Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki

Znakowanie pojedynczych komórek i wizualizacja altan dendrytycznych lub aksonalnych jest wymagana do badania morfogenezy neuronów. Dzięki znakowaniu rozwijających się altan w sposób minimalnie inwazyjny, tkanka siatkówki pozostaje zdrowa i nadaje się do długotrwałego konfokalnego obrazowania na żywo. Główną zaletą tej metody jest możliwość wizualizacji poszczególnych altan z wielokolorowymi białkami fluorescencyjnymi w ciągu czterech dni po iniekcji.

Dzięki temu możliwe jest badanie morfologii altan noworodków. Ten protokół obrazowania i analizy iniekcyjnej może być wykorzystany do badania morfologii neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym. Należy określić odpowiedni wybór Cre i miejsce wstrzyknięcia, aby celować w populację komórek będących przedmiotem zainteresowania.

Zacznij od wybrania linii myszy Cre, aby oznaczyć interesujące populacje komórek siatkówki. Otrzymać zależny od rekombinazy wirus AAV kodujący białka fluorescencyjne. Aby uzyskać optymalne znakowanie drobnych procesów, wybierz wektory, które wyrażają zmodyfikowane białka fluorescencyjne skierowane na błonę plazmatyczną.

Dla podwielokrotności AAV na lodzie i przygotować rozcieńczenie od jednego do czterech AAV przy użyciu sterylnego roztworu soli fizjologicznej lub PBS. Aby uwidocznić wstrzyknięcia, pokoloruj roztwór na niebiesko, dodając około jednego mikrolitra 0,02% roztworu barwnika Fast Green FCF na każde 15 mikrolitrów rozcieńczenia AAV. Wysterylizuj obszar wstrzyknięcia 70% etanolem.

Napełnić mikropipetę rozcieńczeniem AAV za pomocą mikrostrzykawki. Pod mikroskopem stereoskopowym rozbij końcówkę mikropipety za pomocą igły o rozmiarze 30, aby rozszczelnić końcówkę. Po znieczuleniu nowonarodzonych myszy wytatuuj ich opuszki łap tuszem do tatuażu za pomocą igły o rozmiarze 30, aby zidentyfikować zwierzęta.

Zbierz wycinki ogonów w celu izolacji DNA i genotypowania. Przetrzyj skórę pokrywającą oczy 70% etanolem. Użyj igły o rozmiarze 30G, aby otworzyć zrośniętą powiekę, jednocześnie lekko uciskając palcami, aby otworzyć oko.

Zrób mały otwór w rogówce na skrzyżowaniu twardówki rogówki. Włóż szklaną mikropipetę do otworu i naciśnij pedał nożny mikrowtryskiwacza dwa do czterech razy, aby wstrzyknąć AAV do przestrzeni doszklistkowej. Powoli wyjmij mikropipetę i potwierdź wstrzyknięcie AAV, wizualizując niebieski barwnik w źrenicy.

Po przygotowaniu aCSF siatkówki zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym, należy natlenić aCSF siatkówki poprzez bulgotanie karbogenem przez co najmniej 15 minut, a następnie dostosować pH do 7,4. Umieść szalkę Petriego o średnicy 60 milimetrów w tacce na lód i napełnij ją natlenionym aCSF siatkówki. Umieść napełnioną szalkę Petriego pod mikroskopem stereoskopowym.

Następnie odetnij klapkę powieki uświęconej myszy, aby odsłonić oko. Użyj kleszczy, aby wyłuszczyć oczy i przenieść je do zimnego aCSF siatkówki umieszczonego pod mikroskopem stereoskopowym. Pod mikroskopem stereoskopowym ustabilizuj oko, zaciskając nerw wzrokowy za pomocą kleszczy Dumonta numer pięć i przebij otwór w środku rogówki igłą o rozmiarze 30, a następnie włóż jedną końcówkę mikronożyczek do otworu, aby wykonać nacięcie od otworu do końca rogówki.

Powtórz tę czynność, aby zrobić cztery plasterki w kierunkach kardynalnych, tworząc cztery klapki. Chwyć i rozsuń dwie sąsiednie płatki, delikatnie odrywając twardówkę od siatkówki dla wszystkich płatków rogówki. Następnie wyjmij soczewkę z miseczki siatkówki za pomocą kleszczy.

Na koniec za pomocą mikronożyczek wykonaj cztery promieniste nacięcia od krawędzi siatkówki w kierunku nerwu wzrokowego, tworząc cztery równe płatki. Jeśli do montażu używasz szarych filtrów membranowych MCE o dużej średnicy, pokrój dysk na ćwiartki o średnicy około jednego centymetra, a następnie umieść dysk MCE na środku większej białej bibuły filtracyjnej. Używając dwóch pędzli o rozmiarze trzy na zero, odwróć jeden kubek siatkówki na pędzel pędzlem komórką zwojową siatkówki do dołu.

Delikatnie wyjmij siatkówkę z aCSF, upewniając się, że ciśnienie wody nie rozerwie siatkówki. Trzymając pędzel przy siatkówce, odsuń szalkę Petriego zawierającą CSF i umieść białą bibułę filtracyjną z membraną MCE pod stereoskopem. Za pomocą pipety transferowej umieść kroplę CSF na środku bibuły filtracyjnej MCE.

Umieść siatkówkę w kropelce CSF utworzonej przez napięcie powierzchniowe i naładowaną membranę MCE. Użyj pędzli, aby ustawić siatkówkę w kropli komórką zwojową siatkówki do góry, a następnie rozłóż cztery płatki. Po ustawieniu utwórz mostek wodny między pędzlem a białą bibułą filtracyjną, aby przełamać napięcie powierzchniowe kropli.

Zmontować komorę inkubacyjną do obrazowania na żywo i napełnić ją natlenionym aCSF. Włącz pompę i regulator temperatury, upewniając się, że temperatura nie wzrośnie powyżej 34 stopni Celsjusza. Ustabilizowanie się temperatury w komorze może potrwać do godziny.

Zaleca się ustawienie komory inkubacyjnej przed rozpoczęciem rozwarstwienia siatkówki. Stabilna temperatura w komorze pomaga zmniejszyć dryft próbki. Aby przenieść płaski wzgórek siatkówki do komory perfuzyjnej, zatrzymaj pompę i usuń aCSF, który znajduje się w komorze.

Następnie umieść krążek MCE z płaskim mocowaniem siatkówki w komorze inkubacyjnej. Wstępnie zwilż wzorzec próbki, aby złamać napięcie powierzchniowe, a następnie umieść ją na płaskim uchwycie, upewniając się, że wzorzec próbki jest umieszczony na papierze MCE, aby zmniejszyć dryft próbki. Napełnij komorę podgrzanym aCSF i cyrkuluj aCSF w ilości około jednego mililitra na minutę.

Umieść końcówkę z obiektywem do 25-krotnego zanurzania wody w komorze obrazowania. Wykonaj badanie przesiewowe w poszukiwaniu oznaczonych komórek zainteresowania za pomocą światła epifluorescencyjnego i dostosuj głośność obrazowania, aby uchwycić interesujące cechy dendrytyczne. Korzystając z tabeli przeglądowej, która identyfikuje zarówno przesycone, jak i nienasycone piksele, dostosuj moc lasera w taki sposób, aby żadne piksele nie były przesycone.

Uzyskaj objętość obrazowania 3D i powtórz akwizycję z żądaną liczbą klatek na sekundę. Objętość obrazowania można regulować między poszczególnymi punktami czasowymi, aby skompensować dryft próbki. Zaimportuj serię obrazów, dzieląc obrazy według czasu.

Zapisz wszystkie punkty czasowe ręcznie lub uruchamiając wtyczkę makra. Utwórz teoretyczną funkcję rozrzutu punktów za pomocą wtyczki ImageJ, klikając opcję Defrakcja PSF 3D, przysłona numeryczna obiektywu, długość fali emisji fluoroforu, rozmiar piksela i odstępy Z są wymagane do utworzenia dokładnego PSF. Wybierz wtyczki, makra i uruchom, aby wykonać równoległą iteracyjną dekonwolucję wsadową dla wszystkich punktów czasowych przy użyciu dostarczonego makra.

Zaimportuj wszystkie zdekonwolucjonizowane punkty czasowe jako stos, klikając plik, importuj, a następnie sekwencję obrazów. Przekonwertuj stos na hyperstack, klikając image, hyperstacks, a następnie stacks na hyperstack. Dodaj liczbę wycinków Z i przedziałów czasowych, a następnie skoryguj dryf 3D za pomocą odpowiedniej wtyczki dryfu 3D.

Zapisz hiperstos z korektą dryfu 3D i przekonwertuj obraz z powrotem na zwykły stos, klikając obraz, hyperstacks, hyperstack do stosu, a następnie podziel punkty czasu, klikając obraz, stosy, narzędzia i rozdzielacz stosów. W polu Liczba stosów podrzędnych do podziału wprowadź liczbę punktów czasowych. Użyj przetwarzania wsadowego, aby utworzyć maksymalne odwzorowanie dla wszystkich punktów czasowych.

Zaimportuj sekwencję zdjęć poklatkowych, klikając plik, importuj, a następnie sekwencję obrazów. I użyj konwencjonalnych narzędzi ImageJ do pożądanej analizy zdekonwoluowanego i przetworzonego dwuwymiarowego wideo, Uzyskano film 3D o wysokiej rozdzielczości przedstawiający rozwijające się dendryty komórek gwiazdotwórczych, zdekonwoluować i skorygować je pod kątem dryfu 3D. Maksymalne projekcje w płaszczyźnie Z zostały wyprodukowane w celu stworzenia filmów 2D do analizy, pokazujących obszar wyrafinowania dendrytycznego i obszar wyrostu dendrytycznego.

Dekonwolucja 3D każdego punktu czasowego zwiększyła rozdzielczość drobnych projekcji filopodiów pojedynczej komórki amakrynowej P6 gwiazdotwórczej przed i po dekonwolucji za pomocą ImageJ. Przedłużone okresy infekcji AAV niekoniecznie prowadzą do zwiększonego sygnału fluorescencyjnego, o czym świadczą podobne poziomy ekspresji białka po pięciu i 11 dniach od wstrzyknięcia. Zmniejszenie dryfu próbki podczas obrazowania jest ważne.

Dryft jest minimalizowany poprzez utrzymanie stałej temperatury obrazowania i odpowiednie ustawienie masy na próbce. Jeśli wystąpi dryft, ręczna akwizycja szeregów czasowych pozwala na regulację objętości obrazowania między klatkami. Dzięki temu interesujące nas cechy pozostaną w kadrze.

Protokół ten tworzy filmy 3D o wysokiej rozdzielczości, zdekonwolucyjne i skorygowane o dryf, przedstawiające rozwijające się neuryty. Takie filmy prowadzą do lepszego zrozumienia okablowania neuronów i są niezbędne do rozwoju metod analizy obliczeniowej morfogenezy 3D. Lepsze oprogramowanie do automatycznego śledzenia i śledzenia jest niezbędne do osiągnięcia wysokiej przepustowości analizy rozwoju neurytów.