Name: Analiza molekularna przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego wywołanego sygnalizacją transformacji czynnika wzrostu β (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Poznaj metodę indukcji przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego w komórkach MS-1 za pomocą TGF-β2. Protokół umożliwia analizę zmian morfologicznych i molekularnych, w tym roli mikroRNA w biologii naczyniowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Zea Borok i Kohei Miyazono za sugestie dotyczące przygotowania manuskryptu. H.I.S. i M.H. są wspierane przez Uehara Memorial Foundation Research Fellowship, a H.I.S. jest wspierany przez Osamu Hayaishi Memorial Scholarship for Study Abroad. Prace te zostały wsparte grantem Fundacji Naukowej Takeda (A.S.).

1. Indukcja EndMT
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki MS-1 w standardowych warunkach hodowli i unikaj konfluencji. Źródło komórek MS-1 opisano w Tabeli Materiałów. W przypadku komórek MS-1 należy użyć Minimum Essential Medium-α (MEM-α) z 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), 50 U/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny.</li>
	<li>Umyj komórki MS-1 na 10 cm naczyniu z 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i dodaj 1,0 ml trypsyny do płytki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odłączyć komórki za pomocą 9 ml pożywki hodowlanej. Zebrać zawiesinę komórek w probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 300–400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant i zawiesić osad komórkowy we wstępnie podgrzanej pożywce hodowlanej.</li>
	<li>Policz żywe komórki za pomocą roztworu błękitu trypanowego i standardowego hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Płytki MS-1 na niepowlekanych standardowych płytkach hodowlanych w proporcji 0,5 x 103 komórki nacm2 w celu długotrwałej hodowli. Na przykład płytka 5,0 x 103 komórki na dołek w 6-dołkowej płytce hodowlanej. Stosować te same pożywki hodowlane, w tym FCS o tym samym stężeniu. W komórkach MS-1 TGF-β indukuje EndMT w długotrwałej hodowli (co najmniej 48–72 h) z wykorzystaniem FCS.</li>
	<li>Stymulować komórki śródbłonka TGF-β2 (końcowe stężenie 1 ng/ml) po 24 godzinach.</li>
	<li>Hodowla komórek w nawilżanym inkubatorze (5% CO2, 37 °C). Codziennie monitoruj komórki, koncentrując się na zmianach morfologicznych.</li>
	<li>Zastąp pożywkę świeżymi, wstępnie ogrzanymi pożywkami hodowlanymi zawierającymi TGF-β2 po 48 godzinach leczenia TGF-β w długotrwałej hodowli.</li>
	<li>Przejdź do dalszych analiz. Zazwyczaj reorganizację aktyny obserwuje się po 24 godzinach leczenia, a regulację w dół markerów śródbłonka i regulację w górę markerów mezenchymalnych obserwuje się po 48–72 godzinach leczenia TGF-β.</li>
</ol>
2. Analiza immunocytochemiczna
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki MS-1 w standardowych warunkach hodowli.</li>
	<li>Umieść komórki MS-1 na 4-dołkowych szkiełkach w komorze do hodowli komórek o wymiarach 1,0 x 10,3 komórki na studzienkę (1,7cm2). Szkiełka są wstępnie pokryte żelatyną. Użyj 0,5–1,0 ml pożywki hodowlanej na studzienkę.</li>
	<li>Stymulować komórki śródbłonka TGF-β2 (końcowe stężenie 1 ng/ml) po 24 godzinach. Analizując udział ROCK w EndMT, dodaj inhibitor ROCK Y-27632 (10 μM) 1 godzinę przed leczeniem TGF-β. Oceniając wpływ hamowania sygnalizacji TGF-β, można zastosować inhibitory kinazy receptora TGF-β.</li>
	<li>Hodowla komórek w nawilżanym inkubatorze (5% CO2, 37 °C). Reorganizację aktyny obserwuje się w komórkach MS-1 po 24 godzinach leczenia TGF-β. Inne zmiany stają się widoczne po 48–72 godzinach leczenia. W przypadku 72 godzin hodowli należy zastąpić pożywkę świeżą pożywką zawierającą TGF-β po 48 godzinach leczenia TGF-β.</li>
	<li>Barwienie F-aktyną
	<ol>
		<li>Po 24 godzinach leczenia TGF-β usuń pożywkę, utrwal komórki 4% paraformaldehydem w 1x PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej i przepłucz komórki 1x PBS.</li>
		<li>Inkubować z 0,2% Triton X-100 przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przepłucz komórki trzykrotnie 1x PBS.</li>
		<li>Inkubować z izotiocyjanianem falloidyny-tetrametylorodaminy B z Amanita phalloides rozcieńczonym 150-krotnie buforem blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przepłucz komórki trzykrotnie 1x PBS.</li>
		<li>Wybarwić jądra barwnikami wiążącymi cyjaninowe kwasy nukleinowe przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Opłucz szkiełka podstawowe i zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełku ekranem do dołu za pomocą nośnika do mocowania szkiełek.</li>
		<li>Obserwuj pod mikroskopem konfokalnym. Użyj lasera o długości fali 543 nm i filtra emisyjnego o długości fali 560–615 nm do wykrywania fluorescencji falloidyny. Do barwienia jądrowego należy użyć lasera o długości fali 633 nm i filtra emisyjnego dłuższego niż 650 nm. Po leczeniu TGF-β zaobserwowano tworzenie się grubych włókien stresowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie VE-kadheryną i α-SMA
	<ol>
		<li>Po 72 godzinach leczenia TGF-β usunąć pożywkę, utrwalić komórki zimnym 50% metanolem i 50% acetonem (0,5–1,0 ml na studzienkę) przez 5 minut.</li>
		<li>Wypłucz komórki trzykrotnie 1x PBS (0,5-1,0 ml na studzienkę).</li>
		<li>Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C w ciemności, zgodnie ze stężeniem zalecanym przez producenta. Użyj przeciwciała monoklonalnego VE-kadheryny (BV13, rozcieńczenie 1:100) i przeciwciała monoklonalnego α-SMA sprzężonego z Cy3 (1A4, rozcieńczenie 1:200)20.</li>
		<li>Przepłucz komórki trzykrotnie 1x PBS.</li>
		<li>Inkubować komórki z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z zielonym barwnikiem przeciwko przeciwciału VE-kadheryny w buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności zgodnie ze stężeniem zalecanym przez producenta.</li>
		<li>Przepłucz komórki trzykrotnie 1x PBS.</li>
		<li>Wybarwić jądra barwnikami wiążącymi cyjaninowe kwasy nukleinowe przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Opłucz szkiełka podstawowe i zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełku ekranem do dołu za pomocą nośnika do mocowania szkiełek.</li>
		<li>Obserwuj pod mikroskopem konfokalnym. Do wykrywania α-SMA (Cy3) należy użyć lasera o długości fali 543 nm i filtra emisyjnego o długości fali 560–615 nm. Do wykrywania kadheryny VEGE należy użyć lasera o długości fali 488 nm i filtra emisyjnego o długości fali 505–550 nm. Zazwyczaj po leczeniu TGF-β obserwuje się zmniejszenie sygnałów VE-kadheryny i zwiększenie sygnałów α-SMA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Trójwymiarowy test skurczu żelu kolagenowego
<ol>
	<li>Przeprowadzić hodowlę komórek MS-1 z/bez TGF-β przez 72 godziny przed testem skurczu żelu kolagenowego.</li>
	<li>Przygotuj żel kolagenowy typu I na lodzie. Wymieszaj zimny roztwór kolagenu, 10x skoncentrowane podłoże MEM i bufor rozcieńczający kolagen zawierający 0,05 N NaOH, 2,2%NaHCO3 i 200 mM HEPES pH 7,4 w stosunku 8:1:1.</li>
	<li>Wymieszać 200 ml zawiesiny komórek śródbłonka kontrolnej lub TGF-β (1,0 x 106 komórek/200 μl) i 800 μl roztworu żelu kolagenowego. W przypadku próbek poddanych działaniu TGF-β dodać TGF-β2 (1 ng/ml) do zawiesiny komórek.</li>
	<li>Dodać 1,0 ml mieszaniny do każdego dołka z 12-dołkowymi płytkami hodowlanymi i pozostawić do zestalenia w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 30–60 minut.</li>
	<li>Po żelatynizacji nałóż 1,0 ml MEM-α zawierającego 10% FCS, 50 U/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny, aby unosić żel. W przypadku próbek poddanych działaniu TGF-β należy dodać TGF-β2 (1 ng/ml) do pożywki. 
	UWAGA: W przypadku próbek poddanych działaniu TGF-β należy dodać TGF-β zarówno do żelu, jak i pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Inkubować pływające żele w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.</li>
	<li>Zeskanuj obrazy żeli od spodu płytek za pomocą skanera. Alternatywnie, rejestruj obrazy żeli za pomocą aparatu cyfrowego w stałej odległości nad żelami.</li>
	<li>Określ ilościowo powierzchnię żelu na podstawie liczby pikseli za pomocą ImageJ. Wybierz żel za pomocą zaznaczania odręcznego lub powiązanych narzędzi do zaznaczania lub wybierz żel za pomocą "Obraz | Dostosuj | Próg koloru", a następnie określ obszar żelu za pomocą "Analizuj | Zmierz polecenie".</li>
</ol>
4. Hamowanie aktywności miRNA przez inhibitory miRNA oparte na zablokowanych kwasach nukleinowych
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki MS-1 w standardowych warunkach hodowli.</li>
	<li>Transfekcyjne inhibitory miRNA zablokowanych kwasów nukleinowych (LNA), syntetyczne dupleksy miRNA lub siRNA (20 lub 50 nM) przy użyciu odczynników lipofekcji zgodnie z instrukcją producenta. Szczegóły i źródła inhibitorów miRNA LNA, syntetycznych dupleksów miRNA i siRNA zostały opisane w naszych poprzednich raportach26,27. W komórkach MS-1 standardowe procedury transfekcji oparte na instrukcji producenta sprawdzają się przy wprowadzaniu inhibitorów miRNA LNA, syntetycznych dupleksów miRNA lub siRNA.</li>
	<li>Po 16–48 godzinach stymuluj komórki śródbłonka TGF-β2 (końcowe stężenie 1 ng/ml).</li>
	<li>Przejdź do różnych dalszych analiz, w tym analizy ekspresji RNA (ilościowe analizy RT-PCR i sekwencjonowania RNA (sekwencjonowanie RNA)), analiza immunocytochemiczna i test reporterowy. Dalsze analizy zostały opisane w naszych poprzednich raportach20,26,27.</li>
</ol>

<ol><li>Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-to-mesenchymal+transition+in+cardiovascular+diseases%3A+Developmental+signaling+pathways+gone+awry%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry.</a> Developmental Dynamics. , (2017).</li>
<li>Markwald, R. R., Fitzharris, T. P., Smith, W. N. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0012160675903218">Structural analysis of endocardial cytodifferentiation.</a> Developmental Biology. 42 (1), 160-180 (1975).</li>
<li>Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+atrioventricular+valvuloseptal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis.</a> Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+are+progenitors+of+cardiac+pericytes+and+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells are progenitors of cardiac pericytes and vascular smooth muscle cells.</a> Nature Communications. 7, 12422(2016).</li>
<li>DeRuiter, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+endothelial+cells+transdifferentiate+into+mesenchymal+cells+expressing+smooth+muscle+actins+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Embryonic endothelial cells transdifferentiate into mesenchymal cells expressing smooth muscle actins in vivo and in vitro.</a> Circulation Research. 80 (4), 444-451 (1997).</li>
<li>Arciniegas, E., Neves, C. Y., Carrillo, L. M., Zambrano, E. A., Ramirez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-mesenchymal+transition+occurs+during+embryonic+pulmonary+artery+development%5BTitle%5D)+AND+%22Endothelium%22%5BJournal%5D)">Endothelial-mesenchymal transition occurs during embryonic pulmonary artery development.</a> Endothelium. 12 (4), 193-200 (2005).</li>
<li>Welch-Reardon, K. M., Wu, N., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+partial+endothelial-mesenchymal+transitions+in+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">A role for partial endothelial-mesenchymal transitions in angiogenesis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (2), 303-308 (2015).</li>
<li>Zeisberg, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-to-mesenchymal+transition+contributes+to+cardiac+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis.</a> Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).</li>
<li>Chen, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-to-mesenchymal+transition+drives+atherosclerosis+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Endothelial-to-mesenchymal transition drives atherosclerosis progression.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4514-4528 (2015).</li>
<li>Bostrom, K. I., Yao, J., Guihard, P. J., Blazquez-Medela, A. M., Yao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-mesenchymal+transition+in+atherosclerotic+lesion+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerotic lesion calcification.</a> Atherosclerosis. , 124-127 (2016).</li>
<li>Qiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+fate+mapping+in+mice+with+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension.</a> Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).</li>
<li>Ranchoux, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25593290">Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension.</a> Circulation. 131 (11), 1006-1018 (2015).</li>
<li>Maddaluno, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EndMT+contributes+to+the+onset+and+progression+of+cerebral+cavernous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations.</a> Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).</li>
<li>Krenning, G., Zeisberg, E. M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+fibroblasts+and+mechanism+of+cardiac+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis.</a> Journal of Cell Physiology. 225 (3), 631-637 (2010).</li>
<li>Cooley, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+mediates+endothelial-to-mesenchymal+transition+%28EndMT%29+during+vein+graft+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling.</a> Science Translational Medicine. 6 (227), 227ra234(2014).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+Growth+Factor-beta1+Induces+Endothelial-to-Mesenchymal+Transition+via+Akt+Signaling+Pathway+in+Renal+Transplant+Recipients+with+Chronic+Allograft+Dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transforming Growth Factor-beta1 Induces Endothelial-to-Mesenchymal Transition via Akt Signaling Pathway in Renal Transplant Recipients with Chronic Allograft Dysfunction.</a> Annals of Transplantation. 21, 775-783 (2016).</li>
<li>Xu-Dubois, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+Endothelial-to-Mesenchymal+Transition%3A+Evidence+for+Antibody-Endothelium+Interaction+during+Antibody-Mediated+Rejection+in+Kidney+Recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Markers of Endothelial-to-Mesenchymal Transition: Evidence for Antibody-Endothelium Interaction during Antibody-Mediated Rejection in Kidney Recipients.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (1), 324-332 (2016).</li>
<li>Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+endothelial+to+mesenchymal+transition+as+a+source+for+carcinoma-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts.</a> Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).</li>
<li>Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., Gomez-Puerto, M. C., Ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-Induced+Endothelial-Mesenchymal+Transition+in+Fibrotic+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-Induced Endothelial-Mesenchymal Transition in Fibrotic Diseases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).</li>
<li>Mihira, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-induced+mesenchymal+transition+of+MS-1+endothelial+cells+requires+Smad-dependent+cooperative+activation+of+Rho+signals+and+MRTF-A%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-induced mesenchymal transition of MS-1 endothelial cells requires Smad-dependent cooperative activation of Rho signals and MRTF-A.</a> Journal of Biochemistry. 151 (2), 145-156 (2012).</li>
<li>Hashimoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-mesenchymal+transition+in+bleomycin-induced+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Endothelial-mesenchymal transition in bleomycin-induced pulmonary fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 43 (2), 161-172 (2010).</li>
<li>Suzuki, H. I., Miyazono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+microRNA+biogenesis%3A+crosstalk+between+p53+network+and+microRNA+processing+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Dynamics of microRNA biogenesis: crosstalk between p53 network and microRNA processing pathway.</a> Journal of Molecular Medicine (Berl). 88 (11), 1085-1094 (2010).</li>
<li>Suzuki, H. I., Miyazono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+complexity+of+microRNA+generation+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Emerging complexity of microRNA generation cascades.</a> Journal of Biochemistry. 149 (1), 15-25 (2011).</li>
<li>Nicoloso, M. S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S., Calin, G. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19262572">MicroRNAs--the micro steering wheel of tumour metastases.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (4), 293-302 (2009).</li>
<li>Lagendijk, A. K., Goumans, M. J., Burkhard, S. B., Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-23+restricts+cardiac+valve+formation+by+inhibiting+Has2+and+extracellular+hyaluronic+acid+production%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-23 restricts cardiac valve formation by inhibiting Has2 and extracellular hyaluronic acid production.</a> Circulation Research. 109 (6), 649-657 (2011).</li>
<li>Katsura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-31+is+a+positive+modulator+of+endothelial-mesenchymal+transition+and+associated+secretory+phenotype+induced+by+TGF-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-31 is a positive modulator of endothelial-mesenchymal transition and associated secretory phenotype induced by TGF-beta.</a> Genes Cells. 21 (1), 99-116 (2016).</li>
<li>Suzuki, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+TGF-beta-mediated+endothelial-mesenchymal+transition+by+microRNA-27%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of TGF-beta-mediated endothelial-mesenchymal transition by microRNA-27.</a> Journal of Biochemistry. 161 (5), 417-420 (2017).</li>
<li>Camenisch, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+distinct+TGFbeta+ligand+requirements+during+mouse+and+avian+endocardial+cushion+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal and distinct TGFbeta ligand requirements during mouse and avian endocardial cushion morphogenesis.</a> Developmental Biology. 248 (1), 170-181 (2002).</li>
<li>Krenning, G., Moonen, J. R., van Luyn, M. J., Harmsen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+cells+for+use+in+vascular+tissue+engineering+obtained+by+endothelial-to-mesenchymal+transdifferentiation+%28EnMT%29+on+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle cells for use in vascular tissue engineering obtained by endothelial-to-mesenchymal transdifferentiation (EnMT) on collagen matrices.</a> Biomaterials. 29 (27), 3703-3711 (2008).</li>
<li>Medici, D., Potenta, S., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta2+promotes+Snail-mediated+endothelial-mesenchymal+transition+through+convergence+of+Smad-dependent+and+Smad-independent+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta2 promotes Snail-mediated endothelial-mesenchymal transition through convergence of Smad-dependent and Smad-independent signalling.</a> Biochemical Journal. 437 (3), 515-520 (2011).</li>
<li>Krizbai, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-mesenchymal+transition+of+brain+endothelial+cells%3A+possible+role+during+metastatic+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Endothelial-mesenchymal transition of brain endothelial cells: possible role during metastatic extravasation.</a> PLoS One. 10 (3), e0119655(2015).</li>
<li>Arciniegas, E., Sutton, A. B., Allen, T. D., Schor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta+1+promotes+the+differentiation+of+endothelial+cells+into+smooth+muscle-like+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta 1 promotes the differentiation of endothelial cells into smooth muscle-like cells in vitro.</a> Journal of Cell Science. 103 (Pt 2), 521-529 (1992).</li>
<li>Deissler, H., Deissler, H., Lang, G. K., Lang, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+induces+transdifferentiation+of+iBREC+to+alphaSMA-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">TGFbeta induces transdifferentiation of iBREC to alphaSMA-expressing cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 18 (4), 577-582 (2006).</li>
<li>Paranya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+valve+endothelial+cells+undergo+transforming+growth+factor-beta-mediated+and+non-transforming+growth+factor-beta-mediated+transdifferentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro.</a> American Journal of Pathology. 159 (4), 1335-1343 (2001).</li>
<li>Maleszewska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1beta+and+TGFbeta2+synergistically+induce+endothelial+to+mesenchymal+transition+in+an+NFkappaB-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">IL-1beta and TGFbeta2 synergistically induce endothelial to mesenchymal transition in an NFkappaB-dependent manner.</a> Immunobiology. 218 (4), 443-454 (2013).</li>
<li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal-endothelial+transition+contributes+to+cardiac+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization.</a> Nature. 514 (7524), 585-590 (2014).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+balance+of+aberrant+Rasal1+promoter+methylation+and+hydroxymethylation+regulates+cardiac+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Research%22%5BJournal%5D)">Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis.</a> Cardiovasc Research. 105 (3), 279-291 (2015).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Endothelial+Cells+with+Distinct+Patterns+of+TGFbeta-Driven+Endothelial-to-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition.</a> Cancer Research. 75 (7), 1244-1254 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Doniesiono, że aktywowane Ras i TGF-β leczenie przez 24 godziny indukowały EndMT w komórkach MS-1, podczas gdy sam TGF-β nie indukował EndMT w tym krótkim okresie21. Konsekwentnie, zaobserwowaliśmy, że TGF-β znacząco indukował EndMT po dłuższym leczeniu (48-72 h) w komórkach MS-120. EndMT obserwowano wielokrotnie po długotrwałym leczeniu TGF-β (2-6 dni) w różnych komórkach śródbłonka, takich jak ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), ludzkie komórki mikronaczy...

Przejście śródbłonkowo-mezenchymalne (EndMT) to proces, w którym zróżnicowana komórka śródbłonka ulega różnorodnym zmianom molekularnym, w wyniku czego powstaje komórka mezenchymalna podobna do fibroblastu1. EndMT został początkowo opisany jako transformacja komórek śródbłonka podczas rozwoju serca2,3. We wczesnym rozwoju serca rurka serca składa się z wewnętrznego wsierdzia i zewnętrznego mięśnia sercowego. Te dwie warstwy są oddzielone warstwą macierzy zewnątrzkomórkowej zwaną galaretką serca. Embrionalne komórki wsierdzia, które nabywają markery komórek śródbłonka, przechodzą do komórek mezenchymalnych, atakują leżącą pod spodem galaretkę serca i sprzyjają tworzeniu się poduszek sercowych, stanowiąc podstawę dla zastawek przedsionkowo-komorowych i przegrody oraz zastawek półksiężycowatych. Ponadto zasugerowano, że EndMT jest źródłem perycytów i komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych w innych embrionalnych układach naczyniowych, w tym naczyniach wieńcowych, aorcie brzusznej i tętnicy płucnej4,5,6. Ponadto EndMT jest zaangażowany w fizjologiczne kiełkowanie angiogenne7.
Coraz więcej dowodów sugeruje, że EndMT jest również zaangażowany w wiele chorób sercowo-naczyniowych i innych chorób1,8. Stany związane z EndMT obejmują zwapnienie naczyń krwionośnych, miażdżycę, tętnicze nadciśnienie płucne, malformacje jamiste, zwłóknienie narządów, przebudowę przeszczepu żyły, dysfunkcję przeszczepu allogenicznego po przeszczepieniu nerki i raka8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. W niedawnym raporcie opisano, że kilka molekularnych markerów EndMT może być narzędziem do diagnozowania i przewidywania prognoz dysfunkcji przeszczepu nerki po przeszczepieniu nerki17. Wykazano, że modulacja komórkowych szlaków sygnałowych związanych z EndMT łagodzi kilka stanów chorobowych, w tym zwłóknienie serca i przebudowę przeszczepu żyły w modelach zwierzęcych8,15. Dlatego zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw EndMT jest ważne dla opracowania strategii diagnostycznych i terapeutycznych ukierunkowanych na EndMT.
EndMT charakteryzuje się utratą połączeń komórka-komórka, wzrostem potencjału migracyjnego, regulacją w dół genów specyficznych dla śródbłonka, takich jak VE-kadheryna, oraz regulacją w górę genów mezenchymalnych, w tym aktyny α-mięśni gładkich (α-SMA). Ponadto EndMT i przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT), podobny proces, który przekształca komórki nabłonkowe w komórki mezenchymalne, są związane ze zmienioną produkcją różnych składników macierzy zewnątrzkomórkowej, co może przyczyniać się do rozwoju zwłóknienia tkanek8,19.
Ostatnio, kilka badań in vitro EndMT wyjaśniło szczegóły mechanizmów molekularnych EndMT15,20. EndMT jest indukowany przez różne szlaki sygnałowe, w tym transformujący czynnik wzrostu (TGF)-β, Wnt i Notch1. Wśród nich TGF-β odgrywa kluczową rolę we wprowadzaniu zarówno EMT, jak i EndMT. W EndMT długotrwała ekspozycja na TGF-β powoduje EndMT w różnych komórkach śródbłonka, podczas gdy krótka ekspozycja wydaje się niewystarczająca21. Opisaliśmy tutaj prosty protokół indukcji EndMT, w którym mysie komórki śródbłonka trzustki MILE SVEN 1 (MS-1) są poddawane EndMT in vitro po długotrwałej ekspozycji na TGF-β20. W tym modelu można przeprowadzić wiele dalszych analiz w celu zbadania charakterystycznych cech EndMT, w tym zmian morfologicznych, regulacji w dół markerów śródbłonka, regulacji w górę markerów mezenchymalnych i genów zapalnych, rearanżacji cytoszkieletu i skurczu żelu kolagenowego.
MicroRNA (miRNAs) to ~22 nt małe regulatorowe RNA, które kierują potranskrypcyjną represją różnych celów mRNA22,23. Poprzez rozpoznawanie celu za pośrednictwem sekwencji nasion, miRNA tłumią setki genów docelowych i modulują różne funkcje komórkowe, takie jak różnicowanie komórek, proliferacja i ruchliwość. Dotyczy to również regulacji EMT i EndMT, a kilka miRNA zostało zgłoszonych jako regulatory EMT i EndMT24,25. Model EndMT przedstawiony w niniejszym przeglądzie można łatwo połączyć z procedurami modulacji miRNA w celu zbadania roli miRNA w EndMT. Niniejszy przegląd podsumowuje nasze procedury eksperymentalne mające na celu zbadanie EndMT indukowanego przez TGF-β w komórkach MS-1, a także zawiera porównanie warunków indukcji EndMT przez TGF-β w innych komórkach śródbłonka.

<table><tbody><tr><td>Komórki MS-1</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego</td><td>CRL-2279</td><td></td></tr><tr><td>MEM-alpha</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32571036</td><td></td></tr><tr><td>TGF-beta2</td><td>R& D</td><td>302-B2-002</td><td></td></tr><tr><td>4-dołkowy szkiełko komorowe Lab-Tek II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>154526</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Blocking One</td><td>Nacalai tesque</td><td>03953-95</td><td></td></tr><tr><td>falloidyna-tetrametylorodamina B izotiocyjanian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>Jodek TOTO-3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T3604</td><td></td></tr><tr><td>VE kadheryna przeciwciało monoklonalne (BV13)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-1441-82</td><td></td></tr><tr><td>alfa-SMA Przeciwciało monoklonalne Cy3 (1A4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6198</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozia anty-mysia IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>174934</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kolagenu</td><td>Nitta gelatin Inc.</td><td>Cellmatrix I-P</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do rozcieńczania kolagenu</td><td>Nitta gelatin Inc.</td>Inhibitor miRNA <td>CELLMATRIX I-P</td><td></td></tr><tr><td>LNA</td><td>EXIQON&NBSP;</td><td>miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (kontrola ujemna B i docelowe miRNA)</td><td></td></tr> <tr><td>syntetyczny duplex miRNA</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>miScript miRNA Naśladuje</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektaminę RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778030</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza molekularna przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego wywołanego sygnalizacją transformacji czynnika wzrostu β

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Plastyczność fenotypowa komórek śródbłonka leży u podstaw rozwoju układu sercowo-naczyniowego, chorób sercowo-naczyniowych i różnych stanów związanych ze zwłóknieniem narządów. W tych warunkach zróżnicowane komórki śródbłonka uzyskują fenotypy podobne do mezenchymalów. Proces ten nazywa się przejściem śródbłonkowo-mezenchymalnym (EndMT) i charakteryzuje się regulacją w dół markerów śródbłonka, regulacją w górę markerów mezenchymalnych i zmianami morfologicznymi. EndMT jest indukowany przez kilka szlaków sygnałowych, w tym transformujący czynnik wzrostu (TGF)-β, Wnt i Notch, i regulowany przez mechanizmy molekularne podobne do tych przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT) ważnych dla gastrulacji, zwłóknienia tkanek i przerzutów raka. Zrozumienie mechanizmów EndMT jest ważne dla opracowania podejść diagnostycznych i terapeutycznych ukierunkowanych na EndMT. Solidna indukcja EndMT in vitro jest przydatna do scharakteryzowania wspólnych sygnatur ekspresji genów, identyfikacji mechanizmów molekularnych zdolnych do stosowania leków i badań przesiewowych pod kątem modulatorów EndMT. W tym miejscu opisujemy metodę indukcji EndMT in vitro. Mysie komórki śródbłonka trzustki MS-1 ulegają EndMT po długotrwałej ekspozycji na TGF-β i wykazują regulację w górę markerów mezenchymalnych i zmian morfologicznych, a także indukcję wielu chemokin i cytokin zapalnych. Uwzględniono również metody analizy modulacji mikroRNA (miRNA). Metody te stanowią platformę do badania mechanizmów leżących u podstaw EndMT i udziału miRNA w EndMT.

TGF-β jest silnym induktorem EndMT w różnych komórkach śródbłonka. Po 24 h traktowaniu komórek MS-1 TGF-β, barwienie na F-aktynę wykazuje reorganizację stresowych włókien aktynowych (Rysunek 1A)20. Wstępne traktowanie inhibitorem ROCK Y-27632 hamuje indukcję reorganizacji aktyny20. Komórki śródbłonka MS-1 zmieniają klasyczną morfologię przypominającą brukowaną nawierzchnię na mezenchymalną morfologię wrzecionowa...

Opisano protokół indukcji in vitro przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego (EndMT), który jest przydatny do badania szlaków sygnalizacji komórkowej związanych z EndMT. W tym modelu eksperymentalnym EndMT jest indukowany przez leczenie TGF-β w komórkach śródbłonka MS-1.

Analiza molekularna przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego wywołanego sygnalizacją transformacji czynnika wzrostu β

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii naczyń krwionośnych i nowotworów, takie jak mechanizmy plastyczności śródbłonka w różnych stanach patologicznych, w tym w raku. Główną zaletą tej techniki jest to, że silna indukcja EndMT in vitro jest osiągana poprzez leczenie komórkami śródbłonka TGF-in MS-1. Najpierw hoduj komórki MS-1 w standardowych warunkach hodowli i unikaj zlewania się kultury.Następnie na 10 cm naczyniu umyj komórki MS-1 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Następnie dodaj 1 ml trypsyny do płytki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie dodaj 9 ml pożywki hodowlanej do trypsynizowanych komórek w celu oderwania.Następnie zbierz trypsynizowaną zawiesinę komórek w probówce o pojemności 15 ml. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 300-400 x G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie użyj automatycznego licznika komórek, aby policzyć liczbę żywotnych komórek.Następnie umieść komórki MS-1 na niepowlekanych standardowych płytkach hodowlanych w celu długotrwałej hodowli. Po 24 godzinach stymuluj komórki śródbłonka końcowym stężeniem 1 ng na mililitr TGF-2. Następnie inkubuj płytkę hodowlaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Po 48 godzinach od poddania działaniu substancji należy zastąpić pożywkę świeżą, wstępnie podgrzaną pożywką hodowlaną zawierającą TGF-2 W celu dalszej analizy umieść komórki MS-1 na 8-dołkowym szkiełku w komorze hodowlanej wstępnie pokrytym żelatyną. Po 24 godzinach dodać 10 M inhibitora ROCK do hodowli komórkowej. Po godzinie stymuluj komórki śródbłonka końcowym stężeniem 1 ng na mililitr TGF-2.Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W przypadku hodowli trwającej 72 godziny, po 48 godzinach zastąp starą pożywkę świeżą pożywką zawierającą TGF-2. Po całym dniu leczenia TGF należy usunąć pożywkę.Następnie utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu i soli fizjologicznej buforowanej fosforanami przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po upływie okresu utrwalania przepłukać komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Następnie inkubować komórki z 0,2% Triton X-100 przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Po pięciu minutach ponownie przepłucz komórki trzykrotnie 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem. Po trzech płukaniach inkubować komórki z rozcieńczoną fluorescencyjną fallotoksyną zawierającą bufor blokujący przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyć komórki trzykrotnie 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem.Następnie wybarwić jądra komórkowe za pomocą barwnika wiążącego cyjaninowy kwas nukleinowy przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po pięciu minutach opłucz szkiełko i zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełku za pomocą nośnika do mocowania szkiełek. Obserwuj komórki pod mikroskopem konfokalnym.Komórki wykazują reorganizację grubych włókien stresowych po leczeniu TGF-2. Wskazuje to na siłę TGF-2 w indukowaniu EndMT w komórkach śródbłonka. Po 72 godzinach leczenia TGF-2 wyrzuć pożywkę i utrwal komórki 0,5 do 1 ml 50% zimnego metanolu i 50% acetonu przez pięć minut.Następnie trzykrotnie przepłucz komórki 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem. Po zakończeniu trzech płukań inkubować komórki z pierwszorzędowymi przeciwciałami w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza, w ciemności. Następnego dnia ponownie przemyj komórki 1x roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem, trzykrotnie.Następnie inkubuj komórki z zielonym barwnikiem sprzężonym z przeciwciałem drugorzędowym przeciwko VE-kadherynie w buforze blokującym, przez godzinę w ciemności. Ponownie umyj komórki trzykrotnie 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem. Następnie wybarwić jądra komórkowe za pomocą barwnika wiążącego cyjaninowy kwas nukleinowy przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Po pięciu minutach przepłucz szkiełko i zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełku za pomocą medium do mocowania szkiełek. Następnie obserwuj komórki pod mikroskopem konfokalnym. Komórki wykazują zmniejszoną ekspresję kadheryny VE i zwiększoną ekspresję aktyny mięśni gładkich po leczeniu TGF-2 przez 48 do 72 godzin.Przed testem skurczu żelu kolagenowego należy hodować komórki MS-1 w obecności i bez TGF-2 przez 72 godziny. Następnie przygotuj żel kolagenowy typu 1 na lodzie. Następnie wymieszać 800 l roztworu żelu kolagenowego z 200 ml komórek śródbłonka podanych działaniu kontrolki lub TGF-2.Następnie dodaj 1 ml tej mieszaniny do każdego dołka 12-dołkowej płytki hodowlanej. Pozwól żelowi zestalić się w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut. Po zestaleniu żelu dodać 1 ml MEM Alpha, zawierającego 10% płodowej surowicy cielęcej, 50 jednostek na mililitr penicyliny i 50 g na mililitr streptomycyny, aby unosić żel.Następnie odłącz żel od ściany studni i inkubuj pływający żel w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Po 48 godzinach inkubacji zeskanuj obrazy żelu od spodu płytki za pomocą skanera. Widoczne są wyraźne zmiany morfologiczne, przekształcające komórki z bruku w mezenchymalną architekturę w kształcie wrzeciona w wyniku ekspozycji na leczenie TGF-2 przez 72 godziny.Co ciekawe, leczenie TGF beta 2 przez 48 do 72 godzin wykazuje wzrost zarówno poziomu mRNA, jak i ekspresji białka aktyny mięśni gładkich w komórkach MS-1. Test skurczu żelu pokazuje również, że po leczeniu TGF-2 żel kolagenu typu 1 znacznie się kurczy. Co ciekawe, pozbawienie TGF-2 obniża aktynę mięśni gładkich do poziomu podstawowego, a komórki wznawiają morfologię bruku, co wskazuje, że EndMT jest procesem dynamicznym.W rzeczywistości hamowanie mikroRNA 31 przez inhibitor mikroRNA LNA przy użyciu komórek MS-1 osłabia indukcję markerów mezenchymalnych. Jednak inhibitor nie wpływa na indukcję genów docelowych TGF, takich jak Fibronektyna 1, PAI-1 i Smad 7. Postępując zgodnie z tą procedurą jako metodą, taką jak ekspresja genów, knockdown lub modulacja mikromacierzy, można wykonać w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak specyficzna funkcja genu i mikroRNA w EndMT.

molecular-analysis-endothelial-mesenchymal-transition-induced

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisana jest prosta metoda indukcji przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego (EMT) w różnych typach komórek.  Uwzględniono metody analizy komórek w stanach EMT za pomocą immunocytochemii.

Indukcja i analiza przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego

Wykazano, że Wykazano, że alternatywna regulacja splicingu przyczynia się do przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT), niezbędnego programu komórkowego w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę wykorzystującą indukowalny model EMT do wykrywania alternatywnego splicingu podczas EMT.

Wykrywanie alternatywnego splicingu podczas przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego

Tutaj opisujemy rozwój i zastosowanie testu skurczu żelu do oceny funkcji skurczu w komórkach mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne.

Opracowanie testu in vitro do oceny funkcji skurczowej komórek mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne

Ten manuskrypt opisuje test tworzenia rurki w celu ilościowego określenia wpływu danego związku lub stanu na angiogenezę za pomocą tworzenia komórek śródbłonka w kontrolowanym środowisku.

Strategiczny test tworzenia rurki śródbłonkowej: porównanie macierzy zewnątrzkomórkowej i zredukowanej macierzy zewnątrzkomórkowej czynnika wzrostu

Prezentujemy tutaj metodę hodowli komórkowej do indukowania przemian mezenchymalno-nabłonkowych (MET) w komórkach mięsaka opartą na połączonej ektopowej ekspresji członków rodziny mikroRNA-200 i ziarnistej głowy 2 (GRHL2). Metoda ta jest odpowiednia do lepszego zrozumienia biologicznego wpływu plastyczności fenotypowej na agresywność raka i leczenie.

Indukcja przejść mezenchymalno-nabłonkowych w komórkach mięsaka

Prezentujemy test siły pociągowej o wysokiej przepustowości wykonany z gumy silikonowej (PDMS). Ten nowatorski test nadaje się do badania fizycznych zmian kurczliwości komórek podczas różnych procesów i chorób biologicznych i biomedycznych. Wykazujemy użyteczność tej metody, mierząc zależny od TGF-β wzrost kurczliwości podczas przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego.

Wysokoprzepustowa mikroskopia sił trakcyjnych z wykorzystaniem PDMS ujawnia zależne od dawki efekty transformacji czynnika wzrostu β na przejście z nabłonka do mezenchymów

terapia miRNA ma znaczący potencjał w regulowaniu progresji raka. Zademonstrowano tu podejścia analityczne stosowane do identyfikacji aktywności kombinatorycznego leczenia miRNA w zatrzymywaniu cyklu komórkowego i angiogenezie.

Analiza skojarzonych zabiegów miRNA w celu regulacji cyklu komórkowego i angiogenezy

Opisujemy systematyczny proces badania sygnalizacji TGF-β i EMT indukowanego przez TGF-β, badając ekspresję białek i genów zaangażowanych w ten szlak sygnałowy. Metody obejmują Western blotting, test reporterowy lucyferazy, qPCR i barwienie immunofluorescencyjne.

Badanie sygnalizacji TGF-β i indukowanego przez TGF-β przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego w raku piersi i prawidłowych komórkach

Opisujemy metody badania EndMT indukowanego przez TGF-β2 w komórkach śródbłonka, obserwując zmiany morfologii komórek i badając zmiany markerów związanych z ekspresją EndMT za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Opisano edycję genu CRISPR/Cas9 i wykorzystano ją do wyczerpania genu kodującego ślimaka w celu zbadania jego roli w EndMT indukowanym przez TGF-β2.

Przejście śródbłonka do mezenchymalnego za pośrednictwem TGF-β (EndMT) i ocena funkcjonalna efektorów EndMT przy użyciu edycji genów CRISPR/Cas9

Tutaj ustalamy protokół jednoczesnej wizualizacji i analizy wielu kompleksów SMAD za pomocą testu ligacji zbliżeniowej (PLA) w komórkach śródbłonka narażonych na patologiczne i fizjologiczne warunki stresu ścinającego płyny.

Wizualizacja i kwantyfikacja sygnalizacji TGFβ/BMP/SMAD w różnych warunkach naprężeń ścinających płyn przy użyciu testu podligowania zbliżeniowego

Obecny protokół pozwala na odzyskanie struktur przypominających rurki powstałych w klasycznym teście angiogenezy in vitro, gdzie komórki, takie jak komórki trofoblastu, organizują się w struktury podobne do naczyń włosowatych na warstwie zewnątrzkomórkowej macierzy błony podstawnej. Odzyskane struktury są wykorzystywane do izolacji RNA i białek do różnych analiz biochemicznych.

Odzyskiwanie komórek trofoblastu z testu tworzenia rurki angiogenezy do analizy ekspresji markerów różnicowania

Poznaj metodę indukcji przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego w komórkach MS-1 za pomocą TGF-β2. Protokół umożliwia analizę zmian morfologicznych i molekularnych, w tym roli mikroRNA w biologii naczyniowej.

Analiza molekularna przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego wywołanego sygnalizacją transformacji czynnika wzrostu β

Przeglądaj więcej filmów