Name: Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania genomu o bardzo niskim poziomie wejściowym z pojedynczej próbki niesporczaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Poznaj metodę sekwencjonowania genomu niesporczaka Hypsibius dujardini z pojedynczej próbki przy użyciu zaledwie 50 pikogramów DNA. Technika minimalizuje ryzyko kontaminacji bakteryjnej poprzez antybiotyki i inspekcję wizualną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Nozomi Abe, Yuki Takai i Nahoko Ishii za ich techniczne wsparcie w sekwencjonowaniu genomu. Praca ta była wspierana przez Grant-in-Aid for the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Research Fellow, KAKENHI Grant-in-Aid for Young Scientists (No.22681029) oraz KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B), nr 17H03620 z JSPS, przez Grant for Basic Science Research Projects z Fundacji Sumitomo (No.140340), a częściowo z funduszy badawczych od rządu prefektury Yamagata i miasta Tsuruoka. Japonia. Chlorella vulgaris używana do karmienia niesporczaków została dostarczona dzięki uprzejmości Chlorella Industry Co., LTD.

1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotuj 2% żel agarozowy, używając wody destylowanej (DW) jako rozpuszczalnika w 90-milimetrowym plastikowym naczyniu hodowlanym i 10 ml 1% koktajlu penicyliny/streptomycyny z DW. Żel można przechowywać przez 2 - 3 tygodnie w inkubatorze ustawionym w temperaturze 18 °C. 
	UWAGA: Unikaj przechowywania żelu w temperaturze poniżej 10 °C, ponieważ niska temperatura spowoduje skurczenie się żelu agarozowego, co spowoduje powstanie niewielkiej szczeliny między żelem a ścianką szalki hodowlanej, w której mogą zostać uwięzione niesporczaki.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki i wykluczenie zanieczyszczeń
<ol>
	<li>Zbierz pojedynczy niesporczak, umieść go na przygotowanej płytce agarowej i umyj go 2x - 3x DW, aby usunąć wszelkie pozostałe cząstki.</li>
	<li>Inkubować niesporczak w temperaturze 18 - 22 °C przez 24 godziny, aby usunąć nadmiar pokarmu z jelit.</li>
	<li>Umieść zagłodzonego niesporczaka w antybiotykach penicylinowych/streptomycynowych na 2 - 6 godzin w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń bakteryjnych i umieść odkażone zwierzę na czystym szkiełku szkiełkowym za pomocą pipety P10.</li>
	<li>Obserwuj niesporczaka pod mikroskopem przy 500-krotnym powiększeniu i upewnij się, że nie ma w nim żadnych pozostałych bakterii. 
	UWAGA: Duże powiększenie przy użyciu mikroskopu stereoskopowego jest optymalne, ale mikroskop optyczny może być używany alternatywnie bez nakładania szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Zbierz osobę za pomocą pipety P10 z maksymalnie 5 μl płynu, umieść ją w probówce z nisko wiążącą reakcją łańcuchową polimerazy (PCR) i usuń jak najwięcej nadmiaru płynu. 
	UWAGA: Mikroprobówki, probówki do PCR i końcówki do pipet powinny słabo wiązać, aby zminimalizować utratę DNA. 
	UWAGA: Przeprowadź homogenizację tak szybko, jak to możliwe, ponieważ szybkie wysuszenie lub śmierć zwierzęcia może znacznie uszkodzić genomowe DNA.</li>
</ol>
3. Homogenizacja i ekstrakcja DNA
<ol>
	<li>Homogenizować zwierzę, aby uzyskać jego genomowe DNA (gDNA) za pomocą jednej z następujących metod. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby użyć określonego zestawu pokazanego w Tabeli materiałów w następujących krokach ekstrakcji DNA, ponieważ inne zestawy (zarówno oparte na kolumnie, jak i kulkach) nie są skuteczne przy tak bardzo niskim wejściu. Bufor do lizy genomowej został przed użyciem zaopatrzony w 0,5% beta-merkaptoetanol.
	<ol>
		<li>Homogenizuj zwierzę za pomocą cykli zamrażania i rozmrażania18.
		<ol>
			<li>Bezpośrednio po kroku 2.5 dodać 100 μl buforu do lizy do probówki PCR zawierającej niesporczak.</li>
			<li>Umieścić probówkę PCR w ciekłym azocie na 10 minut i na 10 minut przenieść ją do bloku grzewczego ogrzanego do 37 °C. Powtórz ten krok 2x. 
			UWAGA: Ten krok można powtórzyć, gdy homogenizacja nie jest wystarczająca lub można go wykonać po ręcznym kruszeniu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ręcznie zmiażdż zwierzę.
		<ol>
			<li>Bezpośrednio po kroku 2.5, pod mikroskopem stereoskopowym, zmiażdżyć osobnika końcówką pipety P10, dociskając zwierzę do ścianki probówki PCR, a następnie natychmiast dodać 100 μl buforu do lizy. 
			UWAGA: Bardzo ważne jest, aby obserwować tę procedurę pod mikroskopem stereoskopowym, ponieważ niesporczak może łatwo się wyślizgnąć, a nieefektywne zgniatanie spowoduje niepowodzenie ekstrakcji gDNA. Upewnij się, że naskórek niesporczaka jest uszkodzony, aby bufor do lizy mógł przeniknąć do organizmu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować probówkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby nastąpiła liza. 
	UWAGA: Do efektywnej lizy wymagane jest co najmniej 30 minut, ale inkubacja może być dłuższa.</li>
	<li>Przenieść całą objętość (100 μl) mieszaniny do lizy do czystej mikroprobówki o niskim stopniu wiązania o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 100 μl buforu do lizy do probówki PCR o niskim stopniu wiązania, która została użyta do homogenizacji i jest teraz pusta, a po odpipetowaniu mieszaniny przenieść ją do 1,5 ml mikroprobówki o niskim stopniu wiązania użytej w kroku 3.3. Powtórz ten krok 2 razy.</li>
	<li>Podobnie jak w kroku 3.4, dodać 300 μl buforu do lizy do probówki PCR o niskim poziomie wiązania i po pipetowaniu przenieść mieszaninę do mikroprobówki o niskim stopniu wiązania o pojemności 1,5 ml. Po tym etapie mikroprobówka o niskim poziomie wiązania o pojemności 1,5 ml powinna zawierać 600 μl mieszaniny. 
	UWAGA: Kroki te mają na celu zminimalizowanie utraty gDNA związanego ze ścianką probówki PCR poprzez wielokrotne mycie próbki.</li>
	<li>Dodać łącznie 600 μl mieszaniny do lizy do kolumny wirowej umieszczonej w probówce zbiorczej i odwirować ją przy 10 000 x g przez 1 min.</li>
	<li>Ponownie nanieść przepływ do kolumny i odwirować go przy 10 000 x g przez 1 min. 
	UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie, aby upewnić się, że większość gDNA jest związana z kolumną.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu płuczącego do kolumny wirowej i odwirować ją przy 10 000 x g przez 1 min. Przenieść kolumnę wirową do czystej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Nałożyć 20 μl 10 mM Tris-HCl o pH 8,5 na kolumnę wirową, odczekać 5 minut w temperaturze pokojowej i odwirować przy 10 000 x g przez 1 min. 
	UWAGA: Bufor elucyjny nie może zawierać EDTA, ponieważ zakłóca on działanie enzymów preparatycznych z biblioteki.</li>
	<li>Ponownie przepuścić przepływ przez kolumnę wirową i po 5 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej odwirować go przez 1 minutę przy 10 000 x g. 
	UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia maksymalnej elucji gDNA związanego z kolumną.</li>
</ol>
4. Sekwencja budowy biblioteki
<ol>
	<li>Fragmentacja DNA
	<ol>
		<li>Przenieść 15 μl eluantu gDNA do mikroprobówki o pojemności 15 μl w celu fragmentacji DNA i odwirować probówkę przez 1 minutę za pomocą mikrowirówki stołowej. 
		UWAGA: Określona mikrorurka pokazana w tabeli materiałów jest optymalna dla niskiego wkładu. Fragmentacja za pomocą sonikacji o małej objętości jest krytyczna i nie może być zastąpiona fragmentacją enzymatyczną ze względu na wyjątkowo niskie stężenie DNA.</li>
		<li>Fragmentacja gDNA do 550 bp. 
		UWAGA: Użyte przez nas ustawienia 550 bp są następujące: szczytowa moc padająca = 30 W, współczynnik wypełnienia = 20%, cykle na serię = 50, czas zabiegu = 23 s.</li>
		<li>Po dokładnym pipetowaniu przenieść 10 μl rozdrobnionej mieszaniny DNA do czystej, słabo wiążącej probówki PCR. 
		UWAGA: W tym miejscu eksperyment można przerwać. Zakonserwować DNA w temperaturze 4 °C lub -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekwencja budowy biblioteki 
	UWAGA: Absolutnie konieczne jest użycie określonego zestawu w Tabeli materiałów w poniższych procedurach, ze względu na małą ilość wejściowego DNA.
	<ol>
		<li>Dodać 2 μl buforu do przygotowania matrycy i 1 μl enzymu do przygotowania matrycy i dokładnie wymieszać je pipetą.</li>
		<li>Przeprowadzić reakcję przygotowania matrycy na termocyklerze w następujących warunkach: 22 °C przez 25 min, 55 °C przez 20 min, 4 °C utrzymać i podgrzewać pokrywę w temperaturze 101 - 105 °C. Po zakończeniu reakcji przejdź do następnego kroku.</li>
		<li>Dodać 1 μl buforu do syntezy bibliotecznej i 1 μl enzymu syntezy z biblioteki do produktu reakcji przygotowania matrycy i inkubować mieszaninę w temperaturze 22 °C przez 40 minut (w 4 °C). Po zakończeniu reakcji przejdź do następnego kroku.</li>
		<li>Dodać 30 μl głównej mieszanki bibliotecznej amplifikacji (25 μl bufora do amplifikacji biblioteki, 1 μl enzymu do amplifikacji biblioteki i 4 μl wody wolnej od nukleaz) i 5 μl odczynnika indeksującego.</li>
		<li>Wszystko dokładnie wymieszaj pipetą i krótko odwiruj mieszaninę za pomocą wirówki stołowej.</li>
		<li>Wykonać PCR w warunkach przedstawionych w Tabeli 1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>temperatura</td>
			<td>Godzina</td>
			<td>Cykli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>72 °C</td>
			<td>3 minuty</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>85 °C</td>
			<td>2 minuty</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>98 °C</td>
			<td>2 minuty</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>98 °C</td>
			<td>20 sekund</td>
			<td rowspan="3">4 cykle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>67 °C</td>
			<td>20 sekund</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>72 °C</td>
			<td>40 sekund</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>98 °C</td>
			<td>20 sekund</td>
			<td rowspan="2">16 cykli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>72 °C</td>
			<td>50 sekund</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 °C</td>
			<td>trzymać</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Warunki PCR.
<ol start="3">
	<li>Oczyszczanie produktów PCR 
	UWAGA: Ten krok można zastąpić innymi metodami oczyszczania. Jeśli stosowana jest metoda alternatywna, należy sprawdzić uzyskaną czystość DNA za pomocą spektrofotometru. Współczynniki absorbancji 260/280 i 260/230 muszą być wyższe niż 1,8.
	<ol>
		<li>Dodać 50 μl kulek magnetycznych, odpipetować roztwór 10x i krótko odwirować za pomocą mikrowirówki stołowej.</li>
		<li>Inkubować roztwór przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Inkubować na stojaku magnetycznym przez 5 minut lub do momentu, gdy roztwór stanie się całkowicie klarowny, i usunąć supernatant.</li>
		<li>Dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu do probówki PCR o niskiej wiązalności na stojaku magnetycznym, odczekaj 30 s i usuń supernatant. Powtórz ten krok 2 razy. Nie przeszkadzaj koralikom.</li>
		<li>Krótko odwirować probówkę PCR o niskim poziomie wiązania za pomocą wirówki stołowej i usunąć nadmiar etanolu ze stojaka magnetycznego. Wysuszyć koraliki na powietrzu, ale unikaj przesuszenia.</li>
		<li>Zawiesić kulki w 15 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, dokładnie odpipetować roztwór, aby kulki magnetyczne były równomiernie rozprowadzone, inkubować probówkę przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a po krótkim odwirowaniu inkubować ją na stojaku magnetycznym przez 2 minuty, aż roztwór będzie klarowny. 
		UWAGA: Bufor elucyjny nie powinien zawierać EDTA, ponieważ zakłóca on chemię sekwencjonowania.</li>
		<li>Przenieść supernatant, nie naruszając osadu, do nowej probówki do PCR o niskim stopniu wiązania. 
		UWAGA: W tym miejscu eksperyment można przerwać. Zakonserwuj DNA w temperaturze 4 °C lub -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Kontrola jakości, kwantyfikacja i sekwencja DNA
UWAGA: Kontrola jakości nie jest przeprowadzana przed tym krokiem ze względu na małą ilość DNA.
<ol>
	<li>Walidacja rozkładu wielkości biblioteki DNA 
	UWAGA: Można stosować inne systemy elektroforezy o wysokiej czułości z cyfrowym raportowaniem rozkładu wielkości.
	<ol>
		<li>Przywrócić odczynnik buforowy do elektroforezy i wkład żelowy (w zakresie 25 - 1 000 pz) do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Dodać 3 μl odczynnika buforowego do elektroforezy z 1 μl biblioteki sekwencjonowania i dokładnie mieszać przez 1 minutę z wirem, a następnie krótko odwirować za pomocą wirówki stołowej.</li>
		<li>Przeprowadź elektroforezę i zweryfikuj rozkład wielkości biblioteki za pomocą powiązanego oprogramowania. Główny pik fragmentu powinien mieścić się w zakresie od około 300 do 1000 pz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja DNA 
	UWAGA: Można również zastosować inne metody oparte na fluorescencji lub ilościowy PCR, ale należy unikać spektrofotometrii, ponieważ nie jest ona wystarczająco dokładna do ilościowego określenia bibliotek sekwencjonowania.
	<ol>
		<li>Dodać 796 μl buforu roztworu i 4 μl odczynnika fluorescencyjnego i dokładnie wymieszać. Dozować 190 μl roztworu roboczego do dwóch probówek do oznaczania i 197 μl do jednej probówki do oznaczania.</li>
		<li>Dodać 10 μl wzorców o znanych stężeniach DNA do każdej probówki testowej zawierającej 190 μl roztworu roboczego i 3 μl przygotowanej biblioteki do probówki zawierającej 197 μl roztworu roboczego.</li>
		<li>Krótko zwiruj probówki i odwiruj je na wirówce stołowej. Określ ilościowo DNA za pomocą fluorometru z ustawieniami 3 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekwencja biblioteki DNA 
	Uwaga: Platforma sekwencjonowania musi być kompatybilna z określonym zestawem do budowy biblioteki.
	<ol>
		<li>Przygotuj bibliotekę sekwencjonowania w oparciu o protokół producenta.</li>
		<li>Umieść kasetę z odczynnikiem i komórkę przepływową w przyrządzie do sekwencjonowania i wprowadź informacje o przebiegu sekwencjonowania zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Uruchom plik sequencing. 
		UWAGA: Przeprowadziliśmy dwie sekwencjonowania: jedną próbkę/serię, a także cztery próbki multipleksowane w jednym przebiegu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza obliczeniowa
<ol>
	<li>Wywołanie podstawowe i, w razie potrzeby, demultipleksacja odczytów.</li>
	<li>Sprawdź jakość danych sekwencji za pomocą FastQC19. 
	UWAGA: Aby uzyskać bardziej szczegółową walidację uzyskanych danych, zobacz nasz poprzedni raport16.</li>
</ol>

<ol><li>Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. <a target="_blank" href="https://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev.ph.54.030192.003051">Anhydrobiosis.</a> Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).</li>
<li>Mobjerg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+in+extreme+environments+-+on+the+current+knowledge+of+adaptations+in+tardigrades%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Survival in extreme environments - on the current knowledge of adaptations in tardigrades.</a> Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).</li>
<li>Becquerel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((La+suspension+de+la+vieau+dessous+de+1%2F20+K+absolu+par+demagnetization+adiabatique+de+L%27alun+de+fer+dans+le+vide+les+plus+el%C3%A9ve%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+de+l%27Acad%C3%A9mie+des+Sciences%22%5BJournal%5D)">La suspension de la vieau dessous de 1/20 K absolu par demagnetization adiabatique de L'alun de fer dans le vide les plus eléve.</a> Comptes Rendus de l'Académie des Sciences. 231, 261-264 (1950).</li>
<li>Ono, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/23311940.2016.1167575">Effect of ultra-high pressure on small animals, tardigrades and Artemia.</a> Cogent Physics. 3 (1), 1167575(2016).</li>
<li>Horikawa, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+of+anhydrobiotic+eggs+of+the+Tardigrade+Ramazzottius+varieornatus+to+extreme+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Astrobiology%22%5BJournal%5D)">Tolerance of anhydrobiotic eggs of the Tardigrade Ramazzottius varieornatus to extreme environments.</a> Astrobiology. 12 (4), 283-289 (2012).</li>
<li>Horikawa, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DNA+repair+and+protection+in+the+Tardigrade+Ramazzottius+varieornatus+and+Hypsibius+dujardini+after+exposure+to+UVC+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of DNA repair and protection in the Tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation.</a> PLoS One. 8 (6), e64793(2013).</li>
<li>Horikawa, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+tolerance+in+the+tardigrade+Milnesium+tardigradum%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum.</a> International Journal of Radiation Biology. 82 (12), 843-848 (2006).</li>
<li>May, R. M., Maria, M., Gumard, J. <a target="_blank" href="https://ci.nii.ac.jp/naid/10021039778/">Action différentielle des rayons x et ultraviolets sur le tardigrade Macrobiotus areolatus, a L'état actif et desséché.</a> Bulletin Biologique de la France et de la Belgique. 98, 349-367 (1964).</li>
<li>Jonsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+tolerance+in+the+eutardigrade+Richtersius+coronifer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer.</a> International Journal of Radiation Biology. 81 (9), 649-656 (2005).</li>
<li>Bemm, F., Weiss, C. L., Schultz, J., Forster, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+of+a+tardigrade%3A+Horizontal+gene+transfer+or+bacterial+contamination%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome of a tardigrade: Horizontal gene transfer or bacterial contamination?</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3054-E3056 (2016).</li>
<li>Delmont, T. O., Eren, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+contamination+with+advanced+visualization+and+analysis+practices%3A+metagenomic+approaches+for+eukaryotic+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Identifying contamination with advanced visualization and analysis practices: metagenomic approaches for eukaryotic genome assemblies.</a> PeerJ. 4, e1839(2016).</li>
<li>Koutsovoulos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+evidence+for+extensive+horizontal+gene+transfer+in+the+genome+of+the+tardigrade+Hypsibius+dujardini%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">No evidence for extensive horizontal gene transfer in the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), 5053-5058 (2016).</li>
<li>Boothby, T. C., Goldstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reply+to+Bemm+et+al.+and+Arakawa%3A+Identifying+foreign+genes+in+independent+Hypsibius+dujardini+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reply to Bemm et al. and Arakawa: Identifying foreign genes in independent Hypsibius dujardini genome assemblies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3058-E3061 (2016).</li>
<li>Boothby, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+extensive+horizontal+gene+transfer+from+the+draft+genome+of+a+tardigrade%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (52), 15976-15981 (2015).</li>
<li>Arakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+evidence+for+extensive+horizontal+gene+transfer+from+the+draft+genome+of+a+tardigrade%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">No evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3057(2016).</li>
<li>Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequencing+of+a+single+tardigrade+Hypsibius+dujardini+individual%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual.</a> Scientific Data. 3, 160063(2016).</li>
<li>Yoshida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+the+tardigrades+Hypsibius+dujardini+and+Ramazzottius+varieornatus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus.</a> PLoS Biology. 15 (7), e2002266(2017).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="https://bio-protocol.org/bio101/e47">Total RNA Extraction from C. elegans.</a> Bio-protocol. Bio101, e47(2011).</li>
<li>Andrews, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndrews%2C+S+%22FastQC+a+quality-control+tool+for+high-throughput+sequence+data%22">FastQC a quality-control tool for high-throughput sequence data</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2015).</li>
<li>Hashimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremotolerant+tardigrade+genome+and+improved+radiotolerance+of+human+cultured+cells+by+tardigrade-unique+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein.</a> Nature Communications. 7, 12808(2016).</li>
<li>Zimin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaSuRCA+genome+assembler%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The MaSuRCA genome assembler.</a> Bioinformatics. 29 (21), 2669-2677 (2013).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).</li>
<li>Okonechnikov, K., Conesa, A., Garcia-Alcalde, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualimap+2%3A+advanced+multi-sample+quality+control+for+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).</li>
<li>Horikawa, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+rearing+system+of+the+extremotolerant+tardigrade+Ramazzottius+varieornatus%3A+a+new+model+animal+for+astrobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Astrobiology%22%5BJournal%5D)">Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology.</a> Astrobiology. 8 (3), 549-556 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zanieczyszczenie bakteryjne stanowi zagrożenie dla sekwencjonowania genomu mikroskopijnych organizmów. Podczas gdy poprzednie badania nad sekwencjonowaniem genomu niesporczaków odfiltrowały zanieczyszczenia przy użyciu rozległych metod informatycznych 12,20, my zsekwencjonowaliśmy genom od pojedynczej osoby, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczeń. Ponieważ pojedynczy niesporczak zawiera około 50 - 200 pg genomowego DNA16 i jest otoczony ...

Niesporczaki to mikroskopijne zwierzęta, które mogą wejść w stan ametaboliczny zwany anhydrobiozą, gdy stają w obliczu wysuszenia. Regenerują się poprzez wchłanianie wody1,2. W stanie ametabolicznym niesporczaki są w stanie tolerować różne ekstremalne środowiska, w tym ekstremalne temperatury3 i ciśnienia4,5, wysoka dawka światła ultrafioletowego6, promieniowanie rentgenowskie i promieniowanie gamma7,8 i przestrzeń kosmiczna9. Dane genomiczne stanowią nieodzowną podstawę do badania molekularnych mechanizmów anhydrobiozy.
Poprzednie próby sekwencjonowania genomu niesporczaków wykazały oznaki skażenia bakteryjnego10,11,12,13,14. Sekwencjonowanie genomu takich małych organizmów wymaga dużej liczby zwierząt i jest podatne na skażenie bakteryjne; W związku z tym wcześniej ustaliliśmy protokół sekwencjonowania przy użyciu metody Ultralow Input, zaczynając od pojedynczej próbki niesporczaka, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczeń<Klasa SUP="xref">15. Korzystając z tych danych, przeprowadziliśmy wysokiej jakości ponowne sekwencjonowanie i ponowne składanie genomu H. dujardini16,17. Tutaj szczegółowo opisujemy tę metodę sekwencjonowania genomu od pojedynczego osobnika niesporczaka (Rysunek 1). Walidacja tej metody sekwencjonowania wykracza poza główny temat tego artykułu i została już dokładnie omówiona w naszym poprzednim raporcie16.
Ta metoda składa się z dwóch części: izolacji pojedynczego niesporczaka o możliwie najniższym stopniu zanieczyszczenia oraz wysokiej jakości ekstrakcji poziomów piktogramu DNA. Niesporczak jest głodzony i dokładnie spłukiwany wodą, a także antybiotykami, a następnie obserwowany pod mikroskopem z 500-krotnym powiększeniem, aby zapewnić usunięcie wszelkich zanieczyszczeń bakteryjnych. Poprzednie szacunki i pomiary pokazują, że pojedynczy osobnik niesporczaka zawiera około 50 - 200 pg genomowego DNA16, który jest ekstrahowany przez rozbijanie egzoszkieletu chityny w cyklach zamrażania i rozmrażania lub przez ręczną homogenizację. To genomowe DNA jest przesyłane do budowy biblioteki i sekwencjonowane na instrumencie do sekwencjonowania DNA. Dodatkowa analiza informatyczna wykazała wysoką jakość sekwencjonowania, a także niski poziom zanieczyszczenia w porównaniu z poprzednimi projektami sekwencjonowania niesporczaków.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop SZ61</td><td>OLYMPUS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BactoAgar</td><td>Difco Laboratories</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Gibco firmy life technologies</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>VHX-5000 System</td><td>Keyence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml Silikonowa tubka powlekająca</td><td>Bio Nauki medyczne</td><td>BC-bmb20200</td><td></td></tr><tr><td>Quick-DNA Zestaw do mikroprzygotowania</td><td>ZYMO Research</td><td>D3021</td><td>Korzystanie z tego zestawu jest absolutnie krytyczne; patrz krok 3.1</td></tr><tr><td>1.5 ml mikroprobówki</td><td>Greiner Bio-One</td><td>616-201</td><td>Patrz 4.1.1</td></tr><tr><td>Mikrowirówka z chłodzeniem o wysokiej prędkości</td><td>TOMY</td><td>MX-307</td><td></td></tr><tr><td>Covaris M220</td><td>Covaris Inc.</td><td></td><td></td>4482277</tr><tr><td>Zestaw ThruPLEX DNA-Seq</td><td>Rubicon Genomics</td><td>NR KAT. R400406</td><td>Korzystanie z tego zestawu jest absolutnie krytyczne; patrz krok 4.2</td></tr><tr><td>Odczynnik Thermal Cycler</td><td>Bioer Technology</td><td>TC-96GHbC</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>BECKMAN COULTER Life Science</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Wako</td><td>054-027335</td><td></td></tr><tr><td>EB bufor</td><td>QIAGEN</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation</td><td>Agilent</td><td>G2965AA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki D1000</td><td>Agilent</td><td>5067-5583</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>Cubee Mini-wirówka</td><td>RecenttecGenereach</td><td>R5-AQBD01aqbd</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 600 cycle v3</td><td>Illumina Inc.</td><td>MS-102-3003</td><td></td></tr><tr><td>Sekwencer MiSeq</td><td>Illumina Inc.</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie biblioteki sekwencjonowania genomu o bardzo niskim poziomie wejściowym z pojedynczej próbki niesporczaka

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Niesporczaki to mikroskopijne zwierzęta, które wchodzą w stan ametaboliczny zwany anhydrobiozą, gdy stają w obliczu wysuszenia i mogą powrócić do swojego pierwotnego stanu, gdy woda jest dostarczana. Sekwencjonowanie genomu mikroskopijnych zwierząt, takich jak niesporczaki, grozi zanieczyszczeniem bakteryjnym, które czasami prowadzi do błędnych interpretacji, na przykład dotyczących zakresu horyzontalnego transferu genów u tych zwierząt. W tym miejscu zapewniamy metodę ultraniskiego wkładu do sekwencjonowania genomu niesporczaka, Hypsibius dujardini, z pojedynczego okazu. Stosując rygorystyczne mycie i wykluczanie zanieczyszczeń wraz z wydajną ekstrakcją genomowego DNA o długości 50 ~ 200 pg od pojedynczej osoby, zbudowaliśmy bibliotekę sekwencjonowaną za pomocą instrumentu do sekwencjonowania DNA. Biblioteki te były wysoce powtarzalne i bezstronne, a analiza informatyczna sekwencjonowanych odczytów z innymi genomami H. dujardini wykazała minimalną ilość zanieczyszczenia. Metodę tę można zastosować do niezdolnych do hodowli niesporczaków, których nie można było zsekwencjonować przy użyciu poprzednich metod.

Wykluczenie zanieczyszczeń:
Niniejszy protokół obejmuje dokładne przemycie niesioruków oraz sterylizację za pomocą antybiotyków w celu zminimalizowania zanieczyszczeń. Obejmuje on również proces kontroli wizualnej, aby upewnić się, że procesy te zostały przeprowadzone w pełni. Obraz mikroskopowy wykonany podczas walidacji (krok 2.4 protokołu) przedstawiono na Ryc. 2. Przy powiększen...

Zanieczyszczenie podczas sekwencjonowania genomu mikroskopijnych organizmów pozostaje dużym problemem. Tutaj pokazujemy metodę sekwencjonowania genomu niesporczaka z pojedynczej próbki z zaledwie 50 pg genomowego DNA bez amplifikacji całego genomu, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia.

Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania genomu o bardzo niskim poziomie wejściowym z pojedynczej próbki niesporczaka

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Celem tego protokołu jest sekwencjonowanie genomu mikroskopijnego organizmu zwanego niesporczakami. Opracowaliśmy metodę sekwencjonowania genomu niesporczaka, Hypsibius dujardini, z pojedynczej próbki zawierającej zaledwie 50 pikogramów genomowego DNA z zastosowaniem całego genomu. Po wyizolowaniu pojedynczego niesporczaka minimalizujemy skażenie bakteryjne poprzez stosowanie antybiotyków i oględziny.Zastosowaliśmy również dwie metody homogenizacji. Pierwszy i najczęściej stosowany u C. elegans przy użyciu cykli zamrażania i rozmrażania, a drugi ręczne miażdżenie niesporczaka za pomocą końcówki pipety. DNA jest następnie wykorzystywane do konstruowania biblioteki sekwencjonowania, a następnie sekwencjonowane w instrumencie MiSeq.Ogólne podsumowanie protokołu. Po wyizolowaniu pojedynczego osobnika poddaje się go trzem cyklom zamrażania i rozmrażania w celu homogenizacji. Genomowe DNA jest ekstrahowane i oczyszczane, a następnie fragmentowane przez sonikację.Następnie konstruowana jest biblioteka sekwencjonująca, a po walidacji rozkładu wielkości biblioteki jest ona sekwencjonowana za pomocą instrumentu sekwencjonowania. Przygotuj 2% żel agarozowy, używając wody destylowanej jako roz

ultralow-input-genome-sequencing-library-preparation-from-single

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten manuskrypt opisuje zautomatyzowane podejście do wyboru rozmiaru żelu do oczyszczania fragmentów DNA do sekwencjonowania nowej generacji. Technologia Ranger zapewnia pełną automatyzację całego procesu ładowania żelem agarozowym, analizy elektroforetycznej i odzyskiwania docelowych fragmentów DNA, co pozwala na uzyskanie wysokiej przepustowości i wysokiej jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji.

Zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych na podstawie próbek wody środowiskowej

Test chromatyny dostępnej dla transpozy w połączeniu z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ATAC-seq) to metoda odkrywania dostępnej chromatyny obejmująca cały genom. Jest to protokół sekwencyjny ATAC-seq krok po kroku, od analizy molekularnej do końcowej analizy obliczeniowej, zoptymalizowany pod kątem ludzkich limfocytów (Th1/Th2). Protokół ten może zostać przyjęty przez badaczy bez wcześniejszego doświadczenia w metodach sekwencjonowania nowej generacji.

Mapowanie chromatyny dostępnej w całym genomie w pierwotnych ludzkich limfocytach T za pomocą ATAC-Seq

Regulacja translacyjna odgrywa ważną rolę w kontroli obfitości białek. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową metodę ilościowej analizy translacji w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae.

Kwantyfikacja translacji w całym genomie u pączkujących drożdży za pomocą profilowania rybosomów

Ten artykuł demonstruje szczegółowy protokół izolacji DNA i budowy biblioteki sekwencjonowania o wysokiej przepustowości z materiału zielnikowego, w tym ratowania wyjątkowo niskiej jakości DNA.

Solidna izolacja DNA i wysokoprzepustowa budowa biblioteki sekwencjonowania dla okazów zielnikowych

Ta praca opisuje protokół generowania bibliotek Hi-C o wysokiej rozdzielczości in situ z ciasno zaszczepionych zarodków Drosophila melanogaster przed gastrulacją.

Generowanie bibliotek wychwytywania konformacji chromatyny w całym genomie z ciasno zainscenizowanych wczesnych zarodków Drosophila

Długie sekwencje znacznie ułatwiają tworzenie złożonych genomów i charakteryzację zmienności strukturalnej. Opisujemy metodę generowania ultradługich sekwencji za pomocą platform sekwencjonowania opartych na nanoporach. Podejście to wykorzystuje zoptymalizowaną ekstrakcję DNA, a następnie zmodyfikowane przygotowania biblioteczne w celu wygenerowania setek odczytów kilobazowych z umiarkowanym pokryciem z komórek ludzkich.

Sekwencjonowanie z bardzo długim odczytem do analizy całego genomu DNA

Opisujemy metodę generowania nasyconych bibliotek mutantów transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych i późniejszego przygotowania bibliotek amplikonów DNA do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Jako przykład skupiamy się na patogenie ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ale ten protokół jest podatny na szeroką gamę organizmów Gram-ujemnych.

Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Ten protokół szczegółowo opisuje kompleksowe podejście do hodowli, sekwencjonowania i hybrydowego składania genomu de novo bakterii moczowych. Zapewnia powtarzalną procedurę generowania kompletnych, kolistych sekwencji genomu przydatnych w badaniu zarówno chromosomalnych, jak i pozachromosomalnych elementów genetycznych przyczyniających się do kolonizacji dróg moczowych, patogenezy i rozprzestrzeniania się oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Hybrydowe składanie genomu de novo w celu generowania kompletnych genomów bakterii moczowych przy użyciu technologii sekwencjonowania krótkiego i długiego odczytu

Wykonalność strategii sekwencjonowania całego genomu (WGS) przy użyciu narzędzi laboratoryjnych uprościła badanie genomu każdego mikroba istotnego dla zdrowia publicznego w warunkach laboratoryjnych. Opisano adaptację metodologiczną przepływu pracy dla bakteryjnych WGS, a także przedstawiono proces analizy bioinformatycznej.

Charakterystyka patogennego szczepu Escherichia coli pochodzącego z gospodarstw Oreochromis spp. przy użyciu sekwencjonowania całego genomu

Ekspresja genów jest regulowana przez interakcje promotorów genów z dystalnymi elementami regulatorowymi. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób niski poziom wejściowy Capture Hi-C (liCHi-C) pozwala na identyfikację tych interakcji w rzadkich typach komórek, które wcześniej były niemierzalne.

Zintegrowany proces pracy do badania architektury genomu czasoprzestrzennego skoncentrowanej na promotorze w rzadkich populacjach komórek

Ta praca przedstawia metodę szybkiej ekstrakcji RNA i porównywania poziomów transkryptów do analizy ekspresji genów u niesporczaka Hypsibius exemplaris. Ta wysokoprzepustowa metoda, wykorzystująca fizyczną lizę, wymaga pojedynczego niesporczaka jako materiału wyjściowego i powoduje solidną produkcję cDNA do ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR).

Ekstrakcja RNA z pojedynczego zwierzęcia w jednej probówce w celu porównania względnych poziomów transkryptów za pomocą qRT-PCR u niesporczaka Hypsibius exemplaris

Poznaj metodę sekwencjonowania genomu niesporczaka Hypsibius dujardini z pojedynczej próbki przy użyciu zaledwie 50 pikogramów DNA. Technika minimalizuje ryzyko kontaminacji bakteryjnej poprzez antybiotyki i inspekcję wizualną.

Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania genomu o bardzo niskim poziomie wejściowym z pojedynczej próbki niesporczaka

Przeglądaj więcej filmów