Metodologia decelularyzacji i recelularyzacji żył odpiszczelowych człowieka

Metoda ta wyjaśnia szczegółową procedurę inżynierii tkankowej żyły odpiszczelowej. Pokazujemy również przygotowanie zestawów do decelularyzacji i bioreaktora do recelularyzacji przy użyciu prostej aparatury. Główną zaletą tej techniki jest to, że do recelularyzacji wymagana jest prosta próbka krwi, co eliminuje bolesne pobieranie szpiku kostnego i czasochłonne procedury hodowli komórek.

W przypadku perfuzji i płukania Triton-X 100 przygotuj zestaw do decelularyzacji. Do dwulitrowej komory przyklej taśmą wszystkie trzy kawałki rurki A. Przyklej jedną rurkę do ściany w miejscu, w którym krawędź dotyka dna komory w celu wlotu detergentu. Przyklej pozostałe dwie rurki do przeciwległej ściany w odległości od pięciu do 10 centymetrów między nimi, w zależności od długości żyły.

Co najmniej pięć centymetrów tych rurek powinno być również przyklejone taśmą do podłogi komory. Podłącz rurkę wlotową detergentu do rurki B za pomocą męskich i żeńskich łączników przynęty. Następnie podłącz rurkę B do rurki F i rurkę F do rurki C. Podłącz rurkę C do wlotu żyły.

Teraz umieść rurkę F w kasecie pompy perystaltycznej. Weź kolejną rurkę C i podłącz jeden koniec do ujścia żyły. Umieść drugi koniec w szklanym słoiku wyposażonym w dolny odpływ węża i umieszczonym 45 centymetrów nad komorą i przyklej go taśmą, aby zabezpieczyć.

Służy on jako wylot detergentu. Następnie wepchnij jeden koniec rurki G do wylotu węża szklanego słoika, a drugi koniec umieść w komorze żylnej. Następnie przygotuj drugą konfigurację decelularyzacji dla perfuzji TnBP, jak opisano w protokole tekstowym.

Przygotuj również trzeci zestaw decelularyzacji do perfuzji DNA, jak opisano w tekście, i umieść go w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby przygotować bioreaktor recelularyzacyjny, włóż rurkę H do jednego portu nasadki z czterema portami, aby służyła jako ujście żyły. Do drugiego portu włóż rurkę I, która będzie służyć jako wlot nośnika.

A do trzeciego portu włóż rurkę J do wlotu żyły. Następnie włóż drugi koniec rurki H do czwartego portu, aby służył jako wylot nośnika. Podłącz łączniki redukcyjne do wewnętrznych końców rurek H i J. Zegnij drugi koniec rurki J w kształt litery U i zawiąż go szwem.

Teraz umieść 60-mililitrową rurkę z płaską podstawą w szklance o pojemności 250 mililitrów. Następnie podłącz jeden koniec rurki K do wlotu żyły, a drugi koniec do rurki E. Podłącz rurkę E do drugiej rurki K, a następnie do wlotu mediów. Następnie umieść przygotowany zestaw nakrętek w probówce znajdującej się w butelce.

Na koniec wysterylizuj bioreaktor przez autoklawowanie. Wykonaj dwa cykle zamrażania i rozmrażania na żyle odpiszczelowej człowieka, jak opisano w protokole tekstowym, przed przecięciem nożyczkami biopsji o długości dwóch milimetrów. Utrwal biopsję w formaldehydzie przez 24 do 48 godzin w temperaturze pokojowej.

Przywiąż każdy koniec żyły do zadziorów łącznika przynęty męskiej i żeńskiej za pomocą szwu. Podłącz żyłę do pierwszego zestawu decelularyzacji i napełnij komorę jednym litrem roztworu drugiego. Teraz wykonuj przez 15 minut z prędkością 35 mililitrów na minutę i opróżnij zawartość zestawu.

Następnie dodaj jeden litr roztworu cztery i wykonuj przez cztery godziny z prędkością 35 mililitrów na minutę. Opróżnij zawartość, dodaj 500 mililitrów roztworu dwa, wytrzymuj przez pięć minut i ponownie opróżnij zawartość. Odłącz żyłę od pierwszego ustawienia perfuzji i podłącz ją do drugiego ustawienia perfuzji.

Następnie dodaj jeden litr roztworu pięć, włącz mieszadło i perfuzuj przez cztery godziny z prędkością 35 mililitrów na minutę. Odłącz żyłę od drugiego zestawu perfuzyjnego i dwukrotnie umyj żyłę na zewnątrz 20 mililitrami ultraczystej wody. Następnie za pomocą strzykawki dwukrotnie przemyj żyłę 20 mililitrami ultraczystej wody przez pięć do 10 minut.

Po perfuzji z trzecim ustawieniem perfuzji, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, podłącz żyłę do pierwszego ustawienia perfuzji. Napełnij jeden litr roztworu dwa i przetapiaj przez noc z prędkością 35 mililitrów na minutę. Powtórz proces perfuzji cztery razy, aby całkowicie usunąć materiał jądrowy.

Po perfuzji opróżnij zestaw, napełnij jeden litr roztworu dwa i perfuzuj przez 24 godziny z prędkością 35 mililitrów na minutę. Po 24 godzinach ponownie opróżnij zestaw i napełnij jednym litrem ultraczystej wody. Perfaktor przez kolejne 24 godziny z prędkością 35 mililitrów na minutę.

Na koniec powtórzyć perfuzję w tych samych warunkach, ale z roztworem siódmym. Po weryfikacji decelularyzacji zgodnie z opisem w protokole tekstowym wysterylizuj żyłę, umieszczając ją w 50-mililitrowej probówce zawierającej 50 mililitrów roztworu ósemki. Mieszać z prędkością 80 obrotów na minutę w wytrząsarce przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pracując w komorze z przepływem laminarnym, aby utrzymać sterylność, użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść sterylną żyłę do nowej 50-mililitrowej probówki zawierającej 50 mililitrów sterylnego roztworu siedem, zawierającego 500 mikrolitrów anty anty. Mieszaj żyłę jak poprzednio przez 12 godzin, zmieniając roztwór siedem co najmniej dwa razy w międzyczasie. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś żyłę do nowej 50-mililitrowej probówki, dodaj 50 mililitrów pożywki śródbłonkowej i mieszaj przez 11 godzin.

Teraz połącz żyłę, przywiązując ją do wlotu i wylotu żyły bioreaktora za pomocą sterylnego szwu i kleszczyków, a następnie dokręć zestaw nakrętki do butelki o pojemności 250 mililitrów. Napełnij bioreaktor tym samym podłożem śródbłonkowym. Dodać heparynę w ilości 50 jednostek na mililitr i perfuzjować przez godzinę w ilości dwóch mililitrów na minutę w inkubatorze.

Zbierz od dawcy od 15 do 25 mililitrów świeżej krwi w probówkach próżniowych pokrytych heparyną i rozcieńcz ją jeden do jednego roztworem steny. Później dodaj czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych pochodzący z gruczołów dokrewnych, podstawowy czynnik wzrostu fibro blastów i subtelny kwas salicylowy. Po opróżnieniu pożywki śródbłonkowej z bioreaktora dodaj do niej krew i perfuzjuj przez 48 godzin z prędkością dwóch mililitrów na minutę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentową zawartością dwutlenku węgla.

Około 12 godzin później pracuj w komorze laminarnej, aby usunąć kroplę krwi z bioreaktora i zmierz poziom glukozy za pomocą urządzenia do monitorowania stężenia glukozy we krwi. Jeśli poziom jest mniejszy niż trzy milimole na litr, dodaj glukozę, aby zbliżyć się do zakresu od siedmiu do dziewięciu milimoli na litr. Po 48 godzinach z powrotem w inkubatorze spuść krew z bioreaktora w komorze z przepływem laminarnym.

Dodaj 30 mililitrów sterylnego roztworu siedem, perfuzjuj przez pięć minut i odcedź roztwór. Powtarzaj ten proces, aż do utraty krwistoczerwonego koloru. Na koniec dodaj 30 do 45 mililitrów pożywki śródbłonkowej i wykonuj perfuzję przez 96 godzin w inkubatorze z prędkością dwóch mililitrów na minutę.

Odłącz żyłę recellularyczną od bioreaktora w komorze z przepływem laminarnym, odetnij pięciomilimetrowe krawędzie żyły za pomocą nożyczek i wyrzuć. Wykonaj biopsję jak poprzednio, umieść w formaldehydzie i przeprowadź weryfikację recelularyzacji zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Ogólna morfologia normalnej żyły ma jaskrawoczerwony kolor.

Czerwony kolor jest tracony w postępujących cyklach decelularyzacji, a po pięciu cyklach leczenia wygląda blado i biało. Żyła zrekomórkowana przez perfuzję krwi obwodowej i śródbłonka ponownie wyglądała na jaskrawoczerwoną. Pokazany tutaj jest reprezentatywny obraz barwienia hemotoksyliną i eozyną normalnej żyły, wskazujący na obecność wielu niebieskich jąder.

Jednak niebieskie jądra nie były widoczne w barwieniu hemotoksyliną i eozyną w żyle bezkomórkowej. W żyłie recellularyzowanej perfundowanej krwią i podłożem śródbłonkowym barwienie hemotoksyliną i eozyną wykazało obecność przyczepu komórek w świetle. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić decelularyzację żyły odpiszczelowej za pomocą detergentów i recelularyzację krwią obwodową i pożywką śródbłonkową.

Ta technika decelularyzacji za pomocą perfuzji Triton-X 100, TnBP i DNA pod ciśnieniem była skuteczna i powtarzalna w usuwaniu jąder z ludzkich żył odpiszczelowych. Chociaż ta technika trwa 20 dni, przechowywanie pozbawionej komórek żyły jako produktu po półce skróci czas zabiegu do ośmiu dni. Recelularyzacja żył z wykorzystaniem krwi obwodowej biorcy może być uznana za klinicznie istotną.

Recellularyzacja żyły przy użyciu podobnego protokołu okazała się obiecująca w transplantacji klinicznej, zapewniając funkcjonalny dopływ krwi po operacji. Z niewielkimi modyfikacjami protokół ten może być stosowany do każdego typu żyły oraz jako spersonalizowany przeszczep w klinikach do wszystkich operacji naczyniowych.