Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania genomu o bardzo niskim poziomie wejściowym z pojedynczej próbki niesporczaka

Zanieczyszczenie podczas sekwencjonowania genomu mikroskopijnych organizmów pozostaje dużym problemem. Tutaj pokazujemy metodę sekwencjonowania genomu niesporczaka z pojedynczej próbki z zaledwie 50 pg genomowego DNA bez amplifikacji całego genomu, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia.

Celem tego protokołu jest sekwencjonowanie genomu mikroskopijnego organizmu zwanego niesporczakami. Opracowaliśmy metodę sekwencjonowania genomu niesporczaka, Hypsibius dujardini, z pojedynczej próbki zawierającej zaledwie 50 pikogramów genomowego DNA z zastosowaniem całego genomu. Po wyizolowaniu pojedynczego niesporczaka minimalizujemy skażenie bakteryjne poprzez stosowanie antybiotyków i oględziny.

Zastosowaliśmy również dwie metody homogenizacji. Pierwszy i najczęściej stosowany u C. elegans przy użyciu cykli zamrażania i rozmrażania, a drugi ręczne miażdżenie niesporczaka za pomocą końcówki pipety. DNA jest następnie wykorzystywane do konstruowania biblioteki sekwencjonowania, a następnie sekwencjonowane w instrumencie MiSeq.

Ogólne podsumowanie protokołu. Po wyizolowaniu pojedynczego osobnika poddaje się go trzem cyklom zamrażania i rozmrażania w celu homogenizacji. Genomowe DNA jest ekstrahowane i oczyszczane, a następnie fragmentowane przez sonikację.

Następnie konstruowana jest biblioteka sekwencjonująca, a po walidacji rozkładu wielkości biblioteki jest ona sekwencjonowana za pomocą instrumentu sekwencjonowania. Przygotuj 2% żel agarozowy, używając wody destylowanej jako rozpuszczalnika w 90-milimetrowym plastikowym naczyniu hodowlanym i 10% streptomycyny 1% penicyliny z wodą destylowaną. Żel można przechowywać przez dwa do trzech tygodni w inkubatorze ustawionym na 18 stopni.

Zbierz pojedynczy niesporczak i umieść go na przygotowanej płytce agarowej, a następnie przemyj wodą destylowaną dwa do trzech razy, aby usunąć pozostałe cząstki. Umieść pojedynczy niesporczak w antybiotykach penicylinowo-streptomycynowych na dwie do sześciu godzin w celu usunięcia skażenia bakteryjnego, a następnie umieść odkażone zwierzę na czystym szkiełku za pomocą pipety P10. Obserwuj niesporczaka pod mikroskopem w 500-krotnym powiększeniu i upewnij się, że nie pozostały żadne bakterie.

Zbierz pojedynczą osobę za pomocą pipety P10 z maksymalnie pięcioma mikrolitrami płynu i umieść w probówce do PCR o niskiej wiązalności, usuwając nadmiar płynu w jak największym stopniu. Homogenizacja i ekstrakcja DNA. Homogenizować zwierzę w celu uzyskania genomowego DNA za pomocą jednej z następujących metod.

Homogenizacja z cyklami zamrażania i rozmrażania. Bezpośrednio po kroku 2.5 dodać 100 mikrolitrów buforu do lizy do probówki PCR zawierającej niesporczak. Umieść probówkę PCR w ciekłym azocie na 10 minut i przenieś do bloku grzewczego, ogrzej do 37 stopni przez 10 minut.

Powtórz ten krok trzy razy. Kruszenie ręczne. Pod mikroskopem stereoskopowym zmiażdż osobę końcówką pipety P10, dociskając zwierzę do ścianki probówki PCR i natychmiast dodaj 100 mikrolitrów buforu do lizy.

Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby nastąpiła liza. Przenieś całą objętość mieszaniny do lizy do czystej mikroprobówki o niskim poziomie wiązania o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj 100 mikrolitrów buforu do lizy do probówki PCR o niskim poziomie wiązania, która jest używana do homogenizacji i jest teraz pusta.

Po pipetowaniu przenieś mieszaninę do mikroprobówki o niskim poziomie wiązania. Powtórz ten krok dwukrotnie. Dodaj 300 mikrolitrów buforu do lizy do probówki PCR o niskim poziomie wiązania, a po pipetowaniu przenieś mieszaninę do 1,5 mililitrowej mikroprobówki o niskim stopniu wiązania.

Dodać łącznie 600 mikrolitrów mieszaniny do lizy do kolumny wirowej umieszczonej w probówce zbiorczej i odwirować przy 10 000 G przez jedną minutę. Ponownie nanieść przepływ do kolumny i odwirować przy stężeniu 10 000 G przez jedną minutę. Ten krok ma kluczowe znaczenie, aby upewnić się, że większość genomowego DNA jest związana z kolumną.

Dodać 500 mikrolitrów buforu płuczącego do kolumny wirowej i odwirować przy 10 000 G przez jedną minutę. Przenieś kolumnę wirującą do czystej mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra. Nałóż 20 mikrolitrów 10 milimolowych pierwszych ACL na kolumnę wirową i odczekaj pięć minut w temperaturze pokojowej.

Wirować przy 10 000 G przez jedną minutę. Bufor rozcieńczający nie może zawierać EDTA, ponieważ zakłóca on działanie enzymów preparatu laboratoryjnego. Ponownie nanieść przepływ do kolumny wirowej i po pięciu minutach inkubacji w temperaturze pokojowej wirować przez jedną minutę przy 10 000 G. Budowa biblioteki sekwencjonowania.

Fragmentacja DNA. Przenieś 15 mikrolitrów elucji genomowego DNA do mikroprobówki o pojemności 15 mikrolitrów w celu fragmentacji DNA i wiruj przez jedną minutę za pomocą wirówki stołowej. Fragmentacja genomowego DNA na 550 par zasad.

Po pipetowaniu należy przenieść 10 mikrolitrów rozdrobnionej mieszaniny DNA do czystej, słabo wiążącej probówki PCR. W tym miejscu eksperyment można przerwać. Zachowaj DNA w temperaturze 4 lub minus 20 stopni.

Budowa biblioteki sekwencjonowania. Absolutnie konieczne jest użycie określonego zestawu w poniższych procedurach, ze względu na niski wkład DNA. Przygotuj wymagane odczynniki, postępując zgodnie z protokołem producenta, i skonstruuj bibliotekę sekwencjonowania bez żadnych modyfikacji.

Po nałożeniu mieszaniny amplifikacyjnej biblioteki na mieszaninę syntezy bibliotecznej, przeprowadzić reakcję PCR w termocyklerze. Reakcję PCR przeprowadzono zgodnie z opisem. Oczyszczanie reakcji PCR.

Dodaj 50 mikrolitrów kulek magnetycznych i pipetuj 10 razy, a następnie krótko odwiruj za pomocą mikrowirówki stołowej. Inkubować przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Inkubować na stojaku magnetycznym przez pięć minut lub do momentu, gdy roztwór stanie się całkowicie klarowny, i usunąć supernatant.

Postępuj zgodnie z protokołem producenta. Przenieść supernatant bez naruszania osadu do nowej probówki do PCR o niskiej wiązalności. Kontrola jakości DNA i kwantyfikacja oraz sekwencjonowanie.

Walidacja rozkładu wielkości biblioteki DNA. Dodać trzy mikrolitry próbki wody z jednym mikrolitrem biblioteki sekwencjonowania i dokładnie mieszać przez jedną minutę z wirem i krótko odwirować za pomocą wirówki stołowej. Przeprowadź elektroforezę i zweryfikuj rozkład wielkości biblioteki za pomocą powiązanego oprogramowania.

Główny pik fragmentu powinien mieścić się w szerokim zakresie od około 300 do 1 000 par zasad. Kwantyfikacja DNA. Dodać 796 mikrolitrów buforu roztworu i cztery mikrolitry odczynnika fluorescencyjnego i dokładnie wymieszać.

Dozować 190 mikrolitrów roztworu roboczego do dwóch probówek testowych i 197 mikrolitrów do jednej probówki. Dodać 10 mikrolitrów wzorców o znanych stężeniach DNA do każdej probówki testowej zawierającej 190 mikrolitrów roztworu roboczego i trzy mikrolitry przygotowanej biblioteki do probówki testowej zawierającej 197 mikrolitrów roztworu roboczego. Krótko wirować i odwirować na wirówce stołowej.

Określ ilościowo DNA za pomocą fluorometru z trzema ustawieniami mikrolitrów. Sekwencjonowanie biblioteki DNA. Przygotuj bibliotekę sekwencjonowania w oparciu o protokół producenta.

Umieść kasetę z odczynnikiem i komórkę przepływową w przyrządzie do sekwencjonowania i wprowadź informacje o przebiegu sekwencjonowania, postępując zgodnie z protokołem producenta. Uruchom sekwencjonowanie. Reprezentowane wyniki.

Narażenie na zanieczyszczenia podczas wysokiej jakości ekstrakcji DNA pozostaje krytycznym punktem w naszym protokole. Aby wizualnie sprawdzić, czy są one zanieczyszczone, inkubowaliśmy niesporczaki w antybiotykach, którymi są penicylina i streptomycyna, a także zbadaliśmy osobę pod 500-krotnym mikroskopem. Jak pokazano tutaj, widoczne mikroorganizmy wokół niesporczaków są całkowicie oświetlone.

Po wydajnej homogenizacji, ekstrakcji DNA, fragmentacji i przygotowaniu biblioteki. Rozkład wielkości biblioteki jest weryfikowany za pomocą elektroforezy o wysokiej czułości w celu kontroli jakości. Fioletowe i zielone linie oznaczają górne i dolne znaczniki odpowiednio na 1, 500 i 25 parach zasad.

Tor L to znacznik drabinkowy, pasy S i N1 do N4 to pięć powtórzeń tego samego eksperymentu, wszystkie zaczynające się od jednego okazu niesporczaka. Jak widać z szerokiej jednolitości i rozkładu między 200 a 1 000 par zasad, nasz protokół jest wysoce powtarzalny, nawet przy bardzo niskim wejściu. Oto wynik szybkiej kontroli jakości dla zsynchronizowanych odczytów uzyskanych z pojedynczego przebiegu sekwencjonowania.

Odczyty są uzyskiwane jako zapasowe końce 300 par zasad, gdzie odczyty do przodu i do tyłu są pokazane odpowiednio na górze i na dole. Pokazany tutaj rozkład jest typowy dla 300 odczytów końcowych par, z bardzo wysokiej jakości wywołaniem bazy powyżej Q30 dla pierwszych 200 par zasad i stopniowo malejącym do końca. Tak więc ta metoda wykorzystuje tylko jednego osobnika na jedną próbkę.

Nie ma wymagań dotyczących ogromnych ilości zwierząt, takich jak te wymagane w poprzednich projektach sekwencjonowania genomu niesporczaków. Metody hodowli większości niesporczaków nie zostały jeszcze ustalone. W związku z tym umożliwienie sekwencjonowania genomiki od pojedynczego osobnika, na przykład bezpośrednio z badań terenowych, będzie miało duży wpływ na biologię molekularną niesporczaków, a być może także na inne małe zwierzęta.

Nasze metody sekwencjonowania DNA umożliwiają analizę innych licznych mikroskopijnych organizmów, które nie zostały jeszcze zsekwencjonowane, takich jak rzadkie gatunki barszczu, nicienie, jodły wodne i inne opcje, łącząc część stref z szerszym obszarem publicznym, wspierając otoczenie, w którym możliwe mogą być różne mechanizmy biologiczne.