Name: Wizualizacja i kwantyfikacja sygnalizacji TGFβ/BMP/SMAD w różnych warunkach naprężeń ścinających płyn przy użyciu testu podligowania zbliżeniowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji kompleksów SMAD w komórkach śródbłonka pod różnym naprężeniem ścinającym przy użyciu testu PLA. Protokół ten umożliwia ilościową analizę interakcji czynników transkrypcyjnych w biologii naczyniowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Marii Reichenbach i dr Christianowi Hiepenowi za wsparcie w systemie konfiguracji przepływu oraz Eleanor Fox i Yunyun Xiao za krytyczne przeczytanie manuskryptu. Projekt P-L.M. został sfinansowany przez międzynarodową Szkołę Badawczą im. Maxa Plancka IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC). PK otrzymała dofinansowanie z DFG-SFB1444. Rysunek 1 został stworzony przy użyciu BioRender.

1. Hodowla komórkowa i ekspozycja na naprężenia ścinające płynów
UWAGA: Ludzkie EC żyły pępowinowej (HUVEC) zostały użyte jako przykład do badania indukowanej SS interakcji SMAD. Opisany poniżej protokół można zastosować do każdego typu komórki reagującej na SS.
<ol>
	<li>Pokryj 6-kanałowy szkiełko 0,1% żelatyną ze skóry świń w PBS przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Nasiona HUVEC w wstępnie powlekanych szkiełkach 6-kanałowych o gęstości 2,5 x 106 komórek na ml w 30 μl pełnego podłoża M199. 
	UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji na temat rozsiewania komórek na slajdzie przepływu, zobacz reference24.</li>
	<li>Pozostawić komórki na 1 godzinę w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze.</li>
	<li>Dodać 60 μl wstępnie podgrzanej pożywki M199 do każdego ze zbiorników.</li>
	<li>Hodowla przez 2 dni, z delikatną wymianą pożywki raz dziennie, w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze.
	<ol>
		<li>Całkowicie zassać zbiorniki, dodać 120 μl wstępnie podgrzanej pożywki M199 do jednego ze zbiorników i zassać z drugiej strony.</li>
		<li>Dodać 60 μl wstępnie podgrzanej pożywki M199 do obu zbiorników.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmontuj i uruchom konfigurację przepływu zgodnie z opisem w reference25.
	<ol>
		<li>Zamontuj rurki na jednostkach hydraulicznych. W tym przypadku rurki silikonowe o średnicy 0,8 mm i 1,6 mm służą do przyłożenia naprężeń ścinających odpowiednio 1 dyn/cm2 i 30 dyn/ cm 2. 
		UWAGA: Materiał i długość rurki powinny pozostać stałe, ponieważ zmiany mogą wpływać na powstałe naprężenia ścinające. Ogólnie rzecz biorąc, można stosować inne kombinacje systemów pompowych i przewodów, o ile znane jest wynikowe naprężenie ścinające, a pompa wytwarza stały przepływ laminarny.</li>
		<li>Napełnij zbiorniki odpowiednią ilością wstępnie podgrzanego pełnego podłoża M199 (minimum 10 ml).</li>
		<li>Podłącz jednostki hydrauliczne z rurkami do układu pompy i wykonaj wstępny rozruch bez komórek, aby zrównoważyć medium i usunąć resztki powietrza25.</li>
		<li>Połącz szeregowo pojedyncze kanały na 6-kanałowej prowadnicy ze sobą za pomocą rurki do połączeń szeregowych. Pierwszy i ostatni kanał na suwaku zostaną podłączone do rurki zmontowanej w 1.6.1 (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1A dla schematu). Należy uważać, aby nie wprowadzać powietrza do systemu, ponieważ może to poważnie uszkodzić ogniwa. Więcej informacji na temat połączenia szeregowego można znaleźć w reference26.</li>
		<li>W przypadku narażenia komórek na wysokie poziomy naprężeń ścinających (>20 dyn/cm2) należy zastosować fazę narastania, tj. zwiększać naprężenie ścinające stopniowo wraz z fazami adaptacji. Kroki można ustawiać w krokach co 5 dyn/cm2 na 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Fiksacja
<ol>
	<li>Odłączyć szkiełka od pomp po wystawieniu płynu na działanie SS. Użyj zacisków na wężyku podczas odłączania, aby uniknąć rozlania medium w inkubatorze.</li>
	<li>Natychmiast przenieś przepływ ślizga się po lodzie, podczas gdy pozostała rurka jest odłączana sekwencyjnie. Podczas wyjmowania rurki ze zbiorników, zbiornik po drugiej stronie powinien być zamknięty palcem, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza w kanale. Może to kolidować z krokami fiksacji.</li>
	<li>Trzymając komórki na lodzie, ostrożnie odessać pożywkę ze zbiorników, ale nie z kanału, w którym znajdują się komórki. Następnie przemyć próbki zimnym, sterylnym PBS (4 °C) o trzykrotnie większej objętości kanału (90 μl). Dodaj PBS do jednego zbiornika i ostrożnie odessaj z drugiego zbiornika. Powtórz ten krok w każdym z 6 kanałów na slajd. 
	UWAGA: Dla wszystkich etapów przemywania i inkubacji odpowiedni roztwór jest dodawany do jednego ze zbiorników, co prowadzi do wymiany roztworów w kanale. Aby umożliwić całkowite zastąpienie roztworów w kanale, nadmiar roztworu jest następnie zasysany z drugiego zbiornika. Roztwór na górze komórek w kanale nie jest usuwany. Komórki nie powinny wysychać w żadnym momencie. Dlatego ważne jest, aby myć ostrożnie, bez wprowadzania pęcherzyków powietrza do szkiełek.</li>
	<li>Utrwalić komórki, dodając 90 μl buforowanego 4% roztworu PFA w tym samym zbiorniku, w którym wcześniej dodano PBS i podobnie odessać ciecz z drugiego zbiornika. Powtórz ten krok w każdym kanale na każdym slajdzie. Po dodaniu roztworu PFA przenieść próbki z lodu do temperatury pokojowej (RT) i inkubować przez 20 min. 
	UWAGA: PFA jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie. Używaj rękawiczek i pracuj pod wyciągiem.</li>
	<li>Przemyj komórki 3x PBS (RT), dodając go do jednego zbiornika i ostrożnie zasysając z drugiego zbiornika. Opróżnij tylko zbiorniki, uważając, aby nie wysuszyć kanału. Powtórz ten krok dla każdego z 6 kanałów na slajdzie.</li>
	<li>Utrwalanie PFA należy ugasić przez dodanie 90 μl 50 mM chlorku amonu w temperaturze otoczenia do PBS w jednym ze zbiorników. Odessać nadmiar roztworu z drugiego zbiornika. Powtórz te czynności dla każdego kanału na slajdzie. Inkubować próbki przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyć zgodnie z opisem w kroku 2.5. 
	UWAGA: W tym momencie próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez noc lub protokół może być natychmiast kontynuowany z blokowaniem i inkubacją przeciwciał pierwotnych (patrz krok 3).</li>
</ol>
3. Blokowanie i inkubacja przeciwciał pierwotnych
<ol>
	<li>Aby przepuszczalność komórek, dodaj 90 μl 0,3% Triton-X-100 w PBS do opróżnionego zbiornika i odessaj z drugiego zbiornika dla każdego kanału. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyć zgodnie z opisem w kroku 2.5.</li>
	<li>Dodać 90 μl sterylnego roztworu blokującego PLA do jednego zbiornika kanału i odessać z drugiej strony. Powtórz ten krok dla każdego kanału. Blok przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze.
	<ol>
		<li>Aby przygotować nawilżoną komorę, użyj 10 cm naczynia z mokrą chusteczką uszczelnioną folią woskową i umieść naczynie w inkubatorze. Alternatywnie można zastosować inne formaty komór wilgotnościowych, które zapewniają wilgotną atmosferę. 
		UWAGA: Alternatywnie można użyć samodzielnie przygotowanego roztworu blokującego (np. 3% (w/v) BSA w PBS, sterylnie przefiltrowany).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe (1:100) w rozcieńczalniku przeciwciał PLA. Przygotować 30 μl roztworu na kanał. Dodaj oba przeciwciała pierwszorzędowe jednocześnie i vortex. 
	UWAGA: Alternatywnie można użyć samodzielnie wykonanego rozcieńczalnika przeciwciał (np. 1% (w/v) BSA w PBS). Stosowane tutaj przeciwciała to kombinacje SMAD1-SMAD2/3, SMAD2/3-SMAD4 i fosfo-SMAD1/5-SMAD4. Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli Materiałów.</li>
	<li>Przed zastosowaniem przeciwciał pierwszorzędowych należy odessać roztwór blokujący ze zbiorników, a także ostrożnie z kanału. Odpipetować 30 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego natychmiast do pustego kanału, przechylając kanał podczas dodawania roztworu. 
	UWAGA: Usuń roztwór blokujący i dodaj roztwór przeciwciała kanał po kanale, aby upewnić się, że komórki nie wyschną pomiędzy nimi.</li>
	<li>Próbki z przeciwciałami pierwszorzędowymi inkubować przez noc w wilgotnych komorach w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Inkubację można również przeprowadzać przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, jeśli jesteś zainteresowany kontynuowaniem następujących kroków tego samego dnia.</li>
</ol>
4. Inkubacja sondy PLA
UWAGA: Dla wszystkich kroków w sekcji 4.1-7.3, myjące A i B są przechowywane w temperaturze 4 °C i muszą być podgrzane do temperatury RT przed użyciem.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć sondy PLA (+) -mysz i (-)-królik w stosunku 1:5 w roztworze rozcieńczalnika przeciwciał PLA (lub 1% BSA). Przygotuj 30 μl na kanał.</li>
	<li>Przemywać próbki 2x przez 5 minut przy użyciu 90 μl buforu płuczącego A w temperaturze pokojowej, dodając go do jednego ze zbiorników i ostrożnie zasysając z drugiego zbiornika. Powtórz ten krok dla każdego z 6 kanałów na slajdzie.</li>
	<li>Ostrożnie odessać bufor płuczący A i dodać 30 μl roztworu sondy PLA (przygotowanego w kroku 4.1), podobnie jak w przypadku dodawania przeciwciał pierwszorzędowych w kroku 3.5.</li>
	<li>Inkubować próbki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze.</li>
</ol>
5. Podwiązanie
<ol>
	<li>Przemywać próbki 2 razy przez 5 minut, używając 90 μl buforu A do przemywania w temperaturze pokojowej, jak opisano w ppkt 4.2.</li>
	<li>Przygotować bufor do podwiązania w stosunku 1:5 w wodzie dejonizowanej. Użyj tego buforu, aby rozcieńczyć enzym ligazy do 1:40 (na lodzie). Użyj 30 μl na kanał.</li>
	<li>Całkowicie odessać bufor płuczący A i dodać roztwór do podwiązywania zgodnie z opisem w ppkt 3.5.</li>
	<li>Próbki inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze.</li>
</ol>
6. Wzmocnienie
<ol>
	<li>Przemywać próbki 2 razy przez 2 minuty, używając 90 μl buforu płuczącego A w temperaturze pokojowej, jak opisano w ppkt 4.2.</li>
	<li>Przygotować bufor amplifikacyjny, rozcieńczając go w stosunku 1:5 w wodzie dejonizowanej i użyć go do rozcieńczenia enzymu polimerazy do 1:80 (na lodzie). Chronić przed światłem. Przygotuj 30 μl na kanał.</li>
	<li>Całkowicie odessać bufor płuczący A i natychmiast dodać przygotowany roztwór wzmacniający do pustego kanału, jak opisano w ppkt 3.5. Próbki inkubować przez 100 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze.</li>
</ol>
7. Montaż
<ol>
	<li>Przemywać próbki 2x przez 10 minut, używając 90 μl buforu płuczącego B w temperaturze pokojowej, jak opisano w ppkt 4.2. Dodać DAPI (1:500) z 1 mg/ml roztworu podstawowego (w wodzie dejonizowanej) w pierwszym płukaniu, aby zabarwić jądra. Nie susz kanału.</li>
	<li>Rozcieńczyć bufor B do przemywania w wodzie dejonizowanej (1:10) i przemyć 1x 90 μl 0,1x roztworu buforu B, jak opisano w 4.2.</li>
	<li>Całkowicie odessać bufor płuczący B i natychmiast dodać 2-3 krople płynnego medium montażowego do jednego zbiornika. Rozprowadź go w kanale, przechylając suwak. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C w wilgotnym środowisku do czasu wykonania obrazowania.</li>
</ol>
8. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Upewnij się, że dostępne są odpowiednie filtry pasujące do fluorescencyjnych sond PLA. 
	UWAGA: Jeśli to możliwe, korzystne jest użycie mikroskopu konfokalnego, ponieważ uzyskane plamki PLA są bardziej zdefiniowane. Wspiera to również dalsze przetwarzanie obrazu i analizę danych.</li>
</ol>
9. Analiza obrazu i kwantyfikacja za pomocą ImageJ/FIJI
<ol>
	<li>Przetwarzaj wyeksportowane obrazy (.tiff) za pomocą programu do przetwarzania obrazów, takiego jak ImageJ27. 
	UWAGA: Wszystkie skrypty używane w tym badaniu, które są niezbędne do automatycznego zliczania zdarzeń komórkowych, jądrowych i wszystkich zdarzeń PLA (na komórkę) można znaleźć w repozytorium GitHub: https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis. Wykonaj analizę statystyczną za pomocą dowolnego odpowiedniego programu lub narzędzia.</li>
</ol>

<ol><li>Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+BMP+receptors%3A+Specificity%2C+activation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+and+Growth+Factor+Reviews%22%5BJournal%5D)">Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).</li>
<li>Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+BMP+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+and+Growth+Factor+Reviews%22%5BJournal%5D)">Recent advances in BMP receptor signaling.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).</li>
<li>Hiepen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMPR2+acts+as+a+gatekeeper+to+protect+endothelial+cells+from+increased+TGF%CE%B2+responses+and+altered+cell+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGFβ responses and altered cell mechanics.</a> PLoS Biology. 17 (12), 3000557(2019).</li>
<li>Hildebrandt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ActivinA+induced+SMAD1%2F5+Signaling+in+an+iPSC+derived+EC+model+of+Fibrodysplasia+Ossificans+Progressiva+%28FOP%29+can+be+rescued+by+the+drug+candidate+saracatinib%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).</li>
<li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+the+activation+state+of+the+endothelium+via+two+distinct+TGF-beta+type+I+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors.</a> The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).</li>
<li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+receptor-like+kinase+%28ALK%291+is+an+antagonistic+mediator+of+lateral+TGFbeta%2FALK5+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling.</a> Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).</li>
<li>Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta-induced+Smad1%2F5+phosphorylation+in+epithelial+cells+is+mediated+by+novel+receptor+complexes+and+is+essential+for+anchorage-independent+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).</li>
<li>Ramachandran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+uses+a+novel+mode+of+receptor+activation+to+phosphorylate+SMAD1%2F5+and+induce+epithelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">TGF-β uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition.</a> eLife. 7, 31756(2018).</li>
<li>Flanders, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brightfield+proximity+ligation+assay+reveals+both+canonical+and+mixed+transforming+growth+factor-%CE%B2%2Fbone+morphogenetic+protein+Smad+signaling+complexes+in+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry+%3A+The+Official+Journal+of+The+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-β/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).</li>
<li>Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiyazono%2C+K+%22Smad+Signal+Transduction%3A+Smads+in+Proliferation%2C+Differentiation+and+Disease%22">Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease</a>. Dijke, P. T., Heldin, C. -H. , Springer Netherlands. Dordrecht. 277-293 (2006).</li>
<li>Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins+in+vascular+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989(2018).</li>
<li>Cai, J., Pardali, E., Sánchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+in+vascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">BMP signaling in vascular diseases.</a> FEBS Letters. 586 (14), 1993-2002 (2012).</li>
<li>Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulated+TGF-%CE%B2%2FBMP+signaling+in+vascular+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Deregulated TGF-β/BMP signaling in vascular malformations.</a> Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).</li>
<li>MacCarrick, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loeys-Dietz+syndrome%3A+a+primer+for+diagnosis+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+in+Medicine+%3A+An+Official+Journal+of+the+American+College+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management.</a> Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).</li>
<li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li>
<li>Min, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Smad+2%2F3+signaling+by+low+shear+stress+mediates+artery+inward+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling.</a> bioRxiv. , 691980(2019).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+receptor-integrin+interaction+mediates+responses+of+vascular+endothelial+Smad1%2F5+and+proliferation+to+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-specific+activation+of+Smad1%2F5+regulates+vascular+endothelial+cell+cycle+progression+in+response+to+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).</li>
<li>van Dijk, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+TGF-%CE%B2+and+BMP+signaling+in+human+atherosclerosis%3A+A+histological+evaluation+based+on+Smad+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Visualizing TGF-β and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation.</a> Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).</li>
<li>Derwall, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+bone+morphogenetic+protein+signaling+reduces+vascular+calcification+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).</li>
<li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
<li>Alam, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+Ligation+Assay+%28PLA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Proximity Ligation Assay (PLA).</a> Current Protocols in Immunology. 123 (1), 58(2018).</li>
<li>Application Note 03: Growing Cells in µ-Channels. ibidi. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf</a> (2012).</li>
<li>Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf</a> (2019).</li>
<li>ibidi. Application Note 31: Instructions µ-Slide VI 0.4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ibidi%22">ibidi</a>. , (2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Reichenbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+impact+of+fluid+shear+stress+and+YAP%2FTAZ+on+BMP%2FTGF-%CE%B2+induced+osteogenic+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-β induced osteogenic target genes.</a> Advanced Biology. 5 (2), 2000051(2021).</li>
<li>Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((It+takes+two+to+tango%3A+Endothelial+TGF%CE%B2%2FBMP+signaling+crosstalk+with+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">It takes two to tango: Endothelial TGFβ/BMP signaling crosstalk with mechanobiology.</a> Cells. 9 (9), 1965(2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Opisany tutaj protokół oparty na PLA oferuje skuteczny sposób określania bliskiej odległości dwóch białek (np. ich bezpośredniej interakcji) w EC narażonych na naprężenia ścinające z rozdzielczością ilościową i przestrzenną. Dzięki zastosowaniu szkiełek przepływowych z wieloma równoległymi kanałami, w identycznych warunkach mechanicznych można jednocześnie badać kilka różnych oddziaływań białkowych w komórkach. W przeciwieństwie do tego, niestandardowe systemy komór przepływowych często wykorzystują pojedynczy kanał, któ...

Białka z superfamilii czynników wzrostu transformującego beta (TGFβ) to plejotropowe cytokiny obejmujące szereg członków, w tym TGFβ, białka morfogenetyczne kości (BMP) oraz aktywiny1,2. Wiązanie liganda indukuje tworzenie oligomerów receptorowych, co prowadzi do fosforylacji i tym samym aktywacji cytozolowych regulatorowych białek SMAD (R-SMAD). W zależności od podrodziny ligandów aktywowane są różne R-SMAD1,2. Podczas gdy TGFβ i aktywiny indukują głównie fosforylację SMAD2/3, BMP indukują fosforylację SMAD1/5/8. Istnieją jednak narastające dowody na to, że BMP oraz TGFβ/aktywiny aktywują również R-SMAD z drugiej podrodziny w procesie zwanym „sygnalizacją boczną” (lateral signaling)3,4,5,6,7,8 oraz że tworzą się mieszane kompleksy SMAD składające się zarówno z członków SMAD1/5, jak i SMAD2/33,9. Dwa aktywowane R-SMAD tworzą następnie kompleksy trymeryczne ze wspólnym mediatorem SMAD4. Te kompleksy czynników transkrypcyjnych są następnie zdolne do translokacji do jądra komórkowego i regulacji transkrypcji genów docelowych. Białka SMAD mogą wchodzić w interakcje z różnymi koaktywatorami i korepresorami transkrypcyjnymi, co prowadzi do zróżnicowania możliwości regulacji genów docelowych10. Rozregulowanie sygnalizacji SMAD ma poważne skutki w wielu chorobach. W związku z tym zaburzona sygnalizacja TGFβ/BMP może prowadzić do ciężkich patologii naczyniowych, takich jak nadciśnienie tętnicze płuc, wrodzona naczyniośrodkowa telangiektazja lub miażdżyca3,11,12,13,14.
Komórki śródbłonka (ECs) tworzą wewnętrzną warstwę naczyń krwionośnych i są zatem narażone na naprężenie ścinające (SS), czyli siłę tarcia wywołaną lepkim przepływem krwi. Co ciekawe, komórki śródbłonka znajdujące się w częściach naczyń krwionośnych narażonych na wysoki poziom jednorodnego, laminarnego naprężenia ścinającego, pozostają w stanie homeostatycznym i spoczynkowym. W przeciwieństwie do nich, komórki śródbłonka doświadczające niskiego, niejednorodnego naprężenia ścinającego, np. w obrębie rozgałęzień lub mniejszej krzywizny łuku aorty, wykazują właściwości proliferacyjne i aktywują szlaki zapalne15. Z kolei miejsca z dysfunkcyjnymi komórkami śródbłonka są podatne na rozwój miażdżycy. Co istotne, komórki śródbłonka w tych obszarach predysponujących do miażdżycy wykazują aberracyjnie wysokie poziomy aktywowanych białek SMAD2/3 oraz SMAD1/516,17,18. W tym kontekście stwierdzono, że wzmocniona sygnalizacja TGFβ/BMP jest wczesnym zdarzeniem w rozwoju zmian miażdżycowych19, a zakłócenie sygnalizacji BMP znacząco redukuje zapalenie naczyń, tworzenie się miażdżycy oraz związane z nią zwapnienia20.
Analiza ligacji w bliskim sąsiedztwie (PLA) to technika biochemiczna służąca do badania oddziaływań białko-białko in situ21,22. Opiera się ona na specyficzności przeciwciał z różnych gatunków, które mogą wiązać docelowe białka, co umożliwia wysoce specyficzne wykrywanie endogennych oddziaływań białkowych na poziomie pojedynczej komórki. W tej metodzie przeciwciała pierwotne muszą związać się z docelowym epitopem w odległości mniejszej niż 40 nm, aby detekcja była możliwa23. Z tego względu PLA jest znacznie korzystniejsza od tradycyjnych metod koimmunoprecypitacji, w których do wykrycia endogennych oddziaływań białkowych wymagane są miliony komórek. W technice PLA gatunkowo specyficzne przeciwciała wtórne, kowalencyjnie połączone z fragmentami DNA (zwanymi sondami Plus i Minus), wiążą przeciwciała pierwotne; jeśli badane białka wchodzą w interakcję, sondy Plus i Minus znajdują się w bliskim sąsiedztwie. W kolejnym kroku dochodzi do ligacji DNA, co umożliwia amplifikację kolistą (RCA) kolistego DNA. Podczas amplifikacji fluorescencyjnie znakowane komplementarne oligonukleotydy wiążą się z syntetyzowanym DNA, co pozwala na wizualizację tych oddziaływań białkowych za pomocą konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej.
Protokół opisany w niniejszym materiale umożliwia naukowcom ilościowe porównanie liczby aktywnych kompleksów transkrypcyjnych SMAD w warunkach stresu ścinającego (SS) o działaniu ateroprotekcyjnym i ateropronnym in vitro przy użyciu metody PLA. SS jest generowany za pomocą programowalnego pneumatycznego systemu pompowania, który jest w stanie wytworzyć laminarny przepływ jednokierunkowy o określonych poziomach i pozwala na stopniowe zwiększanie szybkości przepływu. Metoda ta umożliwia wykrycie oddziaływań między SMAD1/5 lub SMAD2/3 a SMAD4, a także mieszanych kompleksów R-SMAD. Może ona zostać łatwo rozszerzona w celu analizy oddziaływań białek SMAD z koregulatorami transkrypcyjnymi lub z kompleksami czynników transkrypcyjnych innymi niż SMAD. Rysunek 1 przedstawia główne etapy poniższego protokołu.
<img alt="Proces ekspozycji na naprężenia ścinające; analiza PLA (Proximity Ligation Assay); akwizycja i analiza obrazów mikroskopowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62608/62608fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie opisanego protokołu. (A) Komórki wysiane na szkiełkach 6-kanałowych są poddawane naprężeniom ścinającym za pomocą pneumatycznego systemu pompowego. (B) Unieruchomione komórki są wykorzystywane do eksperymentu PLA lub w warunkach kontrolnych. (C) Obrazy z eksperymentów PLA są pozyskiwane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i analizowane przy użyciu oprogramowania ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62608/62608fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>&micro;-Slide VI 0.4</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td>6-kanałowy suwak</td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Carl Roth</td><td>K298.1</td><td>Hartowanie</td></tr><tr><td>albuminy surowicy bydlęcej</td><td>Carl Roth</td><td>8076.4</td><td>Blokowanie</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich / Merck</td><td>D9542</td><td>Barwienie DNA/Jądra</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-53500</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Duolink In Odczynniki do wykrywania situ Zestaw Green</td><td>Sigma Aldrich / Merck</td><td>DUO92014</td><td>PLA zawierający ligazę, bufor ligacyjny, polimerazę i bufor amplifikacyjny (z oligonukleotydami oznaczonymi na zielono)</td></tr> <tr><td>Sonda Duolink In Situ PLA Anti-Mouse MINUS</td><td>Sigma Aldrich / Merck</td><td>DUO92004</td><td>Sonda</td></tr><tr><td>MINUS Duolink In Situ PLA Anti-Rabbit PLUS</td><td>Sonda</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sigma Aldrich / Merck DUO92002 PLUSdo płukania Duolink In situ, fluorescencyjne</td><td>płuczące Sigma Aldrich / Merck</td><td>DUO82049</td><td>PLA A i B</td></tr><tr><td>Suplement na wzrost komórek śródbłonka</td><td>Suplement Corning</td><td></td><td>dla pożywki (EKGS)</td></tr><tr><td>Cielęta płodu Suplement surowicy</td><td></td><td></td><td>dla pożywki</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>FIJI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu 4% buforowany</td><td>KLINIPATH/VWR</td><td>VWRK4186. BO1</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Pełna pożywka</td><td></td><td></td><td>M199 pożywka podstawowa +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +&nbsp; 25 &mikro; g/mL HEP +&nbsp; &nbsp; 50 &mikro; g/ml EKG</td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry świni, typ A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2500</td><td>Stosować 0,1% w PBS do powlekania kanałów przepływowych</td></tr><tr><td>GraphPad Prism v.7</td> Program statystyczny <td>GarphPad</td><td></td><td>używany do wykresów i obliczeń statystycznych</td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny z błony śluzowej jelit świń</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4784-250MG</td><td>suplement do pośrednich (Hep)</td></tr><tr><td>HUVECs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ibidi Medium montażowe</td><td>ibidi</td><td>50001</td><td>Medium do montażu cieczy</td></tr><tr><td>System pomp ibidi</td><td>Pompa pneumatyczna ibidi</td><td>10902</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>konfokalny</td><td>Leica</td><td></td><td>TCS SP8</td></tr><tr><td>L-Glutamina 200mM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-80100</td><td>suplement do podłoża (L-Glu)</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2154</td><td>Podłoże bazowe</td></tr><tr><td>mysie przeciwciało anty-SMAD1</td><td>Abcam</td><td>ab53745</td><td>Nadaje się do</td></tr><tr><td>mysiego przeciwciała anty-SMAD2/3</td><td>PLA BD Bioscience</td><td>610843</td><td>Nie nadaje się do PLA w połączeniu z CST 9515</td></tr><tr><td>mousee anty-SMAD4</td><td>Przeciwciało Sanata Cruz Biotechnology</td><td>sc-7966</td><td>Nadaje się do PLA</td></tr><tr><td>Penicylina 10.000U/ml / Streptomycyna 10mg/ml</td><td>PAN Biotech</td><td>P06-07100</td><td>suplement do podłoża (P/ S)</td></tr> <tr><td>Zestaw perfuzyjny BIAŁY</td><td>ibidi</td><td>10963</td><td>Rurki używane do 1 dyn / cm2</td></tr><tr><td>Zestaw perfuzyjny ŻÓŁTY i ZIELONY</td><td>ibidi</td><td>10964</td><td>Rurki używane do 30 dyn / cm2królik</td></tr> <tr><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td> <td>przeciwciała SMAD1 / 5</td><td>9516</td><td>Nadaje się do PLA</td></tr><tr><td>królika anty-SMAD2 / 3 XP</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td> przeciwciał <td>8685</td><td>Nadaje się dla PLA</td></tr><tr><td>królik anty-SMAD4</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td> przeciwciał <td>9515</td><td>Nie nadaje się do PLA w połączeniu z BD</td></tr><tr><td>610843 Złącze szeregowe do &mikroszkiełek</td><td>Rurki połączeniowe</td><td>szeregowe ibidi</td><td>10830</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>6683.1</td><td>Permeabilizacja</td></tr></tbody></table>

wizualizacja i kwantyfikacja sygnalizacji tgfβ/bmp/smad w różnych warunkach naprężeń ścinających płyn przy użyciu testu podligowania zbliżeniowego

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Transforming Growth Factor β (TGFβ)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) sygnalizacja jest ściśle regulowana i zrównoważona podczas rozwoju i homeostazy układu naczyniowego Dlatego deregulacja w tym szlaku sygnałowym powoduje poważne patologie naczyniowe, takie jak nadciśnienie tętnicze płucne, dziedziczne teleangiektazje krwotoczne i miażdżyca. Komórki śródbłonka (EC), jako najbardziej wewnętrzna warstwa naczyń krwionośnych, są stale narażone na naprężenia ścinające płynów (SS). Wykazano, że nieprawidłowe wzorce płynnego SS wzmacniają sygnalizację TGFβ / BMP, która wraz z innymi bodźcami indukuje miażdżycę. W związku z tym stwierdzono, że atheropronowe, niskolaminarne SS wzmacnia sygnalizację TGFβ / BMP, podczas gdy aterrotekcyjne, wysoko laminarne SS, zmniejsza tę sygnalizację. Aby skutecznie analizować aktywację tych szlaków, zaprojektowaliśmy przepływ pracy do badania tworzenia kompleksów czynników transkrypcyjnych w warunkach niskiego laminarnego SS i wysokiego laminarnego SS przy użyciu dostępnego na rynku systemu pomp pneumatycznych i testu ligacji zbliżeniowej (PLA).
Aktywna sygnalizacja TGFβ/BMP wymaga utworzenia trimerycznych kompleksów SMAD składających się z dwóch regulatorowych SMAD (R-SMAD); SMAD2/3 i SMAD1/5/8 odpowiednio dla sygnalizacji TGFβ i BMP) ze wspólnym mediatorem SMAD (co-SMAD; SMAD4). Stosując PLA ukierunkowane na różne podjednostki trimerycznego kompleksu SMAD, tj. R-SMAD/co-SMAD lub R-SMAD/R-SMAD, tworzenie aktywnych kompleksów czynników transkrypcyjnych SMAD można zmierzyć ilościowo i przestrzennie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Użycie suwaków przepływu z 6 małymi równoległymi kanałami, które mogą być połączone szeregowo, pozwala na badanie tworzenia kompleksu czynników transkrypcyjnych i włączenie niezbędnych kontroli. 
Opisany tutaj przepływ pracy można łatwo dostosować do badań ukierunkowanych na bliskość SMAD do innych czynników transkrypcyjnych lub do kompleksów czynników transkrypcyjnych innych niż SMAD, w różnych warunkach płynnego SS. Przedstawiony tutaj przepływ pracy pokazuje szybki i skuteczny sposób badania indukowanej płynem sygnalizacji TGFβ / BMP w EC indukowanej przez SS, zarówno ilościowo, jak i przestrzennie.

Wcześniej wykorzystaliśmy PLA do wykrywania oddziaływań między różnymi białkami SMAD3 oraz przeanalizowaliśmy zmiany w fosforylacji SMAD indukowane naprężeniem ścinającym28.
W tym przypadku obie metody połączono z protokołem opisanym powyżej. Komórki HUVECs poddano naprężeniom ścinającym o wartości 1 dyn/cm2 oraz 30 dyn/cm2 i przeanalizowano oddziaływania czynników transkrypcyjnych SMAD. Wykazujemy, że w porównaniu z wysokim...

Tutaj ustalamy protokół jednoczesnej wizualizacji i analizy wielu kompleksów SMAD za pomocą testu ligacji zbliżeniowej (PLA) w komórkach śródbłonka narażonych na patologiczne i fizjologiczne warunki stresu ścinającego płyny.

Wizualizacja i kwantyfikacja sygnalizacji TGFβ/BMP/SMAD w różnych warunkach naprężeń ścinających płyn przy użyciu testu podligowania zbliżeniowego

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

Protokół ten umożliwia naukowcom ilościowe porównanie liczby kompleksów czynników transkrypcyjnych w różnych warunkach naprężeń ścinających i będzie korzystny dla badań w biologii naczyniowej. Główną zaletą tego protokołu jest wykorzystanie mikroprzepływowych kanałów przepływowych, które umożliwiają jednoczesne badanie kilku par przeciwciał, w tym odpowiednich kontroli. Na początek pokryj szkiełko sześciokanałowe, dodając 0,1% żelatyny ze skóry świń przygotowanej w PBS do kanałów przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Opróżnij kanały z roztworu żelatyny i zasiej Huvecs we wstępnie zakodowanych szkiełkach sześciokanałowych o gęstości 2,5 razy 10 do szóstych komórek na mililitr w 30 mikrolitrach kompletnej pożywki M199. Pozwól komórkom przylegać przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze. Dodaj 60 mikrolitrów wstępnie ostrzeżonej kompletnej pożywki M199 do każdego ze zbiorników.Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwa dni w wilgotnym inkubatorze z wymianą pożywki po 24 godzinach. Zamontuj rurki silikonowe na jednostkach fluidycznych, napełnij zbiorniki co najmniej 10 mililitrami wstępnie ostrzeżonego kompletnego medium M199. Podłącz jednostki hydrauliczne z rurkami do układu pompy i wykonaj rozruch wstępny bez ogniw w celu wyrównania medium i usunięcia pozostałego powietrza.Podłącz pojedyncze kanały na suwaku sześciokanałowym za pomocą rurki połączenia szeregowego. Podłącz pierwszy i ostatni kanał na suwaku do rurek zamontowanych na jednostce fluidyki. W przypadku narażenia komórek na wysoki poziom czystego stresu, zwiększaj czysty stres krok po kroku wraz z fazami adaptacji, ustawiając kroki w krokach co pięć dyn na centymetr kwadratowy na 30 minut.Użyj grudek na rurce, aby odłączyć szkiełka od pomp po wystawieniu na naprężenia ścinające płynu, unikając rozlania medium w inkubatorze, oraz przenieś szkiełka przepływowe na lód. Odłączając rurkę od zbiorników, użyj palca, aby zamknąć drugą stronę zbiornika, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza w kanale. Utrzymując ślizg przepływu na lodzie, ostrożnie zasysać pożywkę ze zbiorników, ale nie z kanału, w którym znajdują się komórki.Przemyć próbki 90 mikrolitrami zimnego sterylnego PBS, dodając PBS do jednego zbiornika i ostrożnie odessać z drugiego zbiornika, a następnie powtórzyć dla wszystkich kanałów. Napraw komórki, dodając 90 mikrolitrów buforowanego 4% roztworu PFA do tego samego zbiornika, w którym dodano PBS i odessać ciecz z drugiego zbiornika, jak pokazano. Po utrwaleniu komórek we wszystkich sześciu kanałach, przenieś próbki z lodu do temperatury pokojowej i inkubuj przez 20 minut.Umyj komórki trzykrotnie PBS, dodając PBS do jednego zbiornika i ostrożnie odsysając go z drugiego zbiornika we wszystkich kanałach, uważając, aby nie wysuszyć kanałów. Ugasić dostęp PFA poprzez dodanie 90 mikrolitrów otaczającego 15-milimolowego chlorku amonu przygotowanego w PBS do jednego ze zbiorników. Odessać z drugiego zbiornika i inkubować komórki przez 10 minut.Przepuszczalność komórek poprzez dodanie 90 mikrolitrów 0,3% Triton X 100 przygotowanego w PBS w pustym zbiorniku. Odessać z drugiego zbiornika dla każdego kanału i inkubować przez 10 minut, a następnie przemyć trzykrotnie PBS, jak pokazano wcześniej. Przy 90 mikrolitrach sterylnego roztworu blokującego PLA do jednego zbiornika.Zassać z drugiej strony do każdego kanału i inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze. Dodaj przeciwciała pierwszorzędowe do rozcieńczalnika przeciwciał PLA i wiru. Ostrożnie zassać roztwór blokujący ze zbiorników i kanałów.Dodać 30 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego natychmiast do pustego kanału, przechylając szkiełko podczas dodawania roztworu. Powtórz dla wszystkich kanałów i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wilgotnej komorze przez noc lub w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Rozcieńczyć minus królika i plus mysie sondy PLA od jednego do pięciu w rozcieńczalniku przeciwciał PLA.Przemyć wszystkie kanały dwa razy, dodając 90 mikrolitrów buforu płuczącego A i zasysając, jak pokazano. Po zassaniu buforu płuczącego dodać 30 mikrolitrów roztworu sondy PLA i inkubować w wilgotnej komorze. Rozcieńczyć bufor ligacyjny od 1 do 5 w wodzie zjonizowanej D i rozcieńczyć enzym lygus od 1 do 40 w rozcieńczonym buforze ligacyjnym.Po umyciu i całkowitym zasysaniu buforu płuczącego A dodać 30 mikrolitrów roztworu ligacyjnego do pustych kanałów, jednocześnie przechylając szkiełko, i inkubować w wilgotnej komorze. Rozcieńczyć bufor amplifikacyjny od jednego do pięciu w wodzie dejonizowanej, a następnie rozcieńczyć enzym polimerazy od 1 do 80 w rozcieńczonym buforze amplifikacyjnym na lodzie. Po umyciu i całkowitym zassaniu buforu płuczącego A, dodać 30 mikrolitrów roztworu amplifikacyjnego do pustych kanałów, jednocześnie przechylając szkiełko, i inkubować go w wilgotnej komorze.Rozcieńczyć DAPI w ilości 1 do 500 w buforze B do przemywania i przepłukać wszystkie kanały jeden raz, dodając 90 mikrolitrów DAPI zawierającego bufor B do przemywania i zasysając, jak wykazano, w celu odparowania jąder. Następnie umyj wszystkie kanały jednorazowo buforem myjącym B bez DAPI. Rozcieńczyć bufor płuczący B od jednego do 10 w wodzie dejonizowanej i przemyć wszystkie kanały raz 90 mikrolitrami rozcieńczonego buforu płuczącego B. Po zassaniu buforu B należy natychmiast dodać dwie do trzech kropli płynnego medium montażowego do jednego zbiornika i przechylić szkiełko, aby rozprowadzić medium montażowe we wszystkich kanałach.Przechowuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wilgotnym środowisku do czasu obrazowania. Huvecs były narażone na wysoki i niski stres czysty. Niskie naprężenie ścinające zwiększyło oddziaływania białek SMAD w cytozolu i jądrach.Pojedyncze przeciwciała kontrolne nie wykazały żadnych lub bardzo niewiele sygnałów, co dowodzi sukcesu eksperymentu. Zwiększone stężenie przeciwciał skutkowało większą liczbą zdarzeń PLA na komórkę, ale różnica w sygnałach PLA między komórkami narażonymi na wysoki i niski stres została zmniejszona. Samodzielnie wykonane do blokowania i rozcieńczania przeciwciał mogą być stosowane jako alternatywa dla komercyjnych.Kwantyfikacja zdarzeń PLA dla komercyjnych i samodzielnie wytwarzanych roztworów rozcieńczalników i bloków wykazała ten sam wzorzec sygnałów PLA w obszarach cytozolowych i jądrowych. Jednak łączna liczba zdarzeń PLA na komórkę była wyższa w przypadku rozwiązań komercyjnych. Zastosowano kombinację przeciwciał SMAD Dwa/Trzy, SMAD Cztery, gdzie przeciwciało SMAD Four nie nadawało się do eksperymentów immunofluorescencyjnych.Nie stwierdzono różnicy w zdarzeniach PLA w warunkach eksperymentalnych i kontrolnych, co wskazuje na znaczenie wyboru właściwej kombinacji przeciwciał w celu wykrycia zdarzeń PLA. Opisany protokół może być dostosowany do wykrywania interakcji kompleksów czynników transkrypcyjnych innych niż SMAD, a tym samym pomóc w zrozumieniu regulacji genów w warunkach podatnych na działanie wirusa i w warunkach ochronnych.

visualization-quantification-tgfbmpsmad-signaling-under-different

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszej pracy pokazujemy, jak wykorzystać test ligacji bliskości (Proximity Ligation Assay, PLA) wraz z kombinacją przeciwciał do wizualizacji sygnalizacji białka morfogenetycznego kości (Bone Morphogenetic Protein, BMP) w utrwalonych komórkach. Technika ta pozwoliła nam śledzić nuklearną akumulację endogennych kompleksów efektorowych aktywowanych przez BMP oraz ilościowo określić ich poziomy w czasie pod wpływem stymulacji BMP4.

Wykrywanie kompleksów efektorowych szlaków sygnalizacyjnych downstream BMP4 przy użyciu in situ PLA, testu ligacji w bliskości

Opisano test do ilościowego pomiaru inwazji indukowanej przez czynnik wzrostu transformującego (TGF)-β w trójwymiarowych żelach kolagenowych. Test ten wykorzystuje serię linii komórkowych MCF10A, które reprezentują różne stadia rozwoju raka piersi. Metodę tę można dostosować do użytku z innymi liniami komórkowymi oraz wykorzystać do badania innych potencjalnych aktywatorów lub inhibitorów inwazji.

Test sferoidów do pomiaru inwazji indukowanej przez TGF-β

Mikrofluidyczne komory przepływowe, wytrawione metodą fotolitografii i wykonane z PDMS, są stosowane do badania wyników funkcjonalnych związanych z dysfunkcją EC i stanem zapalnym. W reprezentatywnym eksperymencie wykazano zdolność różnicowego naprężenia ścinającego do modulowania adhezji komórek monocytarnych do monowarstw EC aktywowanych cytokinami.

Fenotypowanie zapalne śródbłonka na chipie

Różnicowanie komórek jest regulowane przez wiele czynników mikrośrodowiskowych, w tym zarówno skład matrycy, jak i właściwości materiału substratu. Opisujemy tutaj technikę wykorzystującą mikromacierze komórkowe w połączeniu z mikroskopią sił trakcyjnych do oceny zarówno różnicowania komórek, jak i biomechanicznych interakcji komórka-substrat w funkcji kontekstu mikrośrodowiskowego.

Wysokowydajna platforma mikromacierzy komórkowych do korelacyjnej analizy różnicowania komórek i sił trakcyjnych

Opisano protokół indukcji in vitro przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego (EndMT), który jest przydatny do badania szlaków sygnalizacji komórkowej związanych z EndMT. W tym modelu eksperymentalnym EndMT jest indukowany przez leczenie TGF-β w komórkach śródbłonka MS-1.

Analiza molekularna przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego wywołanego sygnalizacją transformacji czynnika wzrostu β

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania aktywności sygnalizacyjnej TGF-β/Smad3 na żywo komórek za pomocą systemu reporterskiego adenowirusa. System ten śledzi aktywność transkrypcyjną w czasie rzeczywistym i może być stosowany zarówno do pojedynczych komórek in vitro, jak i do żywychmodeli zwierzęcych.

Obrazowanie żywych komórek szlaku sygnałowego TGF-β/Smad3 in vitro i in vivo przy użyciu systemu reporterowego adenowirusa

Prezentujemy test siły pociągowej o wysokiej przepustowości wykonany z gumy silikonowej (PDMS). Ten nowatorski test nadaje się do badania fizycznych zmian kurczliwości komórek podczas różnych procesów i chorób biologicznych i biomedycznych. Wykazujemy użyteczność tej metody, mierząc zależny od TGF-β wzrost kurczliwości podczas przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego.

Wysokoprzepustowa mikroskopia sił trakcyjnych z wykorzystaniem PDMS ujawnia zależne od dawki efekty transformacji czynnika wzrostu β na przejście z nabłonka do mezenchymów

Celem tego protokołu jest przeprowadzenie dynamicznej ko-hodowli ludzkich makrofagów i miofibroblastów w rurowych rusztowaniach elektroprzędzonych w celu zbadania regeneracji tkanek sterowanej materiałem, przy użyciu bioreaktora, który umożliwia oddzielenie naprężeń ścinających od cyklicznego rozciągania.

Bioreaktor z wieloma wskazówkami do oceny zdolności zapalnej i regeneracyjnej biomateriałów poddanych przepływowi i rozciąganiu

Opisujemy systematyczny proces badania sygnalizacji TGF-β i EMT indukowanego przez TGF-β, badając ekspresję białek i genów zaangażowanych w ten szlak sygnałowy. Metody obejmują Western blotting, test reporterowy lucyferazy, qPCR i barwienie immunofluorescencyjne.

Badanie sygnalizacji TGF-β i indukowanego przez TGF-β przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego w raku piersi i prawidłowych komórkach

Model in vitro niszy naczyniowej szpiku kostnego jest tworzony przez wysiewanie komórek mezenchymalnych i śródbłonka na prefabrykowane hydrożele PEG 3D. Sieci śródbłonka, komponenty ECM i aktywność ALP w niszach różnią się w zależności od zastosowanego czynnika wzrostu. Platforma może być wykorzystywana do zaawansowanych modeli nowotworów.

Proste utworzenie unaczynionej niszy osteogennej szpiku kostnego za pomocą prefabrykowanych hydrożeli z poli(glikolu etylenowego) (PEG) w mikropłytce do obrazowania

Poznaj metodę wizualizacji kompleksów SMAD w komórkach śródbłonka pod różnym naprężeniem ścinającym przy użyciu testu PLA. Protokół ten umożliwia ilościową analizę interakcji czynników transkrypcyjnych w biologii naczyniowej.

Wizualizacja i kwantyfikacja sygnalizacji TGFβ/BMP/SMAD w różnych warunkach naprężeń ścinających płyn przy użyciu testu podligowania zbliżeniowego (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja i kwantyfikacja sygnalizacji TGFβ/BMP/SMAD w różnych warunkach naprężeń ścinających płyn przy użyciu testu podligowania zbliżeniowego

Przeglądaj więcej filmów