Wizualizacja nawigacji aksonów ruchowych i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła
May 11th, 2018
Tutaj opisujemy protokół wizualizacji projekcji neuronów ruchowych i arboryzacji aksonów w transgenicznych zarodkach myszy Hb9::GFP. Po barwieniu immunologicznym neuronów ruchowych użyliśmy mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego do obrazowania zarodków do późniejszej analizy ilościowej. Protokół ten ma zastosowanie do innych procesów nawigacji neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym.
Ogólnym celem tego protokołu jest umożliwienie jakościowej i ilościowej oceny wzorców arboryzacji aksonów neuronów ruchowych przy użyciu mikroskopu świetlnego i oprogramowania do analizy obrazu na zarodkach myszy. Metoda ta może pomóc w zrozumieniu rozwoju neuronów ruchowych w koordynacji ze złożonym ruchem. Główną zaletą tej techniki jest to, że można obserwować i obrazować wzorce arboryzacji aksonów neuronów ruchowych pod różnymi kątami oraz analizować ilościowo każdy pojedynczy nerw.
Procedurę zademonstrują Ya-Ping Yen i Ee Shan Liau, dwaj doktoranci z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść zarodki pojedynczo na 24-dołkowej płytce z jednym mililitrem świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu w PBS na studzienkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce przez noc. Następnego dnia umyj utrwalone zarodki co najmniej trzy razy, każdy przez pięć do 10 minut, jednym mililitrem 1X PBS i inkubuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnie przesusz każdy zarodek w jednym mililitrze 0,5% PBST przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na shakerze. Zablokuj każdą próbkę jednym mililitrem 10% FBS przygotowanym w 1X PBS przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza na shakerze. Następnie inkubuj każdy zarodek z jednym mililitrem pierwszorzędowego przeciwciała anty-GFP w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 72 godziny przy ciągłym wstrząsaniu.
Po inkubacji przeciwciał pierwotnych umyj każdy zarodek jednym mililitrem 0,5% PBST w ciągu jednego do dwóch dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza na shakerze. Następnie nałóż jeden mililitr przeciwciała drugorzędowego i inkubuj przez noc w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu. Następnego dnia umyj każdy zarodek jednym mililitrem 0,5% PBST co najmniej trzy razy w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce w ciągu dwóch do trzech dni.
Następnie inkubuj każdy zarodek w komercyjnym odczynniku czyszczącym o współczynniku załamania światła 1,49 nd w 1,5 mililitrowej probówce chronionej przed światłem w temperaturze pokojowej przez noc. Ustaw optykę 5X/0,1 oświetlenia i optykę detekcji 5X/0,16. Zamontować uchwyt na próbkę i kapilarę próbki.
Przygotować komorę na próbkę, wypełniając ją roztworem czyszczącym. Aby zamontować zarodek, przygotuj końcówkę pipety P200, odcinając górną część tak, aby pasowała do średnicy naczynia włosowatego i usuń spiczastą część do mocowania próbki. Następnie rozpuść stępiony koniec końcówki pipety za pomocą małego płomienia.
Zgaś płomień i szybko przymocuj zarodek pionowo do stopionego końca. Dopasuj górną część końcówki pipety do kapilary próbki i włóż przygotowaną komorę na próbkę do mikroskopu. Korzystając z oprogramowania do obrazowania, wybierz opcję Zlokalizuj kapilarnę na karcie Lokalizacja i dostosuj osie X, Y i Z.
Następnie wybierz opcję Zlokalizuj próbkę i powiększ do 0,6x, aby ustawić ostrość na zarodku. Pozwól, aby bufor komory zrównoważył się z zarodkiem przez jakiś czas, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia lub pęcherzyki. W celu uzyskania obrazu na karcie Akwizycja zdefiniuj parametry ścieżki światła, takie jak Cele detektywistyczne, Filtr blokujący laser, Rozdzielacz wiązki, Kamery i Lasery.
Zaznacz pole wyboru Pivot Scan (Skanowanie przestawne), aby uzyskać informacje o redukcji cieni. Następnie zdefiniuj ustawienia akwizycji, od Bit Bepth do 16-bit, Zoom do zakresu od 0,36 do 0,7X, oświetlenie pojedyncze lub oświetlenie dwukierunkowe. Kliknij opcję Ciągły i ustaw intensywność lasera, czas ekspozycji, moc lasera i pozycję arkusza świetlnego.
Następnie naciśnij Stop, aby zakończyć pobieranie obrazu. Ważne jest, aby upewnić się, że przezroczysta próbka jest umieszczona w najkrótszej ścieżce światła, aby umożliwić szczegółowe uzyskanie obrazów drobnych struktur arboryzowanych na poszczególnych nerwach ruchowych. W przypadku akwizycji wielowymiarowej zdefiniuj stos Z, przesuwając pozycję Z dla pierwszego i ostatniego obrazu.
Kliknij Optymalny, aby ustawić numer wycinka. Następnie kliknij przycisk Rozpocznij eksperyment, aby uzyskać wybrany stos Z. Po zakończeniu zapisz obraz w formacie czi.
Aby określić ilościowo arboryzację aksonów, otwórz plik obrazu w oprogramowaniu do analizy obrazowania. Dostosuj kolor, jasność i kontrast obrazu za pomocą okna Korekta ekranu, aby wykrywać filamenty na podstawie lokalnego kontrastu intensywności. Następnie kliknij ikonę Dodaj nowe filamenty i wybierz algorytm Autopath z menu rozwijanego.
Wybierz obszar zainteresowania, a następnie zdefiniuj punkt początkowy i początkowy, przypisując pomiary największej i najcieńszej średnicy, które można zmierzyć w trybie Slice. Przypisz punkt początkowy na krawędzi obszaru zainteresowania. Aby ręcznie dodać lub usunąć punkty początkowe, najpierw zmień tryb wskaźnika, przejdź do wyboru, a następnie przesuń Shift i kliknij prawym przyciskiem myszy w punktach zainteresowania.
Następnie wybierz ręczne progi dla punktów siewu, aby upewnić się, że cała widoczna arboryzacja jest zaznaczona. Następnie ręcznie dodaj lub usuń punkty początkowe. Zaznacz pole Usuń rozłączone segmenty i usuń punkty początkowe wokół punktów początkowych.
Następnie dostosuj próg odejmowania tła i zakończ proces. Konieczne jest usunięcie artefaktów tła i potwierdzenie, że ścieżka detektora odzwierciedla prawdziwą arboryzację aksonów w celu dokładnej kwantyfikacji. Na koniec wybierz żądany styl i kolor.
Na karcie Statystyki wybierz opcję Szczegółowe i użyj numeru filamentu, punktów końcowych dendrytów, aby określić ilościowo zakończenia nerwów ruchowych jako wskaźnik arboryzacji aksonów ruchowych. Następnie wyeksportuj obraz zrekonstruowanego aksonu jako plik TIFF. LSFM zapewnia szczegółową wizualizację 3D arboryzacji aksonów ruchowych w zarodkach myszy.
Neurony ruchowe są poddawane opisanemu powyżej protokołowi i znakowane transgenicznie ekspresyjnym GFP. Aby bardziej szczegółowo zobrazować arboryzację aksonów i przeprowadzić kwantyfikację, powiększenie można dostosować tak, aby można było ujawnić każdą drobno zaryzowaną strukturę. Wreszcie, wzorzec arboryzacji aksonów poszczególnych nerwów kończyn przednich można zrekonstruować za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
Algorytm autopath w oprogramowaniu śledzi filament i określa ilościowo całkowitą liczbę końców aksonów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować próbki i zobrazować aksony neuronów ruchowych zarodków myszy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z arkuszem światła. Będziesz także wiedział, jak ilościowo ocenić wzorzec arboryzacji każdego pojedynczego nerwu ruchowego za pomocą MRS.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia protokół wizualizowania projekcji neuronów ruchowych i rozgałęziania się aksonów w embrionach myszy transgenicznych Hb9::GFP. Metoda ta, wykorzystująca mikroskopio fluorescencyjną z warstwą świetlną, umożliwia jakościową i ilościową ocenę wzorców aksonów, co przyczynia się do lepszego zrozumienia rozwoju neuronów ruchowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Rozvoj neuronów
- Techniki obrazowania
Tło
- Protokół koncentruje się na neuronach ruchowych, kluczowych dla koordynacji złożonych ruchów.
- Rozbudowa aksonów neuronów ruchowych jest kluczowa dla funkcjonalnych obwodów nerwowych.
- Zrozumienie tych wzorców może ujawniać wgląd w procesy rozwoju neuronów.
Cel badania
- Wizualizować i ilościowo analizować rozgałęziania się aksonów neuronów ruchowych.
- Ustanowić metodę, którą można zastosować do innych procesów nawigacji neuronów.
- Zgłębić nasze zrozumienie rozwoju neuronów ruchowych w embrionach myszy.
Stosowane metody
- Główną platformą wykorzystaną jest mikroskopia fluorescencyjna z warstwą świetlną.
- Embriony myszy ekspresujące GFP pod promotorem Hb9 służą jako model biologiczny.
- Embriony są przygotowywane przez techniki immunobarwienia i klarowania przed obrazowaniem.
- Kluczowe kroki obejmują fiksację, permeabilizację i inkubację próbek z przeciwciałami.
Główne wyniki
- Wyniki potwierdzają zdolność wizualizowania drobnych szczegółów rozgałęziania się aksonów w 3D.
- Analiza ilościowa ułatwia ocenę wzorców rozgałęziania się poszczególnych nerwów ruchowych.
- Ta metoda pozwala na regulację powiększenia, aby ujawniać skomplikowane struktury.
Wnioski
- Badanie wykazuje solidny protokół do analizy rozwoju neuronów ruchowych.
- Metoda zwiększa wgląd w zachowanie neuronów i potencjalne zastosowanie w innych badaniach.
- Wyniki przyczyniają się do szerszej wiedzy na temat mechanizmów nerwowych leżących u podstaw ruchu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Visualizing motor axon navigation and arborization in mouse embryos provides mechanistic insights into neurodevelopmental processes relevant to target validation in neurodegenerative disease models. Quantitative assessment of axon terminal patterns supports predictive confidence in evaluating genetic or pharmacological interventions affecting motor neuron connectivity. This approach enables early de-risking of therapeutic hypotheses by linking molecular perturbations to structural phenotypes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing motor axon trajectory defects in genetic mutants or disease models.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative analysis of axon arborization as a phenotypic readout.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by correlating molecular changes with neurodevelopmental outcomes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible 3D imaging data suitable for high-content screening of compound libraries.
- Quantitative Output: Provides filament number and terminal point measurements enabling dose-response analysis of axon growth inhibitors or enhancers.
- Scalability: Compatible with clearing and immunostaining workflows adaptable to multi-well embryo processing.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to motor neuron disease models (e.g., ALS, SMA) using Hb9::GFP reporter lines to assess axonal pathology.
- Translational Continuity: Bridges discovery phenotypes to preclinical validation by quantifying arborization deficits predictive of functional impairment.
- Biomarker Alignment: Axon terminal counts serve as quantifiable histopathological endpoints correlating with motor circuit integrity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing structural phenotyping downstream of target engagement and upstream of functional behavioral assays in motor neuron disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of axon guidance molecules via qualitative and quantitative arborization profiling.
- Screening: Enables assay standardization through consistent clearing, staining, and imaging parameters across genetic backgrounds.
- Analytics: Generates morphometric data (filament count, terminal points) for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural phenotypes to functional outcomes in preclinical models of motor neuron degeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for neurodevelopmental and neurodegeneration programs across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in motor neuron development studies through direct visualization of axon patterning.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized fixation, clearing, and imaging protocols applicable across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing structural validation of target modulation in neurodevelopmental pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on axon arborization profiles in disease-relevant embryonic systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection, immunostaining, and optical clearing techniques.
- Dependent on access to light sheet fluorescence microscopy and compatible image analysis software (e.g., Imaris).
- Necessitates standardization of antibody incubation and washing steps to minimize variability in GFP signal detection.
- Adaptation to alternative models may require optimization of clearing reagents and refractive index matching.
- Practical limitations include embryo size constraints and potential signal quenching during prolonged clearing or storage.
