Analiza molekularna przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego wywołanego sygnalizacją transformacji czynnika wzrostu β

Opisano protokół indukcji in vitro przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego (EndMT), który jest przydatny do badania szlaków sygnalizacji komórkowej związanych z EndMT. W tym modelu eksperymentalnym EndMT jest indukowany przez leczenie TGF-β w komórkach śródbłonka MS-1.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii naczyń krwionośnych i nowotworów, takie jak mechanizmy plastyczności śródbłonka w różnych stanach patologicznych, w tym w raku. Główną zaletą tej techniki jest to, że silna indukcja EndMT in vitro jest osiągana poprzez leczenie komórkami śródbłonka TGF-in MS-1. Najpierw hoduj komórki MS-1 w standardowych warunkach hodowli i unikaj zlewania się kultury.

Następnie na 10 cm naczyniu umyj komórki MS-1 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Następnie dodaj 1 ml trypsyny do płytki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie dodaj 9 ml pożywki hodowlanej do trypsynizowanych komórek w celu oderwania.

Następnie zbierz trypsynizowaną zawiesinę komórek w probówce o pojemności 15 ml. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 300-400 x G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie użyj automatycznego licznika komórek, aby policzyć liczbę żywotnych komórek.

Następnie umieść komórki MS-1 na niepowlekanych standardowych płytkach hodowlanych w celu długotrwałej hodowli. Po 24 godzinach stymuluj komórki śródbłonka końcowym stężeniem 1 ng na mililitr TGF-2. Następnie inkubuj płytkę hodowlaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Po 48 godzinach od poddania działaniu substancji należy zastąpić pożywkę świeżą, wstępnie podgrzaną pożywką hodowlaną zawierającą TGF-2 W celu dalszej analizy umieść komórki MS-1 na 8-dołkowym szkiełku w komorze hodowlanej wstępnie pokrytym żelatyną. Po 24 godzinach dodać 10 M inhibitora ROCK do hodowli komórkowej. Po godzinie stymuluj komórki śródbłonka końcowym stężeniem 1 ng na mililitr TGF-2.

Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W przypadku hodowli trwającej 72 godziny, po 48 godzinach zastąp starą pożywkę świeżą pożywką zawierającą TGF-2. Po całym dniu leczenia TGF należy usunąć pożywkę.

Następnie utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu i soli fizjologicznej buforowanej fosforanami przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po upływie okresu utrwalania przepłukać komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Następnie inkubować komórki z 0,2% Triton X-100 przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Po pięciu minutach ponownie przepłucz komórki trzykrotnie 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem. Po trzech płukaniach inkubować komórki z rozcieńczoną fluorescencyjną fallotoksyną zawierającą bufor blokujący przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyć komórki trzykrotnie 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem.

Następnie wybarwić jądra komórkowe za pomocą barwnika wiążącego cyjaninowy kwas nukleinowy przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po pięciu minutach opłucz szkiełko i zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełku za pomocą nośnika do mocowania szkiełek. Obserwuj komórki pod mikroskopem konfokalnym.

Komórki wykazują reorganizację grubych włókien stresowych po leczeniu TGF-2. Wskazuje to na siłę TGF-2 w indukowaniu EndMT w komórkach śródbłonka. Po 72 godzinach leczenia TGF-2 wyrzuć pożywkę i utrwal komórki 0,5 do 1 ml 50% zimnego metanolu i 50% acetonu przez pięć minut.

Następnie trzykrotnie przepłucz komórki 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem. Po zakończeniu trzech płukań inkubować komórki z pierwszorzędowymi przeciwciałami w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza, w ciemności. Następnego dnia ponownie przemyj komórki 1x roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem, trzykrotnie.

Następnie inkubuj komórki z zielonym barwnikiem sprzężonym z przeciwciałem drugorzędowym przeciwko VE-kadherynie w buforze blokującym, przez godzinę w ciemności. Ponownie umyj komórki trzykrotnie 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem. Następnie wybarwić jądra komórkowe za pomocą barwnika wiążącego cyjaninowy kwas nukleinowy przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Po pięciu minutach przepłucz szkiełko i zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełku za pomocą medium do mocowania szkiełek. Następnie obserwuj komórki pod mikroskopem konfokalnym. Komórki wykazują zmniejszoną ekspresję kadheryny VE i zwiększoną ekspresję aktyny mięśni gładkich po leczeniu TGF-2 przez 48 do 72 godzin.

Przed testem skurczu żelu kolagenowego należy hodować komórki MS-1 w obecności i bez TGF-2 przez 72 godziny. Następnie przygotuj żel kolagenowy typu 1 na lodzie. Następnie wymieszać 800 l roztworu żelu kolagenowego z 200 ml komórek śródbłonka podanych działaniu kontrolki lub TGF-2.

Następnie dodaj 1 ml tej mieszaniny do każdego dołka 12-dołkowej płytki hodowlanej. Pozwól żelowi zestalić się w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut. Po zestaleniu żelu dodać 1 ml MEM Alpha, zawierającego 10% płodowej surowicy cielęcej, 50 jednostek na mililitr penicyliny i 50 g na mililitr streptomycyny, aby unosić żel.

Następnie odłącz żel od ściany studni i inkubuj pływający żel w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Po 48 godzinach inkubacji zeskanuj obrazy żelu od spodu płytki za pomocą skanera. Widoczne są wyraźne zmiany morfologiczne, przekształcające komórki z bruku w mezenchymalną architekturę w kształcie wrzeciona w wyniku ekspozycji na leczenie TGF-2 przez 72 godziny.

Co ciekawe, leczenie TGF beta 2 przez 48 do 72 godzin wykazuje wzrost zarówno poziomu mRNA, jak i ekspresji białka aktyny mięśni gładkich w komórkach MS-1. Test skurczu żelu pokazuje również, że po leczeniu TGF-2 żel kolagenu typu 1 znacznie się kurczy. Co ciekawe, pozbawienie TGF-2 obniża aktynę mięśni gładkich do poziomu podstawowego, a komórki wznawiają morfologię bruku, co wskazuje, że EndMT jest procesem dynamicznym.

W rzeczywistości hamowanie mikroRNA 31 przez inhibitor mikroRNA LNA przy użyciu komórek MS-1 osłabia indukcję markerów mezenchymalnych. Jednak inhibitor nie wpływa na indukcję genów docelowych TGF, takich jak Fibronektyna 1, PAI-1 i Smad 7. Postępując zgodnie z tą procedurą jako metodą, taką jak ekspresja genów, knockdown lub modulacja mikromacierzy, można wykonać w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak specyficzna funkcja genu i mikroRNA w EndMT.