Kriosekcja i barwienie immunologiczne tkanki ucha wewnętrznego myszy: od stadium embrionalnego do dorosłego

Moje badania koncentrują się na neurorozwoju ślimaka. W szczególności moim celem jest odkrycie mechanizmów leżących u podstaw powstawania SNAPS w ślimaku i zbadanie związku między chorobą Alzheimera a ubytkiem słuchu. Obrazowanie na żywo i narzędzia genetyczne zwiększają naszą zdolność do bardziej szczegółowego badania struktur ślimaka i obwodów neuronalnych, dostarczając głębszych informacji na temat odporności i dysfunkcji systemu audytora. Publikując ten protokół, chcemy pomóc badaczom, którzy są nowicjuszami w dziedzinie audytorium, zwłaszcza tym, którzy wcześniej nie pracowali ze ślimakiem. Ten przewodnik wyjaśnia krok po kroku, jak przygotować próbki ucha wewnętrznego od embrionalnych, nowonarodzonych i dorosłych myszy. Naszym celem jest ułatwienie eksperymentów z uchem wewnętrznym i zapewnienie, że wyniki są wiarygodne i spójne. Barwienie immunologiczne w przekroju poprzecznym ma kilka zalet w porównaniu z innymi metodami, takimi jak barwienie immunologiczne w całym wierzchołku. Dobrze zachowuje białka i kwasy nukleinowe oraz tworzy cienkie, prawie 2D przekroje, co sprawia, że pomiary są dokładniejsze i bardziej spójne. Metoda ta utrzymuje również wszystkie typy komórek ślimaka w stanie nienaruszonym i widocznym, poprawiając kult barwienia immunologicznego. W przeciwieństwie do preparatów typu całomocowania, przekrój poprzeczny zachowuje ważne struktury, takie jak więzadło spiralne, prążki naczyniowe, błona Reissnera i błona tektorialna.

[Instruktor] Na początek umieść młodocianą mysz poddaną eutanazji na platformie chirurgicznej. Za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych ostrożnie wykonaj nacięcie w linii środkowej wzdłuż skóry głowy, zaczynając od szyi i rozciągając się w kierunku pyska. Następnie umieść dolne ostrze nożyczek na otworze wielkim, a górne ostrze na czaszce. Przetnij górną połowę czaszki aż do nosa, aby zakończyć drugie cięcie. Cofnij nożyczki z częściowo naciętej głowy. Umieść dolne ostrze nożyczek na dole czaszki, a górne ostrze na otworze wielkim. Odetnij dolną połowę głowy aż do nosa, aby zakończyć trzecie cięcie. Za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek ostrożnie odłącz wszelkie tkanki miękkie otaczające kość skroniową, w tym mózg, mięśnie i tkankę łączną. Następnie umieść połówki głów myszy w dołkach 24-dołkowej płytki zawierającej PBS. Zastąp PBS 4% roztworem paraformaldehydu w celu utrwalenia i inkubuj przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu spłucz tkankę trzy razy przez pięć do 10 minut PBS. Zlokalizuj kość skroniową lub torebkę ucha wewnętrznego w połowie głowy myszy. Za pomocą cienkich kleszczyków ostrożnie odłącz tkankę miękką otaczającą torebkę ucha wewnętrznego. Po poluzowaniu przetnij tkankę wokół torebki ucha wewnętrznego. Następnie delikatnie uciskaj obszar otaczający torebkę ucha wewnętrznego za pomocą kleszczy, aby całkowicie ją uwolnić. Przechowuj próbki ucha wewnętrznego w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Na początek umieść dorosłą mysz poddaną eutanazji na platformie chirurgicznej. Za pomocą ostrych nożyczek preparacyjnych wykonaj nacięcie w linii środkowej wzdłuż skóry głowy, zaczynając od szyi i rozciągając się w kierunku pyska. Odchyl skórę do tyłu, aby odsłonić czaszkę podczas pierwszego cięcia. Umieść dolne ostrze nożyczek na otworze wielkim, a górne ostrze na czaszce. Przetnij górną połowę czaszki aż do nosa, aby zakończyć drugie cięcie. Cofnij nożyczki z częściowo naciętej głowy. Umieść dolne ostrze u podstawy czaszki, a górne ostrze u otworu wielkiego. Przytnij dolną połowę głowy aż do nosa wzdłuż linii środkowej, omijając uszy wewnętrzne. Dla każdej połowy głowy użyj kleszczy i nożyczek, aby odłączyć tkankę miękką otaczającą kość skroniową, w tym mózg, mięśnie i tkankę łączną. Następnie odwróć tkankę czaszki palcami i użyj kciuka, aby delikatnie wywrzeć nacisk na spód kości skroniowej. Stopniowo rozluźniaj kość z otaczających ją przyczepów. Po wyjęciu torebki ucha wewnętrznego należy ją dokładnie spłukać za pomocą PBS. Umieść pod mikroskopem naczynie Sylgard wypełnione 4% paraformaldehydem. Umieść pojedynczą kapsułkę ucha wewnętrznego w naczyniu. Zbadaj ucho wewnętrzne pod kątem przyczepionej tkanki miękkiej lub kości i delikatnie je usuń. Zidentyfikuj owalne okienko i delikatnie usuń strzemiączko za pomocą kleszczy. Następnie za pomocą cienkich kleszczy otwórz mały otwór w wierzchołku ślimaka. Używając pipety P20 wypełnionej 4% paraformaldehydem, przepłucz ślimak, aby płyny, takie jak rozcieńczona krew lub endolimfa, wydostały się przez owalne okienko. Przenieś utrwalony ślimak do 24-dołkowej płytki wypełnionej 4% paraformaldehydem. Zaznacz czas i inkubuj przez 30 do 60 minut z delikatnym mieszaniem za pomocą kołyski lub nutatora. Po inkubacji przepłukać próbkę trzykrotnie przez pięć do 10 minut PBS. Po ostatnim płukaniu umieść ślimak w 1,25-milimolowym EDTA i pozwól mu kołysać się przez dwa do trzech dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po leczeniu EDTA przepłucz ślimak trzy razy przez pięć minut za pomocą PBS. Na początek umieść rozciętą kapsułkę ucha wewnętrznego w 10% roztworze sacharozy i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Po inkubacji zastąp 10% roztwór sacharozy 20% sacharozą i inkubuj przez kolejne dwie godziny. Następnie zastąp 20% roztwór sacharozy 30% sacharozą i inkubuj próbkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia usuń połowę 30% roztworu sacharozy. Wypełnij przestrzeń optymalną temperaturą cięcia lub związkiem OCT i pozwól próbce kołysać się przez 30 minut do dwóch godzin. Przenieś próbki do oznakowanych krioform wypełnionych związkiem OCT. Sprawdź orientację ślimaka we wbudowanym kriobloku. Upewnij się, że ucho wewnętrzne; Wklęsła strona jest skierowana w stronę wąskich boków Cryomold dla standardowych przekrojów ślimaka. Następnie umieść suchy lód w małym pojemniku i dodaj od pięciu do 10 mililitrów dimetylobutanu. Umieść krioformy zawierające OCT i próbkę na bulgoczącym suchym lodzie, aby szybko zamrozić blok. Przenieś kriobloki do komory kriostatu wstępnie schłodzonego do minus 20 stopni Celsjusza. Pozostawić próbki do zrównoważenia przez 30 do 60 minut. Za pomocą ołówka lub długopisu zaznacz stronę kriobloku odpowiadającą pozycji ślimaka, aby zapewnić prawidłową orientację do cięcia. Następnie dodaj małą kałużę OCT do uchwytu i umieść na nim krioblok, upewniając się, że szeroka strona bez śladu ołówka jest skierowana w dół. Umieścić uchwyt zawierający OCT i próbkę w schłodzonej komorze kriostatu, pozwalając na całkowite zamrożenie OCT. Po kilku minutach umieść uchwyt z próbką na uchwycie uchwytu, tak aby ołówek był skierowany w prawo lub w lewo. Na kriostacie przytnij blok za pomocą ustawienia 40 mikrometrów, aż tkanka stanie się widoczna. Gdy tkanka jest widoczna, pobierz wycinek o długości 12 mikrometrów za pomocą szkiełek przeznaczonych do kriosekcji. Sprawdź położenie przekroju pod mikroskopem. Jeśli zbliżasz się do skrętu ślimaka, kontynuuj zbieranie 12-mikrometrowych odcinków, okresowo sprawdzając pozycję, aż wszystkie zwoje ślimaka zostaną podzielone na sekcje.