Name: Metodologia decelularyzacji i recelularyzacji żył odpiszczelowych człowieka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Poznaj metodę decelularyzacji i recelularyzacji żył odpiszczelowych człowieka przy użyciu detergentów i próbki krwi obwodowej. Ta technika inżynierii tkankowej oferuje mniej inwazyjną alternatywę dla tradycyjnych procedur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować profesorowi Andersowi Jeppssonowi za pomoc w dostarczeniu naczyń krwionośnych wykorzystywanych w eksperymentach. Badanie zostało sfinansowane z grantu LUA ALF dla SSH.

Użyta tkanka i protokół tego artykułu są zgodne z etycznymi wytycznymi Uniwersytetu w Göteborgu.
1. Przygotowanie i przechowywanie tkanek
<ol>
	<li>Wytnij otaczającą tkankę z pobranej żyły odpiszczelowej za pomocą kleszczy chirurgicznych i nożyczek. 
	UWAGA: Żyła odpiszczelowa jest wycinana z kończyny dolnej człowieka przez chirurgów naczyniowych. Żyła odpiszczelowa użyta w tym artykule jest nieużywaną częścią po operacji pomostowania.</li>
	<li>Aby zapobiec wyciekowi podczas perfuzji, podwiąż wszystkie boczne gałęzie na ich końcach za pomocą szwów i kleszczy.</li>
	<li>Trzymaj żyłę w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 40 ml soli fizjologicznej z buforu fosforanowego (PBS). Przemyj żyłę, zmieniając PBS 2-3 razy, aby usunąć nadmiar krwi. Przechowywać żyłę przez zamrożenie w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zestawów do decelularyzacji i bioreaktora do recelularyzacji
UWAGA: Za pomocą nożyczek przetnij silikonowe rurki tak, jak pokazano w Tabeli 1.
<ol>
	<li>Konfiguracja decelularyzacji 1 (dla perfuzji i mycia Triton X-100)
	<ol>
		<li>Do komory o pojemności 2 litrów (plastikowej wanny) przyklej taśmą wszystkie trzy kawałki rurki A, jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A. 
		UWAGA: Przyklej jedną rurkę do jednej ścianki w miejscu, w którym krawędź styka się z dnem komory (wlotem detergentu), a pozostałe dwie rurki do przeciwległej ścianki w odległości 5 - 10 cm między nimi, w zależności od długości żyły. Co najmniej 5 cm tych rurek powinno być również przyklejone taśmą do dna komory (wlot i wylot żyły).</li>
		<li>Za pomocą męskich i żeńskich złączy Luer połącz szeregowo rurkę doprowadzającą detergent do rurki B, następnie rurki F, rurki C i na końcu do wlotu żyły. Umieścić rurkę F w kasecie pompy perystaltycznej I.</li>
		<li>Weź kolejną rurkę C i podłącz jeden koniec do ujścia żyły. Umieść drugi koniec w szklanym słoiku z dolnym wylotem węża, który znajduje się 45 cm nad komorą (wylot detergentu) i przyklej go taśmą, aby zabezpieczyć. Weź rurkę G i wepchnij jeden koniec do wylotu węża szklanego słoika, a drugi koniec umieść w komorze żylnej. 
		UWAGA: Zdjęcia kompletnej konfiguracji (czerwone strzałki), komory i kierunku przepływu (białe strzałki) są pokazane w Rysunek 1A.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja decelularyzacji 2 (dla perfuzji TnBP)
	<ol>
		<li>Weź szklany słoik o pojemności 1 litra i umieść jeden koniec rurki C (wlot detergentu) w słoiku, aż rurka dotknie dna słoika.</li>
		<li>Podłącz drugi koniec do rurki F, a następnie rurki C. Umieść drugi koniec rurki C w słoiku do połowy głębokości (wlot żyły). Umieścić rurkę F w kasecie pompy perystaltycznej I.</li>
		<li>Weź rurkę D i umieść jeden koniec w słoiku (wylot żyły) do połowy głębokości, a drugi koniec w szklanym słoiku z dolnym wężem umieszczonym na wysokości 45 cm od wlotu żyły (wylotu detergentu). Aby zabezpieczyć, zaklej taśmą rurki wlotowe i wylotowe detergentu.</li>
		<li>Umieść szklany słoik o pojemności 1 l na mieszadle magnetycznym i trzymaj magnes wewnątrz butelki.</li>
		<li>Weź rurkę G i wepchnij jeden koniec na wylot węża szklanego słoika, a drugi koniec umieść w szklanym słoiku o pojemności 1 l. 
		UWAGA: Obraz kompletnej konfiguracji (czerwone strzałki), komory i kierunku przepływu (białe strzałki) jest pokazany w Rysunek 1B.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja decelularyzacji 3 (dla perfuzji DNazy)
	<ol>
		<li>Weź szklaną butelkę o pojemności 250 ml i umieść oba końce probówki C. Umieść środkową część rurki w kasecie pompy perystaltycznej II. 
		UWAGA: Jeden koniec rurki jest wlotem roztworu, a drugi koniec rurki jest podłączony do wlotu żyły. Ujście żyły pozostawia się wolne w roztworze.</li>
		<li>Umieść cały zestaw wraz z pompą w temperaturze 37 °C. Obraz kompletnej konfiguracji i kierunku przepływu jest pokazany w Rysunek 1C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bioreaktor recelularyzacyjny
	<ol>
		<li>Przygotuj wszystkie części, jak pokazano na Rysunek 2A.</li>
		<li>Jak pokazano w Rysunek 2B, weź 4-portową nasadkę i włóż do każdego portu, rurkę H (wylot żyły), rurkę I (wlot mediów) i rurkę J (wlot żyły). Włóż drugi koniec rurki H do 4. portu (gniazda mediów). 
		UWAGA: Widok 4-portowej nasadki od góry jest pokazany na Rysunek 2C. Aby ułatwić wkładanie rurek, przytnij krawędzie do ostrego punktu nożyczkami.</li>
		<li>Zegnij drugi koniec rurki J w kształt litery U i zawiąż ją szwem. Podłącz złącza redukcyjne do wewnętrznych końców rurek H i J.</li>
		<li>Umieść probówkę o pojemności 60 ml z płaską podstawą w szklanej butelce o pojemności 250 ml, a następnie umieść powyższą konfigurację w probówce, jak pokazano w <silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D. Jak pokazano na Rysunek 2E, połącz rury K, E i K szeregowo. Podłącz jedną rurkę K do wlotu żyły, a drugą rurkę K do wlotu mediów. 
		UWAGA: Schemat ideowy konfiguracji i kierunku przepływu jest widoczny na Rysunek 2F.</li>
		<li>Wysterylizuj bioreaktor przez autoklawowanie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Roztwór 1 (10x woda): Do 1 l ultraczystej wody dodać 2 g azydku sodu i 18,6 g kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Mieszaj, aż sole się rozpuszczą.</li>
	<li>Roztwór 2 (1x woda): Weź 100 ml roztworu 1 i dodaj 900 ml ultraczystej wody.</li>
	<li>Roztwór 3 (5x Triton X-100): Do 950 ml ultraczystej wody dodać 50 ml Triton X-100, 1 g azydku sodu i 9,3 g EDTA. Mieszaj, aż się rozpuści.</li>
	<li>Roztwór 4 (1x Triton X-100): Weź 200 ml roztworu 3 i dodaj 800 ml ultraczystej wody.</li>
	<li>Roztwór 5 (1x TnBP): Dodać 10 ml TnBP za pomocą pipety 10 ml do 990 ml roztworu 2.</li>
	<li>Roztwór 6 (40 jednostek Kunitza/ml DNazy): Dodać 2 000 jednostek Kunitza DNazy do 50 ml soli fizjologicznej buforu fosforanowego Dulbecco zawierającej CaCl2 i MgCl2. Przygotuj świeże i natychmiast zużyj.</li>
	<li>Roztwór 7 (PBS): Dodać 24 g chlorku sodu, 0,6 g chlorku potasu, 4,32 g fosforanu sodu i 0,72 g fosforanu potasu do 3 l ultraczystej wody. Mieszaj, aż się rozpuści. Dostosować pH do 7,4. Wysterylizuj 1 l PBS w autoklawie i przechowuj oddzielnie.</li>
	<li>Roztwór 8 (0,1% kwas nadoctowy): Do 50 ml sterylnego roztworu 7 dodać 50 μl kwasu nadoctowego. Przygotuj świeże i natychmiast zużyj.</li>
</ol>
4. Przygotowanie podłoża śródbłonkowego
<ol>
	<li>Dodać 5 ml L-glutaminy, 5 ml anty-anty-anty, 50 ml ludzkiej surowicy AB i wszystkie składniki zestawu czynnika wzrostu EGM-2 z wyjątkiem płodowej surowicy bydlęcej do 500 ml pożywki dla MCDB131 pod sterylnym kapturem.</li>
</ol>
5. Decelularyzacja żyły odpiszczelowej
<ol>
	<li>Rozmrozić ludzką żyłę odpiszczelową od -80 °C w temperaturze pokojowej. Ponownie zamrozić w temperaturze -80 °C i ponownie rozmrozić w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wytnij biopsję o długości 2 mm za pomocą nożyczek i utrwal w formaldehydzie na 24 - 48 godzin w temperaturze pokojowej. Przywiąż każdy koniec żyły do zadziorów męskiego i żeńskiego łącznika Luer za pomocą szwu.</li>
	<li>Podłącz żyłę do zestawu decelularyzacji 1 i napełnij 1 litr roztworu 2. Utymulować przez 15 min przy 35 ml/min. Opróżnij zawartość instalacji.</li>
	<li>Dodać 1 l roztworu 4 i stosować przez 4 godziny w stężeniu 35 ml/min. Opróżnić zawartość zestawu.</li>
	<li>Dodać 500 ml roztworu 2 i stosować przez 5 minut. Opróżnić zawartość zestawu. Powtórz ten krok. Odłącz żyłę od konfiguracji perfuzji 1 i podłącz do konfiguracji perfuzji 2.</li>
	<li>Dodać 1 l roztworu 5, włączyć mieszadło i utrwalać przez 4 godziny przy 35 ml/min. 
	UWAGA: Roztwór 5 wygląda na mętny po włączeniu mieszadła i przez cały czas perfuzji.</li>
	<li>Odłączyć żyłę od zestawu perfuzyjnego 2 i przemywać żyłę na zewnątrz i wewnątrz strzykawką lub pipetą o pojemności 10 ml w 4 podmianach ultraczystej wody przez 5 - 10 minut.</li>
	<li>Podłączyć żyłę do zestawu perfuzyjnego 3, dodać 50 ml roztworu 6 i wysysać z prędkością 10 ml/min w komorze o temperaturze 37 °C przez 4 godziny. Opróżnij zawartość zestawu i odłącz żyłę od zestawu.</li>
	<li>Podłącz żyłę do zestawu perfuzyjnego 1, napełnij 1 litr roztworu 2 i perfuzjuj przez noc z prędkością 35 ml/min. Powtórz kroki od 5.4 do kroku 5.9 4 razy (w sumie 5 cykli). Ponownie wykonaj biopsję, jak podano w kroku 5.2. 
	UWAGA: Pomiń krok 5.8 druga część w cyklach 1 i 3.</li>
	<li>Opróżnij zawartość instalacji. Napełnić 1 l roztworu 2 i uzgadniać przez 24 godziny z prędkością 35 ml/min. Zmień roztwór 2 po 12 godzinach. Opróżnij zawartość instalacji. Napełnij 1 l ultraczystej wody i uzyskuj przez 24 godziny z prędkością 35 ml/min. Wymień ultraczystą wodę po 12 godzinach. Opróżnij zawartość zestawu. Napełnić 1 l roztworu 7 i uzgadniać przez 24 godziny z prędkością 35 ml/min. Zmień roztwór 7 po 12 godzinach.</li>
</ol>
6. Weryfikacja decelularyzacji
<ol>
	<li>Umyj biopsje utrwalone formaliną w ultraczystej wodzie przez 15 minut. Przetwarzaj w procesorze tkanek zgodnie ze standardowymi protokołami i zanurz w parafinie22.</li>
	<li>Wytnij skrawki o grubości 5 μm za pomocą mikrotomu i zabarwij hematoksyliną Meyera i 0,2% alkoholową eozyną (H&E) zgodnie ze standardowymi protokołami22.</li>
	<li>Obejrzyj pod mikroskopem, aby sprawdzić, czy nie ma utraty jąder w tkance pozbawionej komórek w porównaniu z normalną tkanką.</li>
</ol>
7. Recelularyzacja
<ol>
	<li>Wysterylizuj żyłę, umieszczając ją w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 50 ml roztworu 8. Mieszać z prędkością 80 obrotów na minutę (obr./min) w wytrząsarce przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Od teraz należy obchodzić się z żyłą pod szafką z przepływem laminarnym (LAF), aby zachować sterylność. Przenieść żyłę za pomocą sterylnych kleszczyków do nowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 50 ml sterylnego roztworu 7 i 500 μl antyanty-anty. Mieszać jak wyżej przez 12 godzin. Zmienić roztwór 7 co najmniej dwa razy w międzyczasie.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczyków przenieś żyłę do nowej probówki o pojemności 50 ml i dodaj 50 ml pożywki śródbłonkowej. Mieszać jak wyżej przez 11 godzin.</li>
	<li>Zmontuj bioreaktor za pomocą sterylnych rękawiczek pod szafką LAF. Przywiąż żyłę do wlotu i wylotu żyły bioreaktora za pomocą sterylnego szwu i kleszczyków.</li>
	<li>Podłącz żyłę do bioreaktora i napełnij ją tym samym medium. Dodać heparynę w stężeniu 50 j.m./ml i perfuzjować przez 1 godzinę w stężeniu 2 ml/min w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Pobrać 15 - 25 ml świeżej krwi (w zależności od długości żyły) od dawcy w probówkach próżniowych pokrytych heparyną i rozcieńczyć w stosunku 1:1 roztworem Steena. Następnie dodaj czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych pochodzący z gruczołów dokrewnych (EG-VEGF, 80 ng / ml), podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (b-FGF, 4 μl / ml) i kwas acetylosalicylowy (5 μg / ml).</li>
	<li>Przenieść bioreaktor do inkubatora o temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wysysać przez 48 godzin z prędkością 2 ml/min.</li>
	<li>Po około 12 godzinach przenieś bioreaktor do szafy LAF, pobierz kroplę krwi i zmierz poziom glukozy za pomocą urządzenia do monitorowania stężenia glukozy we krwi. Jeśli poziom jest mniejszy niż 3 mmol/L, dodaj glukozę, aby uzyskać zakres 7 - 9 mmol/L. Powtarzaj ten krok co 8 - 12 godzin.</li>
	<li>Po 48 godzinach przenieś bioreaktor do szafy LAF i spuść krew z bioreaktora. Dodać 30 ml sterylnego roztworu 7 i perfuzjować przez 5 minut. Odcedź roztwór. Dodać 30 ml sterylnego roztworu 7 i perfuzjować przez 5 minut. Powtórz dwa razy lub do momentu, gdy stracisz krwistoczerwony kolor. 
	UWAGA: Biopsję można wykonać w celu weryfikacji przyczepu komórki. Odłącz żyłę, odetnij 5 mm krawędzie żyły nożyczkami i wyrzuć je. Wykonaj biopsję zgodnie z opisem w kroku 5.2 i ponownie podłącz żyłę do bioreaktora (krok opcjonalny).</li>
	<li>Dodać 30-45 ml pożywki śródbłonkowej i perfuzjować przez 96 godzin w inkubatorze w tempie 2 ml/min. 
	UWAGA: Dodawaj podłoże śródbłonkowe, aż żyła zostanie zanurzona.</li>
	<li>Przenieś bioreaktor do szafy LAF, odłącz żyłę recelularyczną, odetnij 5 mm krawędzie żyły za pomocą nożyczek i wyrzuć. Wykonaj biopsję, jak opisano w kroku 5.2.</li>
</ol>
8. Weryfikacja recelularyzacji
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami w sekcji 6 i wykonaj barwienie H&E. Zbadaj szkiełka pod mikroskopem pod kątem obecności komórek.</li>
</ol>

<ol><li>Brockbank, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+upon+vein+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation upon vein function in vivo.</a> Cryobiology. 31 (1), 71-81 (1994).</li>
<li>O'Donnell, T. F. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+operative+findings+with+angiographic+and+noninvasive+hemodynamic+factors+associated+with+failure+of+polytetrafluoroethylene+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Correlation of operative findings with angiographic and noninvasive hemodynamic factors associated with failure of polytetrafluoroethylene grafts.</a> Journal of Vascular Surgery. 1 (1), 136-148 (1984).</li>
<li>Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+autologous+bladders+for+patients+needing+cystoplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty.</a> Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).</li>
<li>Raya-Rivera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+autologous+urethras+for+patients+who+need+reconstruction%3A+an+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study.</a> Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).</li>
<li>Macchiarini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li>
<li>Olausson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+an+allogeneic+vein+bioengineered+with+autologous+stem+cells%3A+a+proof-of-concept+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study.</a> Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).</li>
<li>Olausson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Application+of+Tissue-Engineered+Veins+Using+Autologous+Peripheral+Whole+Blood%3A+A+Proof+of+Concept+Study%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">In Vivo Application of Tissue-Engineered Veins Using Autologous Peripheral Whole Blood: A Proof of Concept Study.</a> EBioMedicine. 1 (1), 72-79 (2014).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nature Medicine. 16 (8), 927-933 (2010).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16 (7), 814-820 (2010).</li>
<li>Conconi, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+matrices%2C+obtained+by+a+detergent-enzymatic+method%2C+support+in+vitro+the+adhesion+of+chondrocytes+and+tracheal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells.</a> Transplant International. 18 (6), 727-734 (2005).</li>
<li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16519932">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).</li>
<li>Zhang, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+human+fetal+mesenchymal+stem+cells+for+off-the-shelf+bone+tissue+engineering+application%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The potential of human fetal mesenchymal stem cells for off-the-shelf bone tissue engineering application.</a> Biomaterials. 33 (9), 2656-2672 (2012).</li>
<li>Elebring, E., Kuna, V. K., Kvarnstrom, N., Sumitran-Holgersson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-perfusion+decellularization+of+whole-organ+porcine+pancreas+supports+human+fetal+pancreatic+cell+attachment+and+expression+of+endocrine+and+exocrine+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cold-perfusion decellularization of whole-organ porcine pancreas supports human fetal pancreatic cell attachment and expression of endocrine and exocrine markers.</a> Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417738145(2017).</li>
<li>Masumoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-engineered+cardiac+tissue+sheets+with+cardiomyocytes+and+vascular+cells+for+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration.</a> Science Reports. 4, 6716(2014).</li>
<li>Wiles, K., Fishman, J. M., De Coppi, P., Birchall, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Host+Immune+Response+to+Tissue-Engineered+Organs%3A+Current+Problems+and+Future+Directions%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions.</a> Tissue Engineering Part B Reviews. 22 (3), 208-219 (2016).</li>
<li>Young, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+in+the+eyes+of+an+immunologist%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells in the eyes of an immunologist.</a> Cancer Immunology Immunotherapy. 61 (10), 1609-1616 (2012).</li>
<li>Graham, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+seeding+of+prosthetic+vascular+grafts%3A+early+experimental+studies+with+cultured+autologous+canine+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell seeding of prosthetic vascular grafts: early experimental studies with cultured autologous canine endothelium.</a> Archives of Surgery. 115 (8), 929-933 (1980).</li>
<li>Onuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+endothelialization+model+for+the+study+of+Dacron+graft+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Accelerated endothelialization model for the study of Dacron graft healing.</a> Annals of Vascular Surgery. 11 (2), 141-148 (1997).</li>
<li>Clowes, A. W., Kirkman, T. R., Reidy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+arterial+graft+healing.+Rapid+transmural+capillary+ingrowth+provides+a+source+of+intimal+endothelium+and+smooth+muscle+in+porous+PTFE+prostheses%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of arterial graft healing. Rapid transmural capillary ingrowth provides a source of intimal endothelium and smooth muscle in porous PTFE prostheses.</a> American Journal of Pathology. 123 (2), 220-230 (1986).</li>
<li>L'Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tissue-engineered+blood+vessels+for+adult+arterial+revascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization.</a> Nature Medicine. 12 (3), 361-365 (2006).</li>
<li>Syedain, Z. H., Meier, L. A., Lahti, M. T., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+completely+biological+engineered+grafts+following+decellularization+into+the+sheep+femoral+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Implantation of completely biological engineered grafts following decellularization into the sheep femoral artery.</a> Tissue Engineering Part A. 20 (11-12), 1726-1734 (2014).</li>
<li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protocols%22%5BJournal%5D)">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harb Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).</li>
<li>Pollack, A. A., Taylor, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+exercise+and+body+position+on+the+venous+pressure+at+the+ankle+in+patients+having+venous+valvular+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The effect of exercise and body position on the venous pressure at the ankle in patients having venous valvular defects.</a> Journal of Clinical Investigation. 28 (3), 559-563 (1949).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-molecular-weight+peptides+derived+from+extracellular+matrix+as+chemoattractants+for+primary+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endothelium%22%5BJournal%5D)">Low-molecular-weight peptides derived from extracellular matrix as chemoattractants for primary endothelial cells.</a> Endothelium. 11 (3-4), 199-206 (2004).</li>
<li>van Ark, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+diabetes+mellitus+is+associated+with+an+imbalance+in+circulating+endothelial+and+smooth+muscle+progenitor+cell+numbers%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Type 2 diabetes mellitus is associated with an imbalance in circulating endothelial and smooth muscle progenitor cell numbers.</a> Diabetologia. 55 (9), 2501-2512 (2012).</li>
<li>Steen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+lungs+from+a+non-heart-beating+donor%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor.</a> Lancet. 357 (9259), 825-829 (2001).</li>
<li>Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Cypel, M., Keshavjee, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4133548/">Ex-vivo lung perfusion.</a> Transplant International. 28 (6), 643-656 (2015).</li>
<li>Cross, M. J., Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+and+VEGF+function+in+angiogenesis%3A+signalling+pathways%2C+biological+responses+and+therapeutic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Science%22%5BJournal%5D)">FGF and VEGF function in angiogenesis: signalling pathways, biological responses and therapeutic inhibition.</a> Trends in Pharmacological Science. 22 (4), 201-207 (2001).</li>
<li>Peplow, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor-+and+cytokine-stimulated+endothelial+progenitor+cells+in+post-ischemic+cerebral+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Growth factor- and cytokine-stimulated endothelial progenitor cells in post-ischemic cerebral neovascularization.</a> Neural Regeneration Research. 9 (15), 1425-1429 (2014).</li>
<li>Xiao-Yun, X., Zhao-Hui, M., Ke, C., Hong-Hui, H., Yan-Hong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon-like+peptide-1+improves+proliferation+and+differentiation+of+endothelial+progenitor+cells+via+upregulating+VEGF+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Science+Monitor%22%5BJournal%5D)">Glucagon-like peptide-1 improves proliferation and differentiation of endothelial progenitor cells via upregulating VEGF generation.</a> Medical Science Monitor. 17 (2), BR35-BR41 (2011).</li>
<li>Dragoni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+stimulates+endothelial+colony+forming+cells+proliferation+and+tubulogenesis+by+inducing+oscillations+in+intracellular+Ca2%2B+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor stimulates endothelial colony forming cells proliferation and tubulogenesis by inducing oscillations in intracellular Ca2+ concentration.</a> Stem Cells. 29 (11), 1898-1907 (2011).</li>
<li>Sai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+is+essential+to+maintain+endothelial+progenitor+cell+phenotype+in+TR-BME2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor is essential to maintain endothelial progenitor cell phenotype in TR-BME2 cells.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (4), 688-693 (2014).</li>
<li>Gallus, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspirin+and+other+platelet-aggregation+inhibiting+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Journal+of+Asutralia%22%5BJournal%5D)">Aspirin and other platelet-aggregation inhibiting drugs.</a> Medical Journal of Asutralia. 142 (1), 41-47 (1985).</li>
</ol>

SSH posiada udziały w Verigraft, spółce, która uzyskała licencję na technologię inżynierii tkankowej naczyń krwionośnych. Pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiona tutaj technika decelularyzacji żył odpiszczelowych jest łatwą, prostą i opłacalną metodą, którą można również zastosować do wszystkich żył o małej średnicy, takich jak żyły pępowinowe i sutkowe. Roztwory decelularyzacyjne i ich stężenia stosowane w tej metodzie pochodzą z naszych poprzednich wyników 6,7. Mimo że zalecamy 5 cykli decelularyzacji, w niektórych żyłach zauważyliśmy również całkowitą decelularyzację w 3 cyklach. Jednak powtarzalne wyniki uzyskano przy użyciu 5 cykli. Stosując ten protokół, z powodzeniem przeprowadziliśmy decelularyzację żył o różnej długości do 30 cm (wynik niepublikowany). Podniesienie wylotu roztworu decelularyzacyjnego o 45 cm wytworzy ciśnienie 33 mmHg wewnątrz żyły. Z naszego doświadczenia wynika, że jest to kluczowy krok w decelularyzacji całej żyły w sposób jednolity i powtarzalny w ciągu 5 cykli. Wybrane ciśnienie jest 3 razy wyższe niż normalne ciśnienie w żyle odpiszczelowej (5 - 10 mmHg), ale jest takie samo jak w żyłach niewydolnych (żylaki)23. Ponadto spekulujemy, że to wysokie ciśnienie wytworzy znaczną siłę na ścianach żył i dlatego może pomóc w skutecznym i szybszym usuwaniu komórek.
Ponieważ TnBP jest rozpuszczalnikiem organicznym i jest nierozpuszczalny w wodzie, ważne jest mieszanie detergentu, aż stanie się mętny; W przeciwnym razie detergent będzie unosił się na wodzie. Z tego samego powodu, aby TnBP był zmieszany z roztworem, rurka wylotowa detergentu została umieszczona w górnej części szklanego słoika z wylotem węża. O skutecznym usuwaniu TnBP z żyły po jej użyciu w każdym cyklu świadczy brak pływających kropelek TnBP w przemytej wodzie. Zauważyliśmy również, że pominięcie kroku DNazy również spowodowało decelularyzację tkanki, ale w kilku przypadkach zauważono stosunkowo wysoką zawartość DNA w tkance pozbawionej komórek. Ponieważ wysokie ciśnienie i wysokie natężenia przepływu nie są wymagane do efektywnej aktywności DNazy, można zastosować niską szybkość perfuzji (10 ml/min). Zastosowano inną pompę perystaltyczną, ponieważ jej mniejszy rozmiar pomaga w łatwej obsłudze zestawu. Ponieważ zauważyliśmy, że uszkodzenie większości komórek podczas decelularyzacji powoduje cykl 2, sugerujemy pominięcie leczenia DNazą podczas cykli 1 i 3 (wynik niepublikowany). Mimo że charakterystyka i kwantyfikacja białek macierzy zewnątrzkomórkowej nie zostały przeprowadzone w tym manuskrypcie, nasze wcześniejsze doświadczenia z podobnymi protokołami decelularyzacji wykazały zachowanie właściwości biomechanicznych, struktury macierzy zewnątrzkomórkowej i białek7. Chociaż nasze wstępne eksperymenty kwantyfikacyjne z tymi żyłami dały podobny wynik (niepublikowany), nasze już opublikowane wyniki wzmocnią tę pewność.
Recelularyzacja przy użyciu krwi jest wygodnym i łatwym procesem w przypadku rozszerzonych komórek szpiku kostnego, ponieważ można uniknąć długiego czasu ekspansji komórek, spontanicznych mutacji w rozszerzonych komórkach, inwazji chirurgicznej i dyskomfortu dla pacjenta. Ponieważ wiadomo, że śródbłonek może również zachodzić z krążących EPC, postawiliśmy hipotezę, że perfuzja z krwią, a następnie perfuzja z podłożem śródbłonkowym będzie wystarczająca do recelularyzacji. Bezpieczeństwo tkanek żylnych zmodyfikowanych przy użyciu podobnej metody wynika z pomyślnych wyników przeszczepu, gdy dwie takie żyły zostały wszczepione dzieciom z dodatkową niedrożnością żyły wrotnej wątroby7. Spekulujemy, że czynniki wzrostu w zdecelularizowanej macierzy zewnątrzkomórkowej pozwolą na przyłączenie krążących EPC z krwi24. Recelularyzacja żył zgodnie z podobnym protokołem wykazała komórki dodatnie dla receptora VEGF-2 i klastra różnicowania (CD) 14 na świetle, podczas gdy komórki eksprymujące CD45 zaobserwowano w przydankach7. Wyobrażamy sobie również, że ciągła warstwa śródbłonka może nie być obserwowana we wszystkich przypadkach, zwłaszcza przy użyciu krwi od starszych i chorych pacjentów, ponieważ wiadomo, że takie osoby mają zmniejszoną liczbę krążących komórek progenitorowych25. Postulujemy jednak, że perfuzja z własną krwią biorcy może maskować wiele antygenów, które są narażone z powodu decelularyzacji, a tym samym może zmniejszyć ryzyko wystąpienia niepożądanych reakcji zapalnych po przeszczepie, w przeciwieństwie do przeszczepiania tylko bezkomórkowych naczyń krwionośnych. Ponadto perfuzja krwi może odkładać zwiększony poziom czynników wzrostu na świetle i przydankach, co z kolei może rekrutować zwiększoną liczbę krążących komórek progenitorowych, co powoduje szybki proces recelularyzacji in vivo.
Zalety konstrukcji bioreaktora zastosowanej w tym badaniu to kompletny autoklaw, łatwy montaż, opłacalność, łatwa obsługa i najmniejsze prawdopodobieństwo uszkodzenia. Z naszego doświadczenia, przy użyciu obecnego projektu, żyły o długości do 10 cm zostały zrekomórkowane. Mimo że żyły o długości do 25 cm mogą być również rekomórkowane poprzez utrzymywanie żyły w kształcie litery "U" wewnątrz bioreaktora, powinno to zostać zweryfikowane. Konstrukcja bioreaktora pokazuje, że kierunek przepływu w żyle jest przeciwny do grawitacji i jest tak zaprojektowany, ponieważ jest to normalny kierunek przepływu dla tych żył u ludzi. 12-godzinna perfuzja pożywki śródbłonkowej ma na celu wstępne kondycjonowanie żyły i zwiększenie powinowactwa do przyczepiania przychodzących EPC. Dodanie dodatkowej heparyny i perfuzji przez 1 godzinę zmniejszy ryzyko tworzenia się skrzepów krwi w probówkach podczas perfuzji krwi.
Wymagana objętość krwi zależy od długości żyły. Podstawową zasadą, którą kierujemy się w odniesieniu do objętości krwi, jest to, że żyła powinna być zanurzona we krwi. Podczas pracy z objętościami krwi większymi niż 45 ml może być wymagane sporadyczne mieszanie, aby zapobiec gromadzeniu się komórek na dnie bioreaktora. Dodaliśmy roztwór Steena do krwi, ponieważ zawiera on dużą ilość białek i składników niezbędnych do utrzymania zdrowych tkanek podczas przeszczepu narządów26,27. Dodanie VEGF i b-FGF jest korzystne, ponieważ są one silnymi angiogennymi czynnikami wzrostu28, a ich obecność indukuje migrację, proliferację i różnicowanie EPC 29,30,31,32. Ilość dodanego VEGF opiera się na naszych poprzednich niepublikowanych wynikach, w których proliferację EPC zaobserwowano na poziomie 80 ng / ml. Dodanie aspiryny hamuje aktywację płytek krwi33, zmniejszając w ten sposób szanse na ich przyczepienie się do warstwy śródbłonka. Ciągłe monitorowanie i dodawanie glukozy będzie również korzystne dla proliferacji komórek i zapobiegania hemolizie czerwonych krwinek.
Ponieważ od biorcy wymagana jest tylko prosta próbka krwi, można ją uznać za łatwą i wykonalną procedurę wymagającą mniejszej wiedzy technicznej. Mimo że cała przedstawiona tutaj procedura od początku do końca trwa 20 dni, przechowywanie żył pozbawionych komórek jako produktu z półki skróci procedurę do 8 dni dla pacjentów. Chociaż przechowywanie żył pozbawionych komórek technicznie nie powinno wpływać na skuteczność recelularyzacji, należy je ocenić. Żyły inżynierii tkankowej powstałe w wyniku tej procedury mogą być wykorzystywane w klinice do operacji pomostowania, zastępowania niedrożnych żył, niewydolności żylnej prowadzącej do żylaków bez konieczności immunosupresji, a tym samym zapewniając lepszą jakość życia pacjenta.

Przewody naczyniowe są wymagane w przypadku kilku stanów klinicznych, takich jak tętniaki, zwężenie tętnicy szyjnej i miażdżyca, prowadzące do poważnych problemów naczyniowych. Chirurdzy używają autologicznych, allogenicznych lub syntetycznych przewodów naczyniowych, aby przywrócić funkcjonalny dopływ krwi. Chociaż stosowanie autologicznych naczyń krwionośnych jest nadal uważane za idealne podejście, ich dostępność u pacjentów jest znacznie ograniczona. Alternatywy, takie jak przeszczepy allogeniczne lub syntetyczne, mają poważne problemy z leczeniem immunosupresyjnym i słabą drożnością prowadzącą do reoperacji1,2, co skutkuje poważnymi obciążeniami zdrowotnymi dla krajów. Inżynieria tkankowa naczyń krwionośnych ma na celu zapewnienie przeszczepom naturalnej homologii i komórek autologicznych. W ten sposób układ odpornościowy biorcy rozpoznaje przeszczepiony przeszczep jako jaźń, a ponieważ taki przeszczep zawiera naturalne białka i komórki w oryginalnej konfiguracji, może działać lepiej w porównaniu z obecnymi alternatywami. Narządy inżynierii tkankowej, takie jak bladder3, urethra4, trachea5 i veins6,7, zostały z powodzeniem wykorzystane w klinice.
Inżynieria tkankowa do produkcji spersonalizowanych przeszczepów wymaga przeszczepu od dawcy, a następnie decelularyzacji i recelularyzacji. Decelularyzacja to obiecująca technologia usuwania komórek z tkanek i narządów8,9,10. Decelularyzacja może być przeprowadzana za pomocą określonych metod fizycznych, chemicznych i enzymatycznych11 lub poprzez ich połączenie. Przy optymalnym zastosowaniu tych metod, tkanki pozbawione komórek mogą mieć podobne białka strukturalne i funkcjonalne w macierzy zewnątrzkomórkowej podobne do tkanek natywnych. Takie narządy posiadają wewnętrzną zdolność do wzmacniania przyczepiania, migracji, proliferacji i różnicowania napływających komórek macierzystych.
Recelularyzacja to dynamiczny proces wprowadzania komórek do przeszczepu, a komórki macierzyste biorcy mogą być używane do klinicznego przeszczepu. Komórki macierzyste obecnie wykorzystywane do takich celów obejmują szpik kostny, mezenchymalny i mieszkańców narządów3,5,6. W badaniach na zwierzętach i badaniach naukowych wykorzystano komórki macierzyste pochodzenia mezenchymalnego, które są płodowe i indukowane pluripotencjalne12,13,14. Proces ten wymaga bioreaktora (komory, w której znajduje się żyła i zapewnia niezbędne warunki, takie jak temperatura, gazy, pH i ciśnienie), komórek i pożywek hodowlanych. Wyzwaniem w recelularyzacji jest uzyskanie wymaganej liczby komórek określonego typu i strategii wysiewu, dzięki której komórki mogą dotrzeć do całej tkanki lub narządu. Mimo że do tej pory nie wygenerowano i nie oceniono żadnej kompletnej tkanki lub narządu pod względem strukturalnym i funkcjonalnym, kilka postępów w tej dziedzinie i wstępne wyniki wskazują na przyszłą możliwość15. Kluczową funkcją żyły jest śródbłonek światła, który kontroluje infiltrację komórek zapalnych do tkanek oraz środkowa warstwa mięśni gładkich, która pomaga w zwężaniu, a także zapewnia siłę do utrzymania ciśnienia krwi16. Badania wykazały, że podczas uszkodzenia endotelializacja następuje albo w wyniku zespolenia, albo z krążących śródbłonkowych komórek progenitorowych (EPC) we krwi17,18,19. Nasza strategia recelularyzacji żył opiera się na EPC obecnych we krwi krążącej.
Inżynieria tkankowa żył i tętnic została przeprowadzona przez kilka grup stosujących różne strategie decelularyzacji i recelularyzacji20,21. Nasza grupa przeprowadziła również i opracowała strategie decelularyzacji i recelularyzacji żył biodrowych i sutkowych6,7. Decelularyzacja została przeprowadzona przez mieszanie żyły w Triton X-100, fosforanie tri-n-butylu (TnBP) i enzymie dezoksyrybonukleazie (DNaza). Recelularyzację przeprowadzono przy użyciu komórek śródbłonka i mięśni gładkich pochodzących ze szpiku kostnego6 lub krwi obwodowej7. Żyły zrekomórkowane za pomocą któregokolwiek z protokołów wykazały kliniczną obietnicę w zapewnianiu funkcjonalnego zaopatrzenia w krew w transplantacji pacjentów pediatrycznych z dodatkową niedrożnością żyły wrotnej wątroby6,7.
Obecnie opracowaliśmy zmodyfikowaną wersję tego samego protokołu dla lepszej i łatwiejszej wydajności decelularyzacji, recelularyzacji i obsługi żył o małej średnicy w bioreaktorze. Obecny protokół decelularyzacji wymagał perfuzji detergentów przez żyłę przy użyciu ciśnienia zamiast mieszania z detergentami. Protokół recelularyzacji obejmuje dodatkowy etap wstępnego kondycjonowania w celu poprawy adhezji komórek i dodania czynników wzrostu w krążącej krwi w celu poprawy adhezji, przeżycia i proliferacji komórek. Udoskonaliliśmy również konstrukcję bioreaktora, wykorzystując produkty dostępne na rynku. W artykule przedstawiono szczegółowy opis zmodyfikowanego protokołu wykonywania decelularyzacji i recelularyzacji żył odpiszczelowych człowieka.

<table><tbody><tr><td>4-portowa nasadka</td><td>CPLabSafety</td><td>WF-GL45-4Kit</td><td></td></tr><tr><td>Kwas acetylosalicylowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5376</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>B-FGF</td><td>Lonza</td><td>cc-4113B</td><td></td></tr><tr><td>System monitorowania stężenia glukozy we krwi - Free style Lite</td><td>Abbott</td><td>70808-70</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Worthington</td><td>LS0020007</td><td></td></tr><tr><td>PBS firmy Dulbecco z CaCl2 i MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>EDTA sól disodowa dwuwodna</td><td>AlfaAesar</td><td>A15161. </td> Zestaw czynników wzrostu OB <td></td></tr><tr><td>EGM-2</td><td>Lonza</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>EG-VEGF</td><td>Peprotech</td><td>100-44</td><td></td></tr><tr><td>Butelka szklana 250ml</td><td>VWR</td><td>2151593</td><td>Można użyć dowolnej butelki z nakrętką GL45</td></tr><tr><td>Butelka szklana 1L</td><td>VWR</td><td>2151595</td><td>Można użyć dowolnej butelki z nakrętką GL45</td></tr><tr><td>Szklany słoik 500ml z dolnym odpływem węża</td><td>Kimble Chase Life Science</td><td>14607</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Leo</td><td>387107</td><td></td></tr><tr><td>Rurki próżniowe powlekane heparyną</td><td>Becton Dickinson</td><td>368480</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie serum AB Sigma</td><td>Aldrich</td><td>H3667</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Luer Kobieta z 1/8 "ID Barb</td><td>Oina</td><td>LF-2PP-QC</td><td>Do rurki silikonowej 3X5mm</td></tr><tr><td>Luer Żeńskie z 3/32 "ID Barb</td><td>Oina</td><td>LF-1.5PP-QC</td><td>Do rurki silikonowej 2X4mm</td></tr><tr><td>Luer Male z 3/32" ID Barb</td><td>Oina</td><td>LM-1.5PP-QC</td><td>Do rurki silikonowej 2X4mm</td></tr><tr><td>Luer Male z 1/8" ID Barb</td><td>Oina</td><td>LM-2PP-QC</td><td>Do rurki silikonowej 3X5mm</td></tr><tr><td>Luer Male z 5/32" ID Barb</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45518-06</td><td>Do rurki silikonowej 5X8mm</td></tr><tr><td>MCDB 131</td><td>Life Technologie</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>Na kwas octowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>433241</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna I</td><td>Masterflex</td><td>7524-45</td><td>Do konfiguracji decelularyzacji 1 i 2. Zastosowana kaseta to 7519-75</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna II</td><td>Ismatec</td><td>ISM941</td><td>do konfiguracji decelularyzacji 3 i bioreaktora recelularyzacji.</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Wodorofosforan potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Łącznik redukcyjny 1,5mmX2,5mm</td><td>Biotech</td><td>ISM569A</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Ika</td><td>KS4000 i&nbsp; control</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13423</td><td></td></tr><tr><td>Wodorofosforan sodu</td><td>Merck</td><td>71640-M</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Stena</td><td>Xvivo</td><td>19004</td><td></td></tr><tr><td>Szew</td><td>Agnthos</td><td>14817</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan tri-n-butylu</td><td>AlfaAesar</td><td>A16084.AU</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>AlfaAesar</td><td>A16046. OF</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 60ml z płaską podstawą</td><td>Sarstedt</td><td>60596</td><td></td></tr><tr><td>Rurka A</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Wytnij 3 kawałki, każda o długości 25 cm do decelularyzacji perfuzji steup 1 i 2</td></tr><tr><td>Rurka B</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Wytnij 1 kawałek o długości 35 cm do decelularyzacji perfuzji</td></tr><tr><td>Rurka C</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Wytnij 5 kawałków, każda o długości 75 cm do perfuzji decelularyzacyjnej steups 1-3</td></tr><tr><td>Tube D</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Wytnij 1 kawałek o długości 90 cm do decelularyzacji perfuzyjny steup 2</td></tr><tr><td>Tube E</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Wytnij 1 kawałek o długości 20 cm do recelularyzacji perfuzyjnej</td></tr><tr><td>Rurka F</td><td>VWR</td><td>2280713</td><td>Wytnij 2 kawałki, każdy o długości 15 cm do decelularyzacji perfuzyjny steup 1 i 2 Rurka</td></tr><tr><td>G</td><td>VWR</td><td>2280713</td><td>Wytnij 2 kawałki, każdy o długości 60 cm do decelularyzacji Rurka perfuzyjna 1 i 2</td></tr><tr><td>Rurka H</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Wytnij 1 kawałek o długości 15 cm do rurki perfuzyjnej do recelularyzacji</td></tr><tr><td>Rurka I</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Wytnij 1 kawałek o długości 20 cm do recelularyzacji rurki perfuzyjnej</td></tr><tr><td>Rurka J</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Wytnij 1 kawałek o długości 25 cm do recelularyzacji perfuzji</td></tr><tr><td>Rurka K</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Wytnij 2 kawałki, każdy o długości 35 cm, aby uzyskać efekt perfuzji recelularyzacji</td></tr></tbody></table>

metodologia decelularyzacji i recelularyzacji żył odpiszczelowych człowieka

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Przewody naczyniowe używane podczas większości operacji naczyniowych to allogeniczne lub syntetyczne przeszczepy, które często prowadzą do powikłań spowodowanych immunosupresją i słabą drożnością. Inżynieria tkankowa oferuje nowatorskie rozwiązanie do generowania spersonalizowanych przeszczepów z naturalną macierzą zewnątrzkomórkową zawierającą komórki biorcy przy użyciu metody decelularyzacji i recelularyzacji. Przedstawiono szczegółową metodę wykonywania decelularyzacji żyły odpiszczelowej człowieka oraz recelularyzacji przez perfuzję krwi obwodowej. Żyłę zdecelularyzowano przez perfuzję 1% Triton X-100, 1% fosforanu tri-n-butylu (TnBP) i 2000 jednostek Kunitza dezoksyrybonukleazy (DNazy). Triton X-100 i TnBP perfuzjono w stężeniu 35 ml/min przez 4 godziny, podczas gdy DNazę perfundowano w tempie 10 ml/min w temperaturze 37 °C przez 4 godziny. Żyłę przemyto w ultraczystej wodzie i PBS, a następnie wysterylizowano w 0,1% kwasie nadoctowym. Został ponownie przemyty w PBS i wstępnie kondycjonowany w podłożu śródbłonkowym. Żyłę podłączono do bioreaktora i perfundowano pożywką śródbłonkową zawierającą 50 j.m./ml heparyny przez 1 godzinę. Recelularyzacja przeprowadzono poprzez napełnienie bioreaktora świeżą krwią, rozcieńczoną w stosunku 1:1 w roztworze Steena i dodanie czynników wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych pochodzących z gruczołów dokrewnych (80 ng/ml), zasadowych czynników wzrostu fibroblastów (4 μl/ml) i kwasu acetylosalicylowego (5 μg/ml). Bioreaktor został następnie przeniesiony do inkubatora i poddany perfuzji przez 48 godzin z prędkością 2 ml/min, utrzymując poziom glukozy w zakresie 3-9 mmol/l. Następnie żyłę przemywano PBS, wypełniono pożywką śródbłonkową i perfundowano przez 96 godzin w inkubatorze. Leczenie Triton X-100, TnBP i DNazą spowodowało decellularyzm żyły odpiszczelowej w 5 cyklach. Żyła pozbawiona komórek wyglądała na białą w przeciwieństwie do żył normalnych i recellularnych (jasnoczerwona). Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) wykazało obecność jąder tylko w normalnych, ale nie w żyłach pozbawionych komórek. W żyle recellularizowanej barwienie H&E wykazało obecność komórek na powierzchni światła żyły.

Makroskopowa morfologia prawidłowej żyły charakteryzuje się jasnoczerwonym kolorem (Rysunek 3A). Czerwony kolor zanika w kolejnych cyklach decelularyzacji (cykl 2, Rysunek 3B; cykl 3, Rysunek 3C), a w 5th cyklu żyła staje się blada i biała (Rysunek 3D). Żyła recelularyzowana po perfuzji krwią (Rysunek 3E) oraz perfuzji medium endotelialnym (Rysunek 3F) ma kolor jaskrawoczerwony. 5 cykli procesu decelularyzacji skutecznie usunęło komórki z żyły, o czym świadczy brak niebieskich jąder w barwieniu H&amp;E (Rysunek 4B). W przeciwieństwie do tego, w prawidłowej żyle widocznych było wiele jąder (Rysunek 4A). Obecność przytwierdzonych komórek po stronie luminalnej widoczna jest w barwieniu H&amp;E w żyle recelularyzowanej krwią przez 48 h (Rysunek 4C, czarne strzałki) oraz po perfuzji medium endotelialnym przez 96 h (Rysunek 3D, czarne strzałki).
<img alt="Schemat systemu perfuzyjnego z pompą perystaltyczną, komorą żyły i przepływem w rurkach; badanie dynamiki płynów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Montaż układów perfuzyjnych do decelularyzacji. A) Zdjęcie przedstawiające zmontowany układ decelularyzacyjny 1 do Triton X-100 i płukania. Białe strzałki pokazują drogę przepływu roztworów, a czerwone strzałki wskazują wloty i wyloty dla żyły i roztworów. B) Zdjęcie przedstawiające zmontowany układ decelularyzacyjny 2 do perfuzji TnBP. Podobnie jak w układzie decelularyzacyjnym 1, białe strzałki wskazują drogę przepływu roztworów, a czerwone strzałki wskazują wloty i wyloty dla żyły i roztworów. C) Zdjęcie przedstawiające zmontowany układ decelularyzacyjny 3 do perfuzji deoksyrybonukleazą. Białe strzałki pokazują drogę przepływu roztworów, a czerwone strzałki wskazują wloty dla żyły i roztworów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ pompy perystaltycznej z rurkami, złączkami i butelką; schemat procesu przepływu pożywki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przygotowanie i montaż bioreaktora do recelularyzacji. A) Zdjęcie przedstawiające materiały niezbędne do montażu bioreaktora. B) Zdjęcie wnętrza korka 4-portowego ukazujące rozmieszczenie złączek redukcyjnych (czerwone strzałki), punkty podłączenia wlotu i wylotu żyły (białe strzałki) oraz układ rurek H, I i J. Wolny koniec rurki H jest umieszczony w bioreaktorze w celu zawrotu pożywki. C) Odpowiednie rurki doprowadzające i odprowadzające są widoczne od górnej strony korka 4-portowego. D) Zdjęcie przedstawiające zmontowany bioreaktor. E) Zdjęcie przedstawiające cały układ bioreaktora z pompą perystaltyczną. Rurki K przedłużają połączenia z bioreaktora do pompy perystaltycznej. F) Schematyczny przedstawienie całego systemu perfuzji bioreaktora. Pomarańczowe strzałki wskazują kierunek przepływu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces inżynierii tkankowej; etapy przygotowania rusztowania; eksperyment z wynikami decelularyzacji tkanki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Morfologia makroskopowa żył podczas decelularyzacji i recelularyzacji. A) Morfologia makroskopowa normalnej żyły wykazuje intensywnie czerwony kolor. Kolor ten zanika wraz ze wzrostem liczby cykli decelularyzacji w B) cyklu 2 i C) cyklu 3. D) Po 5 cyklach żyła ma blady, biały kolor. Żyła po perfuzji E) krwią przez 48 h oraz F) pożywką śródbłonkową przez 96 h ponownie wykazuje intensywnie czerwony kolor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza histologiczna, włókna kolagenowe, ściana tętnicy, mikroskopia, struktura warstw, eksperyment barwienia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Charakterystyka żył zdecelularyzowanych i recelularyzowanych. Obraz barwienia hematoksyliną i eozyną A) normalnej żyły wykazuje liczne niebieskie jądra komórkowe, które są nieobecne w B) żyle zdecelularyzowanej. W żyłach recelularyzowanych C) krwią przez 48 h oraz D) pożywką dla komórek śródbłonka przez 96 h zaobserwowano przywieranie komórek (czarne strzałki) w obrębie światła naczynia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj opisujemy protokół decelularyzacji żyły odpiszczelowej za pomocą detergentów i recelularyzacji przez perfuzję krwi obwodowej i śródbłonka.

Metodologia decelularyzacji i recelularyzacji żył odpiszczelowych człowieka

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

Metoda ta wyjaśnia szczegółową procedurę inżynierii tkankowej żyły odpiszczelowej. Pokazujemy również przygotowanie zestawów do decelularyzacji i bioreaktora do recelularyzacji przy użyciu prostej aparatury. Główną zaletą tej techniki jest to, że do recelularyzacji wymagana jest prosta próbka krwi, co eliminuje bolesne pobieranie szpiku kostnego i czasochłonne procedury hodowli komórek.W przypadku perfuzji i płukania Triton-X 100 przygotuj zestaw do decelularyzacji. Do dwulitrowej komory przyklej taśmą wszystkie trzy kawałki rurki A. Przyklej jedną rurkę do ściany w miejscu, w którym krawędź dotyka dna komory w celu wlotu detergentu. Przyklej pozostałe dwie rurki do przeciwległej ściany w odległości od pięciu do 10 centymetrów między nimi, w zależności od długości żyły.Co najmniej pięć centymetrów tych rurek powinno być również przyklejone taśmą do podłogi komory. Podłącz rurkę wlotową detergentu do rurki B za pomocą męskich i żeńskich łączników przynęty. Następnie podłącz rurkę B do rurki F i rurkę F do rurki C. Podłącz rurkę C do wlotu żyły.Teraz umieść rurkę F w kasecie pompy perystaltycznej. Weź kolejną rurkę C i podłącz jeden koniec do ujścia żyły. Umieść drugi koniec w szklanym słoiku wyposażonym w dolny odpływ węża i umieszczonym 45 centymetrów nad komorą i przyklej go taśmą, aby zabezpieczyć.Służy on jako wylot detergentu. Następnie wepchnij jeden koniec rurki G do wylotu węża szklanego słoika, a drugi koniec umieść w komorze żylnej. Następnie przygotuj drugą konfigurację decelularyzacji dla perfuzji TnBP, jak opisano w protokole tekstowym.Przygotuj również trzeci zestaw decelularyzacji do perfuzji DNA, jak opisano w tekście, i umieść go w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby przygotować bioreaktor recelularyzacyjny, włóż rurkę H do jednego portu nasadki z czterema portami, aby służyła jako ujście żyły. Do drugiego portu włóż rurkę I, która będzie służyć jako wlot nośnika.A do trzeciego portu włóż rurkę J do wlotu żyły. Następnie włóż drugi koniec rurki H do czwartego portu, aby służył jako wylot nośnika. Podłącz łączniki redukcyjne do wewnętrznych końców rurek H i J. Zegnij drugi koniec rurki J w kształt litery U i zawiąż go szwem.Teraz umieść 60-mililitrową rurkę z płaską podstawą w szklance o pojemności 250 mililitrów. Następnie podłącz jeden koniec rurki K do wlotu żyły, a drugi koniec do rurki E. Podłącz rurkę E do drugiej rurki K, a następnie do wlotu mediów. Następnie umieść przygotowany zestaw nakrętek w probówce znajdującej się w butelce.Na koniec wysterylizuj bioreaktor przez autoklawowanie. Wykonaj dwa cykle zamrażania i rozmrażania na żyle odpiszczelowej człowieka, jak opisano w protokole tekstowym, przed przecięciem nożyczkami biopsji o długości dwóch milimetrów. Utrwal biopsję w formaldehydzie przez 24 do 48 godzin w temperaturze pokojowej.Przywiąż każdy koniec żyły do zadziorów łącznika przynęty męskiej i żeńskiej za pomocą szwu. Podłącz żyłę do pierwszego zestawu decelularyzacji i napełnij komorę jednym litrem roztworu drugiego. Teraz wykonuj przez 15 minut z prędkością 35 mililitrów na minutę i opróżnij zawartość zestawu.Następnie dodaj jeden litr roztworu cztery i wykonuj przez cztery godziny z prędkością 35 mililitrów na minutę. Opróżnij zawartość, dodaj 500 mililitrów roztworu dwa, wytrzymuj przez pięć minut i ponownie opróżnij zawartość. Odłącz żyłę od pierwszego ustawienia perfuzji i podłącz ją do drugiego ustawienia perfuzji.Następnie dodaj jeden litr roztworu pięć, włącz mieszadło i perfuzuj przez cztery godziny z prędkością 35 mililitrów na minutę. Odłącz żyłę od drugiego zestawu perfuzyjnego i dwukrotnie umyj żyłę na zewnątrz 20 mililitrami ultraczystej wody. Następnie za pomocą strzykawki dwukrotnie przemyj żyłę 20 mililitrami ultraczystej wody przez pięć do 10 minut.Po perfuzji z trzecim ustawieniem perfuzji, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, podłącz żyłę do pierwszego ustawienia perfuzji. Napełnij jeden litr roztworu dwa i przetapiaj przez noc z prędkością 35 mililitrów na minutę. Powtórz proces perfuzji cztery razy, aby całkowicie usunąć materiał jądrowy.Po perfuzji opróżnij zestaw, napełnij jeden litr roztworu dwa i perfuzuj przez 24 godziny z prędkością 35 mililitrów na minutę. Po 24 godzinach ponownie opróżnij zestaw i napełnij jednym litrem ultraczystej wody. Perfaktor przez kolejne 24 godziny z prędkością 35 mililitrów na minutę.Na koniec powtórzyć perfuzję w tych samych warunkach, ale z roztworem siódmym. Po weryfikacji decelularyzacji zgodnie z opisem w protokole tekstowym wysterylizuj żyłę, umieszczając ją w 50-mililitrowej probówce zawierającej 50 mililitrów roztworu ósemki. Mieszać z prędkością 80 obrotów na minutę w wytrząsarce przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Pracując w komorze z przepływem laminarnym, aby utrzymać sterylność, użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść sterylną żyłę do nowej 50-mililitrowej probówki zawierającej 50 mililitrów sterylnego roztworu siedem, zawierającego 500 mikrolitrów anty anty. Mieszaj żyłę jak poprzednio przez 12 godzin, zmieniając roztwór siedem co najmniej dwa razy w międzyczasie. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś żyłę do nowej 50-mililitrowej probówki, dodaj 50 mililitrów pożywki śródbłonkowej i mieszaj przez 11 godzin.Teraz połącz żyłę, przywiązując ją do wlotu i wylotu żyły bioreaktora za pomocą sterylnego szwu i kleszczyków, a następnie dokręć zestaw nakrętki do butelki o pojemności 250 mililitrów. Napełnij bioreaktor tym samym podłożem śródbłonkowym. Dodać heparynę w ilości 50 jednostek na mililitr i perfuzjować przez godzinę w ilości dwóch mililitrów na minutę w inkubatorze.Zbierz od dawcy od 15 do 25 mililitrów świeżej krwi w probówkach próżniowych pokrytych heparyną i rozcieńcz ją jeden do jednego roztworem steny. Później dodaj czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych pochodzący z gruczołów dokrewnych, podstawowy czynnik wzrostu fibro blastów i subtelny kwas salicylowy. Po opróżnieniu pożywki śródbłonkowej z bioreaktora dodaj do niej krew i perfuzjuj przez 48 godzin z prędkością dwóch mililitrów na minutę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentową zawartością dwutlenku węgla.Około 12 godzin później pracuj w komorze laminarnej, aby usunąć kroplę krwi z bioreaktora i zmierz poziom glukozy za pomocą urządzenia do monitorowania stężenia glukozy we krwi. Jeśli poziom jest mniejszy niż trzy milimole na litr, dodaj glukozę, aby zbliżyć się do zakresu od siedmiu do dziewięciu milimoli na litr. Po 48 godzinach z powrotem w inkubatorze spuść krew z bioreaktora w komorze z przepływem laminarnym.Dodaj 30 mililitrów sterylnego roztworu siedem, perfuzjuj przez pięć minut i odcedź roztwór. Powtarzaj ten proces, aż do utraty krwistoczerwonego koloru. Na koniec dodaj 30 do 45 mililitrów pożywki śródbłonkowej i wykonuj perfuzję przez 96 godzin w inkubatorze z prędkością dwóch mililitrów na minutę.Odłącz żyłę recellularyczną od bioreaktora w komorze z przepływem laminarnym, odetnij pięciomilimetrowe krawędzie żyły za pomocą nożyczek i wyrzuć. Wykonaj biopsję jak poprzednio, umieść w formaldehydzie i przeprowadź weryfikację recelularyzacji zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Ogólna morfologia normalnej żyły ma jaskrawoczerwony kolor.Czerwony kolor jest tracony w postępujących cyklach decelularyzacji, a po pięciu cyklach leczenia wygląda blado i biało. Żyła zrekomórkowana przez perfuzję krwi obwodowej i śródbłonka ponownie wyglądała na jaskrawoczerwoną. Pokazany tutaj jest reprezentatywny obraz barwienia hemotoksyliną i eozyną normalnej żyły, wskazujący na obecność wielu niebieskich jąder.Jednak niebieskie jądra nie były widoczne w barwieniu hemotoksyliną i eozyną w żyle bezkomórkowej. W żyłie recellularyzowanej perfundowanej krwią i podłożem śródbłonkowym barwienie hemotoksyliną i eozyną wykazało obecność przyczepu komórek w świetle. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić decelularyzację żyły odpiszczelowej za pomocą detergentów i recelularyzację krwią obwodową i pożywką śródbłonkową.Ta technika decelularyzacji za pomocą perfuzji Triton-X 100, TnBP i DNA pod ciśnieniem była skuteczna i powtarzalna w usuwaniu jąder z ludzkich żył odpiszczelowych. Chociaż ta technika trwa 20 dni, przechowywanie pozbawionej komórek żyły jako produktu po półce skróci czas zabiegu do ośmiu dni. Recelularyzacja żył z wykorzystaniem krwi obwodowej biorcy może być uznana za klinicznie istotną.Recellularyzacja żyły przy użyciu podobnego protokołu okazała się obiecująca w transplantacji klinicznej, zapewniając funkcjonalny dopływ krwi po operacji. Z niewielkimi modyfikacjami protokół ten może być stosowany do każdego typu żyły oraz jako spersonalizowany przeszczep w klinikach do wszystkich operacji naczyniowych.

decellularization-recellularization-methodology-for-human-saphenous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Decelularyzacja perfuzyjna jest nowoczesną techniką wytwarzania rusztowań całej wątroby, która zachowuje skład macierzy zewnątrzkomórkowej oraz mikroarchitekturę narządu. W niniejszym opracowaniu opisano metodę przygotowania rusztowań całego narządu z wykorzystaniem decelularyzacji perfuzyjnej i późniejszej repopulacji hepatocytami. Dzięki tej technice możliwe jest wytworzenie funkcjonalnych i możliwych do przeszczepienia graftów wątroby.

Decelularyzacja i recelularyzacja całych wątrób

Opisano metodę zasiewania autologicznymi komórkami biomateriałów tytanowych mających kontakt z krwią oraz testowania ich biokompatybilności. Metoda ta wykorzystuje komórki progenitorowe śródbłonka oraz rurki tytanowe, zasiewane na kilka minut przed chirurgiczną implantacją do żył głównych świni. Technika ta może zostać dostosowana do wielu innych implantowalnych urządzeń biomedycznych.

Technologia zasiewiania autologicznych komórek progenitorowych śródbłonka oraz badanie biokompatybilności urządzeń sercowo-naczyniowych w modelu dużych zwierząt

Opisano metody tworzenia ludzkich tkanek nowotworowych 3D jako systemów testowych. Technologie te opierają się na bezkomórkowym biologicznym rusztowaniu unaczynionym (BioVaSc), pierwotnych komórkach ludzkich i linii komórek nowotworowych, które mogą być hodowane zarówno w warunkach statycznych, jak i dynamicznych w bioreaktorze przepływowym.

Inżynieria tkankowa ludzkiego systemu badań 3D nowotworów in vitro

Mechanizmy prowadzące do rozwoju przerostu błony wewnętrznej (IH) i niewydolności przeszczepów żył są nadal słabo poznane. Badanie to opisuje system ex vivo do perfuzji ludzkich żył pod kontrolowanym przepływem i ciśnieniem. Ponadto oceniono skuteczność zbrojenia siatką zewnętrzną w celu ograniczenia rozwoju IH.

Procedura perfuzji żył odpiszczelowych człowieka ex vivo i wzmocnienia zewnętrznego

Tutaj prezentujemy protokół do generowania przeszczepów naczyń krwionośnych z inżynierii tkankowej, które są funkcjonalne do szczepienia myszom poprzez podwójne wysiewanie częściowo indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (PiPSC) - pochodzących komórek mięśni gładkich i PiPSC - pochodzących komórek śródbłonka na bezkomórkowym bioreaktorze rusztowania naczyń krwionośnych.

Wytwarzanie i przeszczepianie naczyń krwionośnych metodą inżynierii tkankowej w modelu mysim

To jest wytyczne do konstruowania in vivo unaczynionej tkanki za pomocą mikrochirurgicznej pętli tętniczo-żylnej lub przepływowej konfiguracji szypułki wewnątrz komory inżynierii tkankowej. Powstałe unaczynione tkanki mogą być wykorzystane do regeneracji narządów i wymiany ubytków tkanek, a także do testowania leków i modelowania chorób.

Inżynieria tkankowa poprzez wewnętrzne unaczynienie w komorze inżynierii tkankowej in vivo

Prezentowany tutaj jest protokół endoskopowego pobierania żył z dolnej części nogi, który można bezpiecznie wprowadzić do rutynowego pomostowania aortalno-wieńcowego. Przeszczepy żylne charakteryzują się doskonałą jakością przeszczepu zgodnie z tym ustandaryzowanym protokołem z ustawieniem nóg, minimalnie inwazyjnym dostępem do żyły i endoskopowym pobraniem żyły przedsionkowej.

Synergia endoskopowa antegrade z pomostowym pobraniem żył w celu poprawy jakości przeszczepu żyły odpiszczelowej z dolnej części nogi

Protokół opisuje chirurgiczne pobieranie i późniejszą decelularyzację unaczynionych płatów świńskich poprzez perfuzję detergentu z dodecylosiarczanu sodu przez unaczynienie płata w dostosowanym bioreaktorze perfuzyjnym.

Pobieranie i perfuzja-decelularyzacja unaczynionych płatów świń w niestandardowym bioreaktorze perfuzyjnym

Opisujemy technikę chirurgiczną i proces decelularyzacji kompozytowych kończyn tylnych szczurów. Decelularyzacja odbywa się przy użyciu dodecylosiarczanu sodu o niskim stężeniu przez system perfuzji maszynowej ex vivo.

Pobieranie i decelularyzacja kończyn tylnych szczura przy użyciu bioreaktora opartego na perfuzji ex vivo do unaczynionej allotransplantacji kompozytowej

Tutaj prezentujemy protokół leczenia żyły odpiszczelowej (GSV) i żyły odpiszczelowej małej (SSV) dotkniętych ciężkim refluksem patologicznym, przy użyciu oryginalnego sklerozywającego i embolizującego kleju na bazie cyjanoakrylanu składającego się z cyjanoakrylanu N-butylu i metakrylosulfolianu (NBCA+MS).

Zamknięcie żyły odpiszczelowej wielkiej i małej za pomocą kleju kopolimerowego na bazie cyjanoakrylanu n-butylu i metakrylosulfolianu

Opisujemy protokół izolacji i hodowli ludzkich komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej (hSVECs). Udostępniamy również szczegółowe metody wytwarzania naprężeń ścinających i rozciągania w celu zbadania naprężeń mechanicznych w hSVEC.

Izolacja komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej człowieka i narażenie na kontrolowane poziomy naprężeń ścinających i rozciągania

Poznaj metodę decelularyzacji i recelularyzacji żył odpiszczelowych człowieka przy użyciu detergentów i próbki krwi obwodowej. Ta technika inżynierii tkankowej oferuje mniej inwazyjną alternatywę dla tradycyjnych procedur.

Metodologia decelularyzacji i recelularyzacji żył odpiszczelowych człowieka

Przeglądaj więcej filmów