Eksperymentalne podejścia do badania lokalizacji mitochondrialnej i funkcji kinazy jądrowego cyklu komórkowego, Cdk1

Ogólnym celem poniższej procedury jest określenie submitochondrialnej lokalizacji normalnie jądrowej kinazy cyklu komórkowego, a następnie przeanalizowanie, w jaki sposób jej lokalizacja mitochondrialna wpływa na postęp cyklu komórkowego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań mitochondrialnych, takie jak to, w jaki sposób jądro komunikuje się z mitochondriami podczas cyklu komórkowego. Znakując białka sekwencją wiodącą dla mitochondriów, możemy wykorzystać specyficzną nadekspresję białka w mitochondriach, dzięki czemu możemy badać ich funkcje specyficzne dla mitochondriów.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w mitochondria ukierunkowane na niektóre białka, można ją również zastosować do innych organelli, takich jak jądro, ER, Golgi i lizosom. Po wyhodowaniu, homogenizacji i granulowaniu komórek zgodnie z protokołem tekstowym, przenieś supernatant do nowej probówki. I odwirować próbkę w temperaturze 7 000 g i 4 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Następnie użyj 200 mikrolitrów lodowatego bufora IBC do ponownego zawieszenia granulatu i podziel homogenat na dwie porcje. Ponownie odwirować próbki w temperaturze 7 000 g i 4 stopnie Celsjusza przez 10 minut. I powtórz pranie.

Po odrzuceniu supernatantu dodaj 30 mikrolitrów buforu do lizy komórek do jednego z granulek i przechowuj lizat w temperaturze 80 stopni Celsjusza do immunoblottingu. Aby przeprowadzić ekstrakcję węglanem sodu z drugim osadem w celu oddzielenia białek rozpuszczalnych i związanych z błoną, dodaj 250 mikrolitrów 0,1 molowego węglanu sodu o pH 11,0 i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Wirować przy 100 000 g przez 20 minut.

Następnie zebrać supernatant i dodać równą objętość świeżo przygotowanego, 20% kwasu trichlorooctowego, aby wytrącić białka. Trzymaj na lodzie przez 30 minut. W międzyczasie dodaj 30 mikrolitrów buforu do lizy komórek do osadu i poddaj sonifikacji zgodnie z protokołem tekstowym przed przechowywaniem w temperaturze 80 stopni Celsjusza do immunoblottingu.

Po 30-minutowej inkubacji TCA odwirować reakcję przy 15 000 g przez 10 minut. Wyrzuć supernatant, a następnie użyj 80 mikrolitrów buforu do lizy komórek do ponownego zawieszenia osadu. Po wyizolowaniu frakcji mitochondrialnych z komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym, rozdziel frakcje mitochondrialne na 10 równych porcji.

Próbki należy opastylować w temperaturze 7 000 g i temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 10 minut. Użyj 30 mikrolitrów hipotonicznych sacharozy o różnych stężeniach z trypsyną lub bez, aby rozpuścić każdą osadkę. I inkubować na lodzie przez 30 minut.

Dodaj 3 mikrolitry 10-milimolowego PMSF do fiolek zawierających trypsynę, aby zatrzymać trawienie trypsyny. I inkubować na lodzie przez 10 minut. Odwirować próbki w temperaturze 14 000 g i 4 stopnie Celsjusza przez 10 minut.

I przenieś supernatant do nowej probówki. Aby lizować osad, dodaj 30 mikrolitrów buforu do lizy komórek. Próbki należy poddać sonizacji zgodnie z opisem w protokole tekstowym i przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza.

Aby skonstruować wektory Cdk-1 oznaczone mitochondriami GFP / RFP, sklonuj sekwencję celującą w mitochondria z prekursora ludzkiej podjednostki oksydazy cytochromu c 8A i obramuj n-końcem GFP lub RFP w miejscach Nhe1 i bAmH1 pEGFP-N1 lub pERFP-N1, przy użyciu standardowych technik klonowania molekularnego. Korzystając ze starterów opisanych w protokole tekstowym, amplifikuj geny Cdk1 i cyklinB1 zgodnie ze standardowymi technikami. Następnie użyj BamH1 do trawienia produktów PCR.

Przeprowadź reakcje na 1% żelu agarozowym, a następnie użyj żyletki, aby wyciąć fragmenty DNA o odpowiedniej wielkości. Następnie użyj zestawu do ekstrakcji żelu, aby oczyścić DNA. Następnie trawić jeden mikrogram plazmidów MTS-pEGFP-N1 i MTS-pERFP-N1 z 1 mikrolitrem BamH1 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 2 godziny.

Następnie dodaj 1 mikrolitr fosfatazy alkalicznej jelit cielęcych i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po uruchomieniu produktów trawienia na 1% żelu agarozowym i oczyszczeniu DNA zgodnie z opisem, należy przeprowadzić reakcję ligacji przy użyciu odczynników wymienionych w protokole tekstowym. Następnie inkubuj reakcję w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc.

Przekształć kompetentne komórki E. coli dH5-alfa za pomocą 10 mikrolitrów mieszaniny ligacyjnej. I hoduj bakterie na płytkach agaru LB plus 10 miligramów na mililitr kanamycyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia użyj sterylnej końcówki pipety, aby wybrać kolonię z talerza. I włóż końcówkę do probówki zawierającej 5 mililitrów kanamycyny LB. Inkubuj kulturę przez noc, a następnego ranka użyj mini zestawu przygotowawczego zgodnie z protokołem tekstowym, aby wyizolować plazmid.

Aby przetworzyć wykładniczo rosnące komórki MCF-10A, użyj plazmidów Cdk1 lub cyklinB-1 do przygotowania odczynnika do transfekcji plazmidu w stosunku 1:2 na 100 mikrolitrów surowicy i pożywki wolnej od antybiotyków. Transfekować komórki i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Barwienie i wizualizacja mitochondriów zgodnie z protokołem tekstowym.

Aby przeprowadzić sortowanie komórek, przetransfekuj 2 razy 10 do 5 komórek z pożądanymi wektorami na 6-dołkowej płytce, używając odczynnika do transfekcji 1:2 przygotowanego w 2,5 mililitra surowicy i pożywki wolnej od antybiotyków. Po inkubacji transfekcji przez 48 godzin, użyj cytometrii przepływowej, aby posortować na żywo komórki stabilnie eksprymujące białka Cdk-1 i znakowane RFP ClyclinB1 znakowane GFP zgodnie z protokołem tekstowym. Aby zmierzyć długość cyklu komórkowego za pomocą testu cytometrii przepływowej znakowania EdU, posortowane komórki wysiewano na 6-dołkowych płytkach o gęstości 2,5 razy 10 do 5 komórek na dołek.

Po całonocnej inkubacji dodać EdU do pożywki hodowlanej o końcowym stężeniu 25 mikromolów i inkubować przez dodatkową godzinę. Następnie w odstępach dwugodzinnych użyj 1% BSA w 500 mikrolitrach PBS, aby umyć jedną studzienkę komórek. I zbierz w 1,5-mililitrowej tubce.

Odwirować komórki o masie 350 g przez 5 minut. Następnie odrzucić supernatant. Usunąć osad, dodając 100 mikrolitrów roztworu utrwalającego.

Dobrze wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie użyj 1 mililitra 1% BSA w PBS, aby trzykrotnie umyć komórki. Następnie użyj 0,5 mililitra 70% etanolu, aby utrwalić komórki w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc.

Podczas znakowania EdU z komórkami transfekowanymi białkami znakowanymi GFP i RFP, bardzo ważne jest wygaszenie sygnałów fluorescencyjnych z GFP i RFP. Aby to osiągnąć, dodajemy dodatkowy etap nocnego utrwalania komórek przy użyciu 70% etanolu. Następnego dnia, po umyciu i przepuszczeniu komórek zgodnie z protokołem tekstowym, dodaj 0,5 mililitra koktajlu reakcyjnego do każdej probówki i dobrze wymieszaj.

Po inkubacji w ciemności i kolejnym płukaniu użyj 50 mikrogramów na mililitr jodku propidyny lub PI w 1% BSA PBS do barwienia DNA. Analizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej, aby śledzić populację EdU-dodatnią. Przedstaw rozproszony wykres punktowy komórek znakowanych EdU barwionych pod kątem zawartości DNA i EdU.

Użyj kanału APC dla Alexa 647 EdU, wykorzystując 30-pasmowy filtr 670 z całym obecnym światłem, mniej niż 685 nanometrów uderzających w ten filtr i kanał fikoerytryny dla PI z filtrem 15-pasmowym 581 przed nim, przy pełnym świetle obecnym mniejszym niż 600 nanometrów uderzającym w ten filtr. Przy standardowej strategii bramkowania dla przejęcia, wykreśl obszar FSC według obszaru SSC dla morfologii, a następnie PI przez Alexa 647 EdU dla barwienia komórek. Rejestruj dane dla wszystkich probówek jedna po drugiej, uzyskując 10 000 zdarzeń na próbkę.

Na tym rysunku jako markery lokalizacji submitochondrialnej wykorzystano białko macierzy mitochondrialnej Hsp60 i białko przestrzeni międzybłonowej Timm13. Podobnie jak w przypadku Hsp60, ale w przeciwieństwie do Timm13, cyklina B1 i Cdk1 były chronione przed trawieniem trypsyny, co wskazuje, że lokalizują się w macierzy mitochondrialnej. Jak pokazano tutaj, poprzez Western blotting izolowanych frakcji mitochondrialnych, przy użyciu konstruktów cyklinB1 i Cdk-1 znakowanych MTS i GFP, osiągnięto nadekspresję cykliny B1 i / lub Cdk-1 w mitochondriach.

Za pomocą testu pościgu impulsowego EdU wykazano, że znakowane komórki fazy S przechodziły przez fazę G2M i pojawiały się w fazie G1 tak szybko, jak 4 godziny w komórkach wykazujących ekspresję cykliny mitochondrialnej typu dzikiego B1 Cdk-1. W porównaniu z 6 godzinami, w komórkach transfekowanych kontrolą wektorową lub zmutowaną cykliną B1 Cdk-1, co wskazuje, że wzmocnienie mitochondrialnej cykliny B1 Cdk-1 przyspiesza postęp cyklu komórkowego. Po tej procedurze można zmierzyć inne metody, takie jak mitochondrialne wytwarzanie ATP, zużycie tlenu, potencjał błonowy i reaktywne formy tlenu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób mitochondrialna lokalizacja kinazy cyklu komórkowego Cdk-1 zmienia oddychanie mitochondrialne i produkcję energii.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać lokalizację mitochondriów i specyficzne dla mitochondriów funkcje kinazy jądrowej.