Mikroskopia konfokalna z pełnym mocowaniem dla skóry ucha osoby dorosłej: modelowy system do badania morfogenezy rozgałęzień nerwowo-naczyniowych i dystrybucji komórek odpornościowych

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja rozgałęzionej morfogenezy i wzorca nerwów obwodowych i naczyń krwionośnych, a także rozmieszczenia komórek odpornościowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny neurobiologii, biologii naczyń krwionośnych i immunologii, rzucając światło na nieprawidłowości morfologiczne w nerwach obwodowych i naczyniach krwionośnych, a także stan zapalny. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy uwidocznić składniki komórkowe nerwów obwodowych, naczyń krwionośnych i komórek odpornościowych w skórze na całej jej głębokości oraz możemy porównać trójwymiarową architekturę w układzie nerwowym i naczyniowym.

Metoda ta może zapewnić wgląd w struktury nerwowo-naczyniowe i rozmieszczenie komórek odpornościowych u młodych i dorosłych myszy w warunkach normalnych i patologicznych. Po eutanazji dorosłych myszy zgodnie z protokołem tekstowym, odetnij ucho od podstawy i umieść je na szalce Petriego o wymiarach 35 na 10 milimetrów zawierającej dwa mililitry HBSS. Następnie użyj nożyczek, aby krótko przyciąć włosy.

Ostrożnie oderwij tylną i przednią część skóry od chrząstki znajdującej się między nimi. Przenieś każdą część skóry osobno na 24-dołkową płytkę zawierającą jeden mililitr lodowatego, świeżego 4% PFA w PBS na studzienkę. Następnie spłaszcz skórę w PFA.

Następnie przymocuj tylną i przednią skórę chrząstką w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie użyj jednego mililitra PBS, aby umyć skórę trzy razy przez pięć minut, delikatnie mieszając w temperaturze pokojowej. Przenieś skórę z chrząstką na dno szalki Petriego o wymiarach 35 na 10 milimetrów.

Użyj cienkich zakrzywionych kleszczy, aby oderwać chrząstkę od przedniej części skóry. Następnie odetnij obszar podstawy, który jest złożony i ma tkankę tłuszczową i łączną. Za pomocą tych samych kleszczy ostrożnie usuń włosy, tkankę tłuszczową i tkankę łączną z wnętrza tylnej części skóry.

Użyj PBS, aby utrzymać skórę mokrą. Aby przeprowadzić barwienie immunohistochemiczne w całości, przenieś tylną i przednią skórę na 24-dołkową płytkę zawierającą jeden mililitr 10% inaktywowanego termicznie buforu blokującego surowicę na studzienkę. Inkubować skórę delikatnie mieszając w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w buforze blokującym, jak opisano w protokole tekstowym, i dodać 150 mikrolitrów przeciwciał pierwszorzędowych w buforze blokującym do studzienki. Następnie przenieś tylną i przednią skórę do nowych studzienek zawierających przeciwciała pierwotne. Inkubuj skórę delikatnie mieszając w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia, po przeniesieniu skóry do nowych studzienek lub odessaniu przeciwciał pierwotnych, dodaj jeden mililitr 2% surowicy w PBS z 0,2% Triton X-100. Próbki należy przemywać delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Powtórz pranie jeszcze dwa razy.

W międzyczasie przygotuj przeciwciała wtórne w 10% buforze blokującym i przefiltruj roztwory przeciwciał przez 0,22-mikrometrowy filtr strzykawkowy z membraną PVDF podłączony do strzykawki o pojemności jednego mililitra. Odwirować roztwór pod ciśnieniem 13 000 razy większym niż grawitacja przez 10 minut, aby usunąć zagregowane cząstki przeciwciał drugorzędowych z buforu blokującego, dodając 150 mikrolitrów przeciwciał drugorzędowych w buforze blokującym do nowego dołka. Przenieś skórę do studzienki zawierającej przeciwciała wtórne.

Owiń 24-dołkową płytkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem, i inkubuj skórę, delikatnie mieszając w temperaturze pokojowej przez godzinę. Dodaj jeden mililitr 2% buforu do płukania surowicy. Następnie przenieś skórę tylną i przednią do studzienek zawierających bufor do mycia.

Owinąć płytkę i umyć próbki, delikatnie mieszając w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Powtórz pranie jeszcze dwa razy. Umieść skórę na dnie szalki Petriego o wymiarach 35 na 10 milimetrów.

Następnie, pod mikroskopem stereoskopowym przy słabym oświetleniu, aby zminimalizować wybielanie zdjęć, użyj cienkich zakrzywionych kleszczyków, aby ostrożnie usunąć włosy, tkankę tłuszczową, tkankę łączną, kurz i włókna z wnętrza skóry. Użyj PBS, aby utrzymać skórę mokrą. Za pomocą kleszczy przenieś skórę tylną i przednią, wnętrzem skierowanym do góry, na adhezyjnym szkiełku mikroskopowym.

Użyj kleszczy, aby spłaszczyć skórę. Zamontuj skórę w płynnym podłożu montażowym zapobiegającym blaknięciu, aby uniknąć wybielania fotograficznego i zachować sygnały fluorescencyjne. Upewnij się, że na skórze lub wokół niej nie ma pęcherzyków powietrza.

Szkiełka podstawowe z poplamioną skórą należy przechowywać w ciemności przez noc w temperaturze pokojowej, aby podłoże mocujące stało się twarde. Następnie użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe do szkiełka i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania. Aby przeprowadzić mikroskopię konfokalną, należy ustawić odpowiednie lasery do fluoroforów.

W tym eksperymencie używany jest mikroskop konfokalny z trzema źródłami lasera. Zobrazuj próbki pod obiektywem 10X i użyj narzędzia do skanowania sekwencyjnego, które jednocześnie wzbudza potrójnie zabarwione próbki, aby uniknąć i zredukować nakładanie się. W tym eksperymencie skóra ucha tylnego i skóry ucha przedniego u dorosłych myszy została wybarwiona immunologicznie przeciwciałami przeciwko alfa-SMA, Tuj1 i PECAM-1.

Tylna część skóry została wybarwiona immunologicznie w celu zbadania dystrybucji neuroimmunologicznej przy użyciu przeciwciał przeciwko CD11b i MBP, wraz z Tuj1. Wreszcie, jak pokazano tutaj, dystrybucja komórek zapalnych CD11b-dodatnich, w tym makrofagów, została wykryta w rozdzielczości pojedynczej komórki. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ostrożnym obchodzeniu się ze skórą oraz delikatnym i powolnym usuwaniu włosów, tkanki tłuszczowej i tkanki łącznej z wnętrza skóry ucha przed montażem.

Technika ta utoruje naukowcom drogę do badania rozgałęzionej morfogenezy i wzorców nerwów obwodowych i naczyń krwionośnych, a także trójwymiarowej dystrybucji składników skóry, w tym komórek odpornościowych, w modelach myszy młodocianych i dorosłych. Dzięki za oglądanie. Powodzenia w eksperymentach.