Wizualizacja nawigacji aksonów ruchowych i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Ogólnym celem tego protokołu jest umożliwienie jakościowej i ilościowej oceny wzorców arboryzacji aksonów neuronów ruchowych przy użyciu mikroskopu świetlnego i oprogramowania do analizy obrazu na zarodkach myszy. Metoda ta może pomóc w zrozumieniu rozwoju neuronów ruchowych w koordynacji ze złożonym ruchem. Główną zaletą tej techniki jest to, że można obserwować i obrazować wzorce arboryzacji aksonów neuronów ruchowych pod różnymi kątami oraz analizować ilościowo każdy pojedynczy nerw.

Procedurę zademonstrują Ya-Ping Yen i Ee Shan Liau, dwaj doktoranci z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść zarodki pojedynczo na 24-dołkowej płytce z jednym mililitrem świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu w PBS na studzienkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce przez noc. Następnego dnia umyj utrwalone zarodki co najmniej trzy razy, każdy przez pięć do 10 minut, jednym mililitrem 1X PBS i inkubuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie przesusz każdy zarodek w jednym mililitrze 0,5% PBST przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na shakerze. Zablokuj każdą próbkę jednym mililitrem 10% FBS przygotowanym w 1X PBS przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza na shakerze. Następnie inkubuj każdy zarodek z jednym mililitrem pierwszorzędowego przeciwciała anty-GFP w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 72 godziny przy ciągłym wstrząsaniu.

Po inkubacji przeciwciał pierwotnych umyj każdy zarodek jednym mililitrem 0,5% PBST w ciągu jednego do dwóch dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza na shakerze. Następnie nałóż jeden mililitr przeciwciała drugorzędowego i inkubuj przez noc w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu. Następnego dnia umyj każdy zarodek jednym mililitrem 0,5% PBST co najmniej trzy razy w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce w ciągu dwóch do trzech dni.

Następnie inkubuj każdy zarodek w komercyjnym odczynniku czyszczącym o współczynniku załamania światła 1,49 nd w 1,5 mililitrowej probówce chronionej przed światłem w temperaturze pokojowej przez noc. Ustaw optykę 5X/0,1 oświetlenia i optykę detekcji 5X/0,16. Zamontować uchwyt na próbkę i kapilarę próbki.

Przygotować komorę na próbkę, wypełniając ją roztworem czyszczącym. Aby zamontować zarodek, przygotuj końcówkę pipety P200, odcinając górną część tak, aby pasowała do średnicy naczynia włosowatego i usuń spiczastą część do mocowania próbki. Następnie rozpuść stępiony koniec końcówki pipety za pomocą małego płomienia.

Zgaś płomień i szybko przymocuj zarodek pionowo do stopionego końca. Dopasuj górną część końcówki pipety do kapilary próbki i włóż przygotowaną komorę na próbkę do mikroskopu. Korzystając z oprogramowania do obrazowania, wybierz opcję Zlokalizuj kapilarnę na karcie Lokalizacja i dostosuj osie X, Y i Z.

Następnie wybierz opcję Zlokalizuj próbkę i powiększ do 0,6x, aby ustawić ostrość na zarodku. Pozwól, aby bufor komory zrównoważył się z zarodkiem przez jakiś czas, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia lub pęcherzyki. W celu uzyskania obrazu na karcie Akwizycja zdefiniuj parametry ścieżki światła, takie jak Cele detektywistyczne, Filtr blokujący laser, Rozdzielacz wiązki, Kamery i Lasery.

Zaznacz pole wyboru Pivot Scan (Skanowanie przestawne), aby uzyskać informacje o redukcji cieni. Następnie zdefiniuj ustawienia akwizycji, od Bit Bepth do 16-bit, Zoom do zakresu od 0,36 do 0,7X, oświetlenie pojedyncze lub oświetlenie dwukierunkowe. Kliknij opcję Ciągły i ustaw intensywność lasera, czas ekspozycji, moc lasera i pozycję arkusza świetlnego.

Następnie naciśnij Stop, aby zakończyć pobieranie obrazu. Ważne jest, aby upewnić się, że przezroczysta próbka jest umieszczona w najkrótszej ścieżce światła, aby umożliwić szczegółowe uzyskanie obrazów drobnych struktur arboryzowanych na poszczególnych nerwach ruchowych. W przypadku akwizycji wielowymiarowej zdefiniuj stos Z, przesuwając pozycję Z dla pierwszego i ostatniego obrazu.

Kliknij Optymalny, aby ustawić numer wycinka. Następnie kliknij przycisk Rozpocznij eksperyment, aby uzyskać wybrany stos Z. Po zakończeniu zapisz obraz w formacie czi.

Aby określić ilościowo arboryzację aksonów, otwórz plik obrazu w oprogramowaniu do analizy obrazowania. Dostosuj kolor, jasność i kontrast obrazu za pomocą okna Korekta ekranu, aby wykrywać filamenty na podstawie lokalnego kontrastu intensywności. Następnie kliknij ikonę Dodaj nowe filamenty i wybierz algorytm Autopath z menu rozwijanego.

Wybierz obszar zainteresowania, a następnie zdefiniuj punkt początkowy i początkowy, przypisując pomiary największej i najcieńszej średnicy, które można zmierzyć w trybie Slice. Przypisz punkt początkowy na krawędzi obszaru zainteresowania. Aby ręcznie dodać lub usunąć punkty początkowe, najpierw zmień tryb wskaźnika, przejdź do wyboru, a następnie przesuń Shift i kliknij prawym przyciskiem myszy w punktach zainteresowania.

Następnie wybierz ręczne progi dla punktów siewu, aby upewnić się, że cała widoczna arboryzacja jest zaznaczona. Następnie ręcznie dodaj lub usuń punkty początkowe. Zaznacz pole Usuń rozłączone segmenty i usuń punkty początkowe wokół punktów początkowych.

Następnie dostosuj próg odejmowania tła i zakończ proces. Konieczne jest usunięcie artefaktów tła i potwierdzenie, że ścieżka detektora odzwierciedla prawdziwą arboryzację aksonów w celu dokładnej kwantyfikacji. Na koniec wybierz żądany styl i kolor.

Na karcie Statystyki wybierz opcję Szczegółowe i użyj numeru filamentu, punktów końcowych dendrytów, aby określić ilościowo zakończenia nerwów ruchowych jako wskaźnik arboryzacji aksonów ruchowych. Następnie wyeksportuj obraz zrekonstruowanego aksonu jako plik TIFF. LSFM zapewnia szczegółową wizualizację 3D arboryzacji aksonów ruchowych w zarodkach myszy.

Neurony ruchowe są poddawane opisanemu powyżej protokołowi i znakowane transgenicznie ekspresyjnym GFP. Aby bardziej szczegółowo zobrazować arboryzację aksonów i przeprowadzić kwantyfikację, powiększenie można dostosować tak, aby można było ujawnić każdą drobno zaryzowaną strukturę. Wreszcie, wzorzec arboryzacji aksonów poszczególnych nerwów kończyn przednich można zrekonstruować za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Algorytm autopath w oprogramowaniu śledzi filament i określa ilościowo całkowitą liczbę końców aksonów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować próbki i zobrazować aksony neuronów ruchowych zarodków myszy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z arkuszem światła. Będziesz także wiedział, jak ilościowo ocenić wzorzec arboryzacji każdego pojedynczego nerwu ruchowego za pomocą MRS.