Name: Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Poznaj metodę rzadkiego znakowania neuronów siatkówki myszy wirusem AAV zależnym od rekombinazy Cre. Protokół umożliwia wysokorozdzielcze, poklatkowe obrazowanie dynamicznego rozwoju dendrytów w eksplantatach siatkówki z minimalną inwazyjnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Madison Gray za pomocną mi rękę, kiedy jej nie miałem. Badania te były wspierane przez NSERC Discovery Grant (RGPIN-2016-06128), stypendium Sloan Fellowship w dziedzinie neuronauki oraz Canada Research Chair Tier 2 (dla J.L.L.). S. Ing-Esteves był wspierany przez Vision Science Research Program i NSERC Postgraduate Scholarships-Doctoral.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ten film przedstawia eksperymentalny potok, który wykorzystuje istniejące narzędzia genetyczne do obrazowania dynamiki dendrytów rozwijających się neuronów siatkówki za pomocą konfokalnego obrazowania na żywo. Zademonstrowano również wstrzyknięcia do gałki ocznej zależnych od Cre AAV kodujących białka fluorescencyjne ukierunkowane na błonę u nowonarodzonych myszy. Pojedyncze komórki w populacjach genetycznie celowanych są znakowane już od 4 do 5 dpi. Płaskie mocowania siatkówki przygotowano dla standardowych komór obrazo...

Dendryty neuronów siatkówki tworzą skomplikowane, ale specyficzne wzory, które wpływają na ich funkcjonowanie w obwodach neuronalnych. W siatkówce kręgowców różne typy komórek zwojowych siatkówki (RGC) i interneurony komórek amakrynowych mają unikalną morfologię dendrytyczną, która różni się wielkością trzpienia, lokalizacją, długością gałęzi i gęstością1. Podczas rozwoju pourodzeniowego RGC i komórki amakrynowe rozszerzają wybujałe procesy dendrytyczne do neuropilu zwanego wewnętrzną warstwą splotowatą (IPL), gdzie odbierają dwubiegunowe sygnały komórkowe przekazujące sygnały fotoreceptorów2. Jak uchwycono za pomocą obrazowania poklatkowego fluorescencyjnie znakowanych populacji siatkówki u larw piskląt lub danio pręgowanego, morfogeneza dendrytów jest bardzo dynamiczna3,4,5. W ciągu kilku dni altany dendrytyczne rozszerzają się, przebudowują i rozgałęziają do wąskich podwarstw IPL, gdzie synapsują się z wybranymi partnerami. Altany wykazują różną dynamikę strukturalną w trakcie rozwoju, ze zmianami we względnym tempie dodawania, wycofywania i stabilizacji gałęzi. Dendryty amakrynowe i RGC wykazują również różne zachowania związane z przerastaniem i przebudową, które mogą odzwierciedlać arboryzację specyficzną dla typu. Jednak badania te śledziły szerokie populacje amakrynowe lub RGC i koncentrowały się na celowaniu laminarnym, co jest tylko jednym z aspektów morfologii.
Mechanizmy, które powodują tak ogromną różnorodność morfologiczną obserwowaną w podtypach siatkówki, są słabo poznane. Celem tej grupy było opracowanie metody uchwycenia dynamiki dendrytów i przebudowy trzpienia zdefiniowanych podtypów siatkówki u myszy. Identyfikacja specyficznych dla typu komórek mechanizmów wzorcowania dendrytów wymaga metod wizualizacji i pomiaru zachowań dendrytów w komórkach będących przedmiotem zainteresowania. Organotypowe hodowle siatkówki myszy dobrze nadają się do badań obrazowania żywych komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej lub wielofotonowej. Rozwijające się siatkówki są preparowane i umieszczane w płaskim eksplantacie, który może być obrazowany przez kilka godzin w komorze rejestracyjnej lub hodowany przez kilka dni z ograniczonym wpływem na obwody6,7. Żywe neurony siatkówki mogą być znakowane różnymi technikami, w tym napełnianiem barwnikiem za pomocą elektrod, elektroporacją, biolistycznym dostarczaniem cząstek pokrytych barwnikami lipofilowymi lub plazmidami kodującymi białka fluorescencyjne (np. Gene Gun), a także genetycznie kodowanymi etykietami komórek7,8,9,10. Jednak podejścia te są nieefektywne w obrazowaniu dynamiki dendrytów określonych podtypów siatkówki. Na przykład metody napełniania barwnikiem są niskoprzepustowe i wymagają aparatury elektrofizjologicznej oraz dodatkowych znaczników genetycznych, aby niezawodnie celować w komórki będące przedmiotem zainteresowania. Co więcej, silne sygnały fluorescencyjne w somie mogą przesłaniać pobliskie dendryty.
Biolistyczne metody dostarczania genów mogą jednocześnie oznaczać dziesiątki komórek, ale etapy obejmujące dostarczanie cząsteczek pod wysokim ciśnieniem i nocną inkubację izolowanej siatkówki mogą zagrozić fizjologii komórki i wyrastaniu dendrytycznemu. W artykule zaproponowano, że najnowsze narzędzia genetyczne mogą być wykorzystane do uchwycenia wczesnej dynamiki dendrytów z typem komórki i rozdzielczością strukturalną, biorąc pod uwagę następujące kryteria eksperymentalne. Po pierwsze, aby rozdzielić drobne gałęzie i filopodia, które dominują w rozwijających się altanach, metoda powinna oznaczyć neurony jasnymi, fluorescencyjnymi białkami, które wypełniają procesy w całej altance. Znakowanie fluorescencyjne nie powinno blaknąć z powodu fotowybielania w okresie obrazowania. Wygenerowano i porównano różne warianty białek fluorescencyjnych pod kątem przydatności do obrazowania in vivo/ex vivo11 w oparciu o jasność i fotostabilność. Po drugie, białka fluorescencyjne (XFP) muszą ulegać ekspresji na wystarczająco wysokim poziomie na najwcześniejszym etapie morfogenezy dendrytów, aby nie pominąć wąskiego okna rozwojowego. W analizach statycznych punktów czasowych w siatkówce myszy rozwój dendrytów następuje w pierwszym tygodniu po urodzeniu i obejmuje fazy wzrostu, przebudowy i stabilizacji10,12,13,14,15. Po trzecie, metoda powinna prowadzić do selektywnego znakowania lub do zwiększenia prawdopodobieństwa znakowania subpopulacji neuronalnej będącej przedmiotem zainteresowania. Po czwarte, znakowanie docelowej subpopulacji musi być wystarczająco rzadkie, aby można było zidentyfikować i prześledzić całą trzpień neuronalny. Chociaż podtypy RGC i amakrynowe można rozróżnić na podstawie ich dojrzałych cech morfologicznych i wzorców stratyfikacji IPL16, 17,18,19,20, wyzwaniem jest zidentyfikowanie podtypów podczas rozwoju na podstawie niedojrzałych struktur. Zadanie to jest ułatwione dzięki ekspansji narzędzi transgenicznych do znakowania określonych typów komórek siatkówki podczas rozwoju.
Transgeniczne i mysie linie typu knock-in, w których komórkowa i czasowa ekspresja białek fluorescencyjnych lub Cre jest determinowana przez elementy regulatorowe genów, są szeroko stosowane do badania typów komórek siatkówki13,21,22,23. Kluczowe obserwacje dotyczące specyficznych dla podtypów wzorców rozwoju dendrytów pochodzą z badań transgenicznych siatkówek myszy w statycznych punktach czasowych10,14,24,25. W szczególności system Cre-Lox umożliwia znakomitą manipulację genami i monitorowanie podtypów przy użyciu różnych zależnych od rekombinazy reporterów, czujników i aktywatorów optogenetycznych. Narzędzia te doprowadziły do odkrycia specyficznych dla podtypu programów molekularnych i właściwości funkcjonalnych, które leżą u podstaw zespołu obwodów siatkówki26,27,28,29,30. Jednak nie zostały one jeszcze wykorzystane do badania dynamiki dendrytów specyficznych dla podtypu w siatkówce myszy. Znakowanie o niskiej gęstości można osiągnąć poprzez połączenie linii myszy Cre z transgenami wprowadzonymi przez elektroporację lub rekombinowane AAV. Jeśli to możliwe, można również zastosować indukowane tamoksyfenem linie Cre lub intersekcjonalne strategie genetyczne. Na koniec komórka powinna być znakowana w sposób minimalnie inwazyjny i obrazowana przy użyciu parametrów akwizycji, aby nie naruszyć tkanki ani nie zakłócać funkcji komórkowej wymaganej do morfogenezy dendrytów.
Przedstawiona tutaj jest metoda zastosowania narzędzi transgenicznych i mikroskopii konfokalnej do zbadania dynamiki dendrytów w żywych eksplantatach siatkówki myszy. Transgeniczne linie myszy Cre połączono z wektorami AAV, które wyrażają białka fluorescencyjne po rekombinacji Cre, co pozwala na rzadkie znakowanie komórek siatkówki będących przedmiotem zainteresowania. Dostępne na rynku AAV są dostarczane do siatkówki noworodka za pomocą zastrzyków doszklistkowych. W artykule tym wykazano, że AAV wytwarzają znacznie wysoką i specyficzną dla typu komórki ekspresję fluorescencyjną o 4 dpi, umożliwiając dostęp do postnatalnych punktów czasowych. Aby zilustrować to podejście, cholinergiczny interneuron amakrynowy "gwiazdotwórczy" został oznaczony poprzez dostarczenie Brainbow AAV u nowonarodzonych myszy eksprymujących transgen acetylotransferazy choliny (ChAT) - wewnętrznego miejsca wejścia rybosomu (IRES) - Cre, który jest aktywny we wczesnym pourodzeniowym siatkówce < klasa sup = "xref">31,32. Komórki amakrynowe Starburst rozwijają stereotypową i promienistą morfologię altany, która jest kształtowana przez samounikanie dendrytów, w którym pośredniczą zgrupowane protokadheryny33,34. Praca ta pokazuje, że rozdzielczość dendrytów gwiazdotwórczych i filopodiów jest znacznie poprawiona przez XFP do błony plazmatycznej z dodatkiem motywu CAAX, który ulega farnezylacji, jak to jest używane dla Brainbow AAVs31. Na koniec określono protokoły obrazowania poklatkowego i przetwarzania końcowego, które zapewniają wysokiej jakości obrazy nadające się do rekonstrukcji dendrytów i kwantyfikacji morfometrycznej. Protokół ten może być wykorzystany do identyfikacji czynników kontrolujących morfogenezę dendrytów i uchwycenia kilku zachowań komórkowych w nienaruszonej siatkówce.

<table><tbody><tr><td>Preparat wirusowy Addgene #45185-AAV9</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Preparat wirusowy Addgene #45186-AAV9</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia do preparacji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna z celulozy</td><td>Whatman</td><td>1001-070</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki drobnoziarniste Dumont #5</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td>Do mikrorozwarstwienia siatkówki potrzebne są dwa kleszcze Dumont #5</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont</td><td>VWR</td><td>82027-426</td><td></td></tr><tr><td>Drobne nożyczki</td><td>FST</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>Bibuły filtracyjne z membraną z mieszanych estrów celulozy (MCE), hydrofilowe, 0,45 i mikro; m wielkość porów</td><td>Millipore</td><td>HABG01 300</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego, 50 & razy; 15 mm</td><td>VWR</td><td>470313-352</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa pipeta transferowa z polietylenu</td><td>VWR</td><td>470225-034</td><td></td></tr><tr><td>Pędzel z okrągłą końcówką, rozmiar 3/0</td><td>Konwencjonalny sklep</td><td></td> z artykułami plastycznymi <td>Do płaskiego montażu siatkówki Do płaskiego montażu siatkówki wymagane są dwa pędzle malarskie o rozmiarze 3/0 (lub mniejszym)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>14007-14</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas - 2,5 mm Cutting Edge</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>System inkubacji do obrazowania na żywo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>komorowy rurka polietylenowa, PE-160 10'Warner</td> <td>Instruments</td><td>64-0755</td><td></td></tr><tr><td>Dwukanałowy sterownik grzałki, model TC-344C</td><td>Warner Instruments</td><td>64-2401</td><td></td></tr><tr><td>HC FLUOTAR L 25x/0.95 W Obiektyw zanurzeniowy VISIR</td><td></td> sterownika <td>grzałki Leica</td> 15506374 <td></td></tr><tr><td>Warner</td><td>Instruments</td><td>CC-28</td><td></td></tr><tr><td>Duża komora inkubacyjna do kąpieli z podparciem dla plastrów</td> Minipompa perystaltyczna <td>Warner Instruments</td><td>RC-27L</td><td></td></tr><tr><td>MPII</td><td>Aparat Harvard</td><td>70-2027</td><td></td></tr><tr><td>PM-6D Magnetyczna platforma podgrzewana (grzałka komory inkubacyjnej)</td><td>Warner Instruments</td><td>PM-6D</td><td></td></tr><tr><td>Rurki głowicy pompy do minipompy perystaltycznej MPII</td><td>Aparatura Harvard</td><td>55-4148</td><td></td></tr><tr><td>Kotwica do próbki (harfy)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0260</td><td>Kotwica próbki musi być kompatybilna z komorą inkubacyjną</td></tr><tr><td>Podgrzewacz roztworu Sloflo In-line</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-28</td><td></td></tr><tr><td>Noworodki do iniekcji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &mikro; L Strzykawka mikrolitrowa seria 700, wyjmowana igła</td><td>Hamilton Company</td><td>80314</td><td></td></tr><tr><td>30 G Igły podskórne (0,5 cala)</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>4-calowa cienkościenna szklana kapilara, bez włókna (średnica zewnętrzna 1,0 mm / 0,75 mm)&nbsp;</td><td>WPI World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 99,8% (do rozcieńczenia do 70% wodą podwójnie destylowaną [ddH2O])</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V001229&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF</td><td>Rdzeń wektorowy Penn</td><td>AV-9-PV2453</td><td>Addgene Plazmid #45185&nbsp;</td></tr><tr><td>AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 1.lox. WPRE.hGH-InvCheTF</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-9-PV2454</td><td>Addgene Plasmid #45186</td></tr><tr><td>ChAT-IRES-Cre knock-in transgeniczna linia myszy</td><td>Jackson Laboratory</td><td>6410</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF Zawartość barwnika &ge; 85</td>% <td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-25G</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/brązowy ściągacz do mikropipet, model P-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Zielona pasta do tatuażu</td><td>Ketchum MFG Co</td><td>329A</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH 7,4, płynna, sterylnie filtrowana, odpowiednia do hodowli komórkowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>806552</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatyczna pompa PicoPump</td><td>WPI World Precision Instruments</td><td>PV-820</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki natlenionego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen (5% CO2, 95% O2)</td><td>AirGas</td><td>X02OX95C2003102</td><td>może się różnić w zależności od regionu</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>- HEPES, Free Acid</td><td>Bio Basic</td><td>HB0264</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kwasu solnego, 1 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny (MgCl2&middot; 6H2O)</td><td>Paski testowe pH-55 6H<subO)Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>paski testowe pH (6,0-7,7)</td><td>VWR</td><td>BDH35317.604</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Bio Basic</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy (NaHsub>2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD007</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td>Otwarty kod</td><td></td> źródłowy</tr></tbody></table>

obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki

Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

Odkrywanie mechanizmów, które tworzą rzeźby dendrytyczne, wymaga metod wizualizacji, obrazowania i analizy dendrytów podczas rozwoju. Siatkówka myszy jest potężnym systemem modelowym do badania specyficznych dla typu komórki mechanizmów morfogenezy i łączności neuronów. Organizacja i skład podtypów siatkówki są dobrze zdefiniowane, a narzędzia genetyczne są dostępne w celu uzyskania dostępu do określonych typów podczas rozwoju. Wiele typów komórek siatkówki ogranicza również swoje dendryty i/lub aksony do wąskich warstw, co ułatwia obrazowanie poklatkowe. Hodowle eksplantatów siatkówki myszy dobrze nadają się do obrazowania żywych komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej lub wielofotonowej, ale brakuje metod zoptymalizowanych pod kątem obrazowania dynamiki dendrytów z rozdzielczością czasową i strukturalną. Przedstawiono metodę rzadkiego znakowania i obrazowania rozwoju określonych populacji siatkówki oznaczonych przez system Cre-Lox. Stosowane tu komercyjnie dostępne wirusy związane z adenowirusami (AAV) wykazywały ekspresję białek fluorescencyjnych ukierunkowanych na błonę w sposób zależny od Cre. Podanie AAV do gałki ocznej u nowonarodzonych myszy powoduje znakowanie fluorescencyjne docelowych typów komórek w ciągu 4-5 dni po wstrzyknięciu (dpi). Membranowe sygnały fluorescencyjne są wykrywalne za pomocą obrazowania konfokalnego i rozwiązują drobne struktury i dynamikę rozgałęzień. Wysokiej jakości filmy trwające 2-4 godziny są uzyskiwane z obrazowania płaskich mocowań siatkówki perfuzji natlenionego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF). Dostępny jest również potok przetwarzania końcowego obrazu do dekonwolucji i korekcji dryfu trójwymiarowego (3D). Protokół ten może być wykorzystany do uchwycenia kilku zachowań komórkowych w nienaruszonej siatkówce i do identyfikacji nowych czynników kontrolujących morfogenezę neurytów. Wiele strategii rozwojowych wyuczonych w siatkówce będzie istotnych dla zrozumienia powstawania obwodów nerwowych w innych częściach ośrodkowego układu nerwowego.

Zastosowanie powyższego protokołu pozwoliło na uzyskanie wysokorozdzielczzego wideo 3D rozwijających się dendrytów komórek gwiaździstych, a następnie na przeprowadzenie dekonwolucji i korekcję dryfu 3D. Wykonano projekcje maksymalne płaszczyzny Z w celu stworzenia dwuwymiarowych filmów do analizy (Wideo uzupełniające 1, Rysunek 5A). Dekonwolucja 3D dla każdego punktu czasowego zwiększyła rozdzielczość drobnych projekcji filopodialnych (Rysunek 5B</strong...

Tutaj prezentujemy metodę badania morfogenezy neurytów w pourodzeniowych eksplantatach siatkówki myszy za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Opisujemy podejście do rzadkiego znakowania i pozyskiwania typów komórek siatkówki i ich drobnych procesów przy użyciu rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adeno, które wyrażają białka fluorescencyjne ukierunkowane na błonę w sposób zależny od Cre.

Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

Znakowanie pojedynczych komórek i wizualizacja altan dendrytycznych lub aksonalnych jest wymagana do badania morfogenezy neuronów. Dzięki znakowaniu rozwijających się altan w sposób minimalnie inwazyjny, tkanka siatkówki pozostaje zdrowa i nadaje się do długotrwałego konfokalnego obrazowania na żywo. Główną zaletą tej metody jest możliwość wizualizacji poszczególnych altan z wielokolorowymi białkami fluorescencyjnymi w ciągu czterech dni po iniekcji.Dzięki temu możliwe jest badanie morfologii altan noworodków. Ten protokół obrazowania i analizy iniekcyjnej może być wykorzystany do badania morfologii neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym. Należy określić odpowiedni wybór Cre i miejsce wstrzyknięcia, aby celować w populację komórek będących przedmiotem zainteresowania.Zacznij od wybrania linii myszy Cre, aby oznaczyć interesujące populacje komórek siatkówki. Otrzymać zależny od rekombinazy wirus AAV kodujący białka fluorescencyjne. Aby uzyskać optymalne znakowanie drobnych procesów, wybierz wektory, które wyrażają zmodyfikowane białka fluorescencyjne skierowane na błonę plazmatyczną.Dla podwielokrotności AAV na lodzie i przygotować rozcieńczenie od jednego do czterech AAV przy użyciu sterylnego roztworu soli fizjologicznej lub PBS. Aby uwidocznić wstrzyknięcia, pokoloruj roztwór na niebiesko, dodając około jednego mikrolitra 0,02% roztworu barwnika Fast Green FCF na każde 15 mikrolitrów rozcieńczenia AAV. Wysterylizuj obszar wstrzyknięcia 70% etanolem.Napełnić mikropipetę rozcieńczeniem AAV za pomocą mikrostrzykawki. Pod mikroskopem stereoskopowym rozbij końcówkę mikropipety za pomocą igły o rozmiarze 30, aby rozszczelnić końcówkę. Po znieczuleniu nowonarodzonych myszy wytatuuj ich opuszki łap tuszem do tatuażu za pomocą igły o rozmiarze 30, aby zidentyfikować zwierzęta.Zbierz wycinki ogonów w celu izolacji DNA i genotypowania. Przetrzyj skórę pokrywającą oczy 70% etanolem. Użyj igły o rozmiarze 30G, aby otworzyć zrośniętą powiekę, jednocześnie lekko uciskając palcami, aby otworzyć oko.Zrób mały otwór w rogówce na skrzyżowaniu twardówki rogówki. Włóż szklaną mikropipetę do otworu i naciśnij pedał nożny mikrowtryskiwacza dwa do czterech razy, aby wstrzyknąć AAV do przestrzeni doszklistkowej. Powoli wyjmij mikropipetę i potwierdź wstrzyknięcie AAV, wizualizując niebieski barwnik w źrenicy.Po przygotowaniu aCSF siatkówki zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym, należy natlenić aCSF siatkówki poprzez bulgotanie karbogenem przez co najmniej 15 minut, a następnie dostosować pH do 7,4. Umieść szalkę Petriego o średnicy 60 milimetrów w tacce na lód i napełnij ją natlenionym aCSF siatkówki. Umieść napełnioną szalkę Petriego pod mikroskopem stereoskopowym.Następnie odetnij klapkę powieki uświęconej myszy, aby odsłonić oko. Użyj kleszczy, aby wyłuszczyć oczy i przenieść je do zimnego aCSF siatkówki umieszczonego pod mikroskopem stereoskopowym. Pod mikroskopem stereoskopowym ustabilizuj oko, zaciskając nerw wzrokowy za pomocą kleszczy Dumonta numer pięć i przebij otwór w środku rogówki igłą o rozmiarze 30, a następnie włóż jedną końcówkę mikronożyczek do otworu, aby wykonać nacięcie od otworu do końca rogówki.Powtórz tę czynność, aby zrobić cztery plasterki w kierunkach kardynalnych, tworząc cztery klapki. Chwyć i rozsuń dwie sąsiednie płatki, delikatnie odrywając twardówkę od siatkówki dla wszystkich płatków rogówki. Następnie wyjmij soczewkę z miseczki siatkówki za pomocą kleszczy.Na koniec za pomocą mikronożyczek wykonaj cztery promieniste nacięcia od krawędzi siatkówki w kierunku nerwu wzrokowego, tworząc cztery równe płatki. Jeśli do montażu używasz szarych filtrów membranowych MCE o dużej średnicy, pokrój dysk na ćwiartki o średnicy około jednego centymetra, a następnie umieść dysk MCE na środku większej białej bibuły filtracyjnej. Używając dwóch pędzli o rozmiarze trzy na zero, odwróć jeden kubek siatkówki na pędzel pędzlem komórką zwojową siatkówki do dołu.Delikatnie wyjmij siatkówkę z aCSF, upewniając się, że ciśnienie wody nie rozerwie siatkówki. Trzymając pędzel przy siatkówce, odsuń szalkę Petriego zawierającą CSF i umieść białą bibułę filtracyjną z membraną MCE pod stereoskopem. Za pomocą pipety transferowej umieść kroplę CSF na środku bibuły filtracyjnej MCE.Umieść siatkówkę w kropelce CSF utworzonej przez napięcie powierzchniowe i naładowaną membranę MCE. Użyj pędzli, aby ustawić siatkówkę w kropli komórką zwojową siatkówki do góry, a następnie rozłóż cztery płatki. Po ustawieniu utwórz mostek wodny między pędzlem a białą bibułą filtracyjną, aby przełamać napięcie powierzchniowe kropli.Zmontować komorę inkubacyjną do obrazowania na żywo i napełnić ją natlenionym aCSF. Włącz pompę i regulator temperatury, upewniając się, że temperatura nie wzrośnie powyżej 34 stopni Celsjusza. Ustabilizowanie się temperatury w komorze może potrwać do godziny.Zaleca się ustawienie komory inkubacyjnej przed rozpoczęciem rozwarstwienia siatkówki. Stabilna temperatura w komorze pomaga zmniejszyć dryft próbki. Aby przenieść płaski wzgórek siatkówki do komory perfuzyjnej, zatrzymaj pompę i usuń aCSF, który znajduje się w komorze.Następnie umieść krążek MCE z płaskim mocowaniem siatkówki w komorze inkubacyjnej. Wstępnie zwilż wzorzec próbki, aby złamać napięcie powierzchniowe, a następnie umieść ją na płaskim uchwycie, upewniając się, że wzorzec próbki jest umieszczony na papierze MCE, aby zmniejszyć dryft próbki. Napełnij komorę podgrzanym aCSF i cyrkuluj aCSF w ilości około jednego mililitra na minutę.Umieść końcówkę z obiektywem do 25-krotnego zanurzania wody w komorze obrazowania. Wykonaj badanie przesiewowe w poszukiwaniu oznaczonych komórek zainteresowania za pomocą światła epifluorescencyjnego i dostosuj głośność obrazowania, aby uchwycić interesujące cechy dendrytyczne. Korzystając z tabeli przeglądowej, która identyfikuje zarówno przesycone, jak i nienasycone piksele, dostosuj moc lasera w taki sposób, aby żadne piksele nie były przesycone.Uzyskaj objętość obrazowania 3D i powtórz akwizycję z żądaną liczbą klatek na sekundę. Objętość obrazowania można regulować między poszczególnymi punktami czasowymi, aby skompensować dryft próbki. Zaimportuj serię obrazów, dzieląc obrazy według czasu.Zapisz wszystkie punkty czasowe ręcznie lub uruchamiając wtyczkę makra. Utwórz teoretyczną funkcję rozrzutu punktów za pomocą wtyczki ImageJ, klikając opcję Defrakcja PSF 3D, przysłona numeryczna obiektywu, długość fali emisji fluoroforu, rozmiar piksela i odstępy Z są wymagane do utworzenia dokładnego PSF. Wybierz wtyczki, makra i uruchom, aby wykonać równoległą iteracyjną dekonwolucję wsadową dla wszystkich punktów czasowych przy użyciu dostarczonego makra.Zaimportuj wszystkie zdekonwolucjonizowane punkty czasowe jako stos, klikając plik, importuj, a następnie sekwencję obrazów. Przekonwertuj stos na hyperstack, klikając image, hyperstacks, a następnie stacks na hyperstack. Dodaj liczbę wycinków Z i przedziałów czasowych, a następnie skoryguj dryf 3D za pomocą odpowiedniej wtyczki dryfu 3D.Zapisz hiperstos z korektą dryfu 3D i przekonwertuj obraz z powrotem na zwykły stos, klikając obraz, hyperstacks, hyperstack do stosu, a następnie podziel punkty czasu, klikając obraz, stosy, narzędzia i rozdzielacz stosów. W polu Liczba stosów podrzędnych do podziału wprowadź liczbę punktów czasowych. Użyj przetwarzania wsadowego, aby utworzyć maksymalne odwzorowanie dla wszystkich punktów czasowych.Zaimportuj sekwencję zdjęć poklatkowych, klikając plik, importuj, a następnie sekwencję obrazów. I użyj konwencjonalnych narzędzi ImageJ do pożądanej analizy zdekonwoluowanego i przetworzonego dwuwymiarowego wideo, Uzyskano film 3D o wysokiej rozdzielczości przedstawiający rozwijające się dendryty komórek gwiazdotwórczych, zdekonwoluować i skorygować je pod kątem dryfu 3D. Maksymalne projekcje w płaszczyźnie Z zostały wyprodukowane w celu stworzenia filmów 2D do analizy, pokazujących obszar wyrafinowania dendrytycznego i obszar wyrostu dendrytycznego.Dekonwolucja 3D każdego punktu czasowego zwiększyła rozdzielczość drobnych projekcji filopodiów pojedynczej komórki amakrynowej P6 gwiazdotwórczej przed i po dekonwolucji za pomocą ImageJ. Przedłużone okresy infekcji AAV niekoniecznie prowadzą do zwiększonego sygnału fluorescencyjnego, o czym świadczą podobne poziomy ekspresji białka po pięciu i 11 dniach od wstrzyknięcia. Zmniejszenie dryfu próbki podczas obrazowania jest ważne.Dryft jest minimalizowany poprzez utrzymanie stałej temperatury obrazowania i odpowiednie ustawienie masy na próbce. Jeśli wystąpi dryft, ręczna akwizycja szeregów czasowych pozwala na regulację objętości obrazowania między klatkami. Dzięki temu interesujące nas cechy pozostaną w kadrze.Protokół ten tworzy filmy 3D o wysokiej rozdzielczości, zdekonwolucyjne i skorygowane o dryf, przedstawiające rozwijające się neuryty. Takie filmy prowadzą do lepszego zrozumienia okablowania neuronów i są niezbędne do rozwoju metod analizy obliczeniowej morfogenezy 3D. Lepsze oprogramowanie do automatycznego śledzenia i śledzenia jest niezbędne do osiągnięcia wysokiej przepustowości analizy rozwoju neurytów.

time-lapse-imaging-neuronal-arborization-using-sparse-adeno

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym filmie przedstawiono techniki wielokolorowego konfokalnego obrazowania time-lapse oraz celowanej ablacji komórek. Obrazowanie time-lapse jest wykorzystywane do monitorowania zachowania wielu wybranych typów komórek in vivo. Celowana ablacja komórek ułatwia badanie funkcji obwodów neuronalnych oraz paradygmatów regeneracji neuronów specyficznych dla danej grupy komórek.

Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznych rybek zebrafish: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez ukierunkowaną ablację komórek neuronalnych

W niniejszym materiale przedstawiamy metodę wewnątrzczaszkowej iniekcji wektorów AAV w celu fluorescencyjnego znakowania neuronów i gleju w korze wzrokowej.

Wewnątrzczaszkowe wstrzykiwanie wektorów wirusowych opartych na wirusach adeno-zależnych

Opisujemy protokół obrazowania wideo w czasie rzeczywistym migracji neuronów w przedmózgowiu myszy. Migrację prekursorów neuronalnych oznakowanych wirusowo lub przeszczepionych rejestrowano w ostrych żywych skrawkach, wykorzystując szerokopolowe obrazowanie fluorescencyjne z relatywnie krótkim odstępem między akwizycjami, aby zbadać różne fazy migracji komórek, w tym czas trwania fazy stacjonarnej i migracyjnej oraz prędkość migracji.

Obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w ostrych skrawkach przedmózgowia dorosłej myszy

Źródło: Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki. J. Vis. Exp. (2021)Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dynamiki dendrytycznej w żywych eksplantatach siatkówki myszy. Przedstawiono w nim etapy stabilizacji siatkówki pod mikroskopem konfokalnym, wykonywania obrazowania epifluorescencyjnego w celu...

Poklatkowe obrazowanie konfokalne dynamiki dendrytycznej neuronów w eksplantatach siatkówki myszy

Aby zbadać przepuszczalność bariery krew-siatkówka i wewnętrzną integralność błony ograniczającej w zwierzęcych modelach chorób siatkówki, użyliśmy kilku wariantów wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jako narzędzi do oznaczania neuronów siatkówki i gleju. Ekspresja genu reporterowego za pośrednictwem wirusa jest następnie wykorzystywana jako wskaźnik przepuszczalności bariery siatkówkowej.

Wykorzystanie wirusa związanego z adenowirusem jako narzędzia do badania barier siatkówkowych w chorobie

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Obecny protokół demonstruje prostą metodę śledzenia projekcji glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki (VTA) do hipokampa. Fotostymulację neuronów glutaminianu VTA połączono z zapisem CA1, aby zademonstrować, w jaki sposób zakończenia glutaminianu VTA modulują przypuszczalną szybkość wypalania CA1 w piramidzie in vivo.

Połączone anatomiczne i funkcjonalne śledzenie in vivo zakończeń glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki w hipokampie

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Poznaj metodę rzadkiego znakowania neuronów siatkówki myszy wirusem AAV zależnym od rekombinazy Cre. Protokół umożliwia wysokorozdzielcze, poklatkowe obrazowanie dynamicznego rozwoju dendrytów w eksplantatach siatkówki z minimalną inwazyjnością.

Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki

Przeglądaj więcej filmów