Wizualizacja projekcji neuronów ruchowych i rozgałęzień aksonów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego

Weźmy chemicznie utrwalony i oczyszczony segment tkanki z transgenicznego zarodka myszy wykazującego ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) w neuronach ruchowych rdzenia.

Zamontuj chusteczkę pionowo na zmodyfikowanej końcówce pipety.

Przymocuj końcówkę do kapilary zabezpieczonej w mikroskopie fluorescencyjnym z arkuszem światła.

Umieść wypełnioną buforem komorę na próbkę pod tkanką, aby ją zanurzyć i usunąć zanieczyszczenia.

Za pomocą oprogramowania do obrazowania wyrównaj tkankę na ścieżce światła.

Rozpocznij akwizycję obrazu.

Źródło światła emituje cienką warstwę światła laserowego, wzbudzając GFP w jednej płaszczyźnie tkanki, emitując fluorescencję.

Detektor umieszczony prostopadle do ścieżki światła wychwytuje emitowaną fluorescencję.

Uzyskaj obrazy neuronów ruchowych rdzenia, aby wygenerować rekonstrukcję 3D morfologii rozgałęzień aksonalnych.

Używaj oprogramowania do mapowania aksonów, identyfikowania wzorców rozgałęzień i punktów końcowych w celu oceny wzrostu neuronów ruchowych i łączności.

Ustaw optykę 5X/0,1 oświetlenia i optykę detekcji 5X/0,16. Zamontować uchwyt na próbkę i kapilarę próbki. Przygotować komorę na próbkę, wypełniając ją roztworem czyszczącym. Aby zamontować zarodek, przygotuj końcówkę pipety P200, odcinając górną część tak, aby pasowała do średnicy naczynia włosowatego, i usuń spiczastą część do mocowania próbki.

Następnie rozpuść stępiony koniec końcówki pipety za pomocą małego płomienia. Zgaś płomień i szybko przymocuj zarodek pionowo do stopionego końca. Dopasuj górną część końcówki pipety do kapilary próbki i włóż przygotowaną komorę na próbkę do mikroskopu. Korzystając z oprogramowania do obrazowania, wybierz opcję Zlokalizuj kapilarnę na karcie Lokalizacja i dostosuj osie xy i z.

Następnie wybierz opcję Zlokalizuj próbkę i powiększ do 0,6x, aby ustawić ostrość na zarodku. Pozwól, aby bufor komory zrównoważył się z zarodkiem przez jakiś czas, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia lub pęcherzyki. W celu akwizycji obrazu na karcie Akwizycja zdefiniuj parametry ścieżki światła, takie jak cele detekcji, filtr blokujący laser, rozdzielacz wiązki, kamery i lasery.

Zaznacz pole wyboru skanowania w pozycji pivot, aby zmniejszyć cień. Następnie zdefiniuj ustawienia akwizycji, głębię bitową na 16 bitów. Powiększ do zakresu od 0,36 do 0,7X w przypadku oświetlenia jednostronnego lub dwustronnego. Kliknij opcję Ciągły i ustaw intensywność lasera, czas ekspozycji, moc lasera i pozycję arkusza świetlnego. Następnie naciśnij stop, aby zakończyć akwizycję obrazu.

Ważne jest, aby upewnić się, że przezroczysta próbka jest umieszczona w najkrótszej ścieżce światła, aby umożliwić szczegółowe uzyskanie obrazów drobnych pionowych struktur na poszczególnych nerwach ruchowych.

W przypadku akwizycji wielowymiarowej zdefiniuj stos Z, przesuwając pozycję Z dla pierwszego i ostatniego obrazu. Kliknij Optymalny, aby ustawić numer wycinka. Następnie kliknij przycisk Rozpocznij eksperyment, aby uzyskać wybrany stos Z. Po zakończeniu zapisz obraz w formacie kropki CZI.

Aby określić ilościowo arboryzację aksonów, otwórz plik obrazu w oprogramowaniu do analizy obrazowania. Dostosuj kolor, jasność i kontrast obrazu za pomocą okna regulacji wyświetlacza, aby wykryć włókna na podstawie lokalnego kontrastu intensywności. Następnie kliknij ikonę Dodaj nowe filamenty i wybierz algorytm automatycznej ścieżki z menu rozwijanego. Wybierz interesujący Cię region.

Następnie zdefiniuj punkty początkowe i początkowe, przypisując największe i najcieńsze wymiary średnicy, które można zmierzyć w trybie przekroju. Przypisz punkt początkowy na krawędzi obszaru zainteresowania. Aby ręcznie dodać lub usunąć punkty początkowe, najpierw zmień tryb wskaźnika, wybierz polecenie Nawiguj po zaznaczonym, a następnie naciśnij Shift i kliknij prawym przyciskiem myszy interesujące punkty.

Następnie wybierz opcję Ręczne progi dla punktów początkowych, aby upewnić się, że cała widoczna arboryzacja jest zaznaczona. Następnie ręcznie dodaj lub usuń punkty początkowe. Zaznacz pole Usuń rozłączone segmenty i usuń punkty początkowe wokół punktów początkowych. Następnie dostosuj próg odejmowania tła i zakończ proces.

Konieczne jest usunięcie artefaktów tła i potwierdzenie, że ścieżka detektora odzwierciedla prawdziwą arboryzację aksonów w celu dokładnej kwantyfikacji.

Na koniec wybierz żądany styl i kolor. Na karcie Statystyka wybierz szczegółowe i użyj punktów końcowych dendrytów o numerze włókien, aby określić ilościowo zakończenia nerwów ruchowych jako wskaźnik arboryzacji aksonów ruchowych. Następnie wyeksportuj obraz zrekonstruowanego aksonu jako plik . Plik TIFF.