3' Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania końcowego za pomocą A-seq2

Ten protokół opisuje metodę mapowania końcowych miejsc przetwarzania pre-mRNA 3'.

Ogólnym celem tej metody jest wychwycenie i sekwencjonowanie trzech końców pierwszych mRNA, umożliwiając w ten sposób badania przetwarzania mRNA, w szczególności rozszczepienia trzech pierwszych końców i poliadenylacji, a także ilościowe określenie ekspresji genów. Przedstawiony tutaj protokół A-seq2 i pakiet do analizy danych mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące wytwarzania i funkcji izoform transkryptu w różnych typach komórek i tkanek. Głównymi zaletami metody A-seq2 jest to, że unika sekwencjonowania przez długie poli(A)rozciąganie i nie generuje dimerów adapterowych.

Do tej procedury wykorzystuje się komórki, które są hodowane do 80% zbieżności. Usuń pożywkę wzrostową i umyj komórki raz PBS. Bezpośrednio zjonizuj komórki na płytce, dodając jeden mililitr buforu do lizy na studzienkę i używając gumowej szpatułki, aby całkowicie oderwać materiał komórkowy od powierzchni płytki.

Użyj jednomililitrowej końcówki pipety, aby przenieść lepki lizat z każdej studzienki do 15-mililitrowej plastikowej probówki. Podziel się DNA za pomocą jednomililitrowej strzykawki przymocowanej do igły podskórnej o rozmiarze 23. Wykonaj kilka energicznych ruchów tłoka w górę iw dół, aż lizat przestanie być lepki.

Przenieś lizat do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Wiruj z prędkością 20 000 g i czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, aby usunąć zanieczyszczenia. Zebrać klarowny sklarowany sklarowany sklarowany sklarowany sklarowany stanek nad osadem z lizatu.

Dodać do oligo d(T)25 kulki magnetyczne i ponownie zawiesić mieszaninę. Umieść probówki na obracającym się kole na 10 minut. Następnie umieść probówki na stojaku magnetycznym na dwie minuty.

Usuń klarowny płyn. Dodaj 0,8 mililitra buforu A do każdej probówki i obróć probówkę o 180 stopni dwa do trzech razy. Usuń bufor A z drugiego prania.

Dodaj 0,8 mililitra buforu B do każdej probówki i pozostaw na ruszcie na dwie minuty. Aby wymyć związane mRNA z kulek, usuń bufor B, dodaj 33 mikrolitry wody do każdej probówki i ponownie zawieś kulki. Podgrzej do 75 stopni Celsjusza przez pięć minut na bloku z sercem.

Natychmiast obracaj rurki przez jedną sekundę i umieść je na stojaku magnetycznym. Przenieść supernatant do nowej probówki. Dodaj 66 mikrolitrów alkalicznego buforu hydrolitycznego do każdej probówki, wymieszaj i podgrzewaj w temperaturze 95 stopni Celsjusza dokładnie przez pięć minut na bloku grzewczym.

Natychmiast schłodzić rurki na lodzie. Następnie wykonaj izolację RNA za pomocą zestawu do czyszczenia RNA, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj do każdej próbki RNA 14 mikrolitrów kinazy polinukleotydowej Master Mix.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po 30 minutach załaduj reakcje kinazy na przygotowane kolumny wirowe. Obracaj kolumny pod kątem 735 razy g przez dwie minuty.

Wyrzuć kolumny i umieść probówki z zebranymi reakcjami na lodzie. Aby zablokować trzy pierwsze końce fragmentów RNA, aby uniknąć ich konkategoryzacji w kolejnych reakcjach ligacji, dodaj do każdej próbki 17,5 mikrolitra poli(A)polimerazy Master Mix. Mieszaj i wiruj przez jedną sekundę.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po 30 minutach dodaj 32,5 mikrolitra wody do każdej reakcji i oczyść RNA, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Rozpocznij tę procedurę od umieszczenia reakcji w koncentratorze próżniowym na 10 minut, aby zmniejszyć objętość do sześciu mikrolitrów.

Następnie dodaj do każdej reakcji 24 mikrolitry ligazy RNA Master Mix. Inkubować reakcje na rozgrzanym mieszalniku w temperaturze 24 stopni Celsjusza przez 16 godzin, z przerywanym mieszaniem przy tysiącu obr./min. Następnego dnia dodaj 17 mikrolitrów wody do każdej reakcji i wymieszaj.

Oczyść RNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieść eluity w koncentratorze próżniowym na trzy minuty, aby zmniejszyć objętość do 11 mikrolitrów. Przenieś reakcje do 200 mikrolitrowych probówek PCR w celu przeprowadzenia reakcji odwrotnej transkrypcji.

Dodaj jeden mikrolitr podkładu. Podgrzewaj w temperaturze 70 stopni Celsjusza w cyklerze PCR przez pięć minut, a następnie pozostaw w temperaturze pokojowej na pięć minut. Dodaj osiem mikrolitrów Master Mix z odwrotną transkrypcją do każdej probówki i wymieszaj.

Umieść probówki w cyklerze do PCR. Podgrzewać do 55 stopni Celsjusza przez 10 minut i do 80 stopni Celsjusza przez kolejne 10 minut. Trzymaj na lodzie.

Przygotuj kulki streptawidyny, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodać reakcję odwrotnej transkrypcji do roztworu kulek i inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza na obracającym się kole przez 20 minut. Za pomocą stojaka magnetycznego umyj koraliki dwukrotnie buforem wiążącym biotynę i dwukrotnie buforem TEN.

Ponownie zawiesić kulki w 50 mikrolitrach buforu TEN. Dodać dwa mikrolitry mieszanki enzymatycznej glikozylazy DNA uracylu i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę w mikserze, z przerywanym mieszaniem. Do każdej reakcji dodać 50 mikrolitrów wody, 11 mikrolitrów buforu RNazy H i jeden mikrolitr Rnazy H.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Umieść probówki na stojaku magnetycznym i przenieś płyn zawierający rozszczepione cDNA do nowej probówki. Oczyść rozszczepione cDNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Umieść oczyszczone cDNA w koncentratorze próżniowym na osiem minut, aby skoncentrować się do objętości siedmiu mikrolitrów. Aby podwiązać pięć głównych adapterów do pięciu pierwszych końców wyizolowanego cDNA, dodaj do każdej próbki 23 mikrolitry głównej mieszanki ligazy RNA i inkubuj w temperaturze 24 stopni Celsjusza przez 20 godzin. Na koniec dodaj 70 mikrolitrów wody do każdej reakcji.

Pilotażowy PCR jest wykonywany w celu określenia optymalnej liczby cykli PCR, aby osiągnąć amplifikację biblioteki, w fazie wykładniczej. Do probówki PCR o pojemności 200 mikrolitrów należy pipetować następujące elementy: 25 mikrolitrów mieszanki polimerazy DNA, 20 mikrolitrów reakcji ligacji, dwa mikrolitry wody, 1,5 mikrolitra startera do PCR i 1,5 mikrolitra startera do odwróconego wskaźnika PCR. Uruchom cykler z następującym programem: trzy minuty w 95 stopniach Celsjusza, a następnie 20 cykli po 20 sekund w 98 stopniach Celsjusza, 20 sekund w 67 stopniach Celsjusza i 30 sekund w 72 stopniach Celsjusza.

Zebrać siedem mikrolitrowych porcji bezpośrednio z cyklera, po wskazanych cyklach. Oddziel produkty na 2% żelu agarozowym i zwizualizuj migrację produktów PCR. Określ liczbę cykli na początku amplifikacji wykładniczej, 12 cykli w tym przykładzie, i użyj tej liczby cykli do reakcji PCR na dużą skalę.

Oddziel produkty od reakcji PCR na dużą skalę na 2% żelu agarozowym i wytnij plastry żelu zawierające od 200 do 350 nukleotydowych produktów DNA. Następnie wyekstrahuj DNA z plastrów żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W tym filmie zostaną pokazane tylko najważniejsze kroki obliczeniowe.

Więcej szczegółów dostępnych jest w protokole tekstowym. Zacznij od sklonowania repozytorium Git i przejścia do nowo utworzonego katalogu. Utwórz środowisko zawierające oprogramowanie i aktywuj to środowisko.

Pobierz sekwencję genomu organizmu, z której uzyskano dane A-seq2. Otwórz plik konfiguracyjny i ustaw parametry wejściowe, jak wskazano w protokole tekstowym. Rozpocznij analizę.

Odpowiedź specyficznego genu, NUP214 na knockdown białka HNRNPC, zbadano poprzez analizę odczytów a-seq2 z dwóch próbek komórek HEK-293, potraktowanych albo kontrolnym małym interferującym RNA, albo małym interferującym RNA HNRNPC. Odczyty, które udokumentowały poli(A)sites oznaczone przez potok analizy, zostały zapisane w formacie BAM, który został wykorzystany jako dane wejściowe do przeglądarki genomu IGD. Trzy pierwsze końce odczytanych pików, zmapowane w mMRNA trzy pierwsze końce, które są oznaczone w zespole.

Profile wskazują na zwiększone wykorzystanie długich trzech głównych izoform UTR po powaleniu HNRNCR. Po opanowaniu, protokół A-seq zajmuje osiem godzin czasu praktycznego lub około dwóch do trzech dni, nie licząc czasu na hodowlę komórkową i nocne ligacje. Próbując skorzystać z protokołu, ważne jest, aby najpierw zaprojektować zestaw pierwotny, który jest zgodny z platformą sekwencjonowania używaną w Twojej lokalizacji.

Po uzyskaniu trzech pierwszych końców mMRA, można zastosować inne metody, takie jak sieciowanie krzyżowe i immunoprecypitacja, w celu zidentyfikowania regulatorów przetwarzania trzech pierwszych końców pre-mRNA. Projekt A-seq2 utorował drogę naukowcom zajmującym się przetwarzaniem RNA do zbadania regulacji i konsekwencji alternatywnej poliadenlylacji w poszczególnych typach komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować biblioteki trzech pierwszych końców mRNA, analizować dane sekwencjonowania, identyfikować nowe poli(A) miejsca i określać ilościowo swoje użycie.

Mamy nadzieję, że A-seq2 ułatwi Ci pracę nad rozpoczęciem regulacji przetwarzania mRNA i doprowadzi do wielu nowych spostrzeżeń.