Pobieranie i perfuzja-decelularyzacja unaczynionych płatów świń w niestandardowym bioreaktorze perfuzyjnym

Metoda ta opisuje chirurgiczne pobranie trzech unaczynionych płatów świń, a następnie ich decelularyzację perfuzyjną. Metoda ta może wspomóc wysiłki na rzecz regeneracji płatów świń przy użyciu metody decelularyzacji i recelularyzacji tkanek. Główną zaletą tej techniki jest jej wszechstronność w osiąganiu decelularyzacji obfitości w różnych unaczynionych płatach świń w prostej w montażu konfiguracji bioreaktora.

Opisana tutaj technika może być szeroko stosowana do innych unaczynionych płatów jako potencjalne rozwiązanie inżynierii tkankowej z wykorzystaniem płatów wieprzowych w chirurgii rekonstrukcyjnej. Na początek wykonaj rurkę doprowadzającą i odpływową, mierząc około 50 centymetrów silikonowej rurki pokrytej platyną LS16. Podłącz jeden koniec do żółtej 3-stopniowej rurki pompy, a drugi do sterylnej 2-mililitrowej pipety serologicznej, aby przenieść perfuzat ze zbiorników detergentu do komory bioreaktora.

Autoklaw komory i rurki w pojedynczo zapakowanym sterylnym opakowaniu. W celu pobrania płata moczowego umieść 12-tygodniową, znieczuloną świnię Yorkshire w pozycji leżącej, a następnie przygotuj brzuch w zwykły sterylny sposób. Wykonaj laparotomię mieczykowo-pępowinową, aby wejść do jamy brzusznej i zmobilizować głowo żołądka, a następnie umieścić sieć w polu operacyjnym.

Zaczynając od lewej części większej krzywizny, gdzie lewa tętnica żołądkowo-epiploiczna łączy się z tętnicą śledzionową, zeszkieletuj lewą tętnicę żołądkowo-epiploidalną i żyłę za pomocą prostych nożyczek do tenotomii Stevensa. Następnie podwiąż i podziel oba osobno za pomocą opasek chirurgicznych lub klipsów. Postępuj wzdłuż większej krzywizny żołądka od lewej do prawej, aby podwiązać i podzielić krótkie gałęzie naczyniowe powstające z sieci komórkowej, zapewniając większą krzywiznę żołądka.

Kontynuuj mobilizację sieci większej, aż do napotkania połączenia prawych naczyń żołądkowo-epiploicznych i tętnicy dwunastnicy. Następnie podwiązać i podzielić prawą tętnicę żołądkowo-epiploidalną i żyłę, aby uwolnić płat omentalny i umożliwić późniejszą kaniulację płata. W celu uzyskania płata napinacza powięzi lata, umieść świnię w bocznej pozycji odleżynowej.

Zaznacz wewnętrzną granicę płata od przedniego górnego kręgosłupa biodrowego lub ASIS w kierunku bocznej rzepki i tylną granicę około 8 do 10 centymetrów doogonowo. Użyj skalpela, aby wykonać ostre nacięcie na dystalnym brzegu rzepki. Pogłęb nacięcie przez tkanki podskórne, aby dotrzeć do powięzi leżącej nad mięśniem prostym uda i kontynuuj nacięcia w kierunku ASIS wzdłuż zaznaczonych granic.

Aby odizolować sam płat powięziowy, usuń leżący na nim element skóry z leżącej poniżej warstwy powięzi. Następnie podwiązaj lub kauteryzuj małe naczynia perforacyjne do skóry. Wróć do dystalnej granicy płata i naciąć głęboką powięź.

Zmobilizuj powięź od leżącego poniżej mięśnia obszernego bocznego w kierunku ASIS. Po prześledzeniu szypułki w kierunku głębokich naczyń udowych, zeszkieletuj boczną tętnicę udową okrężną i żyłę zaopatrującą płat powięziowy. Następnie podwiązać i podzielić naczynia płatowe proksymalnie, gdzie łączą się z głębokimi naczyniami udowymi i pozwalają na późniejszą kaniulację.

W przypadku pobierania promieniowego płata przedramienia zaznacz kwadrat o wymiarach 3 na 3 centymetry na promieniowej stronie wyprostowanego przedramienia świni. Narysuj linię między punktem środkowym bliższego brzegu płata a dołem przedłokciowym, aby oznaczyć przybliżony przebieg szypułki tętnicy promieniowej. Potwierdź przebieg tętniczy za pomocą badania palpacyjnego.

Następnie naciąć skórę za pomocą skalpela w dalszej części na głębokości aż do powięzi przedramiennej. Tępo wyciąć nożyczkami do tenotomii, aż do napotkania dalszej tętnicy promieniowej i jej żyły głównej. Następnie podwiąż i podziel tętnicę i żyły za pomocą opasek chirurgicznych lub klipsów.

Kontynuuj nacięcia skóry na promieniowym i łokciowym brzegu zaznaczonego kwadratu skóry. Następnie zmobilizuj płat z leżącej poniżej kości promieniowej za pomocą ostrza chirurgicznego lub kauteryzacji, przechodząc od kierunku łokciowego do promieniowego, jednocześnie unosząc płat skóry proksymalnie w kierunku dołu przedłokciowego. Za pomocą nożyczek do tenotomii zeszkieletuj tętnicę promieniową i żyłę comitantes proksymalnie w dole przedłokciowym, gdzie łączą się odpowiednio z tętnicą ramienną i żyłami.

Wypreparuj naczynia z otaczających tkanek włóknisto-tłuszczowych, aby wyizolować szypułkę naczyniową. Następnie podwiąż i podziel tętnicę i żyłę oddzielnie, aby uwolnić promieniowy płat przedramienia. Następnie kanulokuj naczynia szypułkowe za pomocą angiocewnika o rozmiarze od 20 do 24 zabezpieczonego jedwabnymi opaskami 3-0.

Przepłukać heparynizowaną sól fizjologiczną do płatowej kaniuli tętniczej, aż do zaobserwowania wyraźnego odpływu żylnego. Podczas pracy w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym umieść klapy w komorze tkankowej bioreaktora. Zalać rurki dopływowe sterylną heparynizowaną solą fizjologiczną, aby usunąć resztki powietrza i ułożyć klapki tak, aby umożliwić połączenie między kaniulą tętniczą klapki a męskim złączem luer.

Następnie za pomocą sterylnych hemostatów przykręcić kaniulę tętniczą do łącznika. Następnie przepłukać heparynizowaną sól fizjologiczną przez zawór odcinający, aby sprawdzić, czy połączenie luer jest wolne od wycieków i czy klapki mogą być perfundowane z dowodami odpływu żylnego. Po zamknięciu pokrywy komory na chusteczki należy podłączyć rurkę dopływową z żółtą 3-stopniową rurką pompy do kurka dopływowego komory na chusteczki.

Podłącz również przetwornik czujnika ciśnienia w linii do 3-drogowego kurka dopływu w celu monitorowania ciśnienia perfuzji. Następnie włącz dopływową pompę perystaltyczną i na ekranie początkowym przejdź do trzeciej zakładki za pomocą strzałki, aby ustawić identyfikator rurki na 1,85 milimetra. Następnie ustaw szybkość perfuzji z drugiej zakładki.

Szybkość wejściowa jako metoda dostarczania jest ustawiona na 2 mililitry na minutę. Upewnij się, że kierunek przepływu jest prawidłowy, jak pokazano na ekranie. Załaduj 3-stopniowy przewód pompy do pompy perystaltycznej za pomocą kompatybilnej kasety.

Ustaw pompę odpływową na szybkość 4 mililitrów na minutę. Podłączyć rurkę odpływową z żółtą 3-stopniową rurką pompy do kurka odpływowego komory na chusteczki. Następnie załaduj 3-stopniową rurkę pompy do pompy perystaltycznej i rozpocznij przepływ dla obu pomp, naciskając przycisk zasilania na każdej pompie.

Rozpocznij decelularyzację perfuzyjną płatów za pomocą heparynizowanej soli fizjologicznej w komorze tkankowej przez 15 minut, aby usunąć wszelkie zatrzymane skrzepy krwi. Po zakończeniu zastąp resztki soli fizjologicznej 500 mililitrami dodecylosiarczanu sodu lub roztworu decelularyzacyjnego SDS, aby zanurzyć klapkę. Następnie przenieś rurkę dopływową do roztworu SDS i obficie obficie tkankę.

Po decellularizacji SDS odessaj pozostałą SDS przed perfuzją klapki PBS przez jeden dzień. Po decelularyzacji perfuzyjnej SDS sekwencyjnie perfuzjuj klapki w roztworze DNA przez dwie godziny, a następnie w PBS przez jeden dzień, a następnie przenieś rurkę dopływową do kwasu nadoctowego i etanolu w wodzie destylowanej w celu sterylizacji klapek przez perfuzję przez trzy godziny. Po zakończeniu usuń klapki w aseptyki i zanurz je w dwóch płukaniach PBS zawierających 1% antybiotyków przeciwgrzybiczych na 15 minut każde.

Przechowuj klapki w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do recelularyzacji. Użyj narzędzia do biopsji dziurkowania o średnicy od 3 do 10 milimetrów, aby uzyskać próbki tkanek do oceny płatów bezkomórkowych. Izolowane płaty bezkomórkowe przepłukane pod kontrolą manualną wykazywały dowody odpływu z swobodnie drenującej kaniuli żylnej sieci komórkowej, powięzi napinającej szeroko i płata promieniowego przedramienia.

Ogólna morfologia sieci natywnej, rozcięgna rozcięgna szerokiego i promieniowych płatów przedramienia pojawiła się w kolorze różowym natychmiast po pobraniu. Dla porównania, tkanki pozbawione komórek były charakterystycznie białe lub nieprzezroczyste. Badanie histologiczne tkanek natywnych z hematoksyliną i eozyną wykazało obecność jąder niebieskich.

W płatach pozbawionych komórek barwienie histologiczne wykazało utratę materiału komórkowego bez niebieskiego barwienia jądrowego, co wskazuje na bezkomórkowe rusztowanie tkankowe. Dodatkowa kwantyfikacja zawartości DNA wykazała znaczny spadek DNA w rusztowaniach bezkomórkowych w porównaniu z tkankami natywnymi. Najważniejszą kwestią jest technika chirurgiczna stosowana podczas pobierania, dbająca o to, aby uniknąć uszkodzenia szypułki płatkowej, aby umożliwić późniejszą decelularyzację perfuzyjną.

Po decelularyzacji perfuzyjnej powstałe płaty mogą zostać ponownie ukierunkowane na populacje komórek specyficzne dla tkanki w celu regeneracji natywnych przedziałów tkankowych.