Name: Kriosekcja i barwienie immunologiczne tkanki ucha wewnętrznego myszy: od stadium embrionalnego do dorosłego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-11T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Poznaj metodę kriosekcji i barwienia immunologicznego tkanki ucha wewnętrznego myszy od embrionalnego do dorosłego stadium. Protokół zapewnia niezawodne przygotowanie próbek dla badaczy neurobiologii słuchu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.A.D. i T.M.C. były wspierane przez granty NIH 5R01DC016595-07 (dla T.M.C.) i 5R01DC018040-05 (Michael Deans, Univ. Utah, PI). Przykładowe mikrofotografie na rysunku 1A-H zostały wygenerowane przez dr Kaidi Zhang.

UWAGA: Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Georgetown. Wszystkie myszy w tym badaniu były utrzymywane zgodnie z Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Georgetown (protokół #1147). W pierwszym tygodniu po urodzeniu, ponieważ skroniowe struktury kostne nie są w pełni rozwinięte, odwapnienie nie jest wymagane. Jednak ślimaki od myszy w wieku P6 lat i starszych wymagają odwapnienia i innej metody sekcji. W naszym protokole użyto samców i samic myszy NCI Cr: NIH(S) (NIH Swiss) oraz E16.5, P0 i P30. Dla każdej sekcji podajemy w nawiasach, ile czasu ma zająć każdy krok dla początkujących. Wiele kroków stanie się szybszych wraz z praktyką.
1. Pobieranie próbek z embrionalnego i młodocianego ucha wewnętrznego (~75 min)
<ol>
	<li>Eutanazja i dekapitacja myszy zgodnie z zatwierdzonym protokołem badań na zwierzętach.</li>
	<li>Za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych ostrożnie wykonaj nacięcie w linii środkowej wzdłuż skóry głowy, zaczynając od szyi i rozciągając się w kierunku pyska, popychając skórę na boki (pierwsze cięcie).</li>
	<li>Umieść dolne ostrze nożyczek na otworze wielkim, a górne ostrze nożyczek na czaszce. Przetnij górną połowę czaszki aż do nosa (drugie cięcie).</li>
	<li>Cofnij nożyczki z częściowo naciętej głowy, a następnie umieść dolne ostrze nożyczek na dole czaszki, a górne nożyczki kończą się na otworze wielkim. Odetnij dolną połowę głowy aż do nosa (trzecie cięcie). 
	UWAGA: Ważne jest, aby ostrza nożyczek przecinały linię środkową i cięły łatwo przy niewielkim wysiłku. Zapewni to, że ostrza nożyczek będą ciąć dokładnie między lewym i prawym uchem wewnętrznym.</li>
	<li>W tym momencie głowa myszy jest podzielona na pół wzdłuż osi rostralno-ogonowej. Za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek ostrożnie odłącz wszelkie tkanki miękkie otaczające kość skroniową, takie jak mózg, mięśnie i tkanka łączna. Unikaj uszkodzenia kości lub otaczających struktur.</li>
	<li>Umieść myszy w dołkach 24-dołkowej płytki zawierającej 1x PBS o temperaturze pokojowej. Po przetworzeniu każdej głowy zamień 1x roztwór PBS na 4% roztwór PFA (do utrwalenia) i inkubuj przez 45 minut w temperaturze pokojowej (zwykle 20 °C). 
	UWAGA: Czas wiązania może się różnić w zależności od białek, które muszą zostać wykryte i/lub skuteczności wiązania różnych przeciwciał.</li>
	<li>Po 45 minutach płukać chusteczkę przez 3 x 5-10 min 1x PBS.</li>
	<li>Przechowywać próbki w 1x PBS w temperaturze 4 °C lub przejść do następnego kroku i je rozdzielić. W celu długotrwałego przechowywania przechowywać w 1x PBS zawierającym 0,1% azydku sodu w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wszelkie pozostałe tkanki myszy należy usunąć zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi usuwania zagrożeń biologicznych/tkanek.</li>
</ol>
2. Sekcja próbki z embrionalnego i młodocianego ucha wewnętrznego (3 - 5 min każda próbka)
<ol>
	<li>Zlokalizuj kość skroniową/torebkę ucha wewnętrznego w połowie głowy myszy. Zajmuje tę samą pozycję co ucho zewnętrzne, ale znajduje się wewnątrz kości czaszki. Za pomocą cienkich kleszczyków ostrożnie odłącz tkankę miękką otaczającą torebkę ucha wewnętrznego. Po poluzowaniu torebki ucha wewnętrznego zacznij przecinać tkankę wokół torebki ucha wewnętrznego.</li>
	<li>Gdy torebka ucha wewnętrznego zostanie w większości uwolniona z tkanki czaszki, delikatnie uciskaj otoczenie torebki ucha wewnętrznego za pomocą kleszczy, aby całkowicie ją uwolnić. 
	UWAGA: Stopniowo dociśnij, aby poluzować wkładkę ucha wewnętrznego z otaczających ją nasadek. Unikaj uszkodzenia wkładki ucha wewnętrznego. Ponieważ wcześnie rozwijające się ucho wewnętrzne jest dość miękkie, unikaj bezpośredniego kontaktu z kleszczami.</li>
	<li>Przechowuj próbki ucha wewnętrznego jak w kroku 1.8 i wyrzuć wszelkie pozostałe zanieczyszczenia z utrwalonej tkanki głowy.</li>
</ol>
3. Pobranie i sekcja próbki ucha wewnętrznego dla dorosłych (~75 min + 2 - 3 dni leczenia EDTA)
<ol>
	<li>Eutanazja i dekapitacja myszy zgodnie z zatwierdzonym protokołem badań na zwierzętach.</li>
	<li>Za pomocą ostrych nożyczek preparacyjnych ostrożnie wykonaj nacięcie w linii środkowej wzdłuż skóry głowy, zaczynając od szyi i rozciągając się w kierunku pyska. Odchyl skórę do tyłu, aby odsłonić czaszkę (pierwsze cięcie).</li>
	<li>Umieść dolne ostrze nożyczek na otworze wielkim, a górne ostrze nożyczek na czaszce. Przeciąć górną połowę czaszki aż do nosa (drugie cięcie). 
	UWAGA: Na tym etapie zauważysz umiarkowane "chrupnięcie" ostrzy nożyczek; To normalne.</li>
	<li>Wyciągnij nożyczki z częściowo naciętej głowy, a następnie umieść dolne ostrze nożyczek na dole czaszki, a górne ostrze nożyczek na otworze wielkim. Przytnij dolną połowę głowy aż do nosa (trzecie cięcie), uważając, aby iść w prawo wzdłuż linii środkowej, aby upewnić się, że ostrza nie trafiają do uszu wewnętrznych. 
	UWAGA: Nie przeciskaj nożyczek na siłę przez tkankę; Może to oznaczać, że ostrza uderzyły w jedno z uszu wewnętrznych.</li>
	<li>Dla każdej połowy głowy, za pomocą kleszczy i nożyczek, odłącz wszelkie tkanki miękkie otaczające kość skroniową, takie jak mózg, mięśnie i tkanka łączna. 
	UWAGA: Zachowaj ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia kości skroniowej lub otaczających struktur.</li>
	<li>Po oczyszczeniu otaczającej tkanki "odwróć" tkankę czaszki palcami i użyj kciuka, aby delikatnie wywrzeć nacisk na spód kości skroniowej. Wywieraj stopniowy nacisk, jednocześnie rozluźniając kość z otaczających ją przyczepów. 
	UWAGA: Pod wpływem nacisku torebka ucha wewnętrznego stopniowo oddziela się od otaczających kości czaszki. Przy delikatnej manipulacji kość powinna stosunkowo łatwo wyskoczyć.</li>
	<li>Po wyjęciu kapsułki ucha wewnętrznego przepłucz ją 1x PBS.</li>
	<li>Napełnij naczynie sylgard 4% PFA i umieść je pod mikroskopem. Umieść pojedyncze wystające ucho wewnętrzne w naczyniu sylgardowym.</li>
	<li>Zbadaj ucho wewnętrzne pod kątem przyczepionych tkanek miękkich lub kości i delikatnie je usuń.</li>
	<li>Znajdź owalne okienko i delikatnie usuń strzemiączko kleszczami.</li>
	<li>Znajdź okrągłe okienko i zrób mały otwór, aby upewnić się, że żadna otaczająca tkanka go nie zatyka.</li>
	<li>Otwórz mały otwór w wierzchołku za pomocą drobnych kleszczy. Przepłucz ślimak pipetą P20 wypełnioną 4% PFA, aby naprawić. Pamiętaj, aby wyobrazić sobie płyn (rozcieńczona krew, endolimfa/perylimfę) wydostający się z owalnego okienka.</li>
	<li>Umieść utrwalony ślimak w 24-dołkowej płytce wypełnionej 4% PFA. Zaznacz czas. Inkubować 30-60 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem (kołyska lub nutator), a następnie płukać próbkę przez 3 x 5-10 minut 1x roztworem PBS.</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu umieść tkankę w 1,25 mM EDTA i pozwól jej kołysać się przez 2-3 dni w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Pozostałą tkankę myszy należy usunąć w odpowiedni sposób, zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi zagrożenia biologicznego/usuwania tkanek.</li>
	<li>Po zabiegu EDTA płukać tkankę przez 3 x 5 min 1x PBS.</li>
	<li>Przechowywać próbki w 1x PBS w temperaturze 4 °C lub przejść do następnego kroku i je rozdzielić. W przypadku długotrwałego przechowywania próbki należy przechowywać w 1 PBS zawierającym 0,1% azydku sodu w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. Przygotowanie próbki z ucha wewnętrznego do kriosekcji (~24 h)
<ol>
	<li>Umieść wypreparowaną kapsułkę ucha wewnętrznego w 10% sacharozie (w 1x PBS) i pozostaw do inkubacji w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 godziny 
	UWAGA: Gdy próbki w pełni się zrównoważą, opadną na dno probówki.</li>
	<li>Wyrzuć 10% roztwór sacharozy, dodaj 20% sacharozy do 1x PBS i pozwól na dodatkowe 2 godziny inkubacji w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyrzucić 20% roztwór sacharozy, dodać 30% sacharozy do 1x PBS i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc (minimum). 
	UWAGA: Ten krok można skrócić do 2 godzin, ale najlepsze efekty daje inkubacja przez noc. Tkankę można pozostawić w dowolnym procencie sacharozy przez dłuższy czas.
	<ol>
		<li>Wyjmij połowę 30% roztworu sacharozy i wypełnij przestrzeń związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). Pozwól mu kołysać się przez minimum 30 minut i maksymalnie 2 godziny 
		UWAGA: Pozostawienie próbek w OCT przez dłuższy czas spowoduje skurczenie się tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś próbki do oznakowanych krioform, które są wypełnione OCT.</li>
	<li>Sprawdź orientację ślimaka pod mikroskopem we wbudowanym kriobloku. W przypadku "standardowych" przekrojów ślimaka należy upewnić się, że wklęsła strona ucha wewnętrznego jest skierowana w stronę węższych boków krioformy.</li>
	<li>Umieść suchy lód w małym pojemniku i dodaj 5-10 ml etanolu lub dimetylobutanu. Umieść krioformy + OCT + próbkę na bulgoczącym suchym lodzie, aby szybko zamrozić blok.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
5. Cięcie uszu wewnętrznego (~25 min na próbkę)
<ol>
	<li>Przenieść kriobloki do komory kriostatu wstępnie schłodzonego do temperatury -20 °C. Pozostawić próbki do zrównoważenia przez 30-60 minut.</li>
	<li>Za pomocą ołówka zaznacz stronę kriobloku, która odpowiada pozycji ślimaka, aby zapewnić prawidłową orientację do cięcia.</li>
	<li>Dodaj małą kałużę OCT do uchwytu i umieść na nim krioblok, szeroką stroną (bez śladu ołówka) w dół.</li>
	<li>Umieść uchwyt + OCT + próbkę w schłodzonej komorze kriostatu, pozwalając na całkowite zamrożenie OCT. Po kilku minutach umieść uchwyt + próbkę na uchwycie uchwytu tak, aby ołówek był skierowany w prawo lub w lewo.</li>
	<li>Przycinaj blok, aż tkanka stanie się widoczna (użyj 40 μm jako ustawienia przycinania).</li>
	<li>Gdy tkanka jest widoczna, pobierz wycinek 12 μm za pomocą szkiełek przeznaczonych do kriosekcji i sprawdź miejsce cięcia pod mikroskopem.</li>
	<li>Jeśli zbliżasz się do zakrętów ślimaka, zbierz skrawki 12 μm, od czasu do czasu sprawdzając pozycję, aż miną wszystkie obroty. 
	UWAGA: Liczba sekcji na slajdzie może się różnić, ale zazwyczaj otrzymujemy 8-10 sekcji na slajd i około 6 slajdów na ślimak.</li>
	<li>Przechowywać szkiełka w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
6. Barwienie immunologiczne sekcji (~1 - 3 dni)
<ol>
	<li>Wyjmij szkiełka z zamrażarki w temperaturze -80 °C i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez około 10 minut.</li>
	<li>Za pomocą ołówka oznacz szkiełka przeciwciałami, które zostaną użyte.</li>
	<li>Obrysuj krawędzie za pomocą markera hydrofobowego (np. Hydrofobowego pióra peroksydazy-antyperoksydazy barierowej (PAP)).</li>
	<li>Ponownie hydratelować próbki w 1x PBS przez 5 minut.</li>
	<li>Wyrzuć 1x PBS ze szkiełek i dodaj 1x PBS + 0,1% Triton X-100 (0,1% PBSTx) do szkiełek na 20 minut, aby przepuszczalność.</li>
	<li>Usunąć 0,1% PBSTx ze szkiełka i dodać 200 μl roztworu blokującego na 1-2 godziny inkubacji w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Blokowanie jest kluczowym krokiem w technikach barwienia immunologicznego, takich jak immunohistochemia i immunofluorescencja, gdzie zapobiega niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał z tkankami lub komórkami. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz przewodnik Lewisa dotyczący wyboru odczynników kontrolnych i blokujących27. Powszechnie stosowanym roztworem blokującym jest 10% normalna surowica osła w 0,5% PBSTx, ale ma to zastosowanie tylko wtedy, gdy stosuje się przeciwciała drugorzędowe pochodzące od osła.</li>
	<li>Wykonaj szybkie płukanie 1x PBS, dodaj 200 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego utworzonego w 0,5% PBSTx i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Dla pierwszorzędowych przeciwciał pokazanych w <silna klasa="xfig">Rysunek 1, użyj następujących rozcieńczeń: 1:200 dla Plexin-B1, 1:200 dla Sox2, 1:1,000 dla Tuj1, Myo6 i Myo7A (patrz również Lista materiałów). 
	UWAGA: Każde przeciwciało pierwotne zachowuje się inaczej w zależności od charakterystyki wiązania epitopów i zdolności do przenikania do próbek tkanek.</li>
	<li>Po podaniu działaniu przeciwciał pierwszorzędowych płukać przez 4 x 30 minut w PBSTx, dodać 200 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych sporządzonego w 0,5% PBSTx (lista materiałów) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Czasami pomocne może być wirowanie wtórnych roztworów przeciwciał z pełną prędkością w temperaturze 4 °C przez 30 minut w celu osadzenia niepożądanego osadu. Jeśli roztwory wtórne zostały odwirowane, należy unikać dotykania dna probówki końcówką pipety.</li>
	<li>Płukać przez 4 x 30 min w PBSTx (lub płukać przez noc), a następnie zamontować szkiełka za pomocą podłoża montażowego, które zapobiega fotowybielaniu (np. Fluoromount).</li>
	<li>Dodaj szkiełko nakrywkowe o odpowiedniej wielkości i grubości odpowiedniej dla konfiguracji obrazowania (np. szkiełka nakrywkowe nr 1 o grubości 0,13-0,16 mm).</li>
</ol>

<ol><li>Bainbridge, K. E., Hoffman, H. J., Cowie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+and+hearing+impairment+in+the+United+States%3A+Audiometric+evidence+from+the+National+Health+and+Nutrition+Examination+Survey%2C+1999+to+2004+%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Diabetes and hearing impairment in the United States: Audiometric evidence from the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999 to 2004 .</a> Ann Intern Med. 149 (1), 1-10 (1999).</li>
<li>Baiduc, R. R., Helzner, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+diabetes+and+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Hear%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of diabetes and hearing loss.</a> Semin Hear. 40 (4), 281-291 (2019).</li>
<li>Agarwal, S., Mishra, A., Jagade, M., Kasbekar, V., Nagle, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+hypertension+on+hearing%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Effects of hypertension on hearing.</a> Indian J Otolaryngol Head Neck Surg. 65 (Suppl 3), 614-618 (2013).</li>
<li>Przewoźny, T., Gójska-Grymajło, A., Kwarciany, M., Gąsecki, D., Narkiewicz, K. Hypertension and cochlear hearing loss. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPrzewo%C5%BAny%2C+T+%22Blood+Press%22">Blood Press</a>. 24 (4), 199-205 (2015).</li>
<li>Babarinde, J. A., Adeyemo, A. A., Adeoye, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+loss+and+hypertension%3A+exploring+the+linkage%5BTitle%5D)+AND+%22The+Egyptian+Journal+of+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Hearing loss and hypertension: exploring the linkage.</a> The Egyptian Journal of Otolaryngology. 37 (1), 1-6 (2021).</li>
<li>Mijovic, T., Zeitouni, A., Colmegna, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+sensorineural+hearing+loss%3A+the+otology-rheumatology+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Autoimmune sensorineural hearing loss: the otology-rheumatology interface.</a> Rheumatology (Oxford). 52 (5), 780-789 (2013).</li>
<li>Mancini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+loss+in+autoimmune+disorders%3A+Prevalence+and+therapeutic+options%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun+Rev%22%5BJournal%5D)">Hearing loss in autoimmune disorders: Prevalence and therapeutic options.</a> Autoimmun Rev. 17 (7), 644-652 (2018).</li>
<li>Persson, F., Bjar, N., Hermansson, A., Gisselsson-Solen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+loss+after+bacterial+meningitis%2C+a+retrospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Hearing loss after bacterial meningitis, a retrospective study.</a> Acta Otolaryngol. 142 (3-4), 298-301 (2022).</li>
<li>Kutz, J. W., Simon, L. M., Chennupati, S. K., Giannoni, C. M., Manolidis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+predictors+for+hearing+loss+in+children+with+bacterial+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Clinical predictors for hearing loss in children with bacterial meningitis.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 132 (9), 941-945 (2006).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+loss+in+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hearing loss in neurological disorders.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 716300(2021).</li>
<li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+decline%2C+dementia%2C+Alzheimer%27s+disease+and+presbycusis%3A+Examination+of+the+possible+molecular+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cognitive decline, dementia, Alzheimer's disease and presbycusis: Examination of the possible molecular mechanism.</a> Front Neurosci. 12, 12(2018).</li>
<li>Profant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+dysfunction+in+patients+with+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Auditory dysfunction in patients with Huntington's disease.</a> Clin Neurophysiol. 128 (10), 1946-1953 (2017).</li>
<li>Jafari, Z., Kolb, B. E., Mohajerani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mov+Disord%22%5BJournal%5D)">Auditory dysfunction in Parkinson's disease.</a> Mov Disord. 35 (4), 537-550 (2020).</li>
<li>Rybak, L. P., Ramkumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ototoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Ototoxicity.</a> Kidney Int. 72 (8), 931-935 (2007).</li>
<li>Demirhan, M. A., Celebisoy, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+functions+in+episodic+vestibular+disorders%3A+Meniere%27s+disease+and+vestibular+migraine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vestib+Res%22%5BJournal%5D)">Cognitive functions in episodic vestibular disorders: Meniere's disease and vestibular migraine.</a> J Vestib Res. 33 (1), 63-70 (2023).</li>
<li>Shoham, N., Lewis, G., Favarato, G., Cooper, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+anxiety+disorders+and+symptoms+in+people+with+hearing+impairment%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Soc+Psychiatry+Psychiatr+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Prevalence of anxiety disorders and symptoms in people with hearing impairment: a systematic review.</a> Soc Psychiatry Psychiatr Epidemiol. 54 (6), 649-660 (2019).</li>
<li>Manley, G. A., Gummer, A. W., Popper, A. N., Fay, R. R. The cochlea: What it is, where it came from, and what is special about it. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManley%2C+GA+%22Understanding+the+Cochlea.+Springer+Handbook+of+Auditory+Research%22">Understanding the Cochlea. Springer Handbook of Auditory Research</a>. 62, Springer. Cham. 17-32 (2017).</li>
<li>Bai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensionally+visualized+ossification+and+mineralization+process+of+the+otic+capsule+in+a+postnatal+developmental+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope+Investig+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensionally visualized ossification and mineralization process of the otic capsule in a postnatal developmental mouse.</a> Laryngoscope Investig Otolaryngol. 8 (4), 1036-1043 (2023).</li>
<li>Dabdoub, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+signaling+in+prosensory+domain+specification+and+subsequent+hair+cell+differentiation+in+the+developing+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Sox2 signaling in prosensory domain specification and subsequent hair cell differentiation in the developing cochlea.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (47), 18396-18401 (2008).</li>
<li>Mann, Z. F., Chang, W., Lee, K. Y., King, K. A., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+scleraxis+in+the+developing+auditory+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Expression and function of scleraxis in the developing auditory system.</a> PLoS One. 8 (9), e75521(2013).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+purinergic+receptor+P2rx3+is+required+for+spiral+ganglion+neuron+branch+refinement+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">The purinergic receptor P2rx3 is required for spiral ganglion neuron branch refinement during development.</a> eNeuro. 7 (4), (2020).</li>
<li>Matern, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gfi1Cre+mice+have+early+onset+progressive+hearing+loss+and+induce+recombination+in+numerous+inner+ear+non-hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gfi1Cre mice have early onset progressive hearing loss and induce recombination in numerous inner ear non-hair cells.</a> Sci Rep. 7, 42079(2017).</li>
<li>Woods, C., Montcouquiol, M., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+regulates+development+of+the+sensory+epithelium+in+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Math1 regulates development of the sensory epithelium in the mammalian cochlea.</a> Nat Neurosci. 7 (12), 1310-1318 (2004).</li>
<li>Zhang, K. D., Coate, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+development+and+function+of+type+II+spiral+ganglion+neurons+in+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the development and function of type II spiral ganglion neurons in the mammalian inner ear.</a> Semin Cell Dev Biol. 65, 80-87 (2017).</li>
<li>Brooks, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pou3f4-expressing+otic+mesenchyme+cells+promote+spiral+ganglion+neuron+survival+in+the+postnatal+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pou3f4-expressing otic mesenchyme cells promote spiral ganglion neuron survival in the postnatal mouse cochlea.</a> J Comp Neurol. 528 (12), 1967-1985 (2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+control+vascular+stability+and+auditory+spiral+ganglion+neuron+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pericytes control vascular stability and auditory spiral ganglion neuron survival.</a> Elife. 12, e83486(2023).</li>
<li>Lewis, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLewis%2C+M+%22A+guide+to+selecting+control+and+blocking+reagents%22">A guide to selecting control and blocking reagents</a>. , https://www.jacksonimmuno.com/secondary-antibody-resource/technical-tips/controls-diluents-blocking/ (2018).</li>
<li>Song, L., McGee, J., Walsh, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency-and+level-dependent+changes+in+auditory+brainstem+responses+%28ABRS%29+in+developing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Acoust+Soc+Am%22%5BJournal%5D)">Frequency-and level-dependent changes in auditory brainstem responses (ABRS) in developing mice.</a> J Acoust Soc Am. 119 (4), 2242-2257 (2006).</li>
<li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole-mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> J Vis Exp. (107), e53561(2016).</li>
<li>Driver, E. C., Northrop, A., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%2C+intercalation+and+growth+regulate+mammalian+cochlear+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell migration, intercalation and growth regulate mammalian cochlear extension.</a> Development. 144 (20), 3766-3776 (2017).</li>
<li>Babola, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+signaling+controls+spontaneous+activity+in+the+auditory+system+throughout+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Purinergic signaling controls spontaneous activity in the auditory system throughout early development.</a> J Neurosci. 41 (4), 594-612 (2021).</li>
<li>Donadieu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+cryosections+and+specific+immunohistochemical+methods+for+detecting+hypoxia+in+mouse+and+rat+cochleae%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem%22%5BJournal%5D)">Improved cryosections and specific immunohistochemical methods for detecting hypoxia in mouse and rat cochleae.</a> Acta Histochem. 109 (3), 177-184 (2007).</li>
<li>Rio, C., Dikkes, P., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+fibrillary+acidic+protein+expression+and+promoter+activity+in+the+inner+ear+of+developing+and+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Glial fibrillary acidic protein expression and promoter activity in the inner ear of developing and adult mice.</a> J Comp Neurol. 442 (2), 156-162 (2002).</li>
<li>Ahmad, S., Chen, S., Sun, J., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexins+26+and+30+are+co-assembled+to+form+gap+junctions+in+the+cochlea+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Connexins 26 and 30 are co-assembled to form gap junctions in the cochlea of mice.</a> Biochem Biophys Res Commun. 307 (2), 362-368 (2003).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spag6+mutant+mice+have+defects+in+development+and+function+of+spiral+ganglion+neurons%2C+apoptosis%2C+and+higher+sensitivity+to+paclitaxel%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Spag6 mutant mice have defects in development and function of spiral ganglion neurons, apoptosis, and higher sensitivity to paclitaxel.</a> Sci Rep. 7 (1), 8638(2017).</li>
<li>Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+dysregulation+in+the+stria+vascularis+of+mice+with+Alport+syndrome%3A+implications+for+capillary+basement+membrane+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology.</a> Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).</li>
<li>Goodyear, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+age-related+degradation+of+the+tectorial+membrane+in+the+Ceacam16%CE%B2gal%2F%CE%B2gal+null+mutant+mouse%2C+a+model+for+late-onset+human+hereditary+deafness+DFNB113%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Accelerated age-related degradation of the tectorial membrane in the Ceacam16βgal/βgal null mutant mouse, a model for late-onset human hereditary deafness DFNB113.</a> Front Mol Neurosci. 12, 147(2019).</li>
<li>Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+obtain+good+morphology+and+antigen+detection+in+the+same+tissue+section%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section.</a> Protoplasma. 254 (5), 1931-1939 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Istnieje kilka kluczowych kroków do udanej kriosekcji i barwienia immunologicznego. Niezbędne jest prawidłowe utrwalenie tkanki ślimaka, a także czas trwania utrwalenia, który może się różnić w zależności od przeciwciała. Podczas gdy większość przeciwciał działa lepiej przy krótszym czasie wiązania, takim jak 45 minut w PFA, niektóre docelowe epitopy mogą tolerować fiksację przez noc. Z naszego doświadczenia wynika, że 45-minutowa fiksacja zapewnia odpowiednią konserwację i jest kompatybilna z większością przeciwciał pie...

Zrozumienie rozwoju i funkcji słuchu jest kluczowe dla scharakteryzowania i leczenia różnych form ubytku słuchu. Czynników ryzyka utraty słuchu jest wiele i obejmują cukrzycę1,2, nadciśnienie3,4,5, choroby autoimmunologiczne6,7, bakteryjne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych8,9 oraz kilka zaburzeń neurodegeneracyjnych10,11,12,13. Ponadto niektóre leki, takie jak niektóre antybiotyki i leki stosowane w chemioterapii, mogą również negatywnie wpływać na słuch14. Poza bezpośrednimi wyzwaniami związanymi z upośledzeniem słuchu, ubytek słuchu może negatywnie wpływać na funkcje poznawcze oraz zwiększać lęk i stres, co może korelować z upośledzeniem funkcji poznawczych i pogorszeniem zdrowia psychicznego11,15,16. Publikując ten protokół, staramy się złagodzić wszelkie bariery w rozpoczęciu badań słuchowych, szczególnie dla osób bez wcześniejszego doświadczenia w pracy ze ślimakiem. Ten przewodnik wyjaśnia, jak przygotować próbki ucha wewnętrznego od myszy embrionalnych, młodocianych (noworodków) i dorosłych. Celem tego protokołu jest zapewnienie prostego podejścia do przetwarzania tkanek ucha wewnętrznego, zapewniając odtwarzalność i spójność we wszystkich eksperymentach. Barwienie immunologiczne sekcji jest jedną z najlepszych metod badania różnych typów komórek w kontekście całego ślimaka; W innych okolicznościach barwienie immunologiczne w całości może być korzystniejsze (np. badanie morfologii stereocilii komórek rzęsiastych lub lokalizacji białek).
Uzasadnienie tego wynika z wyzwań związanych z pracą z ślimakiem myszy. Jego niewielki rozmiar, unikalna cewka i delikatna struktura17 wymagają specjalistycznych technik dokładnej sekcji, utrwalania, osadzania, kriosekcji i barwienia immunologicznego. Spiralny kształt ślimaka oznacza, że osadzanie wymaga szczególnej uwagi na orientację, aby zapewnić zachowanie każdego obrotu ślimaka, co ma kluczowe znaczenie dla uzyskania spójnych sekcji. Dodatkowo, w miarę dojrzewania ślimak, ulega kostnieniu18, co oznacza, że stopniowo przekształca się w kość, co może komplikować zachowanie tkanek i wymagać odwapnienia. Barwienie immunologiczne w kriosekcji ma kilka zalet w porównaniu z alternatywnymi preparatami (takimi jak barwienie immunologiczne w całości). Kluczowymi korzyściami płynącymi z kriosekcji jest ogólne zachowanie białek i kwasów nukleinowych, a stosunkowo cienkie, ~2D sekcje pozwalają na spójne i precyzyjne pomiary. Ponadto pozwala na zachowanie i wizualizację wszystkich typów komórek ślimaka oraz może poprawić jakość barwienia immunologicznego. W przeciwieństwie do wielu preparatów ślimakowych typu whole-mount, kriosekcja pozwala zachować struktury, w tym więzadło spiralne, prążek naczyniowy, błonę Reissnera i błonę tektorialną. Zapoznaj się z poniższymi wcześniejszymi publikacjami, aby zapoznać się z przykładami wysokiej jakości sekcji immunologiczne barwienia embrionalnego19,20,21, neonatal22,23,24, and adult25,26 uszy wewnętrzne.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning, Inc.</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, Sp. z o.o.</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza&nbsp;</td><td>VWR International, Inc.</td><td>97061-432</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu&nbsp;</td><td>Amresco, Inc.</td><td>0639-250G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehydowa</td><td>mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon labs, Inc.</td><td>v1001</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylobutan&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>19387-AP</td><td></td></tr><tr><td>Środek do pomiaru optymalnej temperatury cięcia (OCT)</td><td>VWR International, Inc.</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Specjalistyczne wyposażenie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>14-071-459</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72700-DZ</td><td></td></tr><tr><td>Długopis z hydrofobową barierą peroksydazy-antyperoksydazy (PAP)&nbsp;</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td>Mikroskop konfokalny <td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss Microscopy, LLC.</td><td>Mikropipeta LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>P20</td><td>Gilson, Inc.</td><td></td><td></td>F144056M</tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>08-951-20</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Sylgarda</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>24236-10</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Materiały montażowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka Superfrost plus</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>Immunostaining Relings</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson ImmunoResearch, Inc.</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Odłamki FAB przeciw myszy&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch, Inc.</td><td>715-007-003</td><td></td></tr><tr><td>BlokHen</td><td>Aves labs, Inc.</td><td>BH-1001</td><td></td></tr><tr><td>Tuj1 (beta-III-tubulina) mysie przeciwciało monoklonalne</td><td>Biolegend, Inc.</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało poliklonalne Sox2</td><td>R& D Systems, Inc.</td><td>AF2018</td><td></td></tr><tr><td>Myo6 królicze przeciwciało poliklonalne</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25&ndash; 6791</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało poliklonalne Myo7A</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>PA1-936</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne kozy Plexin-B1</td><td>R& D Systems, Inc.</td><td>AF3749</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe (wytwarzane u osła; Alexa-488, Cy3, Cy5)</td><td>Jackson ImmunoResearch, Inc.</td><td>zobacz katalog</td><td></td></tr></tbody></table>

kriosekcja i barwienie immunologiczne tkanki ucha wewnętrznego myszy: od stadium embrionalnego do dorosłego

Cryosectioning and Immunostaining Mouse Inner Ear Tissue: From Embryonic to Adult Stages

Ten protokół szczegółowo opisuje ogólne metody histologiczne przygotowania próbek ucha wewnętrznego od embrionalnych, noworodkowych i dorosłych myszy. Celem tego protokołu jest zapewnienie prostej i ustandaryzowanej metody przetwarzania tkanek ucha wewnętrznego dla badaczy, być może nowych w tej dziedzinie, zainteresowanych pracą ze ślimakiem myszy. Zawarte są tutaj protokoły preparacji, utrwalania, osadzania, kriosekcji i barwienia immunologicznego. Immunologiczne barwienie wycinkowe jest jedną z najlepszych metod badania pojedynczych komórek w kontekście całego ślimaka.
Kluczowe kroki obejmują wypreparowanie ucha wewnętrznego z dala od czaszki, naprawienie tkanki za pomocą 4% paraformaldehydu, zatopienie za pomocą związku o optymalnej temperaturze cięcia, kriosekcję i barwienie immunologiczne przeciwciałami skierowanymi przeciwko określonym białkom wyrażanym przez ślimak.
W naszych metodach uwzględniono specjalne uwagi dotyczące ślimaka, biorąc pod uwagę jego 
kształt i struktura. Potrzebne są dość dobre umiejętności koncentracji i sekcji, ponieważ uszkodzenie tkanek może wpływać na jakość barwienia immunologicznego i spójność między próbkami. Jednak dzięki opisanym przez nas procedurom większość użytkowników można przeszkolić w ciągu kilku tygodni, aby poczynić piękne przygotowania. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten stanowi cenny sposób promowania badań mających na celu zrozumienie rozwoju, funkcji i chorób słuchowych w modelach mysich.

Przedstawiamy przykłady z naszego laboratorium obrazujące wierzchołek oraz podstawowy zwój ślimaka mysiego w 16,5 dniu embrionalnym (E16.5), a także zwój podstawowy w 0. dniu postnatalnym (P0) i 30. dniu postnatalnym (P30). Próbki te zostały poddane sekcjonowaniu i immunohistochemii z wykorzystaniem markerów dla komórek rzęsistych (Myo7A i Myo6), neuronów zwoju spiralnego (SGNs; Tuj1), glejow i komórek podporowych (Sox2) oraz Pleksyny-B1, która znakuje błonę podstawną wokół przewodu ślimaka i SGNs. Przekroje poprzeczne ś...

Ten protokół, przeznaczony dla początkujących użytkowników tkanek ucha wewnętrznego myszy, szczegółowo opisuje etapy przetwarzania uszu wewnętrznego myszy na różnych etapach rozwoju w celu barwienia immunologicznego sekcji.

Kriosekcja i barwienie immunologiczne tkanki ucha wewnętrznego myszy: od stadium embrionalnego do dorosłego

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is ...

Moje badania koncentrują się na neurorozwoju ślimaka. W szczególności moim celem jest odkrycie mechanizmów leżących u podstaw powstawania SNAPS w ślimaku i zbadanie związku między chorobą Alzheimera a ubytkiem słuchu. Obrazowanie na żywo i narzędzia genetyczne zwiększają naszą zdolność do bardziej szczegółowego badania struktur ślimaka i obwodów neuronalnych, dostarczając głębszych informacji na temat odporności i dysfunkcji systemu audytora. Publikując ten protokół, chcemy pomóc badaczom, którzy są nowicjuszami w dziedzinie audytorium, zwłaszcza tym, którzy wcześniej nie pracowali ze ślimakiem. Ten przewodnik wyjaśnia krok po kroku, jak przygotować próbki ucha wewnętrznego od embrionalnych, nowonarodzonych i dorosłych myszy. Naszym celem jest ułatwienie eksperymentów z uchem wewnętrznym i zapewnienie, że wyniki są wiarygodne i spójne. Barwienie immunologiczne w przekroju poprzecznym ma kilka zalet w porównaniu z innymi metodami, takimi jak barwienie immunologiczne w całym wierzchołku. Dobrze zachowuje białka i kwasy nukleinowe oraz tworzy cienkie, prawie 2D przekroje, co sprawia, że pomiary są dokładniejsze i bardziej spójne. Metoda ta utrzymuje również wszystkie typy komórek ślimaka w stanie nienaruszonym i widocznym, poprawiając kult barwienia immunologicznego. W przeciwieństwie do preparatów typu całomocowania, przekrój poprzeczny zachowuje ważne struktury, takie jak więzadło spiralne, prążki naczyniowe, błona Reissnera i błona tektorialna.[Instruktor] Na początek umieść młodocianą mysz poddaną eutanazji na platformie chirurgicznej. Za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych ostrożnie wykonaj nacięcie w linii środkowej wzdłuż skóry głowy, zaczynając od szyi i rozciągając się w kierunku pyska. Następnie umieść dolne ostrze nożyczek na otworze wielkim, a górne ostrze na czaszce. Przetnij górną połowę czaszki aż do nosa, aby zakończyć drugie cięcie. Cofnij nożyczki z częściowo naciętej głowy. Umieść dolne ostrze nożyczek na dole czaszki, a górne ostrze na otworze wielkim. Odetnij dolną połowę głowy aż do nosa, aby zakończyć trzecie cięcie. Za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek ostrożnie odłącz wszelkie tkanki miękkie otaczające kość skroniową, w tym mózg, mięśnie i tkankę łączną. Następnie umieść połówki głów myszy w dołkach 24-dołkowej płytki zawierającej PBS. Zastąp PBS 4% roztworem paraformaldehydu w celu utrwalenia i inkubuj przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu spłucz tkankę trzy razy przez pięć do 10 minut PBS. Zlokalizuj kość skroniową lub torebkę ucha wewnętrznego w połowie głowy myszy. Za pomocą cienkich kleszczyków ostrożnie odłącz tkankę miękką otaczającą torebkę ucha wewnętrznego. Po poluzowaniu przetnij tkankę wokół torebki ucha wewnętrznego. Następnie delikatnie uciskaj obszar otaczający torebkę ucha wewnętrznego za pomocą kleszczy, aby całkowicie ją uwolnić. Przechowuj próbki ucha wewnętrznego w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Na początek umieść dorosłą mysz poddaną eutanazji na platformie chirurgicznej. Za pomocą ostrych nożyczek preparacyjnych wykonaj nacięcie w linii środkowej wzdłuż skóry głowy, zaczynając od szyi i rozciągając się w kierunku pyska. Odchyl skórę do tyłu, aby odsłonić czaszkę podczas pierwszego cięcia. Umieść dolne ostrze nożyczek na otworze wielkim, a górne ostrze na czaszce. Przetnij górną połowę czaszki aż do nosa, aby zakończyć drugie cięcie. Cofnij nożyczki z częściowo naciętej głowy. Umieść dolne ostrze u podstawy czaszki, a górne ostrze u otworu wielkiego. Przytnij dolną połowę głowy aż do nosa wzdłuż linii środkowej, omijając uszy wewnętrzne. Dla każdej połowy głowy użyj kleszczy i nożyczek, aby odłączyć tkankę miękką otaczającą kość skroniową, w tym mózg, mięśnie i tkankę łączną. Następnie odwróć tkankę czaszki palcami i użyj kciuka, aby delikatnie wywrzeć nacisk na spód kości skroniowej. Stopniowo rozluźniaj kość z otaczających ją przyczepów. Po wyjęciu torebki ucha wewnętrznego należy ją dokładnie spłukać za pomocą PBS. Umieść pod mikroskopem naczynie Sylgard wypełnione 4% paraformaldehydem. Umieść pojedynczą kapsułkę ucha wewnętrznego w naczyniu. Zbadaj ucho wewnętrzne pod kątem przyczepionej tkanki miękkiej lub kości i delikatnie je usuń. Zidentyfikuj owalne okienko i delikatnie usuń strzemiączko za pomocą kleszczy. Następnie za pomocą cienkich kleszczy otwórz mały otwór w wierzchołku ślimaka. Używając pipety P20 wypełnionej 4% paraformaldehydem, przepłucz ślimak, aby płyny, takie jak rozcieńczona krew lub endolimfa, wydostały się przez owalne okienko. Przenieś utrwalony ślimak do 24-dołkowej płytki wypełnionej 4% paraformaldehydem. Zaznacz czas i inkubuj przez 30 do 60 minut z delikatnym mieszaniem za pomocą kołyski lub nutatora. Po inkubacji przepłukać próbkę trzykrotnie przez pięć do 10 minut PBS. Po ostatnim płukaniu umieść ślimak w 1,25-milimolowym EDTA i pozwól mu kołysać się przez dwa do trzech dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po leczeniu EDTA przepłucz ślimak trzy razy przez pięć minut za pomocą PBS. Na początek umieść rozciętą kapsułkę ucha wewnętrznego w 10% roztworze sacharozy i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Po inkubacji zastąp 10% roztwór sacharozy 20% sacharozą i inkubuj przez kolejne dwie godziny. Następnie zastąp 20% roztwór sacharozy 30% sacharozą i inkubuj próbkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia usuń połowę 30% roztworu sacharozy. Wypełnij przestrzeń optymalną temperaturą cięcia lub związkiem OCT i pozwól próbce kołysać się przez 30 minut do dwóch godzin. Przenieś próbki do oznakowanych krioform wypełnionych związkiem OCT. Sprawdź orientację ślimaka we wbudowanym kriobloku. Upewnij się, że ucho wewnętrzne; Wklęsła strona jest skierowana w stronę wąskich boków Cryomold dla standardowych przekrojów ślimaka. Następnie umieść suchy lód w małym pojemniku i dodaj od pięciu do 10 mililitrów dimetylobutanu. Umieść krioformy zawierające OCT i próbkę na bulgoczącym suchym lodzie, aby szybko zamrozić blok. Przenieś kriobloki do komory kriostatu wstępnie schłodzonego do minus 20 stopni Celsjusza. Pozostawić próbki do zrównoważenia przez 30 do 60 minut. Za pomocą ołówka lub długopisu zaznacz stronę kriobloku odpowiadającą pozycji ślimaka, aby zapewnić prawidłową orientację do cięcia. Następnie dodaj małą kałużę OCT do uchwytu i umieść na nim krioblok, upewniając się, że szeroka strona bez śladu ołówka jest skierowana w dół. Umieścić uchwyt zawierający OCT i próbkę w schłodzonej komorze kriostatu, pozwalając na całkowite zamrożenie OCT. Po kilku minutach umieść uchwyt z próbką na uchwycie uchwytu, tak aby ołówek był skierowany w prawo lub w lewo. Na kriostacie przytnij blok za pomocą ustawienia 40 mikrometrów, aż tkanka stanie się widoczna. Gdy tkanka jest widoczna, pobierz wycinek o długości 12 mikrometrów za pomocą szkiełek przeznaczonych do kriosekcji. Sprawdź położenie przekroju pod mikroskopem. Jeśli zbliżasz się do skrętu ślimaka, kontynuuj zbieranie 12-mikrometrowych odcinków, okresowo sprawdzając pozycję, aż wszystkie zwoje ślimaka zostaną podzielone na sekcje.

cryosectioning-immunostaining-mouse-inner-ear-tissue-from-embryonic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano prostą procedurę krojenia narządu Cortiego za pomocą wibratomu, a następnie przeprowadzenia immunohistochemii i mikroskopii konfokalnej. Procedura ta pozwala na lepsze zachowanie drobnej cytoarchitektury narządu Cortiego u ssaków, a w konsekwencji umożliwia dokładną kwantyfikację typów komórek.

Krojenie w wibratomie w celu lepszego zachowania cytoarchitektury organu Cortiego ssaków

Prezentujemy metodę, która opisuje izolację i hodowlę eksplantatów ślimaka z embrionalnego ucha wewnętrznego myszy.  Demonstrujemy również metodę transferu genów do eksplantatów ślimakowych za pomocą elektroporacji fali prostokątnej. Hodowla eksplantatów in vitro w połączeniu z techniką transferu genów umożliwia naukowcom badanie skutków zmiany ekspresji genów podczas rozwoju.

Hodowla embrionalnych eksplantatów ślimakowych myszy i transfer genów za pomocą elektroporacji

Przedstawiamy metodę izolowania dorosłego organu Cortiego jako trzech nienaruszonych zwojów ślimaka (wierzchołek, środek i podstawa). Demonstrujemy również procedurę barwienia immunologicznego za pomocą fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał. Razem techniki te pozwalają na badanie komórek rzęsatych, komórek podporowych i innych typów komórek znajdujących się w ślimaku.

Rozwarstwienie całej góry i immunofluorescencja ślimaka dorosłej myszy

Przedstawiamy protokół izolowania pęcherza słuchowego, torebki i kosteczek słuchowych od myszy po urodzeniu w celu przeprowadzenia całego wierzchowca i analizy histologicznej.

Rozwarstwienie pęcherza słuchowego u myszy po urodzeniu: izolacja kości ucha środkowego i analiza histologiczna

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół do wykrywania i ilościowego określania poziomów białek podczas morfogenezy/patogenezy twarzoczaszki poprzez barwienie immunologiczne na przykładzie tkanek twarzoczaszki myszy. Ponadto opisano metodę przygotowania i kriosekcji nieodwapnionych tkanek twardych od młodych myszy w celu barwienia immunologicznego.

Przygotowanie tkanek i barwienie immunologiczne tkanek twarzoczaszki myszy i kości nieodwapnionej

Ten manuskrypt opisuje eksperymentalny protokół oceny cech morfologicznych i statusu funkcjonalnego synaps wstęgowych u normalnych myszy. Prezentowany model nadaje się również do modeli z ograniczeniami synaptopatii ślimakowej wywołanych hałasem i związanych z wiekiem. Omówiono również korelacyjne wyniki poprzednich badań na myszach.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna synaps wstęgowych w określonych obszarach częstości ślimaka myszy

Ten artykuł przedstawia zmodyfikowaną metodę przygotowania powierzchni ślimaka, która wymaga odwapnienia i użycia kleju komórkowego i tkankowego do przyklejenia kawałków nabłonka ślimaka do 10 mm okrągłych szkiełek nakrywkowych do immunohistochemii u dorosłych ślimaków myszy.

Przygotowanie powierzchni ślimaka u dorosłej myszy

To badanie opisuje, jak rozciąć worek endolimfatyczny z wewnętrznego ucha myszy w różnym wieku. Wynik podobnej sekcji pokazano w mysim modelu powiększenia worka endolimfatycznego Slc26a4-zero. Transgeniczna mysz z fluorescencyjnym reporterem wyrażonym w woreczku endolimficznym jest prezentowana jako model do łatwej wizualizacji worka endolimfatycznego i narzędzie edukacyjne.

Wypreparowanie worka endolimfatycznego od myszy

Tutaj prezentujemy protokół dla mysiego modelu ubytku słuchu wywołanego hałasem (NIHL). Aby wywołać NIHL, opracowaliśmy nowe i proste urządzenie wykorzystujące tekturę falistą, klatkę pułapkę na szczury i głośnik. Odpowiedź słuchowa pnia mózgu i obrazowanie immunofluorescencyjne zostały wykorzystane do oceny odpowiednio funkcji słuchu i uszkodzenia zewnętrznych komórek rzęsatych.

Zmodyfikowane warunki eksperymentalne dla ubytku słuchu wywołanego hałasem u myszy oraz ocena funkcji słuchu i uszkodzenia zewnętrznych komórek rzęsatych

Prążek naczyniowy jest niezbędny do generowania potencjału wewnątrzślimakowego. Tutaj przedstawiamy sekcję rozstępów naczyniowych dorosłej myszy w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra lub barwienia immunologicznego.

Rozwarstwienie rozstępu naczyniowego dorosłej myszy w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra lub barwienia immunologicznego

Opisano protokół przygotowania kriosekcji siatkówki myszy i przeprowadzania barwienia immunologicznego na fotoreceptorach. Artykuł ten umożliwia naukowcom konsekwentne wytwarzanie zamrożonych skrawków siatkówki myszy z dobrze zachowaną morfologią i wysokiej jakości wynikami barwienia immunologicznego.

Kriosekcja i barwienie immunologiczne siatkówki myszy

Poznaj metodę kriosekcji i barwienia immunologicznego tkanki ucha wewnętrznego myszy od embrionalnego do dorosłego stadium. Protokół zapewnia niezawodne przygotowanie próbek dla badaczy neurobiologii słuchu.

Kriosekcja i barwienie immunologiczne tkanki ucha wewnętrznego myszy: od stadium embrionalnego do dorosłego

Przeglądaj więcej filmów