Name: Wizualizacja nawigacji aksonów ruchowych i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji i kwantyfikacji arboryzacji aksonów neuronów ruchowych w zarodkach myszy Hb9::GFP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła. Technika umożliwia szczegółową analizę 3D rozwoju neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Eksperymenty LSFM i analiza danych zostały częściowo przeprowadzone przy użyciu zaawansowanych mikroskopów optycznych Division of Instrument Service w Academia Sinica i z pomocą Pani Shu-Chen Shen. Dziękujemy Pani Sue-Ping Lee z Imaging Core Facility IMB za znaczącą pomoc techniczną w analizie obrazu Imaris. Naukowy Rdzeń Edytorski Języka Angielskiego IMB zrecenzował manuskrypt. Praca ta jest finansowana przez Academia Sinica Career Development Award (CDA-107-L05), MoST (104-2311-B-001-030-MY3) i NHRI (NHRI-EX106-10315NC).

Wszystkie żywe zwierzęta były trzymane w obiekcie dla zwierząt wolnym od patogenów (SPF), zatwierdzonym i nadzorowanym przez IACUC Academia Sinica.
1. Fiksacja
<ol>
	<li>Zbierz zarodki z 12,5 dnia embrionalnego (E12,5), a następnie odetnij je i wypatrosz.</li>
	<li>Utrwal zarodki pojedynczo na 24-dołkowych płytkach z 1 ml / studzienkę świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu w 1x bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS) przez noc. Inkubować w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.</li>
	<li>Umyj utrwalone zarodki co najmniej 3 razy, każdy przez 5-10 minut, 1 ml 1x PBS i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce w celu usunięcia pozostałości paraformaldehydu.</li>
</ol>
2. Barwienie immunologiczne w całości
<ol>
	<li>Przepuszczalność każdego zarodka w 1 ml 0,5% PBS-Triton-X-100 (PBST) przez noc w temperaturze 4 °C na shakerze.</li>
	<li>Zablokować każdą próbkę 1 ml 10% FBS przygotowanej w 1x PBS przez noc w temperaturze 4 °C na shakerze.</li>
	<li>Inkubować zarodek z 1 ml pierwszorzędowego przeciwciała anty-GFP (rozcieńczenie 1:1 000 w 10% FBS) w temperaturze 4 °C przez 72 godziny z ciągłym wstrząsaniem w celu zintensyfikowania sygnału GFP nerwów ruchowych.</li>
	<li>Po inkubacji przeciwciał pierwotnych przemyć 1 ml 0,5% PBST przez 1-2 dni w temperaturze 4 °C na shakerze, zmieniając 0,5% PBST co najmniej trzy razy.</li>
	<li>Zastosować 1 ml przeciwciała drugorzędowego (rozcieńczenie 1:1 000 w 10% FBS) i inkubować przez noc w ciemności w temperaturze 4 °C, stale wstrząsając.</li>
	<li>Przemyć 3x 1 ml 0,5% PBST w temperaturze 4 °C na shakerze przez 2-3 dni. Próbki należy przechowywać w 1 PBS w temperaturze 4 °C do dnia poprzedzającego obrazowanie. 
	UWAGA: Zarodki można rozciąć na mniejsze segmenty przed oczyszczeniem, w zależności od tego, która część zarodków zostanie zobrazowana. Kończyny przednie są zachowane w tym eksperymentalnym podejściu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Inkubować zarodek w komercyjnym odczynniku czyszczącym o współczynniku załamania światła 1,49 nD w probówce o pojemności 1,5 ml, chronionym przed światłem w temperaturze pokojowej przez noc, aby zarodek stał się przezroczysty do obrazowania. 
	UWAGA: Objętość odczynnika czyszczącego jest około pięciokrotnie większa niż objętość próbki.</li>
</ol>
3. LSFM (2–3 godziny)
<ol>
	<li>Przykładowa konfiguracja
	<ol>
		<li>Ustaw optykę 5X/0,1 oświetlenia i optykę detekcji 5X/0,16. Zmontuj uchwyt na próbkę i kapilar próbki (średnica wewnętrzna 1,5 mm, kolor zielony) i umieść je w mikroskopie. 
		UWAGA: Zapoznaj się z instrukcją obsługi mikroskopu, aby uzyskać szczegółowe procedury konfiguracji.</li>
		<li>Zamontuj zarodek w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Przygotować końcówkę pipety P200, odcinając górną część tak, aby pasowała do średnicy kapilary i usunąć spiczastą część (~ 3 mm) na nasadkę próbki.</li>
			<li>Rozpuść stępiony koniec końcówki pipety za pomocą małego płomienia.</li>
			<li>Zgaś płomień i szybko przymocuj zarodek pionowo do stopionego końca.</li>
			<li>Dopasuj górną część końcówki pipety do kapilary próbki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pozwól, aby bufor komory zrównoważył się z zarodkiem przez 1 minutę, aby usunąć zanieczyszczenia lub pęcherzyki.</li>
		<li>Korzystając z oprogramowania do obrazowania, wybierz opcję Zlokalizuj kapilarnę na karcie Lokalizacja i dostosuj osie x, y, z, aby ustawić kapilarnę próbki.</li>
		<li>Wybierz opcję Zlokalizuj próbkę i powiększ do 0,6x, aby ustawić ostrość na zarodku. Obróć zarodek, aby upewnić się, że długa oś obrazowanej kończyny pokrywa się z torem światła dwóch źródeł światła (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja obrazu
	<ol>
		<li>Na karcie Akwizycja zdefiniuj parametry ścieżki światła, takie jak cele detekcji, filtr blokujący laser, rozdzielacz wiązki, kamery i lasery. 
		UWAGA: W tym eksperymencie używany jest kanał GFP (długość fali wzbudzenia: 488 nm; filtr emisyjny: BP 505 do 545 nm, rozdzielacz wiązki: SPS LP 560).</li>
		<li>Zaznacz pole wyboru skanowania w pozycji pivot, aby zmniejszyć cień.</li>
		<li>Zdefiniuj ustawienia akwizycji: głębia bitowa, 16 bitów, zoom, 0,36-0,7x, podświetlenie jednostronne (lewy/prawe) lub oświetlenie dwustronne.</li>
		<li>Kliknij opcję Ciągły i ustaw intensywność lasera, czas ekspozycji, moc lasera i pozycję arkusza świetlnego, aby uzyskać ostrzejsze obrazy. 
		UWAGA: Moc lasera jest utrzymywana na jak najniższym poziomie, aby zminimalizować fotouszkodzenia.</li>
		<li>Naciśnij przycisk STOP, aby zakończyć pobieranie obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja wielowymiarowa
	<ol>
		<li>Zdefiniuj stos osi Z, przesuwając pozycję Z dla pierwszego i ostatniego obrazu. Kliknij Optymalny, aby ustawić numer wycinka.</li>
		<li>Kliknij przycisk Rozpocznij eksperyment, aby pobrać wybrany stos z.</li>
		<li>Po zakończeniu zapisz obraz w formacie .czi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzanie obrazu (opcjonalnie)
	<ol>
		<li>Kontynuuj łączenie dwustronne w kanale przetwarzania Lightsheet, jeśli stosowane jest oświetlenie dwustronne. Przetwarzanie wielu widoków jest konieczne, jeśli multiwidoki są uzyskiwane w celu łączenia obrazów pod różnymi kątami.</li>
		<li>Utwórz obraz 2D, korzystając z danych z pikseli o największej intensywności wzdłuż osi projekcji w kanale projekcji maksymalnej intensywności.</li>
		<li>W obszarze Kopiuj kanał kliknij opcję Podzestaw, aby wybrać podzbiory obrazów z oryginalnego zestawu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja arboryzacji aksonów (30 minut dla każdego pojedynczego nerwu)
<ol>
	<li>Otwórz plik obrazu w oprogramowaniu do analizy obrazowania (domyślnie obraz zawierający dane XYZ jest otwierany w trybie Surpass i jako widok renderowany w 3D).</li>
	<li>Dostosuj kolor, jasność i kontrast obrazu za pomocą okna Korekta ekranu (Edycja | Pokaż regulację wyświetlacza), aby wykrywać filamenty na podstawie lokalnego kontrastu intensywności.</li>
	<li>Kliknij ikonę Dodaj nowe filamenty i wybierz algorytm Autopath (bez pętli) z menu rozwijanego.</li>
	<li>Wybierz obszar zainteresowania (w tym przypadku akson segmentacji zainteresowania). Po zakończeniu kliknij przycisk Dalej.</li>
	<li>Zdefiniuj punkty początkowe i początkowe, przypisując największe i najcieńsze wymiary średnicy, które można zmierzyć w trybie Slice.</li>
	<li>Przypisz punkt początkowy na krawędzi obszaru zainteresowania. Aby ręcznie dodać lub usunąć punkty początkowe, najpierw zmień tryb wskaźnika (Nawigacja | Wybierz), a następnie Shift + kliknij prawym przyciskiem myszy w interesujących miejscach.</li>
	<li>Wybierz ręczne progi dla punktów wysiewu, aby upewnić się, że cała widoczna arboryzacja jest zaznaczona. Zmienianie trybu wskaźnika (Nawigacja | Wybierz), a następnie Shift + kliknij lewym przyciskiem myszy w interesujących miejscach, aby ręcznie dodać lub usunąć punkty początkowe. 
	UWAGA: Ważne jest, aby ręcznie usunąć szumy tła i sygnały z sąsiednich nerwów.</li>
	<li>Zaznacz pole Usuń punkty początkowe wokół punktów początkowych.</li>
	<li>Zaznacz opcję Usuń rozłączone segmenty, aby zezwolić na wykluczanie punktów, które znajdują się zbyt daleko i mogą reprezentować szum tła. W następnym kroku wskaż maksymalną długość przerwy, aby zdefiniować górną granicę wykluczenia.</li>
	<li>Dostosuj próg odejmowania tła, który wykorzystuje filtr Gaussa do oszacowania intensywności tła każdego woksela.</li>
	<li>Ustaw automatyczny próg średnicy dendrytu za pomocą algorytmu Przybliżona powierzchnia przekroju.</li>
	<li>Pomiń kroki obliczania kręgosłupa.</li>
	<li>Zakończ proces i wybierz żądany styl i kolor.</li>
	<li>Usuń zaznaczenie pola głośności w obszarze Właściwości, aby wyświetlić tylko zrekonstruowane aksony.</li>
	<li>Na karcie Statystyki wybierz opcję Szczegółowe. Użyj numeru filamentu. Dendrytowe punkty końcowe do ilościowego określenia zakończeń nerwów ruchowych jako wskaźnika arboryzacji aksonów ruchowych. 
	UWAGA: W razie potrzeby można dodać adnotację statystyczną.</li>
	<li>Wyeksportuj obraz zrekonstruowanego aksonu jako plik .tif.</li>
</ol>

<ol><li>Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24449832">How to make spinal motor neurons.</a> Development. 141, 491-501 (2014).</li>
<li>Stifani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurons+and+the+generation+of+spinal+motor+neuron+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity.</a> Front Cell Neurosci. 8, 293(2014).</li>
<li>Kania, A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+motor+projections+in+the+limb+imposed+by+LIM+homeodomain+protein+regulation+of+ephrin-A%3AEphA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions.</a> Neuron. 38, 581-596 (2003).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETS+gene+Pea3+controls+the+central+position+and+terminal+arborization+of+specific+motor+neuron+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools.</a> Neuron. 35, 877-892 (2002).</li>
<li>Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+diversity+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor neuron diversity in development and disease.</a> Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).</li>
<li>Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+Nerve+Arborization+Requires+Proteolytic+Domain+of+Damage-Induced+Neuronal+Endopeptidase+%28DINE%29+during+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development.</a> J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).</li>
<li>Nagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECEL1+mutation+implicates+impaired+axonal+arborization+of+motor+nerves+in+the+pathogenesis+of+distal+arthrogryposis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis.</a> Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).</li>
<li>Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hox+Proteins+Coordinate+Motor+Neuron+Differentiation+and+Connectivity+Programs+through+Ret%2FGfralpha+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes.</a> Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).</li>
<li>Bonanomi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ret+is+a+multifunctional+coreceptor+that+integrates+diffusible-+and+contact-axon+guidance+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals.</a> Cell. 148, 568-582 (2012).</li>
<li>Tung, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mir-17+approximately+92+Governs+Motor+Neuron+Subtype+Survival+by+Mediating+Nuclear+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN.</a> Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Tech%22%5BJournal%5D)">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).</li>
<li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nat Methods. 12, 30-34 (2015).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).</li>
<li>Hanley, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+Pbx-Dependent+Pathways+Govern+the+Coalescence+and+Fate+of+Motor+Columns%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns.</a> Neuron. 91, 1005-1020 (2016).</li>
<li>De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+motor+neuron+pool+identity+and+muscle+nerve+trajectory+defined+by+postmitotic+restrictions+in+Nkx6.1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity.</a> Neuron. 57, 217-231 (2008).</li>
<li>Li, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+filters+Hox+temporal+transcription+noise+to+confer+boundary+formation+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord.</a> Nat Commun. 8, 14685(2017).</li>
<li>Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet-based+fluorescence+microscopy+for+three-dimensional+imaging+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).</li>
<li>Pantazis, P., Supatto, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+whole-embryo+imaging%3A+a+quantitative+transition+is+underway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).</li>
<li>Reynaud, E. G., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+report%3A+first+light+sheet+based+fluorescence+microscopy+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop.</a> Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niektóre etapy protokołu mogą ulec zmianie w pewnych okolicznościach. Na przykład czas utrwalenia zależy od wieku zarodków i wynosi od 2 godzin do 1 lub więcej dni przy użyciu świeżo wytworzonego paraformaldehydu. Ponieważ utrwalanie przeprowadza się przed barwieniem immunologicznym całej góry, w przypadku przeciwciał, które są wrażliwe na sieciowanie białek, metanol może być stosowany jako alternatywny środek utrwalający. Aby uzyskać wysoki stosunek sygnału do szumu po barwieniu, konieczne jest zoptymalizowanie stężenia...

Rdzeniowe MN są częścią ośrodkowego układu nerwowego, ale unerwiają mięśnie obwodowe, aby kontrolować ruch. W rozwijającym się rdzeniu kręgowym komórki progenitorowe MN (pMN) są ustalane zgodnie z sygnałami emanującymi ze struny grzbietowej i sąsiednich somitów. Wszystkie zróżnicowane postmitotyczne MN są następnie generowane z pMN, ostatecznie dając początek serii podtypów MN wzdłuż osi rostrocaudalnej rdzenia kręgowego1,2. Rdzeniowe MN są dobrze zorganizowane topograficznie i anatomicznie. Ich układ morfologiczny koreluje z pozycją odpowiedniego celu na peryferiach3. Po dotarciu do docelowych mięśni aksony otrzymują komórkowe i egzogenne czynniki neurotroficzne, które skłaniają je do rozciągania się i rozgałęziania w głąb mięśni. Wady unerwienia i rozgałęzień mogą przyczyniać się do zaniku tworzenia połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ). Na przykład Pea3 indukowany przez czynniki neurotroficzne pochodzenia glejowego (GDNF) jest niezbędny do arboryzacji aksonów w mięśnie skórne maksymalne (CM) i najszersze grzbietu (LD)4,5. Ponadto zarodki myszy z nokautem DINE wykazują wadliwą arboryzację nerwów przeponowych w przeponie, powodując niewydolność oddechową i śmiertelność natychmiast po urodzeniu6,7. Dlatego ten ostatni etap dojrzewania MN (tj. projekcja aksonalna i rozgałęzianie) ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia komunikacji między neuronami a komórkami docelowymi.
Aby wyświetlić wzorce arboryzacji, badacze zwykle przeprowadzają obrazowanie konfokalne lub mikroskopię fluorescencyjną dwufotonową próbek podzielonych na sekcje lub w całości zamontowanych8,9,10. Obie te techniki mikroskopowe generują akceptowalną rozdzielczość i penetrację głębokości. Mikroskopia światła fluorescencji dwufotonowej polega na wzbudzeniu fluoroforów poprzez jednoczesną absorpcję dwóch fotonów o niższej energii11. Ponieważ wzbudzenie dwufotonowe wykorzystuje promieniowanie bliskiej podczerwieni, zmniejszona częstotliwość wzbudzenia przyczynia się do zmniejszenia rozpraszania i lepszej penetracji tkanek do 1 mm w tkance, umożliwiając w ten sposób obrazowanie z większą głębokością. Mikroskopia konfokalna usuwa za pomocą filtrów nieostre sygnały i zbiera światło tylko w płaszczyźnie ogniskowej12. Dzięki takiemu podejściu obrazy próbek z różnych płaszczyzn ogniskowych można łączyć w celu uzyskania trójwymiarowego (3D) obrazu za pomocą funkcji Z-stack. Niemniej jednak intensywność sygnału jest zmniejszona, ponieważ większość światła jest blokowana, a duże apertury numeryczne przesłaniają głębię ostrości. Co ważniejsze, obie techniki przyczyniają się do poważnych uszkodzeń fotologicznych i fototoksyczności, ponieważ cała próbka jest oświetlona nawet wtedy, gdy w danym momencie obrazowana jest tylko jedna płaszczyzna.
Aby obejść te niedociągnięcia, LSFM stał się preferowaną alternatywą, z zaletami szybkości, wydajności światła i mniej fototoksyczności13,14. Ponadto LSFM umożliwia obrazowanie w wielu widokach. Podejście to jest szczególnie przydatne do wizualizacji aksonów motorycznych i ich końcówek rozpraszających się w miarę rozprzestrzeniania się w przestrzeni 3D. LSFM przewyższa pozostałe dwie opcje, ponieważ próbki są montowane na stoliku, który umożliwia obrót wokół osi pionowej i ruchy wzdłuż osi x, y i z. Taka konfiguracja pozwala nie tylko na minimalnie zablokowany widok próbki, ale także na wybór pożądanej ścieżki oświetlenia, co jest wadą mikroskopii dwufotonowej i konfokalnej, które wymagają montażu próbek na płaskim szkiełku. Dlatego LSFM jest najbardziej odpowiednim narzędziem do obrazowania 3D arboryzacji aksonów i do ilościowego oznaczania zakończeń nerwów ruchowych w zarodkach myszy.

<table><tbody><tr><td>Hb9::GFP</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>005029</td><td>Zbierz zarodki z dnia embrionalnego 12,5 (E12,5)</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehydu (PFA)</td><td></td><td></td><td>Na 200 ml: Dodaj 20 ml 10X PBS, 8 g PFA w ddH2O. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH (10N). Filtrować, sterylizować i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy soli fizjologicznej 10X (PBS 10X)</td><td></td><td></td><td>Dla 1L: Dodaj 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4 i uzupełnij ddH2O. Autoklaw i przechowywanie w RT.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>ThermoFisher</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Owca poliklonalny anty-GFP</td><td>AbD Serotec</td><td>4745-1051</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 osioł anty-owca</td><td>Invitrogen</td><td>A-11015</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Odczynnik czyszczący RapiClear 1.49</td><td>SunJin Lab</td><td>RC149001</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml micro rurka</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td>ThermoFisher</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>5 SA Pęseta</td><td>ideal-tek</td><td>3480641</td><td></td></tr><tr><td>Iris Nożyczki striaght ostre/ostre</td><td>Aesculap</td><td>BC110R</td><td></td></tr><tr><td>Mikrochirurgia Skalpele, jednorazowe</td><td>Aesculap</td><td>BA365</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka</td><td>TKS</td><td>RS-01</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Lightsheet Z.1</td> Mikroskopia <td></td><td></td><td>Carl Zeiss</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu Imaris 8.4.0</td><td>Bitplane, Zurych, Szwajcaria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP myszy)</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>005029</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja nawigacji aksonów ruchowych i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Rdzeniowe neurony ruchowe (MN) rozszerzają swoje aksony, aby komunikować się ze swoimi unerwionymi celami, kontrolując w ten sposób ruch i złożone zadania u kręgowców. Dlatego tak ważne jest odkrycie mechanizmów molekularnych tego, w jaki sposób aksony motoryczne poruszają się, arboryzują i unerwiają swoje cele mięśni obwodowych podczas rozwoju i zwyrodnienia. Chociaż transgeniczne linie myszy Hb9::GFP od dawna służą do wizualizacji trajektorii aksonów ruchowych podczas rozwoju embrionalnego, szczegółowe opisy pełnego spektrum arboryzacji końcowej aksonów pozostają niekompletne ze względu na złożoność wzoru i ograniczenia obecnej mikroskopii optycznej. W tym miejscu opisujemy ulepszony protokół, który łączy mikroskopię fluorescencyjną z arkuszami świetlnymi (LSFM) i solidną analizę obrazu, aby jakościowo i ilościowo wizualizować rozwijające się aksony motoryczne. System ten może być łatwo zaadaptowany do krzyżowania mutantów genetycznych lub modeli choroby MN z liniami Hb9::GFP, ujawniając nowe mechanizmy molekularne, które prowadzą do defektów w nawigacji i arboryzacji aksonów motorycznych.

LSFM zapewnia szczegółową wizualizację 3D trajektorii MN oraz arboryzacji aksonów w embrionach myszy. W świetle przechodzącym tkanki wydają się całkowicie przezroczyste po zanurzeniu w komercyjnym odczynniku do przejrzyszczania. Po maksymalnie jednym tygodniu przechowywania próbki w odczynniku do przejrzyszczania przed obrazowaniem nie zauważono kurczenia się ani obrzęku próbki. W kanale fluorescencji neurony ruchowe są oznakowane transgenicznie wyrażanym białkiem GFP (Movie 1</st...

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji projekcji neuronów ruchowych i arboryzacji aksonów w transgenicznych zarodkach myszy Hb9::GFP. Po barwieniu immunologicznym neuronów ruchowych użyliśmy mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego do obrazowania zarodków do późniejszej analizy ilościowej. Protokół ten ma zastosowanie do innych procesów nawigacji neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym.

Wizualizacja nawigacji aksonów ruchowych i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Ogólnym celem tego protokołu jest umożliwienie jakościowej i ilościowej oceny wzorców arboryzacji aksonów neuronów ruchowych przy użyciu mikroskopu świetlnego i oprogramowania do analizy obrazu na zarodkach myszy. Metoda ta może pomóc w zrozumieniu rozwoju neuronów ruchowych w koordynacji ze złożonym ruchem. Główną zaletą tej techniki jest to, że można obserwować i obrazować wzorce arboryzacji aksonów neuronów ruchowych pod różnymi kątami oraz analizować ilościowo każdy pojedynczy nerw.Procedurę zademonstrują Ya-Ping Yen i Ee Shan Liau, dwaj doktoranci z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść zarodki pojedynczo na 24-dołkowej płytce z jednym mililitrem świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu w PBS na studzienkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce przez noc. Następnego dnia umyj utrwalone zarodki co najmniej trzy razy, każdy przez pięć do 10 minut, jednym mililitrem 1X PBS i inkubuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie przesusz każdy zarodek w jednym mililitrze 0,5% PBST przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na shakerze. Zablokuj każdą próbkę jednym mililitrem 10% FBS przygotowanym w 1X PBS przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza na shakerze. Następnie inkubuj każdy zarodek z jednym mililitrem pierwszorzędowego przeciwciała anty-GFP w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 72 godziny przy ciągłym wstrząsaniu.Po inkubacji przeciwciał pierwotnych umyj każdy zarodek jednym mililitrem 0,5% PBST w ciągu jednego do dwóch dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza na shakerze. Następnie nałóż jeden mililitr przeciwciała drugorzędowego i inkubuj przez noc w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu. Następnego dnia umyj każdy zarodek jednym mililitrem 0,5% PBST co najmniej trzy razy w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce w ciągu dwóch do trzech dni.Następnie inkubuj każdy zarodek w komercyjnym odczynniku czyszczącym o współczynniku załamania światła 1,49 nd w 1,5 mililitrowej probówce chronionej przed światłem w temperaturze pokojowej przez noc. Ustaw optykę 5X/0,1 oświetlenia i optykę detekcji 5X/0,16. Zamontować uchwyt na próbkę i kapilarę próbki.Przygotować komorę na próbkę, wypełniając ją roztworem czyszczącym. Aby zamontować zarodek, przygotuj końcówkę pipety P200, odcinając górną część tak, aby pasowała do średnicy naczynia włosowatego i usuń spiczastą część do mocowania próbki. Następnie rozpuść stępiony koniec końcówki pipety za pomocą małego płomienia.Zgaś płomień i szybko przymocuj zarodek pionowo do stopionego końca. Dopasuj górną część końcówki pipety do kapilary próbki i włóż przygotowaną komorę na próbkę do mikroskopu. Korzystając z oprogramowania do obrazowania, wybierz opcję Zlokalizuj kapilarnę na karcie Lokalizacja i dostosuj osie X, Y i Z.Następnie wybierz opcję Zlokalizuj próbkę i powiększ do 0,6x, aby ustawić ostrość na zarodku. Pozwól, aby bufor komory zrównoważył się z zarodkiem przez jakiś czas, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia lub pęcherzyki. W celu uzyskania obrazu na karcie Akwizycja zdefiniuj parametry ścieżki światła, takie jak Cele detektywistyczne, Filtr blokujący laser, Rozdzielacz wiązki, Kamery i Lasery.Zaznacz pole wyboru Pivot Scan (Skanowanie przestawne), aby uzyskać informacje o redukcji cieni. Następnie zdefiniuj ustawienia akwizycji, od Bit Bepth do 16-bit, Zoom do zakresu od 0,36 do 0,7X, oświetlenie pojedyncze lub oświetlenie dwukierunkowe. Kliknij opcję Ciągły i ustaw intensywność lasera, czas ekspozycji, moc lasera i pozycję arkusza świetlnego.Następnie naciśnij Stop, aby zakończyć pobieranie obrazu. Ważne jest, aby upewnić się, że przezroczysta próbka jest umieszczona w najkrótszej ścieżce światła, aby umożliwić szczegółowe uzyskanie obrazów drobnych struktur arboryzowanych na poszczególnych nerwach ruchowych. W przypadku akwizycji wielowymiarowej zdefiniuj stos Z, przesuwając pozycję Z dla pierwszego i ostatniego obrazu.Kliknij Optymalny, aby ustawić numer wycinka. Następnie kliknij przycisk Rozpocznij eksperyment, aby uzyskać wybrany stos Z. Po zakończeniu zapisz obraz w formacie czi.Aby określić ilościowo arboryzację aksonów, otwórz plik obrazu w oprogramowaniu do analizy obrazowania. Dostosuj kolor, jasność i kontrast obrazu za pomocą okna Korekta ekranu, aby wykrywać filamenty na podstawie lokalnego kontrastu intensywności. Następnie kliknij ikonę Dodaj nowe filamenty i wybierz algorytm Autopath z menu rozwijanego.Wybierz obszar zainteresowania, a następnie zdefiniuj punkt początkowy i początkowy, przypisując pomiary największej i najcieńszej średnicy, które można zmierzyć w trybie Slice. Przypisz punkt początkowy na krawędzi obszaru zainteresowania. Aby ręcznie dodać lub usunąć punkty początkowe, najpierw zmień tryb wskaźnika, przejdź do wyboru, a następnie przesuń Shift i kliknij prawym przyciskiem myszy w punktach zainteresowania.Następnie wybierz ręczne progi dla punktów siewu, aby upewnić się, że cała widoczna arboryzacja jest zaznaczona. Następnie ręcznie dodaj lub usuń punkty początkowe. Zaznacz pole Usuń rozłączone segmenty i usuń punkty początkowe wokół punktów początkowych.Następnie dostosuj próg odejmowania tła i zakończ proces. Konieczne jest usunięcie artefaktów tła i potwierdzenie, że ścieżka detektora odzwierciedla prawdziwą arboryzację aksonów w celu dokładnej kwantyfikacji. Na koniec wybierz żądany styl i kolor.Na karcie Statystyki wybierz opcję Szczegółowe i użyj numeru filamentu, punktów końcowych dendrytów, aby określić ilościowo zakończenia nerwów ruchowych jako wskaźnik arboryzacji aksonów ruchowych. Następnie wyeksportuj obraz zrekonstruowanego aksonu jako plik TIFF. LSFM zapewnia szczegółową wizualizację 3D arboryzacji aksonów ruchowych w zarodkach myszy.Neurony ruchowe są poddawane opisanemu powyżej protokołowi i znakowane transgenicznie ekspresyjnym GFP. Aby bardziej szczegółowo zobrazować arboryzację aksonów i przeprowadzić kwantyfikację, powiększenie można dostosować tak, aby można było ujawnić każdą drobno zaryzowaną strukturę. Wreszcie, wzorzec arboryzacji aksonów poszczególnych nerwów kończyn przednich można zrekonstruować za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.Algorytm autopath w oprogramowaniu śledzi filament i określa ilościowo całkowitą liczbę końców aksonów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować próbki i zobrazować aksony neuronów ruchowych zarodków myszy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z arkuszem światła. Będziesz także wiedział, jak ilościowo ocenić wzorzec arboryzacji każdego pojedynczego nerwu ruchowego za pomocą MRS.

visualization-motor-axon-navigation-quantification-axon-arborization

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół opisuje obrazowanie poszczególnych neuronów lub komórek grzebienia neuronalnego w żywych embrionach danio pruzebrzuchego. Metoda ta jest wykorzystywana do badania zachowań komórkowych oraz lokalizacji aktyny przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse.

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego

Ten film demonstruje metodę śledzenia transportu aksonalnego w neuronach ruchowych za pomocą systemu komór mikroprzepływowych. Polega na hodowli tkanek embrionalnych rdzenia kręgowego myszy w studzienkach pokrytych polimerem z pożywką w celu wywołania wzrostu aksonów. Ruch organelli barwionych barwnikiem fluorescencyjnym w obrazowaniu na żywo potwierdza dwukierunkowy transport aksonalny.

Śledzenie transportu aksonalnego organelli w neuronach ruchowych za pomocą urządzenia mikroprzepływowego

Source: &lt; style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/57546/visualization-of-motor-axon-navigation-and-quantification-of-axon-arborization-in-mouse-embryos-using-light-sheet-fluorescence-microscopy'&gt;Liau, E. S. et al. Wizualizacja motorycznej nawigacji aksonów i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą lekkiej mikroskopii fluorescencyjnej. J. Vis. Exp. (2018). Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii...

Wizualizacja projekcji neuronów ruchowych i rozgałęzień aksonów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego

Źródło: Boyer, N. P. et. al., Obrazowanie i analiza transportu neurofilamentów w wyciętym nerwie piszczelowym myszy. J. Vis. exp. (2020) Ten film przedstawia metodę fotoaktywacji fluorescencji do analizy transport neurofilamentów w mielinowanych aksonach nerwów obwodowych. Śledząc fotoaktywowane zielone neurofilamenty znakowane fluoroforem, technika ta dostarcza informacji na temat transportu aksonalnego w chorobach neurodegeneracyjnych.

Obrazowanie fotoaktywacji fluorescencyjnej transportu neurofilamentów w mielinizowanych aksonach myszy 

Źródło: Jeong, S. Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje wizualizację projekcji aksonalnych w zarodkach Drosophila. Znakowanie immunologiczne neuronów ruchowych, precyzyjna sekcja w celu odsłonięcia struktur neuronalnych oraz mikroskopia kontrastowa z różnicową interferencją łącznie ujawniają szczegółową architekturę neuronów, podkreślając wzorce projekcji aksonalnej.

Wizualizacja wzorców projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Prezentujemy tutaj zoptymalizowany protokół genotypu, barwienia i przygotowania płodów myszy do obrazowania obwodowych projekcji aksonów nocyceptora u całego zwierzęcia, jako skuteczną metodę oceny fenotypów wzrostu aksonów czuciowych u genetycznie modyfikowanych myszy.

Obrazowanie w całości projekcji czuciowych aksonów zarodków myszy

Techniki mikroskopii świetlnej w połączeniu z testami biochemicznymi wyjaśniają udział egzocytozy za pośrednictwem SNARE w zależnym od netryny rozgałęzianiu aksonów. Ta kombinacja technik pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych kontrolujących rozgałęzianie się aksonów i zmianę kształtu komórki.

Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów

Ta praca opisuje standardową metodę immunohistochemiczną do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych zarodków Drosophila melanogaster w późnym stadium 16. Wyfiletowany preparat utrwalonych zarodków wybarwionych przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do scharakteryzowania genów wymaganych do znajdowania ścieżki aksonów ruchowych i rozpoznawania celów podczas rozwoju neuronalnego.

Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak mikrowstrzykiwać mieszaninę DNA/DOTAP do pąków ocznych jednodniowych zarodków Xenopus laevis, oraz jak obrazować i rekonstruować indywidualne zielone białko fluorescencyjne (GFP) wyrażające aksonalne trzpienie wzrokowe w tektalnych śródmózgowiu nienaruszonych, żyjących kijanek Xenopus.

Mikroiniekcja DNA do zawiązków ocznych w zarodkach Xenopus laevis i obrazowanie GFP wyrażającego altanki aksonalne wzrokowe w nienaruszonych, żywych kijankach Xenopus

Tutaj prezentujemy metodę badania morfogenezy neurytów w pourodzeniowych eksplantatach siatkówki myszy za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Opisujemy podejście do rzadkiego znakowania i pozyskiwania typów komórek siatkówki i ich drobnych procesów przy użyciu rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adeno, które wyrażają białka fluorescencyjne ukierunkowane na błonę w sposób zależny od Cre.

Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Poznaj metodę wizualizacji i kwantyfikacji arboryzacji aksonów neuronów ruchowych w zarodkach myszy Hb9::GFP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła. Technika umożliwia szczegółową analizę 3D rozwoju neuronów.

Wizualizacja nawigacji aksonów ruchowych i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja nawigacji aksonów ruchowych i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Przeglądaj więcej filmów