Dwie metody decelularyzacji tkanek roślinnych do zastosowań w inżynierii tkankowej
31 maja 2018
Tutaj prezentujemy i porównujemy dwa protokoły używane do decelularizacji tkanek roślinnych: podejście oparte na detergentach i podejście bez detergentów. Obie metody pozostawiają macierz zewnątrzkomórkową zastosowanych tkanek roślinnych, które można następnie wykorzystać jako rusztowania do zastosowań w inżynierii tkankowej.
Metody te mogą pomóc w rozwiązaniu kluczowych problemów w dziedzinie biomateriałów, takich jak opracowanie rusztowania o doskonałych możliwościach przenoszenia płynów z zaawansowanymi ultrastrukturami i skalowalną produkcją. Główną zaletą tych technik jest to, że można je stosować do większości roślin na tkanki łodygowe bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu. Najpierw zbierz świeże lub mrożone próbki liści F.hispida.
Pozostałą świeżą próbkę należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Niech liść pozostanie zanurzony w dejonizowanej wodzie w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza. Użyj czystego stempla do biopsji, aby pociąć liść na krążki o średnicy ośmiu milimetrów.
Następnie, aby umyć próbki liści, inkubuj je na płytce wstrząsającej z niską prędkością przez pięć do 10 minut, zanurzając w wodzie dejonizowanej. Następnie przygotuj 10% wagowo SDS w wodzie dejonizowanej. Po przygotowaniu roztworu SDS umieść próbki liści na plastikowym naczyniu.
Następnie dodaj roztwór SDS, aby całkowicie pokryć próbki. Umieścić próbki liści z kartą charakterystyki SDS, przykryte, na płycie wstrząsającej, aby zapobiec parowaniu. Następnie inkubuj próbkę liści w temperaturze pokojowej przez pięć dni.
Po pięciu dniach inkubacji zastąp roztwór SDS wodą dejonizowaną. Próbki namoczone w wodzie dejonizowanej inkubować przez 10 do 15 minut na płytce wstrząsającej. Następnie wymieszaj pięć mililitrów niejonowego środka powierzchniowo czynnego z 50 mililitrami wybielacza.
Dodaj tę mieszaninę do 445 mililitrów wody dejonizowanej. Następnie zanurz próbki w świeżo przygotowanym roztworze wybielacza niejonowego środka powierzchniowo czynnego. Kontynuuj wymianę roztworu wybielacza niejonowego środka powierzchniowo czynnego co 24 godziny, aż próbki zostaną oczyszczone.
Następnie pozostaw oczyszczone próbki zanurzone w wodzie dejonizowanej na dwie minuty na płytce wstrząsającej. Aby uzyskać decelularyzację bez detergentów, przygotuj pięcioprocentowy obj. wybielacz w 3% wagowym roztworze wodorowęglanu sodu. Następnie podgrzej roztwór do 60 do 70 stopni Celsjusza na płycie grzejnej w dygestorium.
Gdy tylko roztwór osiągnie pożądaną temperaturę, namocz próbki liści. Następnie zmniejsz prędkość płytki mieszającej, aby zapobiec uszkodzeniu próbek, poszukaj widocznie oczyszczonych próbek i ostrożnie przenieś je z kąpieli. Na koniec inkubować próbki w wodzie dejonizowanej przez jedną do dwóch minut.
Ponieważ wszystkie próbki są wewnętrznie różne, zaleca się sprawdzanie postępu decelularyzacji mniej więcej co 15 minut, aby upewnić się, że próbki nie są uszkodzone. Parametry MTM, SAF i UTS są najpierw badane w celu zbadania unikalnych właściwości rusztowań decelularnych zarówno gatunków P.aquatica, jak i F.hispida. W rzeczywistości wszystkie trzy parametry wykazują podobne właściwości mechaniczne zarówno przy użyciu metod decelularizacji na bazie detergentów, jak i bez detergentów.
Jednak właściwości mechaniczne UTS F.hispida wykazują znacznie wyższą średnią wartość przy użyciu SDS zamiast wybielacza do decelularyzacji. Zawartość genomowego DNA badanych oczyszczonych gatunków roślin jest również znacznie zmniejszona po decelularizacji w porównaniu z próbkami bez decelularyzacji. Następnie mierzy się również aktywność metaboliczną ludzkich tyroblastów skórnych w obecności bezkomórkowych rusztowań P.aquatica lub Garcinia.
Co ciekawe, rusztowania na bazie detergentów wywoływały zmniejszony wpływ na komórkową aktywność metaboliczną, ale mycie buforem trishydrochlorkowym, a następnie pożywką bez surowicy po usunięciu SDS zmniejsza wpływ na komórkową aktywność metaboliczną w porównaniu z myciem samą wodą dejonizowaną. Wreszcie pokazano wzrost mezenchymalnych komórek macierzystych barwionych kalcynacją na powierzchni struktury liścia F.hispida. Po opanowaniu techniki te można wykonać w ciągu około siedmiu dni do zaledwie 15 minut, jeśli są wykonywane prawidłowo.
Podczas wykonywania tych procedur należy pamiętać o monitorowaniu próbek podczas ich decelularyzacji, ponieważ próbki mogą się różnić w zależności od partii, co może skutkować różnymi czasami oczyszczania. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak dekwantyfikacja lub badania mechaniczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jakim stopniu próbki są oczyszczane i do jakich innych tkanek próbki są mechanicznie podobne. Po opracowaniu technika ta pomogła utorować drogę naukowcom zajmującym się inżynierią tkankową do produkcji perfuzyjnych rusztowań.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak decelularyzować tkanki roślinne do wykorzystania jako rusztowania. Nie zapominaj, że praca z detergentami i oparami wybielaczy może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tych procedur należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak stosowanie odpowiedniego sprzętu ochronnego i używanie dygestorio.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia i porównuje dwa protokoły decelularyzacji tkanek roślinnych: podejście oparte na detergentach i podejście bez detergentów. Obie metody zachowują macierz pozakomórkową, która może służyć jako szkielet dla zastosowań w inżynierii tkankowej.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Biomateriały
- Inżynieria tkankowa
- Biologia roślin
Tło
- Techniki decelularyzacji są kluczowe dla tworzenia szkieletów.
- Szkielety mogą poprawiać zdolności transferu płynów.
- Metody mogą być stosowane do różnych tkanek łodyg roślin.
- Do tych technik nie jest wymagane specjalistyczne wyposażenie.
Cel badania
- Porównanie metod decelularyzacji opartych na detergentach i bez detergentów.
- Ocena potencjału roślinnych macierzy pozakomórkowych jako szkieletów.
- Rozwiązanie wyzwań w rozwoju szkieletów dla inżynierii tkankowej.
Stosowane metody
- Zbieranie świeżych lub mrożonych próbek liści F.hispida.
- Przechowywanie próbek w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
- Znurzanie liści w wodzie dejonizowanej w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza.
- Cięcie liści na dyski o średnicy ośmiu milimetrów za pomocą bieracza biopsji.
Główne wyniki
- Obie metody decelularyzacji skutecznie zachowują macierz pozakomórkową.
- Szkielety, które zostały stworzone, mogą być wykorzystane w różnych zastosowaniach inżynierii tkankowej.
- Zdolności transferu płynów szkieletów zostały poprawione.
- Metody są skalowalne i mogą być stosowane do większości gatunków roślin.
Wnioski
- Techniki decelularyzacji zapewniają wykonalne szkielety dla inżynierii tkankowej.
- Obie metody mają wyraźne zalety i mogą być wybierane w oparciu o konkretne potrzeby.
- Przyszłe badania mogą eksplorować dodatkowe zastosowania szkieletów pochodzenia roślinnego.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Plant-derived scaffolds address critical biomaterials challenges in tissue engineering by offering scalable, biocompatible alternatives to autologous, synthetic, and animal-derived grafts. The described decellularization methods enable reproducible production of scaffolds with preserved extracellular matrix architecture, supporting fluid transfer and mechanical functionality essential for regenerative medicine applications. This positions plant-based systems as a strategic option for de-risking early-stage scaffold development in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of extracellular matrix contributions to scaffold biocompatibility and mechanical integrity.
- Operational Value: Provides standardized plant tissue preparation workflows applicable across species without specialized equipment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Yields scaffolds with quantifiable mechanical properties (UTS, MTM, SAF) for comparative biomaterial screening.
- Operational Value: Supports assay-ready scaffold production with low cellular metabolic impact, enabling reproducible cell-seeding experiments.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates evaluation of human cell responses (e.g., dermal thyroblasts, mesenchymal stem cells) on plant-derived matrices.
- Operational Value: Offers dual-method flexibility (detergent-based vs. detergent-free) to optimize scaffold properties for specific tissue engineering endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
These decellularization methods integrate into the discovery continuum by providing preparatory scaffolds for cell-based assays, supporting progression from biomaterial screening to preclinical validation in tissue engineering workflows.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing regarding plant extracellular matrix suitability as a scaffold foundation.
- Screening: Delivers reproducible scaffolds with measurable mechanical and biological outputs for comparative evaluation.
- Analytics: Generates quantifiable data (genomic DNA reduction, metabolic activity, UTS) to inform scaffold selection criteria.
- Translational Research: Supports continuity from biomaterial discovery to preclinical testing via standardized scaffold production.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform-agnostic protocol adaptable to multiple plant species, enhancing resource efficiency across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in scaffold performance by decoupling cellular and extracellular matrix contributions.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized incubation times, solution concentrations, and washing steps.
- Strategic Value: Lowers development barriers by eliminating need for specialized equipment, enabling broader lab adoption.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing scaffolds with tunable properties (e.g., UTS modulation via SDS vs. bleach).
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterial handling and decellularization monitoring to prevent over-processing.
- Necessitates access to standard lab equipment (shake plate, hot plate, fume hood, biopsy punch) and reagents (SDS, bleach, sodium bicarbonate).
- Demands cross-team standardization of clearing endpoint assessment (e.g., visual inspection timing) to ensure batch consistency.
- Requires adaptation of incubation durations based on plant species and tissue thickness, as noted in sample variability observations.
- Involves safety considerations for handling detergents and bleach, including PPE use and fume hood operation during heated steps.
