak generować biblioteki końców 3' mRNA, analizować dane z sekwencjonowania, identyfikować nowe miejsca poli(A) oraz kwantyfikować ich wykorzystanie.Mamy nadzieję, że metoda A-seq2 ułatwi Państwu pracę w zakresie badania regulacji przetwarzania mRNA i przyczyni się do wielu nowych odkryć.

3-end-sequencing-library-preparation-with-a-seq2

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę przygotowania bibliotek do sekwencjonowania mRNA-Seq systemu Illumina, zarówno do odczytów pojedynczych, jak i parowanych, przeznaczonych do analizy ekspresji genów w oparciu o liniową amplifikację RNA za pomocą T7. Protokół ten wymaga jedynie 10 nanogramów całkowitego RNA wyjściowego i pozwala na uzyskanie wysoce spójnych bibliotek reprezentujących pełne transkrypty.

Biblioteki mRNA-Seq Illumina do sekwencjonowania pojedynczego odczytu oraz sekwencjonowania par końców z 10 nanogramów całkowitego RNA

Scharakteryzowanie społeczności mikrobiologicznej było od dawna celem w mikrobiologii środowiskowej. Metody sekwencjonowania nowej generacji pozwalają obecnie na scharakteryzowanie społeczności drobnoustrojów na niespotykanej dotąd głębokości przy minimalnych kosztach i nakładzie pracy. Szczegółowo opisujemy tutaj nasze podejście do sekwencjonowania bakteryjnych genów rybosomalnego RNA 16S za pomocą sekwenatora laboratoryjnego.

Sekwencjonowanie nowej generacji amplikonów genu rybosomalnego RNA 16S

Opisany jest zintegrowany system do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji próbek onkologicznych. Ten wieloplatformowy system jest zoptymalizowany pod kątem biopsji guza o niskiej jakości i małej ilości, obsługuje niskie dane wejściowe DNA, zawiera dobrze scharakteryzowane wielowariantowe kontrole i zawiera nowatorski wariant wywołujący, który jest informowany o ilościowych przedanalitycznych środkach kontroli jakości.

Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Gel-seq umożliwia badaczom jednoczesne przygotowanie bibliotek dla sekwencji DNA i RNA przy znikomych dodatkowych kosztach, zaczynając od 100 - 1000 komórek za pomocą prostego urządzenia hydrożelowego. W artykule przedstawiono szczegółowe podejście do wytwarzania urządzenia, a także protokół biologiczny do generowania sparowanych bibliotek.

Gel-seq: metoda jednoczesnego przygotowania biblioteki sekwencjonowania DNA i RNA przy użyciu matryc hydrożelowych

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to potężne narzędzie do charakterystyki genomu, które jest ograniczone przez wysoki poziom błędów platformy (~0,5–2,0%). Opisujemy nasze metody sekwencjonowania z korekcją błędów, które pozwalają nam wyeliminować wskaźnik błędów NGS i wykryć mutacje przy frakcjach alleli wariantów tak rzadkich, jak 0,0001.

Wykrywanie rzadkich zdarzeń za pomocą sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów

Identyfikacja fizycznych interakcji między genami a elementami regulatorowymi jest trudna, ale została ułatwiona dzięki metodom wychwytywania konformacji chromosomów. Ta modyfikacja protokołu 4C-seq łagodzi stronniczość PCR, minimalizując nadmierną amplifikację matryc PCR i maksymalizując mapowalność odczytów poprzez włączenie etapu trawienia enzymu ograniczającego dodawanie.

Wysokoprzepustowa identyfikacja sekwencji regulatorowych genów przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji wychwytywania konformacji chromosomów kołowych (4C-seq)

Prezentujemy szczegółowy protokół naprawy małej biblioteki RNA z mniejszym odchyleniem niż standardowe metody i zwiększoną czułością dla 2'-O-metylowych RNA. Protokół ten można przestrzegać, używając domowych odczynników w celu zaoszczędzenia kosztów lub używając zestawów dla wygody.

Poprawa sekwencji małych RNA: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2'-O-metylowych RNA

Ten protokół zapewnia łatwy do naśladowania przepływ pracy do przeprowadzenia oczyszczania poli(A) RNA, konwersji wodorosiarczynu i przygotowania biblioteki przy użyciu standardowego sprzętu dla interesującej próbki biologicznej.

Wzbogacenie biblioteki mRNA i mRNA wodorosiarczynowego do sekwencjonowania nowej generacji

W artykule przedstawiono protokół umożliwiający kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomii RNA gospodarza, wirusowego, grzybiczego i mikrobiomowego z fragmentów tkanek osadzonych w parafinie z formaliną zafiksowanymi w parafinę za pomocą Stereo-seq, co umożliwia mapowanie różnorodnych transkryptomów w wysokiej rozdzielczości, jednocześnie zachowując architekturę tkanek.

Kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomów niezależnych od gatunku za pomocą stereo-seq

Opisano konstrukcję biblioteki fosmidów z genomowego DNA środowiskowego, wyizolowanego z pionowego kontinuum głębokości sezonowo hipoksycznego fiordu. Powstała biblioteka klonów zostaje przeniesiona do płytek 384-dołkowych i zarchiwizowana w celu późniejszego sekwencjonowania oraz przesiewania funkcjonalnego przy użyciu zautomatyzowanego systemu wybierania kolonii.

Tworzenie środowiskowej biblioteki genomicznej z dużymi insertami

Poznaj metodę A-seq2 do przygotowania biblioteki sekwencjonowania końców 3' mRNA, umożliwiającą analizę poliadenylacji i ilościowego określenia ekspresji genów w różnych typach komórek.

3' Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania końcowego za pomocą A-seq2

Przeglądaj więcej filmów