Name: Pobieranie i perfuzja-decelularyzacja unaczynionych płatów świń w niestandardowym bioreaktorze perfuzyjnym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Naucz się metody dekompozycji naczyniowanych płatów świń w niestandardowym bioreaktorze perfuzyjnym. Technika ta umożliwia inżynierię tkankową w chirurgii rekonstrukcyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+Forearm+Flap+Donor-Site+Complications+and+Morbidity%3A+A+Prospective+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).</li>
<li>Edsander-Nord, Å, Jurell, G., Wickman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-site+morbidity+after+pedicled+or+free+TRAM+flap+surgery%3A+A+prospective+and+objective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).</li>
<li>Qian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+and+meta-analysis+of+free-style+flaps%3A+Risk+analysis+of+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery.+Global+Open%22%5BJournal%5D)">A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651(2018).</li>
<li>Issa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+composite+allograft-specific+characteristics+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses.</a> Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).</li>
<li>Kueckelhaus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+composite+allotransplantation%3A+Current+standards+and+novel+approaches+to+prevent+acute+rejection+and+chronic+allograft+deterioration%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration.</a> Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).</li>
<li>Iske, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+tissue+allotransplantation%3A+Opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges.</a> Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).</li>
<li>Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+implications+for+extracellular+matrix-based+technologies+in+vascularized+composite+allotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation.</a> Stem Cells International. 2016, 1541823(2016).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix-based+materials+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).</li>
<li>Colazo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applied+bioengineering+in+tissue+reconstruction%2C+replacement%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+B+Reviews%22%5BJournal%5D)">Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration.</a> Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).</li>
<li>Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Vascularization in tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+skin%2Fadipose+tissue+flap+matrix+for+engineering+vascularized+composite+soft+tissue+flaps%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps.</a> Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).</li>
<li>Jank, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+a+bioengineered+skin+flap+scaffold+with+a+perfusable+vascular+pedicle%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+-+Part+A%22%5BJournal%5D)">Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle.</a> Tissue Engineering - Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).</li>
<li>Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+large-volume+human-derived+adipose+acellular+allogenic+flap+by+perfusion+decellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Development of a large-volume human-derived adipose acellular allogenic flap by perfusion decellularization.</a> Wound Repair and Regeneration. 26 (2), 245-250 (2018).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+skeletal+muscle+as+a+three-dimensional+scaffold+with+a+vascular+network+template%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template.</a> Biomaterials. 89, 114-126 (2016).</li>
<li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+the+porcine+ear+generates+a+biocompatible%2C+nonimmunogenic+extracellular+matrix+platform+for+face+subunit+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering.</a> Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).</li>
<li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularization+of+human+ear+grafts+enables+ECM-based+scaffolds+for+auricular+vascularized+composite+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).</li>
<li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+a+human+face+graft%3A+The+matrix+of+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Bioengineering a human face graft: The matrix of identity.</a> Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).</li>
<li>Haughey, B. H., Panje, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+porcine+model+for+multiple+musculocutaneous+flaps%5BTitle%5D)+AND+%22The+Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">A porcine model for multiple musculocutaneous flaps.</a> The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).</li>
<li>Khachatryan, A., et al. Radial Forearm Flap. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhachatryan%2C+A+%22Microsurgery+Manual+for+Medical+Students+and+Residents%3A+A+Step-by-Step+Approach%22">Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach</a>. , Springer. Denmark. 177-181 (2021).</li>
<li>Hammouda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+effect+on+the+nanostructure+of+SDS+micelles+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Research+of+the+National+Institute+of+Standards+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water.</a> Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).</li>
<li>Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+a+fasciocutaneous+flap+for+use+as+a+perfusable+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold.</a> Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).</li>
<li>Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+tissue+decellularization+used+for+preparation+of+biologic+scaffolds+and+in+vivo+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance.</a> Methods. 84, 25-34 (2015).</li>
<li>Mendibil, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+decellularization+methods%3A+Rationale+and+strategies+to+achieve+regenerative+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447(2020).</li>
<li>Lupon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vascularized+composite+allografts+using+natural+scaffolds%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+B+Reviews%22%5BJournal%5D)">Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review.</a> Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).</li>
<li>Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vascularized+composite+tissues+by+perfusion+decellularization%2Frecellularization%3A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Transplantation+Reports%22%5BJournal%5D)">Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review.</a> Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).</li>
<li>Adil, A., Xu, M., Haykal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recellularization+of+bioengineered+scaffolds+for+vascular+composite+allotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Surgery%22%5BJournal%5D)">Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation.</a> Frontiers in Surgery. 9, 843677(2022).</li>
<li>Phelps, E. A., García, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+more+than+a+cell%3A+Vascularization+strategies+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering.</a> Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).</li>
<li>Pozzo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reliable+porcine+fascio-cutaneous+flap+model+for+vascularized+composite+allografts+bioengineering+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (181), e63557(2022).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2394(2011).</li>
<li>Uzarski, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+repopulation+and+preparation+of+rodent+extracellular+matrix+scaffolds+for+renal+tissue+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53271(2015).</li>
<li>Sullivan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+methods+of+porcine+kidneys+for+whole+organ+engineering+using+a+high-throughput+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system.</a> Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).</li>
<li>Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+systems+and+devices%3A+State-of-the-art%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Decellularization systems and devices: State-of-the-art.</a> Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).</li>
<li>Schilling, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+an+automatable%2C+3D+printed+perfusion+device+for+tissue+infusion+and+perfusion+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering.</a> Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Proponowany protokół wykorzystuje perfuzję SDS o niskim stężeniu do decelularizacji szeregu płatów pochodzących od świń. Dzięki tej procedurze sieć bezkomórkowa, tensor fascia lata i promieniowe płaty przedramienia mogą być z powodzeniem decellularizowane przy użyciu protokołu, który sprzyja SDS o niskim stężeniu. Wstępne eksperymenty optymalizacyjne wykazały, że SDS w niskim stężeniu (0,05%) między 2 dniami a 5 dniami jest zdolny do usunięcia materiału komórkowego dla sieci komórkowej, tensora powięzi szerokiej i promie...

Uraz i usunięcie guza mogą prowadzić do dużych i skomplikowanych wad tkanek miękkich. Wady te mogą pogarszać jakość życia pacjenta, powodować utratę funkcji i prowadzić do trwałej niepełnosprawności. Chociaż techniki takie jak autologiczny transfer płata tkankowego są powszechnie praktykowane, problemy z dostępnością płata i chorobowością miejsca pobrania są głównymi ograniczeniami1,2,3. Unaczyniona allotransplantacja kompozytowa (VCA) jest obiecującą alternatywą, która przenosi tkanki złożone, np. mięśnie, skórę, naczynia krwionośne, jako pojedynczą jednostkę do biorców. Jednak VCA wymaga długotrwałej immunosupresji, co prowadzi do toksyczności leków, infekcji oportunistycznych i nowotworów złośliwych4,5,6.
Bezkomórkowe rusztowania inżynierii tkankowej są potencjalnym rozwiązaniem tych ograniczeń7. Bezkomórkowe rusztowania tkankowe można uzyskać za pomocą metod decelularyzacji, które usuwają materiał komórkowy z tkanek natywnych, zachowując jednocześnie podstawową mikroarchitekturę macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). W przeciwieństwie do zastosowania materiałów syntetycznych w inżynierii tkankowej, zastosowanie rusztowań pochodzenia biologicznego oferuje biomimetyczny substrat ECM, który umożliwia biokompatybilność i potencjał translacji klinicznej8. Po decelularyzacji, późniejsza recelularyzacja rusztowań z komórkami specyficznymi dla biorcy może następnie wytworzyć funkcjonalne, unaczynione tkanki o niewielkiej lub zerowej immunogenności9,10,11. Opracowując skuteczny protokół uzyskiwania tkanek bezkomórkowych przy użyciu technik decelularyzacji perfuzyjnej, można zaprojektować szeroki zakres typów tkanek. Z kolei oparcie się na tej technice pozwala na zastosowanie do bardziej złożonych tkanek. Do tej pory decelularyzacja perfuzyjna unaczynionych tkanek miękkich była badana przy użyciu prostych unaczynionych tkanek, takich jak płat powięziowo-skórny o pełnej grubości u gryzoni12, porcine13 i modele ludzkie14, a także mięśnie szkieletowe mięśnia prostego brzucha świni15. Dodatkowo, złożone unaczynione tkanki zostały również zdecellaryzowane perfuzjowo, jak wykazano w przypadku świń i ludzkich ucho16,17 modeli i ludzkich modeli przeszczepów całej twarzy18.
Tutaj protokół opisuje decelularyzację unaczynionych wolnych płatów za pomocą biologicznie pochodnych rusztowań ECM. Przedstawiamy decelularyzację trzech klinicznie istotnych płatów: 1) sieci komórkowej, 2) tensora powięzi szerokiej i 3) promieniowego przedramienia, z których wszystkie są reprezentatywne dla płatów koni roboczych stosowanych rutynowo w chirurgii rekonstrukcyjnej i nie były wcześniej badane w badaniach na zwierzętach w kontekście decelularyzacji tkanek. Te bioinżynieryjne płaty stanowią wszechstronną i łatwo dostępną platformę, która ma potencjał do zastosowań klinicznych w dziedzinie naprawy i rekonstrukcji dużych ubytków tkanek miękkich.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mikro; Filtr m pore Acrodisk VWR</td><td></td><td>CA28143-310</td><td></td></tr><tr><td>0,9% roztwór chlorku sodu (sól fizjologiczna)</td><td>Baxter</td><td>JF7123</td><td></td></tr><tr><td>20 L Polipropylenowy gąsior</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-62507-20</td><td></td></tr><tr><td>3-0 Niewchłanialny krawat chirurgiczny z tworzywa sztucznego</td><td>Covidien</td><td>&nbsp; LS639</td><td></td></tr><tr><td>3-drogowy kran</td><td>Cole-Parmer</td><td>UZ-30600-04</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Adson</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy, 100X</td><td>Żubr</td><td>450-115-EL</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan atropiny 15 mg/30ml</td><td>Krokwia 8 Produkty</td><td>238481</td><td></td></tr><tr><td>BD Angiocath 20-Gauge</td><td>VWR</td><td>BD381134</td><td></td></tr><tr><td>BD Angiocath 22-Gauge</td><td>VWR</td><td>BD381123</td><td></td></tr><tr><td>BD Angiocath 24-Gauge</td><td>VWR</td><td>BD381112</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>Kofaktor DNAzy</td></tr><tr><td>DNaza I z trzustki bydła</td> Test DNA <td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>(zestaw do oznaczania Quant-iT PicoGreen dsDNA)</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 10X</td><td>Żubr</td><td>311-415-CL</td><td>&nbsp; bez Ca++/Mg++</td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito Hemostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13008-12</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna, 1000 I.U./mL</td><td>Leo Pharma A/S</td><td>453811</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy&nbsp; 5000 mg/50 ml</td><td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td><td></td><td></td>612316</tr><tr><td>Pompa Ismatec Tygon 3-stopowa rurka</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-96450-40</td><td>Średnica wewnętrzna:&nbsp; 1,85 mm</td></tr><tr><td>Ismatec REGLO 4-kanałowa pompa</td><td>Cole-Parmer</td><td>78001-78</td><td></td></tr><tr><td>Ismatec Kasety do rurek</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-78016-98</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran 99,9%, 250 ml</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td></td><td></td>2231929</tr><tr><td>LB Agar Lennox</td><td>Bioshop Canada</td><td>LBL406.500</td><td>Płytki agarowe do testowania sterylności</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>Kofaktor DNAzy</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 16 Rurka</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-96410-16</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam 50 mg/10 ml</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td></td><td></td>2242905</tr><tr><td>Monopolar Cautery Pencil</td><td>Valleylab</td><td>E2100</td><td></td></tr><tr><td>Normalna buforowana formalina, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>N&deg; 11 ostrzy skalpela</td><td>Swann Morton</td><td>303</td><td></td></tr><tr><td>Papaina z lateksu papai</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3125</td><td></td></tr><tr><td>Kwas nadoctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>269336</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe złącze kolczaste do rurki 1/4 "do 1/8" ID</td><td>McMaster-Carr</td><td>5117K61</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa rura kolczasta 90&deg; Złącza kolankowe</td><td>McMaster-Carr</td><td>5117K76</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe szybkoobrotowe zaślepki do rur</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K143</td><td>Męskie</td></tr><tr><td>plastikowe szybkoobrotowe gniazda rurowe</td><td>Luer McMaster-Carr</td><td>51525K293</td><td>Żeńskie</td></tr><tr><td>narzędzie do biopsji</td> Luer Punch <td>Integra Miltex</td><td>3332</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu 40 mEq/20 ml</td><td>Hospira Healthcare Corporation</td><td>37869</td><td></td></tr><tr><td>Powidon-jod, 10%</td> <td>Rougier</td><td>833133</td><td></td></tr><tr><td>Pipet serologiczny, 2 ml</td><td>Fisher Science</td><td>13-678-27D</td><td></td></tr><tr><td>Hermetyczne pojemniki z zatrzaskową pokrywką</td><td>SnapLock</td><td>142-3941-4</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu w proszku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgiczne metalowe klipsy do podwiązywania, mały</td><td>Teleflex</td><td>001200</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do tenotomii Stevens, 115 mm, proste</td><td>B. Braun</td><td>BC004R</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do monitorowania ciśnienia TruWave</td><td>Edwards Lifesciences</td><td>PX260</td><td></td></tr></tbody></table>

pobieranie i perfuzja-decelularyzacja unaczynionych płatów świń w niestandardowym bioreaktorze perfuzyjnym

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Duże ubytki tkanek miękkich prowadzą do deficytów funkcjonalnych i mogą znacznie wpłynąć na jakość życia pacjenta. Chociaż rekonstrukcję chirurgiczną można wykonać za pomocą autologicznego transferu wolnego płata lub unaczynionej allotransplantacji kompozytowej (VCA), takie metody mają również wady. Problemy takie jak zachorowalność w miejscu dawczym i dostępność tkanek ograniczają autologiczny transfer wolnego płata, podczas gdy immunosupresja jest znaczącym ograniczeniem VCA. Modyfikowane tkanki w chirurgii rekonstrukcyjnej z wykorzystaniem metod decelularyzacji/recelularyzacji stanowią możliwe rozwiązanie. Tkanki pozbawione komórek są generowane przy użyciu metod, które usuwają natywny materiał komórkowy przy jednoczesnym zachowaniu podstawowej mikroarchitektury macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Te bezkomórkowe rusztowania mogą być następnie rekomórkowane komórkami specyficznymi dla biorcy.
Ten protokół szczegółowo opisuje metody pozyskiwania i decelularyzacji używane do uzyskania bezkomórkowych rusztowań w modelu świni. Ponadto zawiera również opis projektu i konfiguracji bioreaktora perfuzyjnego. Płaty obejmują sieć świni, tensor powięzi szerokiej i promieniowe przedramię. Decelularyzacja odbywa się poprzez perfuzję ex vivo detergentu z dodecylosiarczanu sodu (SDS), a następnie obróbkę enzymatyczną DNazy i sterylizację kwasem nadoctowym w dostosowanym bioreaktorze perfuzyjnym.
Udana decelularyzacja tkanek charakteryzuje się biało-nieprzezroczystym wyglądem płatów makroskopowo. Płaty bezkomórkowe wykazują brak jąder na barwieniu histologicznym i znaczne zmniejszenie zawartości DNA. Protokół ten może być efektywnie wykorzystywany do generowania bezkomórkowych rusztowań tkanek miękkich z zachowaną ECM i mikroarchitekturą naczyniową. Takie rusztowania mogą być wykorzystywane w późniejszych badaniach nad recelularyzacją i mają potencjał do zastosowania klinicznego w chirurgii rekonstrukcyjnej.

Niniejszy protokół decelularyzacji unaczynionych płatów świńskich opiera się na perfuzji detergentu jonowego, SDS, poprzez naczynia krwionośne płata w dostosowanym bioreaktorze perfuzyjnym. Przed decelularyzacją pobrano trzy unaczynione płaty w modelu świńskim i kanulowano je zgodnie z głównymi naczyniami doprowadzającymi. Bezpośrednio po pobraniu płaty zostały przepłukane w celu utrzymania drożnego, perfuzyjnego układu naczyniowego, co umożliwia skuteczną decelularyzację. Wykorzystując szczelne pojemniki z zatrzaskową p...

Protokół opisuje chirurgiczne pobieranie i późniejszą decelularyzację unaczynionych płatów świńskich poprzez perfuzję detergentu z dodecylosiarczanu sodu przez unaczynienie płata w dostosowanym bioreaktorze perfuzyjnym.

Pobieranie i perfuzja-decelularyzacja unaczynionych płatów świń w niestandardowym bioreaktorze perfuzyjnym

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Metoda ta opisuje chirurgiczne pobranie trzech unaczynionych płatów świń, a następnie ich decelularyzację perfuzyjną. Metoda ta może wspomóc wysiłki na rzecz regeneracji płatów świń przy użyciu metody decelularyzacji i recelularyzacji tkanek. Główną zaletą tej techniki jest jej wszechstronność w osiąganiu decelularyzacji obfitości w różnych unaczynionych płatach świń w prostej w montażu konfiguracji bioreaktora.Opisana tutaj technika może być szeroko stosowana do innych unaczynionych płatów jako potencjalne rozwiązanie inżynierii tkankowej z wykorzystaniem płatów wieprzowych w chirurgii rekonstrukcyjnej. Na początek wykonaj rurkę doprowadzającą i odpływową, mierząc około 50 centymetrów silikonowej rurki pokrytej platyną LS16. Podłącz jeden koniec do żółtej 3-stopniowej rurki pompy, a drugi do sterylnej 2-mililitrowej pipety serologicznej, aby przenieść perfuzat ze zbiorników detergentu do komory bioreaktora.Autoklaw komory i rurki w pojedynczo zapakowanym sterylnym opakowaniu. W celu pobrania płata moczowego umieść 12-tygodniową, znieczuloną świnię Yorkshire w pozycji leżącej, a następnie przygotuj brzuch w zwykły sterylny sposób. Wykonaj laparotomię mieczykowo-pępowinową, aby wejść do jamy brzusznej i zmobilizować głowo żołądka, a następnie umieścić sieć w polu operacyjnym.Zaczynając od lewej części większej krzywizny, gdzie lewa tętnica żołądkowo-epiploiczna łączy się z tętnicą śledzionową, zeszkieletuj lewą tętnicę żołądkowo-epiploidalną i żyłę za pomocą prostych nożyczek do tenotomii Stevensa. Następnie podwiąż i podziel oba osobno za pomocą opasek chirurgicznych lub klipsów. Postępuj wzdłuż większej krzywizny żołądka od lewej do prawej, aby podwiązać i podzielić krótkie gałęzie naczyniowe powstające z sieci komórkowej, zapewniając większą krzywiznę żołądka.Kontynuuj mobilizację sieci większej, aż do napotkania połączenia prawych naczyń żołądkowo-epiploicznych i tętnicy dwunastnicy. Następnie podwiązać i podzielić prawą tętnicę żołądkowo-epiploidalną i żyłę, aby uwolnić płat omentalny i umożliwić późniejszą kaniulację płata. W celu uzyskania płata napinacza powięzi lata, umieść świnię w bocznej pozycji odleżynowej.Zaznacz wewnętrzną granicę płata od przedniego górnego kręgosłupa biodrowego lub ASIS w kierunku bocznej rzepki i tylną granicę około 8 do 10 centymetrów doogonowo. Użyj skalpela, aby wykonać ostre nacięcie na dystalnym brzegu rzepki. Pogłęb nacięcie przez tkanki podskórne, aby dotrzeć do powięzi leżącej nad mięśniem prostym uda i kontynuuj nacięcia w kierunku ASIS wzdłuż zaznaczonych granic.Aby odizolować sam płat powięziowy, usuń leżący na nim element skóry z leżącej poniżej warstwy powięzi. Następnie podwiązaj lub kauteryzuj małe naczynia perforacyjne do skóry. Wróć do dystalnej granicy płata i naciąć głęboką powięź.Zmobilizuj powięź od leżącego poniżej mięśnia obszernego bocznego w kierunku ASIS. Po prześledzeniu szypułki w kierunku głębokich naczyń udowych, zeszkieletuj boczną tętnicę udową okrężną i żyłę zaopatrującą płat powięziowy. Następnie podwiązać i podzielić naczynia płatowe proksymalnie, gdzie łączą się z głębokimi naczyniami udowymi i pozwalają na późniejszą kaniulację.W przypadku pobierania promieniowego płata przedramienia zaznacz kwadrat o wymiarach 3 na 3 centymetry na promieniowej stronie wyprostowanego przedramienia świni. Narysuj linię między punktem środkowym bliższego brzegu płata a dołem przedłokciowym, aby oznaczyć przybliżony przebieg szypułki tętnicy promieniowej. Potwierdź przebieg tętniczy za pomocą badania palpacyjnego.Następnie naciąć skórę za pomocą skalpela w dalszej części na głębokości aż do powięzi przedramiennej. Tępo wyciąć nożyczkami do tenotomii, aż do napotkania dalszej tętnicy promieniowej i jej żyły głównej. Następnie podwiąż i podziel tętnicę i żyły za pomocą opasek chirurgicznych lub klipsów.Kontynuuj nacięcia skóry na promieniowym i łokciowym brzegu zaznaczonego kwadratu skóry. Następnie zmobilizuj płat z leżącej poniżej kości promieniowej za pomocą ostrza chirurgicznego lub kauteryzacji, przechodząc od kierunku łokciowego do promieniowego, jednocześnie unosząc płat skóry proksymalnie w kierunku dołu przedłokciowego. Za pomocą nożyczek do tenotomii zeszkieletuj tętnicę promieniową i żyłę comitantes proksymalnie w dole przedłokciowym, gdzie łączą się odpowiednio z tętnicą ramienną i żyłami.Wypreparuj naczynia z otaczających tkanek włóknisto-tłuszczowych, aby wyizolować szypułkę naczyniową. Następnie podwiąż i podziel tętnicę i żyłę oddzielnie, aby uwolnić promieniowy płat przedramienia. Następnie kanulokuj naczynia szypułkowe za pomocą angiocewnika o rozmiarze od 20 do 24 zabezpieczonego jedwabnymi opaskami 3-0.Przepłukać heparynizowaną sól fizjologiczną do płatowej kaniuli tętniczej, aż do zaobserwowania wyraźnego odpływu żylnego. Podczas pracy w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym umieść klapy w komorze tkankowej bioreaktora. Zalać rurki dopływowe sterylną heparynizowaną solą fizjologiczną, aby usunąć resztki powietrza i ułożyć klapki tak, aby umożliwić połączenie między kaniulą tętniczą klapki a męskim złączem luer.Następnie za pomocą sterylnych hemostatów przykręcić kaniulę tętniczą do łącznika. Następnie przepłukać heparynizowaną sól fizjologiczną przez zawór odcinający, aby sprawdzić, czy połączenie luer jest wolne od wycieków i czy klapki mogą być perfundowane z dowodami odpływu żylnego. Po zamknięciu pokrywy komory na chusteczki należy podłączyć rurkę dopływową z żółtą 3-stopniową rurką pompy do kurka dopływowego komory na chusteczki.Podłącz również przetwornik czujnika ciśnienia w linii do 3-drogowego kurka dopływu w celu monitorowania ciśnienia perfuzji. Następnie włącz dopływową pompę perystaltyczną i na ekranie początkowym przejdź do trzeciej zakładki za pomocą strzałki, aby ustawić identyfikator rurki na 1,85 milimetra. Następnie ustaw szybkość perfuzji z drugiej zakładki.Szybkość wejściowa jako metoda dostarczania jest ustawiona na 2 mililitry na minutę. Upewnij się, że kierunek przepływu jest prawidłowy, jak pokazano na ekranie. Załaduj 3-stopniowy przewód pompy do pompy perystaltycznej za pomocą kompatybilnej kasety.Ustaw pompę odpływową na szybkość 4 mililitrów na minutę. Podłączyć rurkę odpływową z żółtą 3-stopniową rurką pompy do kurka odpływowego komory na chusteczki. Następnie załaduj 3-stopniową rurkę pompy do pompy perystaltycznej i rozpocznij przepływ dla obu pomp, naciskając przycisk zasilania na każdej pompie.Rozpocznij decelularyzację perfuzyjną płatów za pomocą heparynizowanej soli fizjologicznej w komorze tkankowej przez 15 minut, aby usunąć wszelkie zatrzymane skrzepy krwi. Po zakończeniu zastąp resztki soli fizjologicznej 500 mililitrami dodecylosiarczanu sodu lub roztworu decelularyzacyjnego SDS, aby zanurzyć klapkę. Następnie przenieś rurkę dopływową do roztworu SDS i obficie obficie tkankę.Po decellularizacji SDS odessaj pozostałą SDS przed perfuzją klapki PBS przez jeden dzień. Po decelularyzacji perfuzyjnej SDS sekwencyjnie perfuzjuj klapki w roztworze DNA przez dwie godziny, a następnie w PBS przez jeden dzień, a następnie przenieś rurkę dopływową do kwasu nadoctowego i etanolu w wodzie destylowanej w celu sterylizacji klapek przez perfuzję przez trzy godziny. Po zakończeniu usuń klapki w aseptyki i zanurz je w dwóch płukaniach PBS zawierających 1% antybiotyków przeciwgrzybiczych na 15 minut każde.Przechowuj klapki w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do recelularyzacji. Użyj narzędzia do biopsji dziurkowania o średnicy od 3 do 10 milimetrów, aby uzyskać próbki tkanek do oceny płatów bezkomórkowych. Izolowane płaty bezkomórkowe przepłukane pod kontrolą manualną wykazywały dowody odpływu z swobodnie drenującej kaniuli żylnej sieci komórkowej, powięzi napinającej szeroko i płata promieniowego przedramienia.Ogólna morfologia sieci natywnej, rozcięgna rozcięgna szerokiego i promieniowych płatów przedramienia pojawiła się w kolorze różowym natychmiast po pobraniu. Dla porównania, tkanki pozbawione komórek były charakterystycznie białe lub nieprzezroczyste. Badanie histologiczne tkanek natywnych z hematoksyliną i eozyną wykazało obecność jąder niebieskich.W płatach pozbawionych komórek barwienie histologiczne wykazało utratę materiału komórkowego bez niebieskiego barwienia jądrowego, co wskazuje na bezkomórkowe rusztowanie tkankowe. Dodatkowa kwantyfikacja zawartości DNA wykazała znaczny spadek DNA w rusztowaniach bezkomórkowych w porównaniu z tkankami natywnymi. Najważniejszą kwestią jest technika chirurgiczna stosowana podczas pobierania, dbająca o to, aby uniknąć uszkodzenia szypułki płatkowej, aby umożliwić późniejszą decelularyzację perfuzyjną.Po decelularyzacji perfuzyjnej powstałe płaty mogą zostać ponownie ukierunkowane na populacje komórek specyficzne dla tkanki w celu regeneracji natywnych przedziałów tkankowych.

procurement-perfusion-decellularization-porcine-vascularized-flaps

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Decelularyzacja perfuzyjna jest nowoczesną techniką wytwarzania rusztowań całej wątroby, która zachowuje skład macierzy zewnątrzkomórkowej oraz mikroarchitekturę narządu. W niniejszym opracowaniu opisano metodę przygotowania rusztowań całego narządu z wykorzystaniem decelularyzacji perfuzyjnej i późniejszej repopulacji hepatocytami. Dzięki tej technice możliwe jest wytworzenie funkcjonalnych i możliwych do przeszczepienia graftów wątroby.

Decelularyzacja i recelularyzacja całych wątrób

Opisano metodę szybkiego i całkowitego usuwania składników komórkowych z nienaruszonego serca świni poprzez wsteczną perfuzję. Metoda ta pozwala uzyskać specyficzne dla miejsca rusztowanie macierzy zewnątrzkomórkowej serca, które może być stosowane w wielu zastosowaniach klinicznych.

Procedura decelularyzacji serca świni przez wsteczną perfuzję wieńcową

Decelularyzacja całego narządu tworzy naturalne biologiczne rusztowania, które mogą być wykorzystane w medycynie regeneracyjnej. Przedstawiono opis modelu regeneracji płuc u naczelnych u zwierząt innych niż człowiek, w którym całe płuca są decelularyzowane, a następnie wysiewane dorosłymi komórkami macierzystymi i komórkami śródbłonka w bioreaktorze ułatwiającym krążenie naczyniowe i wentylację płynnych mediów.

Decelularyzacja i recelularyzacja płuc naczelnych przy użyciu specjalistycznego bioreaktora wielkonarządowego

Tutaj prezentujemy protokół do generowania przeszczepów naczyń krwionośnych z inżynierii tkankowej, które są funkcjonalne do szczepienia myszom poprzez podwójne wysiewanie częściowo indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (PiPSC) - pochodzących komórek mięśni gładkich i PiPSC - pochodzących komórek śródbłonka na bezkomórkowym bioreaktorze rusztowania naczyń krwionośnych.

Wytwarzanie i przeszczepianie naczyń krwionośnych metodą inżynierii tkankowej w modelu mysim

Do tej pory, grube ubytki tkanek są zazwyczaj rekonstruowane za pomocą autologicznych płatów tkankowych lub tkanek zmodyfikowanych. W niniejszym protokole przedstawiamy nową metodę inżynierii unaczynionego płata tkankowego z autologiczną szypułką, która ma służyć jako substytut płatów autologicznych.

Zaprojektowana unaczyniona płat mięśniowa

Przedstawione techniki pobierania wątroby, kaniulacji i perfuzji przy użyciu naszego zastrzeżonego urządzenia umożliwiają zaawansowane ustawienia perfuzji w celu usprawnienia eksperymentów z decelularyzacją i recelularyzacją w wątrobach szczurów.

Procedura decelularyzacji wątroby szczura w urządzeniu do perfuzji o oscylacyjnym ciśnieniu

Ta metoda umożliwia decelularyzację złożonego stałego organu przy użyciu prostego protokołu opartego na szoku osmotycznym i perfuzji jonowego detergentu przy minimalnym naruszeniu macierzy narządu. Obejmuje on nowatorską technikę decelularyzacji ludzkich serc w woreczku ciśnieniowym z monitorowaniem w czasie rzeczywistym dynamiki przepływu i odpływu zanieczyszczeń komórkowych.

Decellularyzacja całego ludzkiego serca w woreczku ciśnieniowym w orientacji odwróconej

Obecny protokół opisuje model płata powięziowo-skórnego świń i jego potencjalne zastosowanie w badaniach nad unaczynionymi tkankami kompozytowymi.

Niezawodny model płata powięziowo-skórnego świni do badań bioinżynieryjnych unaczynionych kompozytowych przeszczepów allogenicznych

Opisujemy technikę chirurgiczną i proces decelularyzacji kompozytowych kończyn tylnych szczurów. Decelularyzacja odbywa się przy użyciu dodecylosiarczanu sodu o niskim stężeniu przez system perfuzji maszynowej ex vivo.

Pobieranie i decelularyzacja kończyn tylnych szczura przy użyciu bioreaktora opartego na perfuzji ex vivo do unaczynionej allotransplantacji kompozytowej

Ten protokół przedstawia konfigurację i działanie nowo opracowanego, wydrukowanego w 3D bioreaktora do hodowli ex vivo naczyń krwionośnych w trakcie perfuzji. System został zaprojektowany tak, aby mógł być łatwo przyjęty przez innych użytkowników, praktyczny, niedrogi i możliwy do dostosowania do różnych zastosowań eksperymentalnych, takich jak podstawowa biologia i badania farmakologiczne.

Ex vivo Kultura perfuzyjna dużych naczyń krwionośnych w bioreaktorze wydrukowanym w 3D

Protokół ten opisuje technikę chirurgiczną pobierania ludzkiego modelu płata perforatora opartego na głębokim dolnym szypułku tętnicy nadbrzuszkowej, przeznaczonego do badań eksperymentalnych.

Eksperymentalny ludzki model płatów DIEP do badania strategii zachowania dla naczyniowych allograftów kompozytowych i płatów wolnych

Naucz się metody dekompozycji naczyniowanych płatów świń w niestandardowym bioreaktorze perfuzyjnym. Technika ta umożliwia inżynierię tkankową w chirurgii rekonstrukcyjnej.

Pobieranie i perfuzja-decelularyzacja unaczynionych płatów świń w niestandardowym bioreaktorze perfuzyjnym

Przeglądaj więcej filmów