Wizualizacja i kwantyfikacja sygnalizacji TGFβ/BMP/SMAD w różnych warunkach naprężeń ścinających płyn przy użyciu testu podligowania zbliżeniowego

Protokół ten umożliwia naukowcom ilościowe porównanie liczby kompleksów czynników transkrypcyjnych w różnych warunkach naprężeń ścinających i będzie korzystny dla badań w biologii naczyniowej. Główną zaletą tego protokołu jest wykorzystanie mikroprzepływowych kanałów przepływowych, które umożliwiają jednoczesne badanie kilku par przeciwciał, w tym odpowiednich kontroli. Na początek pokryj szkiełko sześciokanałowe, dodając 0,1% żelatyny ze skóry świń przygotowanej w PBS do kanałów przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Opróżnij kanały z roztworu żelatyny i zasiej Huvecs we wstępnie zakodowanych szkiełkach sześciokanałowych o gęstości 2,5 razy 10 do szóstych komórek na mililitr w 30 mikrolitrach kompletnej pożywki M199. Pozwól komórkom przylegać przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze. Dodaj 60 mikrolitrów wstępnie ostrzeżonej kompletnej pożywki M199 do każdego ze zbiorników.

Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwa dni w wilgotnym inkubatorze z wymianą pożywki po 24 godzinach. Zamontuj rurki silikonowe na jednostkach fluidycznych, napełnij zbiorniki co najmniej 10 mililitrami wstępnie ostrzeżonego kompletnego medium M199. Podłącz jednostki hydrauliczne z rurkami do układu pompy i wykonaj rozruch wstępny bez ogniw w celu wyrównania medium i usunięcia pozostałego powietrza.

Podłącz pojedyncze kanały na suwaku sześciokanałowym za pomocą rurki połączenia szeregowego. Podłącz pierwszy i ostatni kanał na suwaku do rurek zamontowanych na jednostce fluidyki. W przypadku narażenia komórek na wysoki poziom czystego stresu, zwiększaj czysty stres krok po kroku wraz z fazami adaptacji, ustawiając kroki w krokach co pięć dyn na centymetr kwadratowy na 30 minut.

Użyj grudek na rurce, aby odłączyć szkiełka od pomp po wystawieniu na naprężenia ścinające płynu, unikając rozlania medium w inkubatorze, oraz przenieś szkiełka przepływowe na lód. Odłączając rurkę od zbiorników, użyj palca, aby zamknąć drugą stronę zbiornika, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza w kanale. Utrzymując ślizg przepływu na lodzie, ostrożnie zasysać pożywkę ze zbiorników, ale nie z kanału, w którym znajdują się komórki.

Przemyć próbki 90 mikrolitrami zimnego sterylnego PBS, dodając PBS do jednego zbiornika i ostrożnie odessać z drugiego zbiornika, a następnie powtórzyć dla wszystkich kanałów. Napraw komórki, dodając 90 mikrolitrów buforowanego 4% roztworu PFA do tego samego zbiornika, w którym dodano PBS i odessać ciecz z drugiego zbiornika, jak pokazano. Po utrwaleniu komórek we wszystkich sześciu kanałach, przenieś próbki z lodu do temperatury pokojowej i inkubuj przez 20 minut.

Umyj komórki trzykrotnie PBS, dodając PBS do jednego zbiornika i ostrożnie odsysając go z drugiego zbiornika we wszystkich kanałach, uważając, aby nie wysuszyć kanałów. Ugasić dostęp PFA poprzez dodanie 90 mikrolitrów otaczającego 15-milimolowego chlorku amonu przygotowanego w PBS do jednego ze zbiorników. Odessać z drugiego zbiornika i inkubować komórki przez 10 minut.

Przepuszczalność komórek poprzez dodanie 90 mikrolitrów 0,3% Triton X 100 przygotowanego w PBS w pustym zbiorniku. Odessać z drugiego zbiornika dla każdego kanału i inkubować przez 10 minut, a następnie przemyć trzykrotnie PBS, jak pokazano wcześniej. Przy 90 mikrolitrach sterylnego roztworu blokującego PLA do jednego zbiornika.

Zassać z drugiej strony do każdego kanału i inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze. Dodaj przeciwciała pierwszorzędowe do rozcieńczalnika przeciwciał PLA i wiru. Ostrożnie zassać roztwór blokujący ze zbiorników i kanałów.

Dodać 30 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego natychmiast do pustego kanału, przechylając szkiełko podczas dodawania roztworu. Powtórz dla wszystkich kanałów i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wilgotnej komorze przez noc lub w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Rozcieńczyć minus królika i plus mysie sondy PLA od jednego do pięciu w rozcieńczalniku przeciwciał PLA.

Przemyć wszystkie kanały dwa razy, dodając 90 mikrolitrów buforu płuczącego A i zasysając, jak pokazano. Po zassaniu buforu płuczącego dodać 30 mikrolitrów roztworu sondy PLA i inkubować w wilgotnej komorze. Rozcieńczyć bufor ligacyjny od 1 do 5 w wodzie zjonizowanej D i rozcieńczyć enzym lygus od 1 do 40 w rozcieńczonym buforze ligacyjnym

Po umyciu i całkowitym zasysaniu buforu płuczącego A dodać 30 mikrolitrów roztworu ligacyjnego do pustych kanałów, jednocześnie przechylając szkiełko, i inkubować w wilgotnej komorze. Rozcieńczyć bufor amplifikacyjny od jednego do pięciu w wodzie dejonizowanej, a następnie rozcieńczyć enzym polimerazy od 1 do 80 w rozcieńczonym buforze amplifikacyjnym na lodzie. Po umyciu i całkowitym zassaniu buforu płuczącego A, dodać 30 mikrolitrów roztworu amplifikacyjnego do pustych kanałów, jednocześnie przechylając szkiełko, i inkubować go w wilgotnej komorze.

Rozcieńczyć DAPI w ilości 1 do 500 w buforze B do przemywania i przepłukać wszystkie kanały jeden raz, dodając 90 mikrolitrów DAPI zawierającego bufor B do przemywania i zasysając, jak wykazano, w celu odparowania jąder. Następnie umyj wszystkie kanały jednorazowo buforem myjącym B bez DAPI. Rozcieńczyć bufor płuczący B od jednego do 10 w wodzie dejonizowanej i przemyć wszystkie kanały raz 90 mikrolitrami rozcieńczonego buforu płuczącego B. Po zassaniu buforu B należy natychmiast dodać dwie do trzech kropli płynnego medium montażowego do jednego zbiornika i przechylić szkiełko, aby rozprowadzić medium montażowe we wszystkich kanałach.

Przechowuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wilgotnym środowisku do czasu obrazowania. Huvecs były narażone na wysoki i niski stres czysty. Niskie naprężenie ścinające zwiększyło oddziaływania białek SMAD w cytozolu i jądrach.

Pojedyncze przeciwciała kontrolne nie wykazały żadnych lub bardzo niewiele sygnałów, co dowodzi sukcesu eksperymentu. Zwiększone stężenie przeciwciał skutkowało większą liczbą zdarzeń PLA na komórkę, ale różnica w sygnałach PLA między komórkami narażonymi na wysoki i niski stres została zmniejszona. Samodzielnie wykonane do blokowania i rozcieńczania przeciwciał mogą być stosowane jako alternatywa dla komercyjnych.

Kwantyfikacja zdarzeń PLA dla komercyjnych i samodzielnie wytwarzanych roztworów rozcieńczalników i bloków wykazała ten sam wzorzec sygnałów PLA w obszarach cytozolowych i jądrowych. Jednak łączna liczba zdarzeń PLA na komórkę była wyższa w przypadku rozwiązań komercyjnych. Zastosowano kombinację przeciwciał SMAD Dwa/Trzy, SMAD Cztery, gdzie przeciwciało SMAD Four nie nadawało się do eksperymentów immunofluorescencyjnych.

Nie stwierdzono różnicy w zdarzeniach PLA w warunkach eksperymentalnych i kontrolnych, co wskazuje na znaczenie wyboru właściwej kombinacji przeciwciał w celu wykrycia zdarzeń PLA. Opisany protokół może być dostosowany do wykrywania interakcji kompleksów czynników transkrypcyjnych innych niż SMAD, a tym samym pomóc w zrozumieniu regulacji genów w warunkach podatnych na działanie wirusa i w warunkach ochronnych.