Name: Wysokoprzepustowy generator ekspresji białek wykorzystujący platformę mikroprzepływową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Poznaj metodę ekspresji białek w mikroprzepływowym urządzeniu PDMS bez etapu oczyszczania. Technika umożliwia szybkie tworzenie modułowych mikromacierzy białkowych z bibliotekami genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została sfinansowana z międzynarodowego grantu reintegracyjnego programu Marie Curie.

1. Wytwarzanie urządzenia
<ol>
 <li>Należy zakupić formę kontrolną DTPA-D SU-8 oraz formę przepływową SPR220-7 z Stanford Microfluidics Foundry (<a href="http://www.stanford.edu/group/foundry" target="_blank">www.stanford.edu/group/foundry</a>).</li>
 <li>Formy silikonowe należy poddać działaniu oparów chlorotrimetylosilanu (TMCS) przez 10 min, aby ułatwić oddzielenie elastomeru po etapach wygrzewania9. </li>
 <li>Należy przygotować mieszaninę elastomeru na bazie silikonu i utwardzacza (dokładnie wymieszać) w dwóch różnych proporcjach: 5:1 dla formy kontrolnej oraz 20:1 dla formy przepływowej. Różne proporcje są niezbędne do prawidłowego wiązania wielu warstw. </li>
 <li>PDMS w proporcji 5:1 należy wlać na warstwę kontrolną (wysokość około 5 mm). Warstwę kontrolną należy odgazować, a następnie wygrzewać przez 30 min w temperaturze 80 °C. Mieszaninę PDMS w proporcji 20:1 należy nanieść metodą spin coatingu (Laurell, USA) na warstwę przepływową przy prędkości 2,600 rpm przez 60 sec, a następnie wygrzewać w temperaturze 80 °C przez 30 min. Prędkość wirówki została zoptymalizowana pod kątem aktywacji zaworu przy ciśnieniu 15 psi. Szybsze wirowanie spowoduje uzyskanie cieńszej warstwy z niższym ciśnieniem aktywacji i na odwrót. Stosowane przez nas urządzenia mają limit 25 psi w kanale kontrolnym i 10 psi w kanale przepływowym, powyżej których może dojść do odklejenia od podłoża. </li>
 <li>Należy oddzielić warstwę kontrolną od formy. Czynność tę należy wykonywać powoli, uważając, aby nie oderwać wzoru SU8. Następnie należy wyciąć urządzenie wzdłuż jego obwodu i wykonać otwory umożliwiające dostęp do kanałów kontrolnych.</li>
 <li>Warstwy przepływową i kontrolną należy wyrównać ręcznie pod stereomikroskopem. Należy zacząć od wyrównania górnego lewego rogu; zawór przyciskowy (warstwa kontrolna) musi znajdować się w środku komory reakcyjnej (warstwa przepływowa). Następnie należy wyrównać pierwszy rząd i delikatnie zwolnić warstwę kontrolną rząd po rzędzie. Należy upewnić się, że wszystkie zawory przyciskowe znajdują się w środku komór reakcyjnych, a zawory adresujące i wlotowe przecinają kanały przepływowe w odpowiednich miejscach. Proces ten można powtarzać lokalnie, aż wszystkie rzędy zostaną wyrównane. Na koniec należy zniwelować wszelkie napięcia w PDMS, ostrożnie podnosząc go od boków i narożników. Nie należy podnosić go zbyt wysoko, aby nie doprowadzić do rozregulowania. </li>
 <li>Urządzenie należy wygrzewać przez 2 hr w temperaturze 80 °C.</li>
 <li>Należy wyciąć urządzenie wzdłuż jego obwodu i oddzielić dwuwarstwowy układ (chip) od formy przepływowej. Następnie należy wykonać otwory umożliwiające dostęp do kanałów przepływowych (Rysunek 1). </li>
</ol>
2. Tworzenie matrycy DNA i wyrównanie urządzenia
<ol>
 <li>Przygotuj syntetyczne geny za pomocą PCR montażowego. Syntetyczne geny składają się z promotora T7, miejsca wiązania rybosomów (RBS), ORF z dwoma znacznikami epitopowymi (po jednym na każdym końcu) oraz terminatora T7 4. Długość genów może wynosić od 100 bp do co najmniej 5 000 bp.</li>
 <li>Przygotuj syntetyczne geny do rozmieszczenia w matrycy: sporządź mieszaninę glikolu polietylenowego (1,25%) i trehalozy dwuwodnej (125 mg/ml) i odmierz 2 μl na reakcję do płytki 384-dołkowej. Roztwór ten ograniczy nieodwrącalne wiązanie DNA do szkła oraz ułatwi wizualizację podczas wyrównywania 10. </li>
 <li>Przenieś syntetyczne geny do płytki 384-dołkowej. Zazwyczaj stężenia DNA mogą wynosić od 10 ng/μl do 100 ng/μl stężenia końcowego. Dodaj dH2O do końcowej objętości 20 μl (zależnie od mikroarrayera i rodzaju pinów). </li>
 <li>Nanieś serię syntetycznych genów na szklane podłoża powlekane epoksydem za pomocą mikroarrayera. Używamy urządzenia MicroGrid 610 (Bio Robotics) z silikonowymi pinami SMT-S75 (Parallel Synthesis, USA). Drukowanie kontaktowe DNA przy użyciu tych konkretnych pinów pozwala uzyskać plamki o średnicy około 100 μm na powierzchni szkła. Pojemność każdego pinu jest wystarczająca na około 100 plamek. Upewnij się, że skok kolumn i rzędów odpowiada konkretnemu używanemu urządzeniu. Urządzenie, którego używamy, posiada 16 kolumn i 40 rzędów o skoku odpowiednio 680 μm na 320 μm. </li>
 <li>Ręcznie wyrównaj urządzenie mikrofluidyczne względem matrycy genowej pod stereomikroskopem. Plamka DNA powinna znajdować się w środku komór DNA. Rozpocznij wyrównywanie od zlokalizowania pierwszego rzędu plamek poniżej pierwszego rzędu komór DNA. Następnie ustaw w linii pozostałe rzędy, kończąc precyzyjnym dostrojeniem całego urządzenia. Po wyrównaniu matrycy należy zadbać o zniwelowanie wszelkich naprężeń w PDMS poprzez jego lokalne uniesienie. Jeśli w PDMS pozostanie naprężenie, może on nie połączyć się prawidłowo z mikroarrayem. </li>
 <li>Na koniec przytwierdź urządzenie do szkiełka przedmiotowego poprzez inkubację przez noc na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C. </li>
</ol>
3. Przygotowanie i aktywacja urządzenia
<ol>
 <li>Zawory w warstwie sterującej są uruchamiane z komputera za pomocą programu LabVIEW. Skrypt LabVIEW steruje serią mikrozaworów elektromagnetycznych poprzez elektroniczną skrzynkę sterującą (zakupioną w Stanford Microfluidics Foundry). Kolektor zaworów elektromagnetycznych jest podłączony do sprężonego powietrza, które kontroluje przepływ i ciśnienie powietrza w zaworach sterujących urządzenia.</li>
 <li>Podłącz urządzenie do kolektora zaworów elektromagnetycznych, używając elastycznych rurek plastikowych o średnicy wewnętrznej 0.02" (Tygon) oraz stalowych pinów (New England Small Tubes Corporation).</li>
 <li>Wypełnij rurki wodą DDW i włóż piny do otworów dostępowych warstwy sterującej. Upewnij się, że każda rurka jest podłączona do odpowiadającego jej kanału sterującego.</li>
 <li>Uruchom aplikację LabVIEW na komputerze, aby aktywować kanały sterujące. Poprzez aktywację zaworu ze skryptu LabVIEW przyłożone zostaje ciśnienie powietrza, które z kolei wtłoczy wodę do kanałów sterujących PDMS. Ustaw ciśnienie powietrza na 5 psi. Zaleca się najpierw wypełnienie tzw. „kanapki” (sandwich) i zaworów adresowych, aby zidentyfikować zakłócenia (cross-talks) między kanałami sterującymi w wadliwych urządzeniach. W przypadku wystąpienia zakłóceń, aktywacja linii sterującej „kanapki” doprowadzi do aktywacji linii sterujących szyjki (neck) lub przycisku (button). Jest to analogiczne do zwarcia w obwodzie elektrycznym. Urządzenie z zakłóceniami jest wadliwe i nie może być użyte.</li>
 <li>Po wypełnieniu wszystkich kanałów sterujących i zaworów wodą DDW, zawory są przygotowane i gotowe do blokowania kanałów przepływowych znajdujących się pod nimi. Zwiększ ciśnienie powietrza do 15 psi. Aktywacja zaworów jest sterowana z programu LabVIEW poprzez zestaw przełączników włącz/wyłącz podłączonych do poszczególnych zaworów elektromagnetycznych. Każdy przełącznik steruje konkretną linią sterującą poprzez odpowiadający jej zawór elektromagnetyczny. Włączenie przycisku przełącznika (w skrypcie) spowoduje przyłożenie ciśnienia powietrza w odpowiedniej rurce. Ciśnienie powietrza przesunie wodę DDW w linii sterującej, co spowoduje rozszerzenie zaworów mikrofluidycznych i zablokowanie kanału pod nimi. Wyłączenie zaworu sterującego zwolni ciśnienie powietrza, a w konsekwencji odblokuje odpowiedni kanał przepływowy.</li>
 <li>Aby upewnić się, że wszystkie zawory są otwarte, podłącz rurkę do jednego z wlotów przepływowych i wprowadź powietrze do urządzenia pod ciśnieniem 4-5 psi. Pozwoli to odkleić ewentualne przylegające zawory od szkiełka przedmiotowego.</li>
 <li>W końcowym etapie urządzenie jest przygotowane i gotowe. Zamknij wszystkie zawory wlotowe oraz zawory „szyjki”, aby rozpocząć chemię powierzchniową.</li>
</ol>
4. Chemia powierzchni
<ol>
 <li>W celu ułatwienia samoorganizacji macierzy białkowej na powierzchni oraz zapobiegania niespecyficznej adsorpcji wewnątrz urządzenia mikrofluidycznego, powierzchnię modyfikuje się chemicznie: </li>
 <li>Aby wprowadzić składnik do urządzenia, należy podłączyć nową probówkę z wymaganym roztworem do jednego z kanałów przepływowych w urządzeniu. Wolny koniec probówki należy podłączyć do manifoldu ręcznego i otworzyć przepływ ciśnienia powietrza (5 psi). </li>
 <li>Należy nanieść 40 μl biotynylowanego BSA (1 μg/μl) do nowej probówki i przeprowadzić przepływ około połowy tej objętości przez 20 min przez urządzenie; BSA zwiąże się z powierzchnią epoksydową. </li>
 <li>Do wypłukiwania niezwiązanego substratu pomiędzy poszczególnymi etapami modyfikacji chemicznej powierzchni należy stosować bufor Hepes (50 mM). </li>
 <li>Przepływ 25 μl streptawidyny (0.5 μg/μl) należy prowadzić przez 20 min na warstwę biotynylowanego BSA.</li>
 <li>Wypłukać buforem Hepes przez 5 min. </li>
 <li>Zamknąć zawór „button” i wprowadzić pozostałą część biotynylowanego BSA (zgodnie z opisem powyżej), aby spasywować powierzchnię wokół przycisku. </li>
 <li>Wypłukać buforem Hepes przez 5 min. </li>
 <li>Otworzyć zawór „button” i przeprowadzić przepływ 30 μl penta-His-biotyny (0.16 μg/μl) przez 20 min. Przeciwciało zwiąże się z odsłoniętą streptawidyną, konkretnie w obszarze pod „buttonem”, tworząc macierz anty-His-tag. </li>
</ol>
5. Ekspresja białka
<ol>
 <li>Exprymuj białka na urządzeniu, wykorzystując szybką, sprzężoną reakcję transkrypcji i translacji z retikulocytów królika. Ekspresja białek z naniesionych na urządzenie syntetycznych genów tworzy matrycę białek gotowych do użycia. Przykładem takiego zastosowania jest screening wiązania białek.</li>
 <li>Otwórz zawory „szyjki” (neck) i przepuść szybką, sprzężoną reakcję transkrypcji i translacji z retikulocytów królika przez urządzenie do komory DNA. Następnie zamknij zawory „kanapkowe” (sandwich), aby odizolować każdy gen od jego otoczenia. Inkubuj urządzenie na płycie grzejnej przez 2,5 hr w temperaturze 30 °C. Wyexprymowane białka będą spontanicznie dyfundować z komory DNA do komory reakcyjnej (zawór szyjki jest otwarty) i wiązać się z przeciwciałem anty-His pod zaworem „przycisku” (button), co unieruchomi białko za pomocą znacznika C-końca.</li>
 <li>Oznakuj białka przeciwciałem C-myc Cy3. Przeciwciało zwiąże się z odpowiadającym mu epitopem znajdującym się na N-końcu białka.</li>
 <li>Wyznacz poziomy ekspresji białek za pomocą skanera mikromacierzy (LS Reloaded, Tecan), używając lasera 532 nm i filtra emisji 575 nm.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
1. Wykonanie urządzenia
Projekt graficzny urządzenia został stworzony w programie AutoCAD na podstawie naszych potrzeb eksperymentalnych. Projekt został wydrukowany na folii przezroczystej za pomocą wysokorozdzielczego rasteryzatora. Przezroczystość ta służy jako fotomaska w fotolitografii kontaktowej. Do stworzenia trójwymiarowych szablonów na waflu krzemowym, zgodnie ze wzorami naniesionymi na użyte maski, zastosowano technikę mikrobobierania powierzchniowego.
Urządzenie mikroprzepływowe zostało wykonane metodą odlewania elastomeru silikonowego polidimetylosiloksanu (PDMS, SYLGARD 184, Dow Corning, USA) na formie silikonowej (Rysunek 1). Każde urządzenie składa się z dwóch wyrównanych warstw PDMS: warstwy przepływowej oraz warstwy sterującej. Formę poddano najpierw działaniu oparów chlorotrimetylosilanu (TMCS, Aldrich) przez 10 min, aby ułatwić oddzielenie elastomeru po etapach wygrzewania. Mieszaninę elastomeru silikonowego i utwardzacza przygotowano w dwóch różnych proporcjach: 5:1 dla formy warstwy sterującej i 20:1 dla formy warstwy przepływowej. Warstwę sterującą odgazowano i wygrzewano przez 30 min w temperaturze 80 °C. Warstwę przepływową początkowo naniesiono metodą spin-coatingu (Laurell, USA) przy 2 600 rpm przez 60 s, a następnie wygrzewano w 80 °C przez 30 min. Warstwę sterującą oddzielono od formy i wykonano otwory dostępu do kanałów sterujących. Następnie warstwę przepływową i sterującą wyrównano ręcznie pod stereomikroskopem i wygrzewano przez 2 h w 80 °C. Dwuwarstwowe urządzenie oddzielono od formy przepływowej i wykonano otwory dostępu do kanałów przepływowych.
2. Opis urządzenia
Pojemność urządzenia może wynosić od 500 do 10 000 komórek jednostkowych (Rycyna 2). Urządzenie składa się z dwóch warstw: warstwy przepływowej (szarej) oraz warstwy sterującej (kolorowej). Warstwa sterująca zawiera szereg zaworów o różnych funkcjach. Każda komórka jednostkowa w warstwie przepływowej składa się z jednej komory DNA i jednej komory reakcyjnej; jest ona kontrolowana przez trzy typy mikromechanicznych zaworów: „neck” (szyjkowy), „button” (przyciskowy) oraz „sandwich” (kanapkowy) (Rycina 2A). Naniesiony „gen syntetyczny” wewnątrz komory DNA jest oddzielony od komory reakcyjnej za pomocą zaworu „neck” (zielony). Chwytanie i mechaniczne płukanie białek związanych z powierzchnią w komorze reakcyjnej odbywa się za pomocą zaworu „button” (niebieski). Zawór „sandwich” umożliwia przeprowadzenie każdej reakcji w oddzielnej komórce jednostkowej (czerwony). Zawory adresowe pozwalają podzielić urządzenie na maksymalnie 8 niezależnych sekcji, co umożliwia analizę różnych warunków. Dodatkowo warstwa sterująca zawiera zawory wlotowe, które umożliwiają przepływ wybranych cieczy do warstwy przepływowej. Kanały sterujące z PDMS są wypełnione DDW. Po aktywacji zaworu wzrost ciśnienia (15 psi) powoduje rozszerzenie PDMS. W miejscach, gdzie membrana jest wystarczająco cienka (np. na przecięciu linii sterującej i przepływowej), jest to wystarczające do całkowitego zablokowania linii przepływu. Średnia wysokość komórki jednostkowej wynosi 10 μm, a średnia objętość komórki jednostkowej jest mniejsza niż 1 nl.
3. Ekspresja i detekcja białek
Białka wyekspresjonowano w urządzeniu z wykorzystaniem szybkiego sprzężonego układu transkrypcji i translacji z retikulocytów królika (Promega). Ekspresja białek pozwoliła na stworzenie macierzy białek gotowych do użycia w badaniu wiązania (Rysunek 3). Mieszaninę do ekspresji (12,5 μl) wprowadzono do urządzenia, a następnie wpuszczono do komór z DNA poprzez otwarcie zaworów „szyjnych”. Następnie zamknięto zawory „kanapkowe”, oddzielając każdą komórkę jednostkową od komórek sąsiednich, i inkubowano urządzenie na płycie grzejnej przez 2,5 h w temperaturze 30 °C. Wyekspresjonowane białka dyfundowały z komory genów do komory reakcyjnej, gdzie ich znacznik His na C-końcu mógł związać się z przeciwciałem anty-His (Qiagen) zlokalizowanym pod zaworem „przyciskowym”, co doprowadziło do unieruchomienia białka na powierzchni. Białka znakowano C-myc Cy3 (Sigma), który wiązał się z odpowiadającym mu epitopem znajdującym się na N-końcu białka i znakował go. Poziomy ekspresji białek określono za pomocą skanera mikrotablic (LS Reloaded, Tecan), używając lasera 532 nm i filtra 575 nm. Powstała macierz białek składa się z różnych poziomów ekspresji białek. Zazwyczaj około 20% biblioteki genów nie wykazuje ekspresji na poziomach wykrywalnych. Nie zaobserwowano korelacji z wielkością białka 3. Poziomy tła określono przy użyciu komór, w których nie naniesiono DNA. Zatem sygnały z odpowiadających im komór białkowych wynikają albo z szumu, albo z nieswoistej adsorpcji przeciwciał znakujących.
<img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig1.jpg" alt="Schemat procesu równowagi statycznej z zabiegiem TMCS; pokazuje wpływ temperatury na obróbkę powierzchniową." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Fabrykacja chipa. (A) Formy poddano działaniu oparów TMCS przez 10 min. (B) PDMS został odlany na kontrolnych i przepływowych formach krzemowych. (C) Zarówno formy kontrolne, jak i przepływowe, wypiekano w 80 °C przez 30 min. (D) Warstwę kontrolną oddzielono od formy, docięto do odpowiedniego rozmiaru i wykonano otwory wlotowe dla kontroli. (E) Warstwę kontrolną wyrównano względem warstwy przepływowej pod stereomikroskopem, a następnie wypiekano w 80 °C przez 2 hr. Równolegle do fabrykacji urządzenia z PDMS, szereg syntetycznych genów naniesiono metodą mikroarray na szklane podłoża pokryte epoksydem (CEL Associates). (F) Następnie urządzenie wyrównano względem mikroarray DNA, zamykając „syntetyczne geny” w komorach DNA.
<img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig2.jpg" alt="Schemat mikrofluidyki lab-on-chip; komora reakcji DNA, sterowanie zaworami, konfiguracja nanoszenia genów." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Zdjęcie urządzenia PING. (A) Urządzenie składa się z dwóch wyrównanych warstw PDMS (kontrolnej i przepływowej). Warstwa przepływowa zawiera równoległe komory DNA i komory reakcyjne (szare), sterowane za pomocą zaworów mikromechanicznych (typu „button”, „sandwich” i „neck”) znajdujących się w warstwie kontrolnej. (B) Warstwy są wyrównane względem wydrukowanego mikrociałcza, co pozwala na zaprogramowanie każdej komory DNA za pomocą pojedynczego punktu. Eliminuje to wszelkie potencjalne zanieczyszczenia.
<img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig3.jpg" alt="Schemat mikromacierzy DNA, ilustrujący transkrypcję i translację z detekcją białek za pomocą fluorescencji." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Obrazy fluorescencyjne macierzy białek stworzonej za pomocą chipa mikrofluidycznego. Naniesione geny w plamkach zostały wyekspresowane do postaci białek wewnątrz urządzenia (w komorze DNA) i zostały przyciągnięte do powierzchni (poniżej zaworu typu „przycisk” w komorze reakcyjnej) za pomocą znaczników His na koniec C. Ekspresję białek wykryto za pomocą znaczników C-myc na koniec N oraz specyficznego przeciwciała fluorescencyjnego. Różne natężenia sygnału wskazują na różne poziomy ekspresji białek. Komory bez naniesionych genów służyły jako kontrole poziomu tła.

<ol><li>Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+column%3A+Microfluidic+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Integration column: Microfluidic high-throughput screening.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 1, 19-29 (2009).</li>
<li>Hong, J. W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+nanoliter+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrated nanoliter systems.</a> Nature. 21, 1179-1183 (2003).</li>
<li>Unger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Monolithic+Microfabricated+Valves+and+Pumps+by+Multilayer+Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li>
<li>Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+microfluidic+approach+to+generating+protein-interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks.</a> Nature. 6, 71-74 (2009).</li>
<li>Einav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+hepatitis+C+target+and+its+pharmacological+inhibitors+by+microfluidic+affinity+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Discovery of a hepatitis C target and its pharmacological inhibitors by microfluidic affinity analysis.</a> Nature. 26, 1019-1027 (2008).</li>
<li>Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+identification+and+biophysical+characterization+of+transcription-factor+binding+sites+with+microfluidic+affinity+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">De novo identification and biophysical characterization of transcription-factor binding sites with microfluidic affinity analysis.</a> Nature Biotechnology. 28, 962-967 (2010).</li>
<li>Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science (New York, N.Y.). 293, 2101-2105 (2001).</li>
<li>Ramachandran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Self-assembling protein microarrays.</a> Science (New York, N.Y.). 305, 86-90 (2004).</li>
<li>Zhong, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab on a chip. 8, 68-74 (2008).</li>
<li>Kusnezow, W., Hoheisel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+supports+for+microarray+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+recognition+JMR%22%5BJournal%5D)">Solid supports for microarray immunoassays.</a> Journal of molecular recognition JMR. 16, 165-176 (2003).</li>
<li>Lundin, M., Monne, M., Widell, A., Von Heijne, G., Persson, M. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+of+the+membrane-associated+hepatitis+C+virus+protein+NS4B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Topology of the membrane-associated hepatitis C virus protein NS4B.</a> Journal of virology. 77, 5428(2003).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę wysokoprzepustowego generowania macierzy białkowych z wykorzystaniem platformy mikrofluidycznej. Tworzenie macierzy opiera się na drukowaniu matryc DNA w formie mikromacierzy oraz ekspresji białek in vitro z DNA bezpośrednio w urządzeniu mikrofluidycznym.
Nasza nowatorska platforma mikroprzepływowa posiada kilka istotnych zalet w porównaniu z obecnie stosowanymi metodami, co czyni ją obiecującym i uniwersalnym narzędziem dla proteomiki. Jedną z ...

<table><tbody><tr><td>PDMS- SYLGARD 184</td><td>Dow Corning USA</td><td>ESSEX-DC</td><td></td></tr><tr><td>Chlorotrimetylosilan (TMCS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C72854</td><td></td></tr><tr><td>Podłoża szklane powlekane epoksydem</td><td>CEL Associates USA</td><td>VEPO-25C</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy (PEG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>D-trehaloza dwuwodnian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9531</td><td></td></tr><tr><td>Biotynilowana BSA</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>PIR-29130</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidyna</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>31050</td><td></td></tr><tr><td>penta-His-biotyna</td><td>Qiagen</td><td>34440</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td><a href="http://www.bioind.com/htmls/article.aspx?c0=741&amp;amp;bsp=13384" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Biological Industries</a></td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>TNT-T7</td><td>Promega Corp.</td><td>L5540</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało C-myc Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterownik</td><td>Stanford Microfluidics Foundry</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forma</td><td>Stanford Microfluidics Foundry</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pin</td><td>New England Small Tubes Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przewody Tygon microbore</td><td>Tygon</td><td>S-54-HL</td><td></td></tr><tr><td>Microarrayer</td><td>Bio Robotics</td><td>MicroGrid 610</td><td></td></tr><tr><td>Piny silikonowe</td><td>Parallel Synthesis</td><td>SMT-S75</td><td></td></tr></tbody></table>

generator wysokoprzepustowej ekspresji białek z wykorzystaniem platformy mikroprzepływowej

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Szybko rozwijające się dziedziny, takie jak biologia systemowa, wymagają opracowania i wdrożenia nowych technologii umożliwiających wysokoprzepustowe i precyzyjne pomiary dużych układów. Mikrofluidyka obiecuje spełnienie wielu z tych wymagań, takich jak przeprowadzanie wysokoprzepustowych eksperymentów przesiewowych na chipie, obejmujących testy biochemiczne, biofizyczne i komórkowe1. Od początków urządzeń mikrofluidycznych dziedzina ta ewoluowała drastycznie, co doprowadziło do rozwoju mikrofluidycznej integracji wielkoskalowej2,3. Technologia ta pozwala na zintegrowanie tysięcy mikromechanicznych zaworów na jednym urządzeniu o rozmiarach znaczka pocztowego (Rysunek 1). Opracowaliśmy wysokoprzepustową platformę mikrofluidyczną do generowania ekspresji macierzy białkowych in vitro (Rysunek 2) o nazwie PING (Protein Interaction Network Generator). Macierze te mogą służyć jako wzorzec dla wielu eksperymentów, takich jak oddziaływania białko-białko4, białko-RNA5 lub białko-DNA6.
Urządzenie składa się z tysięcy komór reakcyjnych, które są programowane indywidualnie za pomocą mikroarrayera. Dopasowanie tych wydrukowanych mikroarrayów do urządzeń mikroprzepływowych programuje każdą komorę za pomocą pojedynczej plamki, co eliminuje potencjalne zanieczyszczenie lub reaktywność krzyżową. Ponadto generowanie mikroarrayów przy użyciu standardowych technik nanoszenia plamek jest bardzo modułowe, co umożliwia tworzenie macierzy białek7, DNA8, małych cząsteczek, a nawet zawiesin koloidalnych. Potencjalny wpływ mikroprzepływów na nauki biologiczne jest znaczący. Liczne testy oparte na mikroprzepływach dostarczyły już nowych informacji na temat struktury i funkcji systemów biologicznych, a dziedzina mikroprzepływów będzie nadal oddziaływać na biologię.

Przedstawiamy podejście mikrofluidyczne do ekspresji macierzy białkowych. Urządzenie składa się z tysięcy komór reakcyjnych sterowanych za pomocą mikromechanicznych zaworów. Urządzenie mikrofluidyczne jest połączone z biblioteką genów naniesioną w formie mikromacierzy. Geny te są następnie transkrybowane i translacyjne bezpośrednio na chipie, co pozwala na otrzymanie macierzy białkowej gotowej do zastosowań eksperymentalnych.

Generator wysokoprzepustowej ekspresji białek z wykorzystaniem platformy mikroprzepływowej

Szybko rozwijające się dziedziny, takie jak biologia systemowa, wymagają opracowania i wdrożenia nowych technologii umożliwiających wysokoprzepustowe i ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie modularnej macierzy białkowej, która nie wymaga etapu oczyszczania, co czyni ją kompatybilną z dowolną biblioteką białek. Osiąga się to najpierw poprzez generowanie syntetycznych genów za pomocą PCR asemblacyjnej. Następnie syntetyczne geny są nanoszone na szkiełka epoksydowe w formie macierzy.W celu wykonania urządzenia mikrofluidycznego należy użyć PDMS z silikonowymi formami kontrolnymi i przepływowymi. Następnie urządzenie mikrofluidyczne jest wyrównywane względem naniesionego matrycy DNA. Na koniec do urządzenia mikrofluidycznego wprowadzany jest lizat retikulocytów królika, a następnie następuje ekspresja białek.Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące ekspresję tysięcy białek dzięki fluorescencyjnemu znakowaniu przeciwciałami. Stosowanie techniki opartej na mikroprzepływach niesie ze sobą szereg zalet w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikromacierze białkowe. Wykonujemy mikromacierz DNA, a następnie wykorzystujemy system Cellis do syntezy białek bezpośrednio na urządzeniu.W związku z tym nie wymagamy oczyszczania białek, a same białka nigdy nie wysychają. Pozostają one świeże przez cały czas trwania eksperymentu. Technika mikrofluidyczna zapewnia również wyższą czułość. Aby wykonać urządzenie mikrofluidyczne, należy poddać silikonowe formy sterujące i przepływowe działaniu par chlorynotrymetylosilanu przez 10 minut, aby ułatwić oddzielenie elastomeru.Po etapach wypalania przygotować mieszaninę elastomeru na bazie silikonu i utwardzacza w dwóch różnych proporcjach: 5:1 oraz 20:1, odpowiednio dla form kontrolnych i form przepływowych. Wylać PDMS w proporcji 5:1 na warstwę kontrolną. Odgazować warstwę kontrolną i wypalać przez 30 minut w temperaturze 80 °C.Następnie na warstwę przepływową nałóż metodą spin-coatingu mieszaninę PDMS w stosunku 20:1, wirując z prędkością 2 600 RPM przez 60 sekund, a następnie wygrzej w temperaturze 80 °C przez 30 minut. Powoli oddziel warstwę sterującą od formy, uważając, aby nie oderwać wzoru z SU-8. Następnie za pomocą skalpela wytnij urządzenie wzdłuż jego obrysu i używając tępej igły, wykonaj pod mikroskopem otwory umożliwiające dostęp do kanałów sterujących.Ręcznie dopasuj warstwę przepływową i sterującą, zaczynając od górnego lewego rogu i pozycjonując zawór przyciskowy na warstwie sterującej na środku komory reakcyjnej. Następnie wyrównaj pierwszy rząd i delikatnie zwolnij warstwę sterującą rząd po rzędzie. Upewnij się, że wszystkie zawory przyciskowe znajdują się na środku komór reakcyjnych, a zawory adresowe i wlotowe przecinają kanały przepływowe w odpowiednim miejscu.Powtarzaj ten proces lokalnie, aż wszystkie rzędy zostaną wyrównane. Po pełnym wyrównaniu zdejmij wszelkie naprężenia w PDMS, ostrożnie podnosząc go od boków i narożników. Następnie wypal urządzenie przez dwie godziny w temperaturze 80 °C.Przetnij wzdłuż obwodu i odklej dwuwarstwowe urządzenie od otworów po wybijaniu formy przepływowej, aby uzyskać dostęp do kanałów przepływowych w celu wytworzenia konstruktów DNA dla urządzenia. Przeprowadź reakcję PCR, aby wytworzyć syntetyczne geny składające się z promotora T7, miejsca wiązania rybosomu, otwartej ramki odczytu z różnymi znacznikami epitopowymi na obu końcach oraz terminatora T7. Aby przygotować syntetyczne geny do rozmieszczenia w matrycy, przygotuj mieszaninę glikolu polietylenowego i wodnego roztworu trehalozy. Rozlej 2 µL na każdą reakcję do dołków płytki 384.Płytka wielodołkowa. Należy przenieść syntetyczne geny do płytki 384-dołkowej. Następnie dodać wodę destylowaną do uzyskania objętości końcowej 20 µL.Następnie, przy użyciu techniki mikroarray, nanieś serię syntetycznych genów na szklane podłoża pokryte żywicą epoksydową. Pod stereomikroskopem ręcznie wyrównaj urządzenie mikroprzepływowe z macierzą genową tak, aby plamka DNA znajdowała się w środku komór z DNA. Następnie wyrównaj pozostałe rzędy.Proces kończymy precyzyjnym dostrojeniem całego urządzenia, aby zredukować naprężenia w PDMS i zapewnić jego prawidłowe połączenie z mikrotablicą. Unieś je miejscowo. Na koniec przymocuj urządzenie do szkiełka przedmiotowego poprzez inkubację przez noc na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C.Barwniki spożywcze zostały użyte w tej sekcji w celu wizualizacji. Zawory w warstwie sterującej są uruchamiane z komputera za pomocą oprogramowania LabVIEW. Skrypt LabVIEW steruje serią mikrozaworów elektromagnetycznych poprzez elektroniczny moduł sterujący.Blok zaworów elektromagnetycznych jest podłączony do sprężonego powietrza, które kontroluje przepływ i ciśnienie powietrza w zaworach sterujących urządzenia. Używając elastycznej rurki plastikowej o średnicy wewnętrznej 0,02 cala oraz stalowego trzpienia, należy podłączyć urządzenie do bloku zaworów elektromagnetycznych. Rurki należy napełnić wodą dwukrotnie destylowaną, a następnie wprowadzić trzpień do otworów dostępowych warstwy sterującej.Należy upewnić się, że każda probówka jest podłączona do odpowiedniego kanału sterującego. Aby aktywować kanały sterujące, należy uruchomić aplikację LabVIEW, ustawić ciśnienie powietrza na 5 PSI, a następnie przyłożyć ciśnienie powietrza, aktywując zawór w skrypcie LabVIEW. Spowoduje to wtłoczenie wody do kanałów sterujących PDMS w celu zidentyfikowania potencjalnego przesłuchu (crosstalk) między kanałami sterującymi w wadliwych urządzeniach.W pierwszej kolejności napełnij zawory typu „sandwich” oraz zawory adresowe. Gdy wszystkie kanały sterujące i zawory zostaną wypełnione wodą, odpowietrz zawory, aby zablokować znajdujące się pod nimi kanały przepływowe. Wykonaj to najpierw poprzez zwiększenie ciśnienia powietrza do 15 PSI, a następnie w programie LabVIEW za pomocą zestawu przełączników włącz/wyłącz połączonych z poszczególnymi zaworami elektromagnetycznymi.Aktywuj wszystkie zawory, włączając wszystkie przyciski przełączników, aby upewnić się, że wszystkie zawory są otwarte. Podłącz rurkę do jednego z wlotów przepływu i wprowadź powietrze do urządzenia pod ciśnieniem 4-5 PSI. Pozwoli to na zwolnienie wszelkich przyklejonych zaworów z szkiełka przedmiotowego.Urządzenie jest teraz przygotowane i gotowe do celów wizualizacji. W tej sekcji do wizualizacji odczynników użyto żółtego barwnika spożywczego, a bezbarwny roztwór reprezentuje hippies; aby ułatwić samoorganizację matrycy białkowej na powierzchni i zapobiec nieswoistej adsorpcji wewnątrz urządzenia mikroprzepływowego, należy zmodyfikować chemicznie powierzchnię, podłączając najpierw nową rurkę z wymaganym roztworem do jednego z kanałów przepływowych w urządzeniu. Następnie należy podłączyć wolny koniec rurki do rozdzielacza ręcznego i otworzyć przepływ ciśnienia powietrza.Przenieś 40 µL biotynilowanego BSA do nowej probówki i przepuść około połowy tej objętości przez urządzenie przez 20 minut. Pomiędzy poszczególnymi etapami używaj 50 mM HEPES do wypłukania wszelkich niereaktywnych substratów. Następnie przepuść 25 µL streptawidyny przez 20 minut.Po nałożeniu biotynilowanej BSA przemyj układ roztworem PBS przez pięć minut, aby oczyścić powierzchnię wokół przycisku, zamknij zawór przycisku, przepuść resztę biotynilowanej BSA, a następnie ponownie przemyj roztworem PBS przez pięć minut. Na koniec, aby stworzyć macierz przeciwciał przeciwko znacznikowi His pod przyciskiem, otwórz zawór przycisku i przepuść 30 µL Penta-his biotyny przez 20 minut, w celu utworzenia macierzy białek na urządzeniu. Otwórz zawory szyjki i przepuść retikulocyty królika.Szybko wprowadź roztwór reakcji sprzężonej transkrypcji i translacji przez urządzenie do komory z DNA. Następnie zamknij zawory kanapkowe, aby odizolować każdy gen od jego otoczenia, i inkubuj urządzenie na płycie grzejnej przez 2,5 godziny w temperaturze 30 °C. Następnie znakuj koniec terminalny białek przeciwciałem C mix SI three.Na koniec, przy użyciu skanera do mikromacierzy z laserem o długości fali 532 nanometrów i filtrem emisyjnym 575 nanometrów, określ poziomy białek. Rycina ta przedstawia zmienne poziomy ekspresji białek na macierzy białkowej.Zazwyczaj 20% biblioteki genów nie wykazuje ekspresji na poziomach wykrywalnych. Poziomy tła określono przy użyciu komór, w których nie naniesiono DNA. W związku z tym sygnały z odpowiadających im komór białkowych wynikają albo z szumu, albo z niespecyficznej adsorpcji przeciwciał znakujących.Przy prawidłowym przeprowadzeniu weryfikacja urządzenia trwa cztery godziny, a eksperyment z użyciem chipa pięć godzin.

high-throughput-protein-expression-generator-using-microfluidic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Generator o wysokiej wydajności ekspresji białek za pomocą platformy mikrofluidalnej

Opisano wysokoprzepustową, zautomatyzowaną platformę rozwoju linii komórkowych do produkcji białkowych leków terapeutycznych. Wdrożenie sortera komórek BD FACS Aria, obrazownika CloneSelect Imager oraz systemu do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO wykazało znaczące zwiększenie wydajności przetwarzania w procesie rozwoju linii komórkowych, przy jednoczesnej poprawie jakości linii komórkowych i wysokiej powtarzalności.

Wysokoprzepustowa zautomatyzowana platforma do opracowywania linii komórkowych produkcyjnych dla białkowych produktów terapeutycznych

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

Laboratoryjna produkcja białek eukariotycznych z odpowiednią modyfikacją potranslacyjną stanowi istotną barierę. Oto solidny protokół z szybkim ustanowieniem i przekształceniem w ekspresję białek przy użyciu systemu ekspresji ssaków. System ten wspomaga selektywne znakowanie aminokwasów, selektywne znakowanie białek i małocząsteczkowych modulatorów składu glikanów.

Wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek HEK293 w zawiesinie

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek ujawnia niejednorodność genotypową w systemach biologicznych, ale obecnym technologiom brakuje przepustowości niezbędnej do głębokiego profilowania składu i funkcji społeczności. W tym miejscu opisujemy mikroprzepływowy przepływ pracy do sekwencjonowania &gt;50 000 genomów jednokomórkowych z różnych populacji komórek.

Ultraprzepustowa platforma mikroprzepływowa do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki

Ten protokół szczegółowo opisuje kroki, koszty i sprzęt niezbędny do generowania ekstraktów komórkowych na bazie E. coli i przeprowadzania reakcji syntezy białek in vitro w ciągu 4 dni lub krócej. Aby wykorzystać elastyczny charakter tej platformy do szerokich zastosowań, omawiamy warunki reakcji, które można dostosować i zoptymalizować.

Bezkomórkowa synteza białek na bazie Escherichia coli: Protokoły dla solidnej, elastycznej i dostępnej technologii platformy

Opisano proces wytwarzania wielowarstwowego, mikroprzepływowego urządzenia opartego na PDMS, które umożliwia przeprowadzanie reakcji transkrypcji i translacji in vitro (IVTT) przez dłuższy czas. Ponadto zapewniony jest kompleksowy przegląd sprzętu i oprogramowania wymaganego do automatyzacji i utrzymania tych reakcji przez dłuższy czas.

Wielowarstwowa platforma mikroprzepływowa do prowadzenia przedłużonej ekspresji genów bez komórek

Prezentujemy system mikroprzepływowy do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Chip mikroprzepływowy pozwala na analizę wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo.

Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

Ten protokół opisuje system Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) używany do budowy syntetycznych komórek. Przedstawiono w nim kluczowe etapy z reprezentatywnymi wynikami w różnych mikrokompartmentach. Protokół ma na celu ustanowienie najlepszych praktyk dla różnych laboratoriów w społeczności komórek syntetycznych, przyspieszając postęp w rozwoju komórek syntetycznych.

Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych

Ten protokół przedstawia standardowy przepływ wysokowydajnego przesiewania dla mikroorganizmów przemysłowych. Obejmuje ono konstruowanie biblioteki mutantów poprzez mutagenezę ARTP, przeprowadzanie pozytywnego przesiewania kropel za pomocą zautomatyzowanych mikrofluidów i następnie weryfikację wyników. Niezawodność przepływu została zweryfikowana poprzez przesiewanie wysokowydajnych szczepów B. coagulans.

Przesiewowe badanie wysokowydajne mutantów Bacillus coagulans hiperprodukujących kwas L-mlekowy za pomocą zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej kroplowej

Poznaj metodę ekspresji białek w mikroprzepływowym urządzeniu PDMS bez etapu oczyszczania. Technika umożliwia szybkie tworzenie modułowych mikromacierzy białkowych z bibliotekami genów.

Generator wysokoprzepustowej ekspresji białek z wykorzystaniem platformy mikroprzepływowej

Przeglądaj więcej filmów