Wysokoprzepustowy generator ekspresji białek wykorzystujący platformę mikroprzepływową

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie modułowej macierzy białek, która nie wymaga etapu oczyszczania, dzięki czemu jest kompatybilna z dowolną biblioteką białek. Osiąga się to poprzez najpierw wygenerowanie syntetycznych genów poprzez montaż PCR. Następnie syntetyczne geny są umieszczane na szkiełkach epoksydowych.

Do wytworzenia urządzenia mikroprzepływowego należy użyć PDMS z silikonowymi formami sterującymi i przepływowymi. Następnie urządzenie mikroprzepływowe jest ustawiane w jednej linii z nastrzeżoną matrycą DNA. Na koniec lizat retikulocytów królika jest przepływany do urządzenia mikroprzepływowego i dochodzi do ekspresji białek.

Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują ekspresję tysięcy białek poprzez fluorescencyjne znakowanie przeciwciałami. Stosowanie techniki opartej na mikroprzepływach ma kilka zalet w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikromacierze białkowe. Mikromateryzujemy DNA, a następnie używamy komórek do wytwarzania białek na urządzeniu.

Dzięki temu nie wymagamy oczyszczania białek, a białka nigdy nie wysychają. Pozostają świeże przez cały czas trwania eksperymentu. Technika mikroprzepływowa zapewnia również wyższą czułość Aby wytworzyć urządzenie mikroprzepływowe, wystaw silikonowe formy sterujące i przepływowe na działanie oparów chlorotrimetylosilenu przez 10 minut, aby przyspieszyć uwalnianie elastomeru.

Po etapach pieczenia przygotuj mieszaninę elastomeru na bazie silikonu i utwardzacza w dwóch różnych proporcjach pięć do jednego i 20 do jednego odpowiednio dla form kontrolnych i przepływowych. Wlej pięć do jednego PDMS na warstwę kontrolną. Odgazuj warstwę kontrolną i piecz przez 30 minut w temperaturze 80 stopni Celsjusza.

Następnie odwiruj mieszaninę 20 do jednego PDMS na warstwie przepływowej z prędkością 2 600 obr./min przez 60 sekund, a następnie piecz ją w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 30 minut. Powoli oddziel warstwę kontrolną od formy, uważając, aby nie odkleić wzoru SU ósemki. Następnie za pomocą skalpela przetnij urządzenie na jego obwodzie i igłą wybij otwory, aby uzyskać dostęp do kanałów kontrolnych pod mikroskopem.

Ręcznie wyrównaj warstwy przepływu i sterowania, zaczynając od lewego górnego rogu i umieszczając zawór przyciskowy na warstwie kontrolnej pośrodku komory reakcyjnej. Następnie wyrównaj pierwszy rząd i delikatnie zwolnij warstwę kontrolną rząd po rzędzie. Upewnij się, że wszystkie zawory guzikowe znajdują się pośrodku komór reakcyjnych i że zawory adresowe i wejściowe przecinają kanały przepływowe we właściwej pozycji.

Powtarzaj ten proces lokalnie, aż wszystkie wiersze zostaną wyrównane. Po całkowitym wyrównaniu zwolnij wszelkie naprężenia w PDMS, ostrożnie podnosząc go z boków i rogów. Następnie po upieczeniu piecz urządzenie przez dwie godziny w temperaturze 80 stopni Celsjusza.

Wytnij na obwodzie i oderwij dwuwarstwowe urządzenie od otworów w formie przepływowej, aby uzyskać dostęp do kanałów przepływowych w celu wygenerowania konstruktów DNA dla urządzenia. Przeprowadź PCR w celu wytworzenia syntetycznych genów składających się z promotora T siódemki, miejsca wiązania rybosomów, otwartej ramki odczytu z różnymi znacznikami epitopów na obu końcach i terminatora T siódemki. Aby przygotować syntetyczne geny do układu, wykonaj mieszaninę glikolu polietylenowego i dihydratu triozy D Dozuj dwa mikrolitry na reakcję do studzienek 384.

Talerz studni. Dodaj syntetyczne geny do płytki 384-dołkowej. Następnie dodaj wodę destylowaną do końcowej objętości 20 mikrolitrów.

Następnie, za pomocą plamki mikromacierzy, serię syntetycznych genów na podłożach szklanych pokrytych żywicą epoksydową. Pod stereoskopem ręcznie wyrównaj urządzenie mikroprzepływowe do macierzy genów z plamką DNA umieszczoną pośrodku komór DNA. Następnie wyrównaj pozostałe rzędy.

Na koniec dostrajamy całe urządzenie, aby złagodzić wszelkie obciążenia PDMS i zapewnić jego dobre połączenie z mikromacierzą. Podnieś go lokalnie. Na koniec przymocuj urządzenie do szkiełka podstawowego, inkubując je przez noc na gorącej płycie w temperaturze 80 stopni Celsjusza.

Barwniki spożywcze są używane w tej sekcji do celów wizualizacji. Zawory w warstwie sterującej są uruchamiane z komputera za pomocą widoku laboratoryjnego. Skrypt widoku laboratoryjnego steruje szeregiem mikrozaworów elektromagnetycznych za pośrednictwem elektronicznej skrzynki sterowniczej.

Wyspa zaworów elektromagnetycznych jest podłączona do sprężonego powietrza, które steruje przepływem powietrza i ciśnieniem do zaworów regulacyjnych na urządzeniu. Za pomocą elastycznej rurki z tworzywa sztucznego o średnicy wewnętrznej 0,02 cala i trzpienia ze stali nierdzewnej podłącz urządzenie do kolektora zaworów elektromagnetycznych. Napełnij rurki podwójnie destylowaną wodą i włóż kołek do otworów dostępowych warstwy kontrolnej.

Upewnij się, że każda rura jest podłączona do odpowiedniego kanału sterującego. Aby aktywować kanały sterujące, uruchom aplikację lab view, ustaw ciśnienie powietrza na pięć PS. Następnie wywieram ciśnienie powietrza, aktywując zawór z poziomu skryptu widoku laboratorium. Spowoduje to wepchnięcie wody do kanałów sterujących PDMS w celu zidentyfikowania potencjalnych przesłuchów między kanałami sterującymi uszkodzonych urządzeń.

Najpierw napełnij kanapkę i zawory adresowe. W końcu kanały sterujące i zawory są pełne wody, zalej zawory, aby zablokować kanały przepływowe pod nimi. Najpierw zwiększając ciśnienie powietrza do 15 PSI, a następnie w programie widoku laboratoryjnego poprzez zestaw włączników podłączonych do poszczególnych zaworów elektromagnetycznych.

Aktywuj wszystkie zawory, włączając wszystkie przyciski przełączników, aby upewnić się, że wszystkie zawory są otwarte. Podłącz rurkę do jednego z wejść przepływu, a przy czterech do pięciu PSI wlej powietrze do urządzenia. Spowoduje to uwolnienie wszelkich lepkich zaworów ze szklanego szkiełka.

Urządzenie jest teraz zagruntowane i gotowe do celów wizualizacji. Żółty barwnik spożywczy służy do wizualizacji odczynników w tej sekcji, a bezbarwny roztwór reprezentuje hipisów, aby ułatwić samoorganizację układu białkowego na powierzchni i zapobiec niespecyficznej absorpcji w urządzeniu mikroprzepływowym, chemicznie zmodyfikować powierzchnię, najpierw podłączając nową rurkę z wymaganym roztworem do jednego z kanałów przepływowych w urządzeniu. Następnie podłącz wolną stronę rurki do kolektora ręcznego i otwórz przepływ ciśnienia powietrza.

Załaduj 40 mikrolitrów BSA nasyconego biotyną do nowej probówki i przepływaj około połowy przez urządzenie przez 20 minut. Użyj 50 milimolowych hipisów, aby zmyć niereaktywny substrat między każdym z etapów. Następnie przepływaj 25 mikrolitrów streptawidyny przez 20 minut.

Na wierzchu podsyconego biotyną BSA myj hees przez pięć minut, aby zjeść powierzchnię otaczającą przycisk, zamknij zawór guzikowy i przelej resztę biotynylowanego BSA, a następnie ponownie myj groszkiem przez pięć minut. Na koniec, aby utworzyć tablicę znaczników zapobiegających syczeniu pod przyciskiem, zwolnij zawór przycisku i przepływaj 30 mikrolitrów biotyny Penta przez 20 minut, aby utworzyć tablicę białek na urządzeniu. Otwórz zawory szyjki i przelej retikulocyt królika.

Szybko sprzężony roztwór reakcji transkrypcji i translacji przez urządzenie do komory DNA. Następnie zamknij zawory wielowarstwowe, aby oddzielić każdy gen od jego otoczenia i inkubuj urządzenie na gorącej płycie przez 2,5 godziny w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnie znakuj koniec końcowy białek przeciwciałem C mix SI 3.

Na koniec za pomocą skanera mikromatrycowego z laserem o długości 532 nanometrów i filtrem emisyjnym o długości fali 575 nanometrów. Określ poziom białka. Ten rysunek pokazuje różne poziomy ekspresji białka w macierzy białkowej.

Zwykle 20% biblioteki genów nie ulega ekspresji do wykrywalnych poziomów. Poziomy tła określono za pomocą komór, które nie były naznaczone DNA. W związku z tym sygnały z odpowiednich komór białkowych są spowodowane albo szumem, albo niespecyficzną absorpcją przeciwciał znakujących.

Jeśli zostanie przeprowadzony poprawnie, weryfikacja urządzenia trwa cztery godziny, a eksperyment z chipem trwa pięć godzin.