Ilościowa analiza aortapatii metodą mikro-CT w mysim modelu tętniaka i rozwarstwienia aorty wywołanego β-aminopropionitrylem

Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii naczyniowej, takie jak określenie, w jaki sposób rozmiar naczynia wpływa na różne zwierzęce modele chorób naczyniowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że mikrotomografia komputerowa umożliwia szczegółowe obrazy zarówno dużych, jak i małych naczyń, zarówno in vivo, jak i ex vivo, które można precyzyjnie określić ilościowo. 24 godziny przed analizą CT należy wykonać zabiegi chirurgiczne w celu przygotowania próbki do pośmiertnej obfitości wewnątrzsercowej.

Do znieczulenia użyj 3% izofluranu i upewnij się, że masz w użyciu pochłaniacz węgla drzewnego. Następnie utrzymuj znieczulenie za pomocą dwóch do 2,5 procent izofluranu z maski na twarz, również przymocowanej do zmiatacza z jednym litrem tlenu na minutę. Przed rozpoczęciem operacji wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby sprawdzić, czy nie ma odruchu pedałowania.

Następnie skonfiguruj pole operacyjne z instrumentami i tak dalej. Następnie ustaw zwierzę w pozycji leżącej grzbietowej i zabezpiecz kończyny. Teraz za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie w linii środkowej przez skórę i tkankę miękką nad mostkiem między spojeniem łonowym a wcięciem mostka.

Następnie użyj nożyczek, aby utworzyć otwór w przeponie w wyrostku mieczykowatym, aby wejść do jamy klatki piersiowej. Następnie kontynuuj używanie nożyczek do obustronnego wypreparowania przepony brzusznej ściany klatki piersiowej. Przeciąć chrząstki żebrowe, aby oddzielić żebra od mostka na prawej granicy mostka.

Teraz przyłóż cienki zacisk hemostatyczny do czubka mostka w pobliżu wyrostka mieczykowatego i przesuń hemostat czaszkowo tak, aby znajdował się nad głową myszy. Następnie ostro przeanalizuj wszelkie przyczepy między sercem a ścianą klatki piersiowej. Należy ograniczyć liczbę naczyń uszkodzonych podczas przygotowywania zwierząt, ponieważ spowoduje to wyciek środka kontrastowego z odciętych naczyń, co zmieni objętość wymaganą do całkowitego wypełnienia i wprowadzi artefakty do końcowego obrazowania.

Teraz podłącz igłę do cewnika dożylnego o rozmiarze 27 do strzykawki wstępnie załadowanej 10 mililitrami heparynizowanego PBS i napełnij wszystkie rurki buforem, usuwając wszystkie pęcherzyki powietrza. Niezbędne jest usunięcie wszystkich pęcherzyków z linii. Następnie natychmiast naciąć prawą komorę lub żyłę główną dolną, aby odsączyć roztwór heparyny i krew.

Aby kontynuować, użyj kaniuli do nakłucia lewej komory, stabilizowanej przez zacisk. Przeprowadzaj obfitowanie ze stałą prędkością dwóch mililitrów na minutę za pomocą pompy strzykawkowej. Powinno być widoczne blednięcie narządów.

W ciągu kilku minut krążenie żyły powinno być wolne od krwi. Następnie należy zatrzymać pompę i odłączyć rurkę cewnika od strzykawki, ale nie przesuwać igły cewnika. Teraz rozdziel roztwór środka kontrastowego na pięć mililitrowych porcji, dodaj utwardzacz i dobrze wymieszaj.

Następnie załaduj pięć mililitrów mieszaniny do 10-mililitrowej strzykawki i oblej zwierzę środkiem kontrastowym w stałym tempie dwóch mililitrów na minutę. Utrzymuj napar po osiągnięciu momentu, w którym zobaczysz, jak czynnik odlewniczy opuszcza zwierzę. Środek kontrastowy utwardzi się w ciągu 20 minut.

Po wysuszeniu zbierz interesujące Cię narządy i utrwal je w 10% neutralnej buforowanej formalinie. Następnie, jeśli próbki nie są używane do skanowania mikro-CT, należy przymocować całą tuszę. W przeciwnym razie ułóż tuszę na metalowej tacy i umieść ją w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby utwardziła się przez noc.

Następnego dnia uzyskaj zdjęcia rentgenowskie tomografii komputerowej każdej myszy za pomocą skanera mikro-CT. Ustaw parametry skanera w następujący sposób; Szczytowe napięcie lampy rentgenowskiej wynosi 55 kilowoltów, prąd 150 mikroamperów, współczynnik powiększenia systemu 2,19 i współczynnik grupowania pikseli kamery CCD wynosi dwa. Ten współczynnik kategoryzacji da efektywny rozmiar piksela wynoszący 29 mikronów.

Następnie przeanalizuj obrazy, aby zidentyfikować tętniaki przy użyciu standardowego podejścia. Zmierz średnicę osi pomocniczej w najszerszym punkcie z trzech lokalizacji; łuku aorty, zstępującej aorty piersiowej i aorty brzusznej. Idealnie byłoby, gdyby dwóch obserwatorów, z których jeden jest oślepiony, analizowało każdy obraz.

Korzystając z pomiarów, zidentyfikuj tętniaki jako miejscowe lub rozproszone poszerzenia odcinków aorty do średnic większych niż 50% średnicy odniesienia. 20 dorosłych samców myszy o mieszanym pochodzeniu i w wieku od 20 do 30 tygodni analizowano z leczeniem BAPN lub bez niego. Każdy z nich był obficie wypełniony nieprzepuszczającą promieni rentgenowskich gumą silikonową na bazie ołowiu.

Średnia średnica aorty wstępującej u myszy leczonych BAPN była znacznie większa niż u nieleczonych kontrolnych w tym samym wieku. Punkty danych od myszy, u których stwierdzono tętniaki, są zaznaczone na czerwono. Natomiast hamowanie oksydazy lizylowej za pomocą BAPN nie miało znaczącego wpływu na średnią zstępującą klatkę piersiową, ani też leczenie to nie wpłynęło na średnicę aorty brzusznej.

Tętniak zdefiniowano jako 1,5 raza większą od średniej średnicy grupy nieleczonej. Leczenie prowadzi do znacznego wzrostu tętniaków według tej definicji. Tętniaki u myszy leczonych BAPN zidentyfikowano wyłącznie w aorcie, przy czym większość zidentyfikowano w aorcie piersiowej.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obfitować naczynia krwionośne do obrazowania radiologicznego. Po opanowaniu, obfitość i analizę obrazu można wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że protokoły obrazowania CT można dostosować z pomocą personelu radiologicznego w celu optymalizacji akwizycji obrazu dla określonych celów poszczególnych eksperymentów.