Name: Ilościowa analiza aortapatii metodą mikro-CT w mysim modelu tętniaka i rozwarstwienia aorty wywołanego β-aminopropionitrylem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Naucz się ilościowej analizy aortapatii metodą mikro-CT w mysim modelu tętniaka aorty wywołanego β-aminopropionitrylem. Technika ta umożliwia precyzyjne obrazowanie naczyń krwionośnych i kwantyfikację zmian w biologii naczyniowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Markowi Smithowi za pomoc w obrazowaniu radiograficznym. Praca ta jest wspierana przez NIH T32 Grant for Interdisciplinary Research in Cardiovascular Disease (BOA), American Heart Association (SMC) oraz NIH R35 Grant (DKS).

Protokoły dotyczące postępowania ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Maryland w Baltimore (numer protokołu dla zwierząt 0116024) i przeprowadzone zgodnie z międzynarodowymi standardami AAALAC.
1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>heparyna
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 250 μl 1000 j/ml siarczanu heparyny w 50 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, aby uzyskać końcowe stężenie 5 U/ml.</li>
		<li>Ogrzać heparynizowany (5 U/ml) roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanem, który zastąpi krew w układzie krwionośnym w łaźni wodnej ustawionej na 37 °C.</li>
		<li>Przygotować pompę z kontrolowanym ciśnieniem, podłączając wymagany przewód i 2 puste strzykawki o pojemności 10 ml, 1 dla buforu heparynizowanego soli fizjologicznej i 1 dla środka kontrastowego.</li>
		<li>Napełnij rurkę ciepłym roztworem soli fizjologicznej buforowanym heparynami fosforanowymi i usuń pęcherzyki powietrza z rurki pompy ciśnieniowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Środek kontrastowy 
	UWAGA: Proszę zapoznać się z tabelą materiałów, aby zapoznać się ze składnikami zestawu środków kontrastowych.
	<ol>
		<li>Wymieszaj pigmentowany związek z rozcieńczalnikiem, aby uzyskać stosunek barwnika do rozcieńczalnika 1:6.</li>
		<li>Bezpośrednio przed użyciem (etap 2.3.12) dodać 200 μl utwardzacza do każdej 5 ml porcji rozcieńczonego związku pigmentowego i dobrze je wymieszać (4% objętościowo). 
		UWAGA: Producent podał, że czas pracy to 40 min. Ponieważ środek kontrastowy z kauczuku silikonowego zaczyna polimeryzować po 20 minutach od dodania utwardzacza, ważne jest, aby przygotować roztwór bezpośrednio przed jego infuzją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>BAPN woda pitna
	<ol>
		<li>Rozpuść β-aminopropionitryl (BAPN) w wodzie pitnej, aby uzyskać końcowe stężenie 3 g/L (dostosowane do protokołów opisanych wcześniej w literaturze)9,16,17.</li>
		<li>Podawaj wodę pitną zawierającą BAPN grupie myszy po osiągnięciu przez nie wieku 4 tygodni do czasu perfuzji w celu mikro-CT.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Zabieg chirurgiczny
<ol>
	<li>Przygotowanie zwierząt
	<ol>
		<li>Myszy należy odstawić od piersi w wieku 3 tygodni, utrzymywać je w cyklu 12 godzin światła/12 godzin ciemności i karmić je standardową karmą dla gryzoni. W przypadku grupy leczonej BAPN należy podawać świeżo przygotowaną wodę pitną BAPN przez 16 - 26 tygodni ad libitum. Zapewnić zwierzętom kontrolnym standardową wodę pitną ad libitum.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Technika anestezjologiczna 
	UWAGA: Na 24 godziny przed badaniem TK wykonywana jest następująca procedura. Zabiegi chirurgiczne są wykonywane w celu przygotowania próbki do pośmiertnej perfuzji wewnątrzsercowej.
	<ol>
		<li>Wywołaj znieczulenie za pomocą zbiornika indukcyjnego ze 100%O2 i 3% izofluranem dostarczanym przez precyzyjny waporyzator. Po indukcji znieczulenia należy odstawić izofluran i przepłukać komoręO2. Utrzymuj znieczulenie za pomocą 2 - 2,5% izofluranu i 1 l/minO2 przez stożek nosowy.</li>
		<li>Przymocuj zarówno komorę indukcyjną, jak i maskę na twarz do pochłaniacza węgla drzewnego w celu adsorpcji gazów odlotowych w celu ochrony personelu. Zapewnij odpowiednią płaszczyznę znieczulenia, wykazując, że nie ma reakcji na szkodliwe bodźce (szczypanie palców).</li>
		<li>Przygotuj pole operacyjne składające się z tacki chirurgicznej i niezbędnych narzędzi chirurgicznych.</li>
		<li>Przenieś zwierzę na pole operacyjne i ustaw je w pozycji grzbietowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Technika operacyjna
	<ol>
		<li>Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie w linii środkowej przez skórę i tkankę miękką od połowy spojenia łonowego do wcięcia mostka, rozciągając się przez skórę i tkankę miękką pokrywającą mostek.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek utwórz otwór w przeponie w wyrostku mieczykowatym, aby wejść do jamy klatki piersiowej.</li>
		<li>Użyj nożyczek, aby obustronnie wypreparować przeponę brzusznej ściany klatki piersiowej.</li>
		<li>Przeciąć chrząstki żebrowe, aby oddzielić żebra od mostka na prawej granicy mostka.</li>
		<li>Przyłóż cienki zacisk hemostatyczny do czubka mostka (w pobliżu wyrostka mieczykowatego) i przesuń hemostat czaszkowo tak, aby znajdował się nad głową myszy. Spowoduje to cofnięcie grasicy i mostka z dala od serca, odsłaniając serce i wielkie naczynia do dalszej manipulacji.</li>
		<li>Ostro przeanalizuj wszelkie przyczepy między sercem a ścianą klatki piersiowej.</li>
		<li>Podłączyć igłę cewnika dożylnego o rozmiarze 27 do strzykawki wstępnie załadowanej 10 ml heparynizowanego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (5 U/ml) i napełnić wszystkie rurki buforem w celu usunięcia pęcherzyków powietrza z rurek pompy ciśnieniowej.</li>
		<li>Zachowaj ostrożność podczas przygotowywania płynu, ponieważ pęcherzyki w przewodzie płynu mogą utrudniać napełnianie mniejszych naczyń. Należy ograniczyć liczbę naczyń, które ulegają uszkodzeniu podczas przygotowania dla zwierząt, ponieważ spowoduje to wyciek środka kontrastowego z odciętych naczyń, zmianę objętości wymaganej do całkowitego wypełnienia i wprowadzenie artefaktów do końcowego obrazowania.</li>
		<li>Nakłuć lewą komorę igłą o rozmiarze 27, która jest stabilizowana za pomocą zacisku pod kątem prostym. Natychmiast naciąć prawą komorę lub żyłę główną dolną, aby odsączyć roztwór heparyny i krew. 
		UWAGA: Heparyna jest stosowana jako antykoagulant, aby zapobiec krzepnięciu krwi w naczyniach po śmierci zwierzęcia.</li>
		<li>Przeprowadzić fuzję zwierzęcia ze stałą szybkością 2 ml/minutę za pomocą jednej pompki strzykawkowej. Zwróć uwagę na widoczne zblednienie narządów. Kontynuuj perfuzję, aż perfuzat odprowadzający z krążenia żylnego będzie wolny od krwi (około 5 - 6 ml). Zatrzymaj pompę.</li>
		<li>Odłączyć rurkę cewnika dożylnego od strzykawki o pojemności 10 ml, uważając, aby nie zakłócić pozycji igły w lewej komorze.</li>
		<li>Natychmiast po całkowitym wykrwawieniu rozdzielić roztwór środka kontrastowego na 5 ml podwielokrotności i w tym czasie dodać utwardzacz (patrz krok 1.2). Dobrze je wymieszaj. Pobrać 5 ml mieszanki środka kontrastowego do strzykawki o pojemności 10 ml i wykonać nią perfuzję zwierzęcia.</li>
		<li>Aby całkowicie wypełnić naczynia (tętnice i żyły), kontynuuj infuzję po przekroczeniu punktu, w którym można zobaczyć wyjście z roztworu żylnego. Szukaj oznak udanej perfuzji, w tym wizualizacji środka odlewniczego w tętnicach wieńcowych, tętnicach płucnych, jelicie i unaczynieniu wątroby.</li>
		<li>Środek kontrastowy utwardza się po około 20 minutach w temperaturze pokojowej. Po utwardzeniu zbierz poszczególne narządy, w razie potrzeby, i utrwal je w 10% neutralnej buforowanej formalinie. Naprawić całe tusze, jeśli próbki nie są używane do badania mikrotomografią komputerową następnego dnia. Jeżeli tusze będą używane następnego dnia, należy je umieścić na metalowej tacy i umieścić w lodówce w temperaturze 4 °C do utwardzenia przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Skanowanie mikro-tomografią komputerową i parametry
UWAGA: Konkretne parametry akwizycji obrazu będą zależne od używanej maszyny.
<ol>
	<li>Uzyskaj obrazy rentgenowskiej tomografii komputerowej każdej myszy następnego dnia po perfuzji za pomocą mikrotomografu komputerowego przy użyciu napięcia lampy rentgenowskiej 55 kVp, prądu 150 μA, współczynnika powiększenia systemu 2,19 i współczynnika kategoryzacji pikseli kamery CCD wynoszącego 2. Daje to efektywny rozmiar piksela wynoszący 29 μm.
	<ol>
		<li>Połóż tuszę myszy na wznak na stole skanera mikrotomografii komputerowej i wykonaj zwiadowczy skan rentgenowski.</li>
		<li>Ustaw ostrość pole widzenia detektora 57,4 mm (osiowo) x 37,1 mm (transosiowo) na tułowiu, aby zobrazować całą długość aorty.</li>
		<li>Uzyskaj 180 projekcji obrazu z krokiem obrotu o 2 stopnie i czasem projekcji wynoszącym 2800 ms.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zrekonstruuj obrazy za pomocą zmodyfikowanego algorytmu Feldkampa; zrekonstruowany rozmiar woksela to 29 x 29 x 29μm3 (grubość warstwy = 29 μm) za pomocą wtyczki Multimodal 3D Visualization do używanego tutaj oprogramowania.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie końcowe i renderowanie
<ol>
	<li>Przekonwertuj dane CT do formatu DICOM za pomocą odpowiedniego oprogramowania.</li>
	<li>Przeanalizuj obrazy, aby określić, czy tętniak był obecny. Zmierz średnicę osi mniejszej w najszerszym punkcie łuku aorty, zstępującej aorty piersiowej i aorty brzusznej, jak opisano wcześniej18 (Rysunek 1). 
	UWAGA: W naszym badaniu obrazy były analizowane przez dwóch niezależnych obserwatorów (jeden zaślepiony) wykorzystujących przeglądarkę DICOM w celu określenia, czy tętniak jest obecny. Średnica osi mniejszej została zmierzona w najszerszym punkcie łuku aorty, zstępującej aorty piersiowej i aorty brzusznej, jak opisano wcześniej19 (Rysunek 1). Średnie nietętniakowe odcinki tętnic myszy nieleczonych BAPN ustaliły normalne średnice naczyń, służąc jako wartości kontrolne dopasowane do wieku.</li>
	<li>Tętniaki definiuje się jako miejscowe lub rozlane poszerzenie odcinków aorty do średnic większych niż 50% średnicy odniesienia. Zlokalizuj je na podstawie powyższych pomiarów.</li>
</ol>

<ol><li>Meszaros, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+clinicopathology+of+aortic+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22CHEST%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and clinicopathology of aortic dissection.</a> CHEST. 117 (5), 1271-1278 (2000).</li>
<li>Kochanek, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deaths%3A+final+data+for+2009%5BTitle%5D)+AND+%22National+Vital+Statistics+Reports%22%5BJournal%5D)">Deaths: final data for 2009.</a> National Vital Statistics Reports. 60 (3), 1-116 (2011).</li>
<li>Li, J. S., Li, H. Y., Wang, L., Zhang, L., Jing, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+beta-aminopropionitrile-induced+aortic+dissection+model+in+rats+by+different+administration+and+dosage%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular%22%5BJournal%5D)">Comparison of beta-aminopropionitrile-induced aortic dissection model in rats by different administration and dosage.</a> Vascular. 21 (5), 287-292 (2013).</li>
<li>Huffman, M. D., Curci, J. A., Moore, G., Kerns, D. B., Starcher, B. C., Thompson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+importance+of+connective+tissue+repair+during+the+development+of+experimental+abdominal+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Functional importance of connective tissue repair during the development of experimental abdominal aortic aneurysms.</a> Surgery. 128 (3), 429-438 (2000).</li>
<li>Wu, D., Shen, Y. H., Russel, L., Coselii, J. S., LeMaire, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+thoracic+aortic+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of thoracic aortic dissection.</a> Journal of Surgical Research. 184 (2), 907-924 (2013).</li>
<li>Bruel, A., Ortoft, G., Oxlund, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+cross-links+in+collagen+is+associated+with+reduced+stiffness+of+the+aorta+in+young+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Inhibition of cross-links in collagen is associated with reduced stiffness of the aorta in young rats.</a> Atherosclerosis. 140 (1), 135-145 (1998).</li>
<li>Martinez-Revelles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysyl+oxidase+induces+vascular+oxidative+stress+and+contributes+to+arterial+stiffness+and+abnormal+elastin+structure+in+hypertension%3A+Role+of+p38MAPK%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Lysyl oxidase induces vascular oxidative stress and contributes to arterial stiffness and abnormal elastin structure in hypertension: Role of p38MAPK.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 27 (7), 379-397 (2017).</li>
<li>Kumar, D., Trent, M. B., Boor, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allylamine+and+beta-aminopropionitrile+induced+aortic+medial+necrosis%3A+Mechanisms+of+synergism%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Allylamine and beta-aminopropionitrile induced aortic medial necrosis: Mechanisms of synergism.</a> Toxicology. 125 (2-3), 107-115 (1998).</li>
<li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4916438/">β-Aminopropionitrile monofumarate induces thoracic aortic dissection in C57BL/6 mice.</a> Scientific Reports. 6, 28149(2016).</li>
<li>Kanematsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologically-induced+thoracic+and+abdominal+aortic+aneurysms+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Pharmacologically-induced thoracic and abdominal aortic aneurysms in mice.</a> Hypertension. 55 (5), 1267-1274 (2010).</li>
<li>Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+Perfusion+and+Filling+of+Mouse+Coronary+Vasculature+as+Preparation+for+Micro+Computed+Tomography+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging.</a> J Vis Exp. (60), e3740(2012).</li>
<li>Cortell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicone+rubber+for+renal+tubular+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Silicone rubber for renal tubular injection.</a> Journal of Applied Physics. 26 (1), 158-159 (1969).</li>
<li>Bentley, M. D., Ortiz, M. C., Ritman, E. L., Romero, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+microcomputed+tomography+to+study+microvasculature+in+small+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">The use of microcomputed tomography to study microvasculature in small rodents.</a> American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 282 (5), R1267-R1279 (2002).</li>
<li>Marxen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+scanner+performance+and+considerations+for+vascular+specimen+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Physics%22%5BJournal%5D)">MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging.</a> Medical Physics. 31 (2), 305-313 (2004).</li>
<li>Yang, J., Yu, L. X., Rennie, M. Y., Sled, J. G., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+structural+and+hemodynamic+analysis+of+vascular+trees%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparative structural and hemodynamic analysis of vascular trees.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (4), H1249-H1259 (2010).</li>
<li>Jia, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stretch-induced+endoplasmic+reticulum+stress%2C+apoptosis%2C+and+inflammation+contribute+to+thoracic+aortic+aneurysm+and+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Mechanical stretch-induced endoplasmic reticulum stress, apoptosis, and inflammation contribute to thoracic aortic aneurysm and dissection.</a> The Journal of Pathology. 236 (3), 373-383 (2015).</li>
<li>Kurihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+matrix+metalloproteinase+9+triggers+acute+aortic+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived matrix metalloproteinase 9 triggers acute aortic dissection.</a> Circulation. 126 (25), 3070-3080 (2012).</li>
<li>Dillavou, E. D., Buck, D. G., Muluk, S. C., Makaroun, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+versus+three-dimensional+CT+scan+for+aortic+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endovascular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional versus three-dimensional CT scan for aortic measurement.</a> Journal of Endovascular Therapy. 10 (3), 531-538 (2003).</li>
<li>Muratoglu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRP1+protects+the+vasculature+by+regulating+levels+of+connective+tissue+growth+factor+and+HtrA1%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">LRP1 protects the vasculature by regulating levels of connective tissue growth factor and HtrA1.</a> Arterioclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33, 2137-2146 (2013).</li>
<li>Badea, C. T., Dragova, M., Holdsworth, D. W., Johnson, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+small+animal+imaging+using+micro-CT+and+digital+subtraction+angiography%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo small animal imaging using micro-CT and digital subtraction angiography.</a> Phys Med Biol. 53 (19), R319-R350 (2008).</li>
<li>Zhou, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-guided+left-ventricular+catheterization%3A+A+novel+method+of+whole+mouse+perfusion+for+microimaging%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-guided left-ventricular catheterization: A novel method of whole mouse perfusion for microimaging.</a> Laboratory Investigation. 84, 385-389 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obrazowanie mikro-CT może być wykorzystywane do dostarczania bardzo szczegółowych i trójwymiarowych rekonstrukcji patologii naczyń krwionośnych w modelach zwierzęcych. Dzięki zastosowaniu wewnątrznaczyniowych środków wzmacniających kontrast można odróżnić niewzmocnione tkanki miękkie, takie jak światło naczynia krwionośnego, od tych, które się poprawiają. Chociaż doppler laserowy, mikroangiografia, angiografia rezonansu magnetycznego, histologia z mikroskopią konfokalną lub mikroskopia dwufotonowa mogą być stosowane do o...

Częstość występowania rozwarstwienia aorty wynosi 3 przypadki na 100 000 rocznie1. Rozwarstwienie aorty i choroby tętniakowe są przyczyną ponad 10 000 zgonów w Stanach Zjednoczonych każdego roku, co stanowi 1-2% wszystkich zgonów w krajach zachodnich2. Rozwarstwienie aorty rozpoczyna się od rozdarcia warstwy wewnętrznej naczynia z rozchodzeniem się krwi przez warstwy ściany aorty pod wpływem ciśnienia fizjologicznego. Podwyższone ciśnienie tętna pacjenta wiąże się ze zwiększoną częstością rozwarstwień i powikłań. Zwiększone naprężenie ścinające ścianę jest związane z rozszerzaniem się ściany aorty prowadzącym do powstania tętniaka3,4. Konsekwencje rozwarstwienia aorty obejmują zamknięcie przepływu krwi do odległych narządów, w tym mózgu, nerek, jelit i kończyn, powstawanie przewlekłych tętniaków, pęknięcie lub śmierć5,6,7.
Obecnie procesy biochemiczne i komórkowe związane z inicjacją i progresją tętniaków aorty oraz rozwarstwień są nadal słabo poznane. Powtarzalne modele zwierzęce tętniaka i rozwarstwienia aorty są kluczem do zrozumienia ich patofizjologii. β-aminopropionitryl (BAPN) jest inhibitorem oksydazy lizylowej, który zapobiega sieciowaniu elastyny i kolagenu oraz wykazano, że znacząco zmienia strukturę ściany naczynia macierzy zewnątrzkomórkowej i jej integralność biomechaniczną6,8. Gryzonie leczone BAPN zostały wykorzystane jako powszechny model zwierzęcy tętniaka aorty i rozwarstwienia9,10.
Metody obrazowania naczyniowego są pomocne w identyfikacji patologii naczyniowej, potwierdzaniu drożności naczyń krwionośnych i ocenie perfuzji narządów. Ostatnio mikrotomografia komputerowa (mikro-CT) została wykorzystana do badania unaczynienia myszy i zwierząt o podobnej wielkości. W przeciwieństwie do kości, osiowe obrazowanie naczyń krwionośnych za pomocą tomografii komputerowej jest ograniczone, ponieważ krew śródświetlna jest z natury stosunkowo przezierna dla promieni rentgenowskich. Jednak w połączeniu z wewnątrznaczyniowymi środkami kontrastowymi, mikro-CT umożliwia szczegółową trójwymiarową rekonstrukcję naczyń krwionośnych zwierząt w celu zbadania makroanatomicznej patologii naczyń krwionośnych11.
Wybrany środek kontrastowy (zobacz Tabelę Materiałów) to nieprzepuszczający promieni rentgenowskich kauczuk silikonowy, który zawiera chromian ołowiu i siarczan ołowiu. Po perfuzji w obecności katalizatora szybko twardnieje, tworząc odlew układu naczyniowego przy minimalnych zmianach w makroanatomicznej architekturze naczyń, co sprawia, że układ naczyniowy jest wysoce nieprzepuszczalny dla promieni rentgenowskich w przeciwieństwie do tkanek tła podczas badania radiologicznego. Ten środek kontrastowy jest korzystny, ponieważ jest łatwy w obsłudze i pozwala uniknąć degradacji tkanek i utraty naczyń z powodu pęknięcia, często związanego z korozją odlewu naczyniowego. Ponieważ utwardza się przy minimalnym skurczu12, naczynia oczyszczone z krwi pozostają opatentowane i pozwalają na dokładną ocenę makro-unaczynienia zwierząt w eksperymentach bez przeżycia. Wcześniejsze prace z powodzeniem wykorzystywały kontrast z nieprzepuszczalnym dla promieni rentgenowskich kauczukiem silikonowym w różnych badaniach na zwierzętach. W szczególności pokazano możliwość zastosowania w wizualizacji krążenia wieńcowego, kłębuszkowego, łożyskowego i mózgowego11,12,13,14,15. W tym artykule szczegółowo opisujemy metodologię otwartego nakłucia lewej komory do wewnątrznaczyniowej perfuzji nieprzepuszczalnego dla promieni rentgenowskich kauczuku silikonowego na bazie ołowiu w celu ilościowego scharakteryzowania patologii aorty indukowanej przez BAPN w modelu mysim za pomocą mikro-CT.

<table><tbody><tr><td>Microfil</td><td>Flow Tech, Inc</td><td>MV-122 Używamy</td><td>koloru żółtego, inny kolor można zamówić według uznania. Zestaw zawiera MV-Compound, MV-Diluent i MV-Curing Agent.</td></tr><tr><td>Heparyna (1000 U / ml)</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>25021-400-10</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Vet One, MWI</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>Sól fumaranu 3-aminopropionitrylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3134</td><td></td></tr><tr><td>Pojedyncza pompa strzykawkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-831-200</td><td></td></tr><tr><td>27-gauge Igła do ustawiania żył skóry głowy</td><td>Exel Int</td><td>26709</td><td>27G x 3/4", rurka 12"</td></tr><tr><td>Skaner Micro-CT Inveon</td><td>Siemens Medical Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osirix MD</td><td>Pimxmeo SARL</td><td></td><td>Wersja 8.0.2</td></tr><tr><td>Inveon Research Workplace</td><td>Siemens Medical Solutions</td><td></td><td>Wersja 4.2</td></tr><tr><td>Gryzoń Chow</td><td>Harlan Teklad</td><td>2018sx</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowa analiza aortapatii metodą mikro-ct w mysim modelu tętniaka i rozwarstwienia aorty wywołanego β-aminopropionitrylem

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of &#946;-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Tętniak aorty i rozwarstwienie wiąże się ze znaczną zachorowalnością i śmiertelnością w populacji i może być wysoce śmiertelne. Chociaż istnieją zwierzęce modele choroby aorty, obrazowanie naczyń krwionośnych in vivo jest ograniczone. W ostatnich latach mikrotomografia komputerowa (mikro-CT) stała się preferowaną metodą obrazowania zarówno dużych, jak i małych naczyń krwionośnych, zarówno in vivo, jak i ex vivo. W połączeniu z metodą odlewania naczyniowego z powodzeniem zastosowaliśmy mikro-CT do scharakteryzowania częstości i rozkładu patologii aorty u myszy C57 / Bl6 leczonych β-aminopropionitrylem. Ograniczenia techniczne tej metody obejmują różnice w jakości perfuzji spowodowane złym przygotowaniem zwierząt, zastosowanie właściwych metodologii ilościowego określania wielkości naczyń oraz niezdolność do przeżycia tej procedury. W artykule szczegółowo opisano metodologię wewnątrznaczyniowej perfuzji nieprzepuszczalnego dla promieni rentgenowskich kauczuku silikonowego na bazie ołowiu w ilościowej charakterystyce aortopatii w mysim modelu tętniaka i rozwarstwienia. Oprócz wizualizacji patologii aorty, metoda ta może być stosowana do badania innych łożysk naczyniowych in vivo lub łożysk naczyniowych usuniętych pośmiertnie.

W celu oceny tego protokołu, 20 dorosłych samców myszy o mieszanym pochodzeniu, zgodnie z wcześniejszym opisem19, w wieku 20 – 30 tygodni, z zastosowaniem lub bez zastosowania BAPN, poddano perfuzji za pomocą radiokontrastowej gumy silikonowej na bazie ołowiu (patrz Tabela Materiałów), stosując szczegółowy protokół opisany powyżej. Następnego dnia zwierzęta poddano skanowaniu mikro-CT (Rysunek 1 i <str...

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię użycia nieprzepuszczającego promieni rentgenowskich kauczuku silikonowego na bazie ołowiu do perfuzji mysiego układu krwionośnego do ilościowego określenia średnicy aorty w mysim modelu tętniaka i rozwarstwienia aorty.

Ilościowa analiza aortapatii metodą mikro-CT w mysim modelu tętniaka i rozwarstwienia aorty wywołanego β-aminopropionitrylem

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of ...

Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii naczyniowej, takie jak określenie, w jaki sposób rozmiar naczynia wpływa na różne zwierzęce modele chorób naczyniowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że mikrotomografia komputerowa umożliwia szczegółowe obrazy zarówno dużych, jak i małych naczyń, zarówno in vivo, jak i ex vivo, które można precyzyjnie określić ilościowo. 24 godziny przed analizą CT należy wykonać zabiegi chirurgiczne w celu przygotowania próbki do pośmiertnej obfitości wewnątrzsercowej.Do znieczulenia użyj 3% izofluranu i upewnij się, że masz w użyciu pochłaniacz węgla drzewnego. Następnie utrzymuj znieczulenie za pomocą dwóch do 2,5 procent izofluranu z maski na twarz, również przymocowanej do zmiatacza z jednym litrem tlenu na minutę. Przed rozpoczęciem operacji wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby sprawdzić, czy nie ma odruchu pedałowania.Następnie skonfiguruj pole operacyjne z instrumentami i tak dalej. Następnie ustaw zwierzę w pozycji leżącej grzbietowej i zabezpiecz kończyny. Teraz za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie w linii środkowej przez skórę i tkankę miękką nad mostkiem między spojeniem łonowym a wcięciem mostka.Następnie użyj nożyczek, aby utworzyć otwór w przeponie w wyrostku mieczykowatym, aby wejść do jamy klatki piersiowej. Następnie kontynuuj używanie nożyczek do obustronnego wypreparowania przepony brzusznej ściany klatki piersiowej. Przeciąć chrząstki żebrowe, aby oddzielić żebra od mostka na prawej granicy mostka.Teraz przyłóż cienki zacisk hemostatyczny do czubka mostka w pobliżu wyrostka mieczykowatego i przesuń hemostat czaszkowo tak, aby znajdował się nad głową myszy. Następnie ostro przeanalizuj wszelkie przyczepy między sercem a ścianą klatki piersiowej. Należy ograniczyć liczbę naczyń uszkodzonych podczas przygotowywania zwierząt, ponieważ spowoduje to wyciek środka kontrastowego z odciętych naczyń, co zmieni objętość wymaganą do całkowitego wypełnienia i wprowadzi artefakty do końcowego obrazowania.Teraz podłącz igłę do cewnika dożylnego o rozmiarze 27 do strzykawki wstępnie załadowanej 10 mililitrami heparynizowanego PBS i napełnij wszystkie rurki buforem, usuwając wszystkie pęcherzyki powietrza. Niezbędne jest usunięcie wszystkich pęcherzyków z linii. Następnie natychmiast naciąć prawą komorę lub żyłę główną dolną, aby odsączyć roztwór heparyny i krew.Aby kontynuować, użyj kaniuli do nakłucia lewej komory, stabilizowanej przez zacisk. Przeprowadzaj obfitowanie ze stałą prędkością dwóch mililitrów na minutę za pomocą pompy strzykawkowej. Powinno być widoczne blednięcie narządów.W ciągu kilku minut krążenie żyły powinno być wolne od krwi. Następnie należy zatrzymać pompę i odłączyć rurkę cewnika od strzykawki, ale nie przesuwać igły cewnika. Teraz rozdziel roztwór środka kontrastowego na pięć mililitrowych porcji, dodaj utwardzacz i dobrze wymieszaj.Następnie załaduj pięć mililitrów mieszaniny do 10-mililitrowej strzykawki i oblej zwierzę środkiem kontrastowym w stałym tempie dwóch mililitrów na minutę. Utrzymuj napar po osiągnięciu momentu, w którym zobaczysz, jak czynnik odlewniczy opuszcza zwierzę. Środek kontrastowy utwardzi się w ciągu 20 minut.Po wysuszeniu zbierz interesujące Cię narządy i utrwal je w 10% neutralnej buforowanej formalinie. Następnie, jeśli próbki nie są używane do skanowania mikro-CT, należy przymocować całą tuszę. W przeciwnym razie ułóż tuszę na metalowej tacy i umieść ją w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby utwardziła się przez noc.Następnego dnia uzyskaj zdjęcia rentgenowskie tomografii komputerowej każdej myszy za pomocą skanera mikro-CT. Ustaw parametry skanera w następujący sposób; Szczytowe napięcie lampy rentgenowskiej wynosi 55 kilowoltów, prąd 150 mikroamperów, współczynnik powiększenia systemu 2,19 i współczynnik grupowania pikseli kamery CCD wynosi dwa. Ten współczynnik kategoryzacji da efektywny rozmiar piksela wynoszący 29 mikronów.Następnie przeanalizuj obrazy, aby zidentyfikować tętniaki przy użyciu standardowego podejścia. Zmierz średnicę osi pomocniczej w najszerszym punkcie z trzech lokalizacji; łuku aorty, zstępującej aorty piersiowej i aorty brzusznej. Idealnie byłoby, gdyby dwóch obserwatorów, z których jeden jest oślepiony, analizowało każdy obraz.Korzystając z pomiarów, zidentyfikuj tętniaki jako miejscowe lub rozproszone poszerzenia odcinków aorty do średnic większych niż 50% średnicy odniesienia. 20 dorosłych samców myszy o mieszanym pochodzeniu i w wieku od 20 do 30 tygodni analizowano z leczeniem BAPN lub bez niego. Każdy z nich był obficie wypełniony nieprzepuszczającą promieni rentgenowskich gumą silikonową na bazie ołowiu.Średnia średnica aorty wstępującej u myszy leczonych BAPN była znacznie większa niż u nieleczonych kontrolnych w tym samym wieku. Punkty danych od myszy, u których stwierdzono tętniaki, są zaznaczone na czerwono. Natomiast hamowanie oksydazy lizylowej za pomocą BAPN nie miało znaczącego wpływu na średnią zstępującą klatkę piersiową, ani też leczenie to nie wpłynęło na średnicę aorty brzusznej.Tętniak zdefiniowano jako 1,5 raza większą od średniej średnicy grupy nieleczonej. Leczenie prowadzi do znacznego wzrostu tętniaków według tej definicji. Tętniaki u myszy leczonych BAPN zidentyfikowano wyłącznie w aorcie, przy czym większość zidentyfikowano w aorcie piersiowej.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obfitować naczynia krwionośne do obrazowania radiologicznego. Po opanowaniu, obfitość i analizę obrazu można wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że protokoły obrazowania CT można dostosować z pomocą personelu radiologicznego w celu optymalizacji akwizycji obrazu dla określonych celów poszczególnych eksperymentów.

quantitative-micro-ct-analysis-aortopathy-mouse-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisujemy procedury ilościowego określania i charakteryzowania zmian miażdżycowych w modelach mysich, wykorzystując precyzyjne przekroje zatoki aortalnej aorty i aorty wstępującej w połączeniu z analizą histochemiczną i immunohistochemiczną.

Analiza ilościowa i charakterystyka zmian miażdżycowych w mysiej zatoce aortalnej

Obrazowanie ultradźwiękowe stało się powszechną metodą określania wymiarów światła tętniaków aorty piersiowej i brzusznej u myszy. Protokół ten opisuje procedurę uzyskiwania wiarygodnych i powtarzalnych dwuwymiarowych obrazów ultrasonograficznych aorty wstępującej i brzusznej u myszy.

Obrazowanie ultrasonograficzne aorty piersiowej i brzusznej u myszy w celu określenia wymiarów tętniaka

Mysie modele miażdżycy są użytecznymi narzędziami do badania szlaków patogennych na poziomie molekularnym, ale wymagają standaryzowanej kwantyfikacji rozwoju zmian. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę określania wielkości zmiany w głównych naczyniach tętniczych, w tym w korzeniu aorty, łuku aortalnym i tętnicy ramienno-głowowej.

Kwantyfikacja miażdżycy u myszy

Opisujemy protokół chirurgiczny mający na celu konsekwentne wywoływanie silnych tętniaków aorty piersiowej u myszy. Zabieg polega na tym, że torakotomia lewa strona, odsłonięcie aorty piersiowej i umieszczenie gąbki nasączonej elastazą trzustkową świni na ścianie aorty.

Mysi model chirurgiczny miejscowego tętniaka aorty piersiowej wywołanego elastazą

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół korzystania z obrazowania ultradźwiękowego o wysokiej częstotliwości do pomiaru średnicy światła, prędkości propagacji impulsów, rozciągliwości i odkształcenia promieniowego na mysim modelu tętniaka aorty brzusznej.

Pomiar prędkości, rozciągliwości i odkształcenia impulsu w mysim modelu tętniaka aorty brzusznej

Obecny protokół opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgiczną dla modelu AAA wywołanego elastazą poprzez bezpośrednie zastosowanie elastazy do przydanki podnerkowej aorty brzusznej u myszy.

Mysi model tętniaka aorty brzusznej indukowany przez okołonaczyniowe zastosowanie elastazy

Ten protokół opisuje mysi model tętniaka aorty brzusznej (AAA) wywołanego fosforanem wapnia w celu zbadania cech patologicznych i mechanizmów molekularnych AAA.

Model tętniaka aorty brzusznej myszy wywołany fosforanem wapnia

Ten manuskrypt przedstawia protokół tworzenia mysiego modelu tętniaka aorty brzusznej myszy przy użyciu chlorku wapnia i elastazy, łącząc zalety poprzednich metod modelowania. Model ten można wykorzystać do badania mechanizmów patofizjologicznych leżących u podstaw tętniaków aorty brzusznej.

Mysi model tętniaka aorty brzusznej za pomocą okołoprzybytkowego nacieku chlorku wapnia i elastazy

Ten protokół opisuje metodyczne podejście chirurgiczne do modelowania zaawansowanych tętniaków aorty brzusznej u myszy poprzez kombinację bezpośredniego stosowania elastazy do aorty podnerkowej i podawania ß-aminopropionitrylu przez wodę pitną.

Zaawansowane modelowanie tętniaka aorty brzusznej u myszy poprzez połączenie miejscowej elastazy i doustnego ß-aminopropionitrylu

Protokół ten zapewnia szczegółową, krok po kroku procedurę indukcji rozwarstwienia aorty piersiowej u myszy. W szczególności obejmuje dokładne obliczenie wymaganych dawek β-aminopropionitrylu i angiotensyny II, procedurę napełniania pompy osmotycznej oraz technikę implantacji pompy osmotycznej.

Mysi model rozwarstwienia aorty piersiowej wywołanego doustną infuzją β-aminopropionitrylu i podskórnej angiotensyny II

Ten protokół zapewnia powtarzalną i niezawodną metodę wywoływania tętniaków tętnicy brzusznej (TTB) u myszy C57BL/6 przy użyciu uczulenia elastyny i przynaczynowego stosowania elastazy, jako model TTB, który obejmuje komponent uczulenia immunologicznego.

Wiarygodne stworzenie modelu tętniaka tętnicy brzusznej u myszy przy użyciu uczulenia na elastynę i peryvaskularnej elastazy

Naucz się ilościowej analizy aortapatii metodą mikro-CT w mysim modelu tętniaka aorty wywołanego β-aminopropionitrylem. Technika ta umożliwia precyzyjne obrazowanie naczyń krwionośnych i kwantyfikację zmian w biologii naczyniowej.

Ilościowa analiza aortapatii metodą mikro-CT w mysim modelu tętniaka i rozwarstwienia aorty wywołanego β-aminopropionitrylem

Przeglądaj więcej filmów