Name: Dwie metody decelularyzacji tkanek roślinnych do zastosowań w inżynierii tkankowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Poznaj dwie metody decelularyzacji tkanek roślinnych z użyciem detergentów i bez nich. Techniki te zachowują macierz pozakomórkową jako rusztowania do inżynierii tkankowej bez specjalistycznego sprzętu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Johnowi Wirthowi z Ogrodów Olbrich za łaskawe dostarczenie okazów użytych w tym projekcie. Praca ta jest częściowo wspierana przez Narodowy Instytut Serca, Płuc i Krwi (R01HL115282 do G.R.G.) Narodowa Fundacja Nauki (DGE1144804 J.R.G. i G.R.G.) oraz Wydział Chirurgii Uniwersytetu Wisconsin i Fundusz Absolwentów (H.D.L.). Prace te były również częściowo wspierane przez Agencję Ochrony Środowiska (grant STAR nr 83573701), National Institutes of Health (R01HL093282-01A1 i UH3TR000506) oraz National Science Foundation (IGERT DGE1144804).

1. Decelularyzacja tkanki roślinnej przy użyciu metody opartej na detergentach
<ol>
	<li>Używaj świeżych lub mrożonych F. hispida, próbek liści. Niewykorzystane świeże próbki należy zamrozić w zamrażarce o temperaturze -20 °C i przechowywać do wykorzystania w przyszłości (do roku). 
	UWAGA: Użyj tkanki łodygi lub liścia prawie każdej pożądanej rośliny. Wydłużony czas przechowywania może spowodować uszkodzenie tkanek.
	<ol>
		<li>Należy określić wielkość i kształt próbek, które mają być przetworzone, na podstawie zamierzonego zastosowania próbki (tj. próbki pokrojone w paski dobrze nadają się do zastosowań związanych z badaniami mechanicznymi, natomiast próbki z krążkiem o średnicy 8 mm są przydatne w zastosowaniach związanych z hodowlą wielodołkową). Pokrój liść na krążki o średnicy 8 mm ostrym, czystym stemplem do biopsji, zanurzając go w temperaturze pokojowej (20-25 °C) dejonizowanym H2O. 
		Uwaga: Ten protokół może być stosowany na całych liściach i łodygach. Jednak mniejsze próbki będą szybciej decelularyzować.</li>
		<li>Próbki inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej (20-25 °C) dejonizowanegoH2Ona płytce wstrząsającej ustawionej na niską prędkość w celu ich umycia i/lub rozmrożenia. Użyj wystarczającej ilości dejonizowanegoH2O, aby upewnić się, że wszystkie próbki są dokładnie zwilżone.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór 10% (w/v) dodecylosiarczanu sodu (SDS) w dejonizowanymH2O. Umieścić próbki w odpowiednim pojemniku (idealne jest szklane lub plastikowe naczynie) i dodać roztwór SDS, aby całkowicie pokryć próbki. Próbki należy inkubować przez 5 dni w temperaturze pokojowej (20–25 °C) na płytce wstrząsającej ustawionej na niską prędkość, aby zapobiec uszkodzeniu próbek. 
	UWAGA: Nie należy przepełniać pojemnika, ponieważ może to spowolnić proces decelularyzacji i prowadzić do nierównomiernego traktowania przez SDS. Na tym etapie próbki powinny nabrać brązowego odcienia.
	<ol>
		<li>Po 5 dniach zastąp roztwór SDS dejonizowanymH2O. Próbki inkubować przez dodatkowe 10-15 minut na płycie wstrząsającej, aby dokładnie spłukać resztki roztworu SDS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 1% (v/v) niejonowy środek powierzchniowo czynny w 10% (v/v) roztworze wybielacza. Aby przygotować 500 ml roztworu, wymieszaj 5 ml niejonowego środka powierzchniowo czynnego z 50 ml wybielacza, a następnie dodaj 445 ml dejonizowanegoH2O. Zanurz próbki w świeżo przygotowanym roztworze. 
	UWAGA: Niejonowy roztwór środka powierzchniowo czynnego/wybielacza nie ma długiego okresu przydatności do spożycia, dlatego należy go zużyć w ciągu 48 godzin od przygotowania.</li>
	<li>Niejonowy roztwór środka powierzchniowo czynnego/wybielacza należy wymieniać co 24 godziny, aż próbki zostaną całkowicie oczyszczone (patrz <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A dla porównania wizualnego). Następnie inkubuj próbkę w wodzie dejonizowanej na płytce wstrząsającej przez 2 minuty, aby spłukać nadmiar niejonowego roztworu środka powierzchniowo czynnego/wybielacza. Ustaw płytkę potrząsającą na niskim poziomie, aby zapobiec uszkodzeniu próbek. 
	UWAGA: Czas potrzebny do oczyszczenia użytych próbek różni się w zależności od rodzaju i gatunku rośliny. Całkowite odbarwienie próbek wskazuje na pełną decelularyzację (wykonaj kwantyfikację DNA, aby zapewnić dokładne oczyszczenie).
	<ol>
		<li>Liofilizuj próbki w celu przechowywania ich do roku (preferowane jest błyskawiczne zamrażanie przy użyciu ciekłego azotu, dopuszczalne jest również zamrażanie próbek w temperaturze -80 °C) i przechowuj je w temperaturze pokojowej (20-25 °C) w niskiej wilgotności.</li>
		<li>Rozpuść próbki w Tris-HCl (10 mM, pH 8,5), używając wystarczającej ilości do pokrycia próbek. Przed użyciem delikatnie przepłukać próbki 2-3 razy w podłożu bez surowicy za pomocą mikropipety (tj. użyć 150-300 μl na płukanie, w standardowej płytce 24-dołkowej). 
		UWAGA: Bufor Tris-HCl i pożywki wolne od surowicy (tj. DMEM, ale można zastąpić dowolne podstawowe podłoża do hodowli komórkowych) są bardziej skuteczne w obniżaniu wpływu na żywotność komórek próbek poddanych SDS niż tych poddanych działaniu dejonizowanegoH2Osamego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek metodą decelularizacji bez użycia detergentów
UWAGA: Początkowe kroki tej procedury pokrywają się z krokami 1.1-1.1.2 (patrz wyżej).
<ol>
	<li>Przygotować 5% (v/v) roztwór wybielacza (NaClO) i 3% (w/v) wodorowęglanu sodu (NaHCO3). Podgrzać roztwór w dygestorium do temperatury 60-70 °C dla próbek liści F. hispida pokrojonych w krążki o średnicy 8 mm, mieszając na płycie grzejnej. 
	UWAGA: Wodorowęglan sodu można zastąpić węglanem sodu (Na2CO3 ) lub wodorotlenkiem sodu (NaOH). Żądana temperatura jest bardzo zróżnicowana (od temperatury pokojowej do 90 °C) i powinna być dostosowana do właściwości użytych próbek.</li>
	<li>Gdy roztwór osiągnie żądany zakres temperatur, zanurz próbki i zmniejsz prędkość mieszania, aby uniknąć ich uszkodzenia. Po widocznym oczyszczeniu próbek (patrz Rysunek 1B dla porównania wizualnego), ostrożnie wyjmij z kąpieli. Próbki inkubować raz w dejonizowanymH2Oprzez 1-2 minuty, aby usunąć nadmiar roztworu wybielacza. 
	UWAGA: Czas potrzebny do oczyszczenia próbek może się znacznie różnić. Na przykład pokrojoną pietruszkę można oczyścić w ciągu 10-15 minut, podczas gdy grubsze i/lub większe próbki, takie jak całe liście lub łodygi, mogą potrzebować godzin w kąpielach wysokotemperaturowych, aby całkowicie się oczyścić.</li>
	<li>Liofilizować próbki i przechowywać je w temperaturze pokojowej (20-25 °C) przy niskiej wilgotności.</li>
</ol>

<ol><li>Vacanti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+and+regenerative+medicine%3A+from+first+principles+to+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to state of the art.</a> Journal of Pediatric Surgery. 45 (2), 291-294 (2010).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+function+of+hepatocytes+on+a+novel+three-dimensional+synthetic+biodegradable+polymer+scaffold+with+an+intrinsic+network+of+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Survival and function of hepatocytes on a novel three-dimensional synthetic biodegradable polymer scaffold with an intrinsic network of channels.</a> Annals of Surgery. 228 (1), 8-13 (1998).</li>
<li>Park, A., Wu, B., Griffith, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+surface+modification+and+3D+fabrication+techniques+to+prepare+patterned+poly%28L-lactide%29+substrates+allowing+regionally+selective+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomaterial+Science%2C+Polymer+Edition%22%5BJournal%5D)">Integration of surface modification and 3D fabrication techniques to prepare patterned poly(L-lactide) substrates allowing regionally selective cell adhesion.</a> Journal of Biomaterial Science, Polymer Edition. 9 (2), 89-110 (1998).</li>
<li>Steinhoff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+pulmonary+heart+valves+on+allogenic+acellular+matrix+conduits%3A+in+vivo+restoration+of+valve+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+JAMA.+102+%28Suppl+3%29%2C+III-50-+III+-55%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of pulmonary heart valves on allogenic acellular matrix conduits: in vivo restoration of valve tissue.</a> Circulation: JAMA. 102 (Suppl 3), III-50- III -55. 102 (Suppl 3), III-50-III-55 (2000).</li>
<li>Stock, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+valved+conduits+in+the+pulmonary+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered valved conduits in the pulmonary circulation.</a> Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 119 (4 Pt 1), 732-740 (2000).</li>
<li>Ott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).</li>
<li>Guyette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+Human+Myocardium+on+Native+Extracellular+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix.</a> Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).</li>
<li>Huerta, S., Varshney, A., Patel, P., Mayo, H., Livingston, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Mesh+Implants+for+Abdominal+Hernia+Repair%3A+US+Food+and+Drug+Administration+Approval+Process+and+Systematic+Review+of+Its+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Surgery%22%5BJournal%5D)">Biological Mesh Implants for Abdominal Hernia Repair: US Food and Drug Administration Approval Process and Systematic Review of Its Efficacy.</a> JAMA Surgery. 151 (4), 374-381 (2016).</li>
<li>Catalano, E., Cochis, A., Varoni, E., Rimondini, L., Azzimonti, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+skin+substitutes%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered skin substitutes: an overview.</a> Journal of Artificial Organs. 16 (4), 397-403 (2013).</li>
<li>Fang, B., Wan, Y., Tang, T., Gao, C., Dai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+osteoblastic+differentiation+of+human+bone+marrow+stromal+cells+on+hydroxyapatite%2Fbacterial+cellulose+nanocomposite+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Proliferation and osteoblastic differentiation of human bone marrow stromal cells on hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposite scaffolds.</a> Tissue Engineering. 15 (5), 1091-1098 (2009).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0928493106003523">Biomimetic synthesis of hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposites for biomedical applications.</a> Materials Science and Engineering. 27 (4), 855-864 (2007).</li>
<li>Vinatier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+injectable+cellulose-based+hydrogel+for+the+transfer+of+autologous+nasal+chondrocytes+in+articular+cartilage+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">An injectable cellulose-based hydrogel for the transfer of autologous nasal chondrocytes in articular cartilage defects.</a> Biotechnology and Bioengineering. 102 (4), 1259-1267 (2009).</li>
<li>Vinatier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+silanized+hydroxypropyl+methylcellulose+hydrogel+for+the+three-dimensional+culture+of+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel for the three-dimensional culture of chondrocytes.</a> Biomaterials. 26 (33), 6643-6651 (2005).</li>
<li>Vinatier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cartilage+with+human+nasal+chondrocytes+and+a+silanized+hydroxypropyl+methylcellulose+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Engineering cartilage with human nasal chondrocytes and a silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 66-74 (2007).</li>
<li>Helenius, G., Bäckdahl, H., Bodin, A., Nannmark, U., Gatenholm, P., Risberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+biocompatibility+of+bacterial+cellulose%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">In vivo biocompatibility of bacterial cellulose.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 76 (2), 431-438 (2006).</li>
<li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+aligned+nanofibrous+collagen+scaffold+by+electrospinning+and+its+effects+on+in+vitro+fibroblast+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 79 (3), 456-463 (2006).</li>
<li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shape-controlled+tuneable+microgel+platform+to+modulate+angiogenic+paracrine+responses+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A shape-controlled tuneable microgel platform to modulate angiogenic paracrine responses in stem cells.</a> Biomaterials. 35 (31), 8757-8766 (2014).</li>
<li>Lai, C., Zhang, S., Wang, L., Sheng, L., Zhou, Q., Xi, T. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2015/tb/c5tb01640a">The relationship between microstructure and in vivo degradation of modified bacterial cellulose sponges.</a> Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 9001-9010 (2015).</li>
<li>Märtsonad, M., Viljantoa, J., Hurmea, T., Laippalac, P., Saukkob, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+cellulose+sponge+degradable+or+stable+as+implantation+material%3F+An+in+vivo+subcutaneous+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat.</a> Biomaterials. 20 (21), 1989-1995 (1999).</li>
<li>Miyamoto, T., Takahashi, S., Ito, H., Inagaki, H., Noishiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+biocompatibility+of+cellulose+and+its+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue biocompatibility of cellulose and its derivatives.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 23 (1), 125-133 (1989).</li>
<li>Entcheva, E., Bien, H., Yin, L., Chung, C., Farrell, M., Kostov, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cardiac+cell+constructs+on+cellulose-based+scaffolding%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Functional cardiac cell constructs on cellulose-based scaffolding.</a> Biomaterials. 25 (26), 5753-5762 (2004).</li>
<li>Modulevsky, D., Cuerrier, C., Pelling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+of+Subcutaneously+Implanted+Plant-Derived+Cellulose+Biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility of Subcutaneously Implanted Plant-Derived Cellulose Biomaterials.</a> PLoS One. 11 (6), e0157894(2016).</li>
<li>McCulloh, K., Sperry, J., Adler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+transport+in+plants+obeys+Murray%27s+law%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Water transport in plants obeys Murray's law.</a> Nature. 421 (6926), 939-942 (2003).</li>
<li>Gershlak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+kingdoms%3A+Using+decellularized+plants+as+perfusable+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds.</a> Biomaterials. 125, 13-22 (2017).</li>
<li>Fontana, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofunctionalized+Plants+as+Diverse+Biomaterials+for+Human+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Biofunctionalized Plants as Diverse Biomaterials for Human Cell Culture.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (8), (2017).</li>
<li>Wegst, U., Bai, H., Saiz, E., Tomsia, A., Ritchie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinspired+structural+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Bioinspired structural materials.</a> Nature Materials. 14 (1), 23-36 (2015).</li>
<li>Gibson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hierarchical+structure+and+mechanics+of+plant+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">The hierarchical structure and mechanics of plant materials.</a> Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).</li>
<li>Hoshiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+Extracellular+Matrix+as+an+In+vitro+Model+to+Study+the+Comprehensive+Roles+of+the+ECM+in+Stem+Cell+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Decellularized Extracellular Matrix as an In vitro Model to Study the Comprehensive Roles of the ECM in Stem Cell Differentiation.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li>
<li>Guyette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+decellularization+of+whole+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Perfusion decellularization of whole organs.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).</li>
<li>Modulevsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apple+derived+cellulose+scaffolds+for+3D+mammalian+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture.</a> PLoS ONE. 9 (5), e97835(2014).</li>
<li>Blonder, B. How to make leaf skeletons. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://benjaminblonder.org/The_secrets_of_leaves/Making_skeletons.html">http://benjaminblonder.org/The_secrets_of_leaves/Making_skeletons.html</a> (2017).</li>
<li>Seba, A., Sloane, H. <a target="_blank" href="http://www.jstor.org/stable/103557?seq=1">The Anatomical Preparation of Vegetables, by Albertus Seba, F. R. S. Communicated to the Royal Society by Sir Hans Sloane, Bart. Pr. R. S. and Col. Med. Lond. Translated from the German, by Mr. Zolman, F. R. S.</a> Philosophical Transactions. 36 (407), 441-444 (1775).</li>
<li>Parrish, E. <a target="_blank" href="https://archive.org/details/phantombouquetpo00parriala">The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste.</a> The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. , (1865).</li>
<li>Coffin, S., Gaudette, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aprotinin+extends+mechanical+integrity+time+of+cell-seeded+fibrin+sutures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Aprotinin extends mechanical integrity time of cell-seeded fibrin sutures.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (9), 2271-2279 (2016).</li>
<li>Zangala, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Genomic+DNA+from+Mouse+Tails%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (6), e246(2007).</li>
<li>Borselli, C., Cezar, C., Shvartsman, D., Vandenburgh, H., Mooney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+multifunctional+delivery+scaffold+in+the+ability+of+cultured+myoblasts+to+promote+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of multifunctional delivery scaffold in the ability of cultured myoblasts to promote muscle regeneration.</a> Biomaterials. 32 (34), 8905-8914 (2011).</li>
<li>Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+Scaffolds+to+Enhance+Transplanted+Myoblast+Survival+and+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Designing Scaffolds to Enhance Transplanted Myoblast Survival and Migration.</a> Tissue Engineering. 12 (5), 1295-1304 (2006).</li>
<li>Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulating+activation+of+transplanted+cells+controls+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulating activation of transplanted cells controls tissue regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (8), 2494-2499 (2006).</li>
<li>Ma, J., Holden, K., Zhu, J., Pan, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Application+of+Three-Dimensional+Collagen-Scaffolds+Seeded+with+Myoblasts+to+Repair+Skeletal+Muscle+Defects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The Application of Three-Dimensional Collagen-Scaffolds Seeded with Myoblasts to Repair Skeletal Muscle Defects.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-9 (2011).</li>
<li>Tyree, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+hydraulics%3A+the+ascent+of+water%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Plant hydraulics: the ascent of water.</a> Nature. 424 (6943), 923(2003).</li>
<li>Raven, P., Evert, R., Eichhorn, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRaven%2C+P+%22Biology+of+Plants%22">Biology of Plants</a>. , 7th edition, (2005).</li>
<li>Turrell, F. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2435976">The area of the internal exposed surface of dicotyledon leaves.</a> American Journal of Botany. 23 (4), 255-264 (1936).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule opisano dwie metody decelularyzacji tkanek roślinnych. Przedstawione tutaj wyniki, w połączeniu z wynikami wcześniejszych badań25, sugerują, że przedstawione protokoły mogą mieć zastosowanie do szerokiego spektrum gatunków roślin i mogą być wykonywane zarówno na łodygach, jak i liściach. Procedury te są proste i nie wymagają specjalistycznego sprzętu, dzięki czemu decelularyzacja roślin może być przeprowadzona w większości laboratoriów. Warto zauważyć, że po decelularyzacji rusztowa...

Inżynieria tkankowa pojawiła się w latach 80. XX wieku w celu stworzenia żywych substytutów tkanek i potencjalnie rozwiązania znacznych niedoborów narządów i tkanek1. Jedna ze strategii wykorzystuje rusztowania do stymulowania i kierowania ciałem w celu regeneracji brakujących tkanek lub narządów. Chociaż zaawansowane podejścia produkcyjne, takie jak druk 3D, pozwoliły wytworzyć rusztowania o unikalnych właściwościach fizycznych, zdolność do produkcji rusztowań o zróżnicowanym zakresie osiągalnych właściwości fizycznych i biologicznych pozostaje wyzwaniem2,3. Ponadto, ze względu na brak funkcjonalnej sieci naczyniowej, techniki te zostały ograniczone w regeneracji tkanek trójwymiarowych. Użycie zdecelularyzowanych tkanek zwierzęcych i ludzkich jako rusztowań pomogło w obejściu tego problemu4,5,6,7. Jednak wysokie koszty, zmienność między partiami i ograniczona dostępność mogą ograniczać powszechne stosowanie rusztowań dla zwierząt bez komórek8. Istnieją również obawy dotyczące potencjalnego przenoszenia choroby na pacjentów i reakcji immunologicznej na niektóre pozbawione komórek tkanki ssaków9.
Celuloza, pochodząca ze źródeł roślinnych i bakteryjnych, była szeroko wykorzystywana do generowania biomateriałów do szerokiego zakresu zastosowań w medycynie regeneracyjnej. Oto kilka przykładów: bone10,11, cartilage12,13,14 i wound healing15. Rusztowania wykonane z celulozy mają dodatkową zaletę, ponieważ są trwałe i odporne na rozkład przez komórki ssaków. Wynika to z faktu, że komórki ssaków nie wytwarzają enzymów niezbędnych do rozkładu cząsteczek celulozy. Dla porównania, rusztowania wytwarzane przy użyciu makrocząsteczek z macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak kolagen, są łatwo rozkładane16 i mogą nie nadawać się do długoterminowych zastosowań. Rusztowania kolagenowe mogą być stabilizowane przez chemiczne sieciowanie. Istnieje jednak kompromis ze względu na nieodłączną toksyczność środków sieciujących, które wpływają na biokompatybilność rusztowań17. Z drugiej strony, celuloza może pozostać obecna w miejscu implantacji przez dłuższy czas, ponieważ jest odporna na degradację enzymatyczną przez komórki ssaków18,19,20. Można to zmienić, dostrajając szybkość degradacji poprzez wstępną obróbkę hydrolizy i jednoczesne dostarczanie rusztowań z celulazami21. Biokompatybilność decelularyzowanych rusztowań celulozowych pochodzenia roślinnego in vivo została również wykazana w badaniu przeprowadzonym na myszach22.
Przez setki milionów lat ewolucji, rośliny udoskonaliły swoją strukturę i skład, aby zwiększyć efektywność transportu i zatrzymywania płynów. Naczynia naczyniowe roślin minimalizują opór hydrauliczny, rozgałęziając się na mniejsze naczynia, podobnie jak naczynia krwionośne ssaków zgodnie z prawem Murraya23. Po decelularyzacji roślina utrzymuje złożoną sieć naczyń krwionośnych i połączonych ze sobą porów. Biorąc pod uwagę ogromną liczbę łatwo dostępnych różnych gatunków roślin, rusztowania pochodzenia roślinnego mają potencjał, aby przezwyciężyć ograniczenia projektowe, które obecnie dotykają rusztowania w inżynierii tkankowej24,25. Na przykład Modulevsky i wsp. wykazali, że angiogeneza i migracja komórek występują, gdy zdeceluloaryzowaną tkankę jabłka wszczepiono podskórnie na grzbiet myszy 22. Podobnie Gershlak i wsp. wykazali, że komórki śródbłonka mogą być hodowane w unaczynieniu zdecelularyzowanych liści24. W innym eksperymencie Gershlak i wsp. byli również w stanie wykazać, że kardiomiocyty mogą rosnąć na powierzchni liści i były w stanie się skurczyć24.
Rośliny również zawierają złożoną organizację od skali komórkowej do makroskopowej, co jest trudne do osiągnięcia nawet przy użyciu najbardziej zaawansowanych technik produkcji opracowanych do tej pory. Złożona, hierarchiczna konstrukcja tkanek roślinnych sprawia, że są one silniejsze niż suma ich składników26. Rośliny posiadają mnóstwo różnych właściwości mechanicznych, począwszy od sztywnych i wytrzymałych elementów, takich jak łodygi, po znacznie bardziej elastyczne i giętkie, takie jak liście27. Liście różnią się w zależności od gatunku pod względem wielkości, kształtu, wytrzymałości na pękanie, stopnia unaczynienia i mogą mieć różny stopień hydrofilowości. Ogólnie rzecz biorąc, te właściwości roślin sugerują, że rośliny pozbawione komórek mogą służyć jako unikalne i wysoce funkcjonalne urządzenia medyczne, w tym jako rusztowania inżynierii tkankowej.
Ten protokół skupia się na dwóch metodach decelularyzacji tkanek roślinnych, takich jak liście i łodygi, do wykorzystania jako rusztowania w inżynierii tkankowej. Pierwsza metoda to technika oparta na detergentach, która wykorzystuje serię kąpieli do usuwania DNA i materii komórkowej, która została zaadaptowana z szeroko stosowanej techniki decelularyzacji tkanek ssaków i roślin6,22,25,28,29,30. Druga metoda nie wymaga użycia detergentów i jest zaadaptowana z protokołu "szkieletyzacji" zwykle używanego do usuwania tkanek miękkich liści31. Wcześniejsze prace wykazały, że gotowanie liści na wolnym ogniu w roztworze wybielacza i wodorowęglanu sodu ułatwiało oddzielenie naczyń krwionośnych od otaczających tkanek miękkich31. Technika ta może być zaczerpnięta z eksperymentów przeprowadzonych w XVII i XVIII wieku, takich jak praca Albertusa Seba32 i Edwarda Parrish33. Eksperymenty te koncentrowały się na pozostawieniu materii roślinnej, takiej jak liście i owoce, zanurzonej w wodzie na dłuższy czas (od tygodni do miesięcy) i umożliwieniu bardziej miękkim tkankom naturalnego rozkładu. W tym przypadku podejście "szkieletyzacji" jest przystosowane do stosowania łagodniejszych warunków, takich jak dłuższy czas inkubacji w niższych temperaturach, w celu usunięcia pozostałości komórkowych i uniknięcia znacznego zakłócenia struktury tkanek miękkich. Do opisanych w niniejszym dokumencie doświadczeń wykorzystano trzy rodzaje roślin: Ficus hispida, Pachira aquatica i gatunek Garcinia. Opisano wyniki kwantyfikacji DNA, testów mechanicznych oraz wpływu obu metod na komórkową aktywność metaboliczną.

<table><tbody><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma Life Science</td><td>75746-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>807426</td><td>Niejonowy środek powierzchniowo czynny, o którym mowa w artykule. Bardzo lepki odczynnik, może pomóc w przecięciu końcówki pipety podczas jej wyciągania.</td></tr><tr><td>Skoncentrowany wybielacz (8,25% podchlorynu sodu)</td><td>Clorox</td><td>Pozycja #: 31009</td><td>Standardowy skoncentrowany wybielacz.</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Acros Organics</td><td>217120010</td><td>Można zastąpić wodorotlenkiem sodu lub węglanem sodu.</td></tr><tr><td>8 mm Biopunch</td><td>HealthLink</td><td>15111-80</td><td>Tnie próbki, które dobrze mieszczą się w 24-dołkowej</td></tr><tr><td>płytce Stół do potrząsania brzuchem</td><td>Stovall Life Sciences</td><td>BDRAA115S</td><td>Używaj niskich prędkości, aby nie uszkodzić tkanek. Może używać dowolnego modelu / marki stołu do wytrząsania.</td></tr><tr><td>Płyta do mieszania na gorąco / na</td> gorąco <td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Może używać dowolnego stylu / marki płyty gorącej / mieszającej.</td></tr><tr><td>Zlewka</td><td>Dowolna</td><td></td><td>Może używać zlewki o dowolnym rozmiarze, o ile będzie pasować do twoich próbek i nie będzie ich przepełniona.</td></tr><tr><td>Tris Hydrochloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>MT50003PC</td><td></td></tr><tr><td>Test Quant-iT Picogreen dsDNA</td><td>Life Technologies</td><td>P11496</td><td>Może używać dowolnego dostępnego urządzenia do oznaczania ilościowego dsDNA.</td></tr></tbody></table>

dwie metody decelularyzacji tkanek roślinnych do zastosowań w inżynierii tkankowej

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

Autologiczne, syntetyczne i zwierzęce przeszczepy obecnie używane jako rusztowania do zastępowania tkanek mają ograniczenia wynikające z niskiej dostępności, słabej biokompatybilności i kosztów. Tkanki roślinne mają korzystne cechy, które sprawiają, że wyjątkowo nadają się do stosowania jako rusztowania, takie jak duża powierzchnia, doskonały transport i retencja wody, porowatość połączeń, istniejące wcześniej sieci naczyniowe i szeroki zakres właściwości mechanicznych. Opisano tutaj dwie skuteczne metody decelularyzacji roślin do zastosowań w inżynierii tkankowej. Pierwsza metoda opiera się na kąpielach detergentowych w celu usunięcia materii komórkowej, co jest podobne do wcześniej ustalonych metod stosowanych do oczyszczania tkanek ssaków. Druga to metoda bez detergentów zaadaptowana z protokołu, który izoluje naczynia krwionośne liści i polega na użyciu podgrzanego wybielacza i kąpieli solnej w celu oczyszczenia liści i łodyg. Obie metody pozwalają uzyskać rusztowania o porównywalnych właściwościach mechanicznych i niskim wpływie na metabolizm komórkowy, co pozwala użytkownikowi wybrać protokół, który lepiej odpowiada jego zamierzonemu zastosowaniu.

Obie metody pozwoliły na otrzymanie rusztowań odpowiednich do hodowli komórkowych i zastosowań w inżynierii tkankowej. Rycina 1 przedstawia ogólny schemat procesu decelularyzacji z wykorzystaniem nienaruszonego liścia w metodzie opartej na detergentach oraz wyciętych próbek (o średnicy 8 mm) w metodzie bezdetergentowej. Skuteczna decelularyzacja tkanek Ficus hispida z zastosowaniem obu metod pozwoliła na uzyskanie przeźroczystych i nienaruszonych pró...

Tutaj prezentujemy i porównujemy dwa protokoły używane do decelularizacji tkanek roślinnych: podejście oparte na detergentach i podejście bez detergentów. Obie metody pozostawiają macierz zewnątrzkomórkową zastosowanych tkanek roślinnych, które można następnie wykorzystać jako rusztowania do zastosowań w inżynierii tkankowej.

Dwie metody decelularyzacji tkanek roślinnych do zastosowań w inżynierii tkankowej

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Metody te mogą pomóc w rozwiązaniu kluczowych problemów w dziedzinie biomateriałów, takich jak opracowanie rusztowania o doskonałych możliwościach przenoszenia płynów z zaawansowanymi ultrastrukturami i skalowalną produkcją. Główną zaletą tych technik jest to, że można je stosować do większości roślin na tkanki łodygowe bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu. Najpierw zbierz świeże lub mrożone próbki liści F.hispida.Pozostałą świeżą próbkę należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Niech liść pozostanie zanurzony w dejonizowanej wodzie w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza. Użyj czystego stempla do biopsji, aby pociąć liść na krążki o średnicy ośmiu milimetrów.Następnie, aby umyć próbki liści, inkubuj je na płytce wstrząsającej z niską prędkością przez pięć do 10 minut, zanurzając w wodzie dejonizowanej. Następnie przygotuj 10% wagowo SDS w wodzie dejonizowanej. Po przygotowaniu roztworu SDS umieść próbki liści na plastikowym naczyniu.Następnie dodaj roztwór SDS, aby całkowicie pokryć próbki. Umieścić próbki liści z kartą charakterystyki SDS, przykryte, na płycie wstrząsającej, aby zapobiec parowaniu. Następnie

two-methods-for-decellularization-plant-tissues-for-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Decelularyzacja perfuzyjna jest nowoczesną techniką wytwarzania rusztowań całej wątroby, która zachowuje skład macierzy zewnątrzkomórkowej oraz mikroarchitekturę narządu. W niniejszym opracowaniu opisano metodę przygotowania rusztowań całego narządu z wykorzystaniem decelularyzacji perfuzyjnej i późniejszej repopulacji hepatocytami. Dzięki tej technice możliwe jest wytworzenie funkcjonalnych i możliwych do przeszczepienia graftów wątroby.

Decelularyzacja i recelularyzacja całych wątrób

Opisano metodę szybkiego i całkowitego usuwania składników komórkowych z nienaruszonego serca świni poprzez wsteczną perfuzję. Metoda ta pozwala uzyskać specyficzne dla miejsca rusztowanie macierzy zewnątrzkomórkowej serca, które może być stosowane w wielu zastosowaniach klinicznych.

Procedura decelularyzacji serca świni przez wsteczną perfuzję wieńcową

Artykuł opisuje metodologię produkcji bezkomórkowej macierzy z jelita szczura. Wyprowadzenie rusztowań jelitowych jest ważne dla przyszłych zastosowań w inżynierii tkankowej, biologii komórek macierzystych i testowaniu leków.

Metodologia decelularyzacji do produkcji naturalnej bezkomórkowej macierzy jelitowej

Tkankowa matryca zewnątrzkomórkowa (ECM) jest kluczowym mediatorem funkcji komórki. W artykule opisano metody syntezy czystych pianek i mikronośników pochodzących z ECM, które są stabilne w hodowli bez konieczności sieciowania chemicznego do zastosowań w zaawansowanych modelach hodowli komórkowych 3D in vitro lub jako proregeneracyjne biorusztowania.

Wytwarzanie pianek i mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej jako specyficznych tkankowo platform do hodowli i dostarczania komórek

Macierz zewnątrzkomórkowa serca (ECM) to złożona sieć molekuł, które zarządzają kluczowymi procesami w tkankach i organach, jednocześnie znosząc fizjologiczną przebudowę przez całe życie. Standaryzowana decelularyzacja serc płodów i dorosłych pozwala na porównawcze badania eksperymentalne obu tkanek w kontekście 3D poprzez uchwycenie natywnej architektury i właściwości biomechanicznych.

Porównywalna decelularyzacja eksplantatów tkanek serca płodu i dorosłych jako platformy podobne do 3D do badań in vitro

Tutaj opisujemy protokół decelularyzacji żyły odpiszczelowej za pomocą detergentów i recelularyzacji przez perfuzję krwi obwodowej i śródbłonka.

Metodologia decelularyzacji i recelularyzacji żył odpiszczelowych człowieka

Ta metoda umożliwia decelularyzację złożonego stałego organu przy użyciu prostego protokołu opartego na szoku osmotycznym i perfuzji jonowego detergentu przy minimalnym naruszeniu macierzy narządu. Obejmuje on nowatorską technikę decelularyzacji ludzkich serc w woreczku ciśnieniowym z monitorowaniem w czasie rzeczywistym dynamiki przepływu i odpływu zanieczyszczeń komórkowych.

Decellularyzacja całego ludzkiego serca w woreczku ciśnieniowym w orientacji odwróconej

Ten protokół wprowadza metodę tworzenia rusztowania przy użyciu pozbawionych komórek nerek szczurów. Protokół obejmuje procesy decelularyzacji i recelularyzacji w celu potwierdzenia biodostępności. Decelularyzacja odbywa się przy użyciu Triton X-100 i dodecylosiarczanu sodu.

Przygotowanie bezkomórkowych rusztowań nerkowych u szczurów

Protokół opisuje chirurgiczne pobieranie i późniejszą decelularyzację unaczynionych płatów świńskich poprzez perfuzję detergentu z dodecylosiarczanu sodu przez unaczynienie płata w dostosowanym bioreaktorze perfuzyjnym.

Pobieranie i perfuzja-decelularyzacja unaczynionych płatów świń w niestandardowym bioreaktorze perfuzyjnym

W tym badaniu szczegółowo opisujemy metody decelularyzacji, charakterystyki fizycznej, obrazowania i implantacji in vivo biomateriałów pochodzenia roślinnego, a także metody sadzenia i różnicowania komórek w rusztowaniach. Opisane metody pozwalają na ocenę biomateriałów pochodzenia roślinnego do zastosowań w inżynierii tkanki kostnej.

Bezkomórkowe rusztowania pochodzące z jabłek do inżynierii tkanki kostnej in vitro i in vivo

Poznaj dwie metody decelularyzacji tkanek roślinnych z użyciem detergentów i bez nich. Techniki te zachowują macierz pozakomórkową jako rusztowania do inżynierii tkankowej bez specjalistycznego sprzętu.

Dwie metody decelularyzacji tkanek roślinnych do zastosowań w inżynierii tkankowej

Przeglądaj więcej filmów