Name: Eksperymentalne podejścia do badania lokalizacji mitochondrialnej i funkcji kinazy jądrowego cyklu komórkowego, Cdk1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 15 s
Description: Poznaj metodę badania lokalizacji mitochondrialnej kinazy cyklu komórkowego Cdk1 i jej wpływu na przebieg cyklu. Technika ta pozwala analizować komunikację między jądrem a mitochondriami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NIH CA133402, CA152313 i Departament Energii Biuro Nauki DE-SC0001271. Dziękujemy Laboratorium Wspólnych Zasobów Cytometrii Przepływowej Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis, które otrzymało finansowanie z CA0933730 NCI P30 oraz granty NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 i S10 RR 026825 oraz z pomocą techniczną Pani Bridget McLaughlin i Pana Jonathana Van Dyke'a za pomoc w eksperymentach z cytometrią przepływową.

<ol><li>Weinert, T., Hartwell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+G2+delay+by+the+rad9+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci+Suppl%22%5BJournal%5D)">Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).</li>
<li>Takizawa, C. G., Morgan, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+mitosis+by+changes+in+the+subcellular+location+of+cyclin-B1-Cdk1+and+Cdc25C%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C.</a> Curr Opin Cell Biol. 12 (6), 658-665 (2000).</li>
<li>Allan, L. A., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+caspase-9+by+CDK1%2Fcyclin+B1+protects+mitotic+cells+against+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis.</a> Mol Cell. 26 (2), 301-310 (2007).</li>
<li>Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+fusion+and+division%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial fusion and division.</a> Trends Cell Biol. 17 (11), 563-569 (2007).</li>
<li>Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+converting+NADH%3Aquinone+oxidoreductase+%28complex+I%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I).</a> Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).</li>
<li>Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+analysis+of+the+peripheral+and+membrane+parts+of+mitochondrial+NADH+dehydrogenase+%28complex+I%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I).</a> J Mol Biol. 221 (3), 1027-1043 (1991).</li>
<li>Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory-chain+NADH+dehydrogenase+%28complex+I%29+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria.</a> Eur J Biochem. 197 (3), 563-576 (1991).</li>
<li>Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+complex+I%3A+structure%2C+function+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial complex I: structure, function and pathology.</a> J Inherit Metab Dis. 29 (4), 499-515 (2006).</li>
<li>Roessler, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+assignment+of+EPR+spectra+to+structurally+defined+iron-sulfur+clusters+in+complex+I+by+double+electron-electron+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 1930-1935 (2010).</li>
<li>Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mitochondrial+retrograde+signals+control+the+G1-S+cell+cycle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint.</a> Nat Genet. 40 (3), 356-361 (2008).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+B1%2FCdk1+coordinates+mitochondrial+respiration+for+cell-cycle+G2%2FM+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression.</a> Dev Cell. 29 (2), 217-232 (2014).</li>
<li>Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-targeting+sequence%2C+a+multi-role+sorting+sequence+recognized+at+all+steps+of+protein+import+into+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria.</a> J Biochem. 123 (6), 1010-1016 (1998).</li>
<li>Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+heavy+ion+tracks+by+labeling+3%27-OH+termini+of+induced+DNA+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Visualization of heavy ion tracks by labeling 3'-OH termini of induced DNA strand breaks.</a> J Radiat Res. 52 (4), 433-440 (2011).</li>
<li>Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history+of+the+initial+application+of+anti-5-BrdU+to+the+detection+and+measurement+of+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase.</a> Cytometry A. 58 (1), 45-52 (2004).</li>
<li>Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+%27click%27+reaction+for+labeling+and+detection+of+DNA+in+proliferating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic 'click' reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells.</a> Biotechniques. 49 (1), 525-527 (2010).</li>
<li>Kondo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+sensitive+fluorescent+dyes+in+linkage+of+laser+microdissection+and+two-dimensional+gel+electrophoresis+as+a+cancer+proteomic+study+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool.</a> Proteomics. 3 (9), 1758-1766 (2003).</li>
<li>Gundry, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+10%2C+Preparation+of+proteins+and+peptides+for+mass+spectrometry+analysis+in+a+bottom-up+proteomics+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Unit 10.25(2009).</li>
<li>Davies, D. Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavies%2C+D+%22Flow+Cytometry%22">Flow Cytometry</a>. Macey, M. G. , Humana Press. 257-276 (2007).</li>
<li>van den Heuvel, S., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+cyclin-dependent+kinases+in+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control.</a> Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).</li>
<li>Terry, N. H. A., White, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+after+bromodeoxyuridine+labeling+to+measure+S+and+G2%2BM+phase+durations+plus+doubling+times+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protcols%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo.</a> Nat. Protcols. 1 (2), 859-869 (2006).</li>
<li>Becker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preprotein+translocase+of+the+outer+mitochondrial+membrane%3A+reconstituted+Tom40+forms+a+characteristic+TOM+pore%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore.</a> J Mol Biol. 353 (5), 1011-1020 (2005).</li>
<li>Karniely, S., Pines, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+translation--dual+destination%3A+mechanisms+of+dual+protein+targeting+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Single translation--dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes.</a> EMBO Rep. 6 (5), 420-425 (2005).</li>
<li>Candas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CyclinB1%2FCdk1+phosphorylates+mitochondrial+antioxidant+MnSOD+in+cell+adaptive+response+to+radiation+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress.</a> J Mol Cell Biol. 5 (3), 166-175 (2013).</li>
<li>Nantajit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+B1%2FCdk1+phosphorylation+of+mitochondrial+p53+induces+anti-apoptotic+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response.</a> PLoS One. 5 (8), e12341(2010).</li>
<li>Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+based+on+click+chemistry%2C+which+overcomes+limitations+of+cell+cycle+analysis+by+classical+determination+of+BrdU+incorporation%2C+allowing+multiplex+antibody+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining.</a> Cytometry A. 73 (7), 626-636 (2008).</li>
<li>Niwa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+nature+of+the+light+emitter+of+the+Aequorea+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13617-13622 (1996).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Marouga, R., David, S., Hawkins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+DIGE+system%3A+2D+fluorescence+difference+gel+analysis+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology.</a> Anal Bioanal Chem. 382 (3), 669-678 (2005).</li>
<li>Timms, J. F., Cramer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Difference gel electrophoresis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4886-4897 (2008).</li>
<li>Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrane%2C+J+%22BD+Biosciences+Appl+Notes%22">BD Biosciences Appl Notes</a>. , (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podobnie jak białka przeznaczone dla innych organelli subkomórkowych, białka docelowe mitochondriów posiadają sygnały celujące w swojej pierwotnej lub drugorzędowej strukturze, które kierują je do organelli za pomocą skomplikowanych maszyn do translokacji i zwijania białek21,22. Sekwencje ukierunkowane na mitochondria (MTS) uzyskane z wyłącznie białek rezydujących w mitochondriach, takich jak COX8, można dodać do N-końca dowolnej sekwencji genu, aby skierować określone białka do mitochondriów11,23,24</sup...

U ssaków postęp cyklu komórkowego zależy od wysoce uporządkowanych zdarzeń kontrolowanych przez cykliny i kinazy zależne od cyklin (Cdk)1. Dzięki swojej cytoplazmatycznej, jądrowej i centrosomalnej lokalizacji, CyclinB1 / Cdk1 jest w stanie synchronizować różne zdarzenia w mitozie, takie jak rozpad otoczki jądrowej i separacja centrosomów2. CyklinaB1/Cdk1 chroni komórki mitotyczne przed apoptozą3 i wspomaga rozszczepienie mitochondriów, co jest krytycznym krokiem dla równomiernego rozmieszczenia mitochondriów do nowo powstałych komórek potomnych4.
W proliferujących komórkach ssaków, mitochondrialne ATP jest generowane przez maszynerię fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) (łańcuch transportu elektronów), która składa się z 5 kompleksów wielopodjednostkowych; kompleks I - kompleks V (CI-CV). Dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NADH): oksydoreduktaza ubichinonu lub kompleks I (CI) jest największym i najmniej poznanym z pięciu kompleksów5. Kompleks składa się z 45 podjednostek, z których 14 tworzy rdzeń katalityczny. Po złożeniu kompleks przyjmuje strukturę w kształcie litery L, z jednym ramieniem wystającym w matrycę, a drugim ramieniem osadzonym w wewnętrznej membranie6,7. Mutacje w podjednostkach CI są przyczyną różnych zaburzeń mitochondrialnych8. Funkcjonalnie wydajny CI w OXPHOS jest wymagany nie tylko dla ogólnego oddychania mitochondrialnego9, ale także dla pomyślnej progresji cyklukomórkowego10. Odkrycie mechanizmów leżących u podstaw funkcjonowania tego związanego z błoną kompleksu enzymatycznego w zdrowiu i chorobie może umożliwić opracowanie nowych procedur diagnostycznych i zaawansowanych strategii terapeutycznych. W niedawnym badaniu odkryliśmy, że kompleks CyclinB1 / Cdk1 przemieszcza się do mitochondriów w fazie M (Gap 2) G2 / (Mitozy) i fosforyluje podjednostki CI w celu zwiększenia produkcji energii mitochondrialnej, potencjalnie w celu zrównoważenia zwiększonego zapotrzebowania komórek na energię podczas cyklu komórkowego11. Tutaj prezentujemy eksperymentalne procedury i strategie, które można wykorzystać do badania translokacji mitochondrialnej kinaz jądrowych / cytoplazmatycznych, ich substratów mitochondrialnych, a także funkcjonalnych konsekwencji ich lokalizacji mitochondrialnej na przykładzie CyclinB1 / Cdk1.
Odkrycie, że kompleks CyclinB1/Cdk1 przemieszcza się do mitochondriów, gdy jest to potrzebne, skłoniło do podjęcia badań nad specyficzną dla mitochondriów nadekspresją i knockdownem tego kompleksu. Aby osiągnąć ekspresję białek specyficzną dla mitochondriów, można dodać sekwencję ukierunkowaną na mitochondria (MTS) w N-końcu białka będącego przedmiotem zainteresowania. Sekwencje ukierunkowane na mitochondria umożliwiają sortowanie białek mitochondrialnych do mitochondriów, w których normalnie się znajdują12. Użyliśmy sekwencji ukierunkowanej na mitochondria 87 zasad pochodzącej z prekursora ludzkiej podjednostki 8A oksydazy cytochromu c (COX8) i sklonowaliśmy ją do cykliny B1 znakowanej zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) lub Cdk1 znakowanej czerwonym białkiem fluorescencyjnym (RFP) zawierającej plazmidy w ramce. Ta metoda pozwoliła nam skierować cyklinę B1 i Cdk1 do mitochondriów, w szczególności zmieniając ekspresję mitochondrialną tych białek bez wpływu na ich pulę jądrową. Dzięki fluorescencyjnemu znakowaniu tych białek byliśmy w stanie monitorować ich lokalizację w czasie rzeczywistym. Podobnie, wprowadziliśmy MTS do plazmidu zawierającego znakowany przez RFP dominujący ujemny Cdk1, co pozwoliło nam specyficznie obniżyć ekspresję mitochondrialną i funkcje Cdk1. Konieczne jest rozróżnienie między mitochondrialnymi i jądrowymi funkcjami kinaz, które mają podwójną lokalizację, taką jak Cdk1. Inżynieria MTS w N-końcu tych podwójnie funkcjonalnych kinaz oferuje świetną strategię, która jest łatwa do zastosowania i skuteczna.
Ponieważ Cdk1 jest kinazą cyklu komórkowego, kluczowe jest określenie przebiegu cyklu komórkowego, gdy Cdk1 jest zlokalizowany w mitochondriach. Aby to osiągnąć, zastosowaliśmy nową metodę monitorowania zawartości DNA w komórkach. Tradycyjne metody obejmują użycie BrdU (bromodeoksyurydyny), syntetycznego analogu tymidyny, który włącza się do nowo zsyntetyzowanego DNA podczas fazy S cyklu komórkowego w celu zastąpienia tymidyny. Następnie komórki, które aktywnie replikują swoje DNA, można wykryć za pomocą przeciwciał anty-BrdU. Jedną z wad tej metody jest to, że wymaga ona denaturacji DNA, aby zapewnić dostęp do przeciwciała BrdU za pomocą ostrych metod, takich jak obróbka kwasowa lub cieplna, co może skutkować niespójnością wyników13,14. Alternatywnie, zastosowaliśmy podobne podejście do monitorowania aktywnie dzielących się komórek za pomocą innego analogu tymidyny, EdU. Detekcja EdU nie wymaga ostrej denaturacji DNA, ponieważ łagodna obróbka detergentem umożliwia odczynnikowi detekcyjnemu dostęp do EdU w nowo zsyntetyzowanym DNA. Metoda EdU okazała się bardziej wiarygodna, spójna i może być przeprowadzana w celu przeprowadzenia analizy o wysokiej przepustowości15.
Na koniec, aby określić mitochondrialne substraty Cdk1, użyliśmy narzędzia proteomicznego o nazwie 2D-DIGE, które jest zaawansowaną wersją klasycznej dwuwymiarowej elektroforezy żelowej. Elektroforeza dwuwymiarowa rozdziela białka zgodnie z ich punktem izoelektrycznym w pierwszym wymiarze i masą cząsteczkową w drugim. Ponieważ modyfikacje potranslacyjne, takie jak fosforylacja, wpływają na punkt izoelektryczny i masę cząsteczkową białek, żele 2D mogą wykrywać różnice między stanami fosforylacji białek w różnych próbkach. Wielkość (obszar i intensywność) plamek białkowych zmienia się wraz z poziomem ekspresji białek, co pozwala na ilościowe porównanie wielu próbek. Korzystając z tej metody, byliśmy w stanie zróżnicować fosforylowane białka w komórkach eksprymujących Cdk1 typu dzikiego i zmutowanych, ukierunkowanych na mitochondria. Specyficzne plamki białkowe, które występowały w typie dzikim, ale brakowało ich w zmutowanym preparacie Cdk1 ukierunkowanym na mitochondria, wyizolowano i zidentyfikowano za pomocą spektrometrii mas.
W tradycyjnych żelach 2D, barwniki trifenylometanowe są używane do wizualizacji białek na żelu. 2D-DIGE używa fluorescencyjnych etykiet białkowych z minimalnym wpływem na ruchliwość elektroforetyczną białka. Różne próbki białek mogą być znakowane różnymi barwnikami fluorescencyjnymi, mieszanymi ze sobą i rozdzielanymi przez identyczne żele, co pozwala na koelektroforezę wielu próbek na jednym żelu16. Minimalizuje to różnice między żelami, co jest krytycznym problemem w badaniach proteomicznych opartych na żelu.

<table><tbody><tr><td>32P ATP&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU002001MC&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne przeciw myszom</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A-11003</td><td>Alexa-546 sprzężone</td></tr><tr><td>drugorzędowe przeciwciało anty-królicze</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A11029</td><td>Alexa-488 sprzężony</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Research Organics</td><td>1166A</td><td>Do testu kinazy in vitro</td></tr><tr><td>Przeciwciało Cdk1</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>9112</td><td></td></tr><tr><td>Bufor kinazy Cdk1</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020S</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Zestaw do obrazowania</td><td>Life Technologies</td><td>C10337</td><td>Do analizy cyklu komórkowego z oznakowaniem</td></tr> <tr><td>EdUTechnologia</td><td>sygnalizacji komórkowej</td> przeciwciała COX IV <td>4844S</td><td>Do mitochondrialnego barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Przeciwciało cykliny B1</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-752</td><td></td></tr><tr><td>Kompleks enzymatyczny cyklinB1 / Cdk1</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020S</td><td>Unikaj zamrażania/rozmrażania</td></tr><tr><td>CyDye DIGE Zestaw do znakowania fluorów</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>25-8009-83</td><td></td></tr><tr><td>DIGE Gel i zestaw buforowy DIGE</td><td>GE Opieka zdrowotna Nauki przyrodnicze</td><td>28-9480-26 AA</td><td></td></tr><tr><td>Dimetyloformamid&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319937</td><td>DMF</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0611</td><td>DTT</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>EMD Millipore</td><td>71004</td><td>Do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce</td></tr><tr><td>Dpn I enzym</td><td>Stratagene</td><td>200519-53</td><td>Do mutagenezy ukierunkowanej</td></tr><tr><td>Suchy płyn do pokrywania pasków</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1335-01</td><td>Stosowany jako olej mineralny</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>4040-03</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>409910250</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Vacufuge Koncentrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-748-13</td><td>Używany jako koncentrator wirówki próżniowej</td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Rozwiązanie montażowe zapobiegające blaknięciu</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy Fortessa</td><td>BD Biosciences</td><td>649908</td><td>Do cyklu komórkowego analiza z oznakowaniem EdU</td></tr><tr><td>Histone H1</td><td>Calbiochem</td><td>382150</td><td>Do testu kinazy in vitro</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelem QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Do oczyszczania fragmentów DNA z żeli agarozowych</td></tr><tr><td>Immobiline DryStrip Gels</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>18-1016-61</td><td>Paski IEF (izoelektryczne ogniskowanie)</td></tr><tr><td>Unieruchomiony Glutation</td><td>Thermo Scientific</td><td>15160</td><td>Koraliki glutationowo-agarozowe</td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>IAA</td></tr><tr><td>IPGphor 3 Izoelektryczna jednostka ogniskująca</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>11-0033-64</td><td>Uchwyty pasków IPGphor</td></tr><tr><td>Izopropylo-b-D-tio-galaktopionozyd&nbsp;</td><td>RPI Corp</td><td>156000-5.0</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9783</td><td>Do buforu do lizy komórek</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668027</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>Lizyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5501</td><td>Do etykietowania CyDye</td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>EMD Chemicals</td><td>5960</td><td></td></tr><tr><td>Mitoctracker Czerwono-Zielony</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>M7512/M7514</td><td>Mitochondrialne barwniki fluorescencyjne</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>EMD Chemikalia</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1</td><td>Clonetech</td><td>6085-1</td><td>Wektor wyrażający GFP</td></tr><tr><td>Pfu</td><td>Stratagene</td><td>600-255-52</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-5X-1&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9545-53</td><td>Wektor wyrażający GST</td></tr><tr><td>Fluorek fenylometylosulfonylu</td><td>Shelton Scientific</td><td>IB01090</td><td>PMSF</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Life Technologies</td><td>14040</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Spectra/Por 4 rurki do dializy</td><td>Spectrum Labs</td><td>132700</td><td>jako porowata rurka membranowa do dializy</td></tr><tr><td>Pro-Q Diamentowa substancja fosfoproteinowa w żelu</td><td>Life Technologies</td><td>P-33300</td><td>Do barwienia fosfoprotein na żelach 2D</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteinaz</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td>Do buforu do lizy komórek</td></tr><tr><td>Zestaw do mutagenezy ukierunkowanej QuikChange</td><td>Stratagene</td><td>200519-5</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Zestaw</td> do <td>izolacji plazmidu</td><td>Qiagen</td><td>27104</td> MiniPrep</tr><tr><td>RO-3306</td><td>Alexis Biochemicals</td><td>270-463-M001</td><td>Inhibitor Cdk1</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>MP Biomedicals</td><td>150154</td><td>Inhibitor kompleksu I</td></tr><tr><td>Węglan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S93359</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>EMD Chemicals</td><td>SX0420-5</td><td>Do buforu do lizy komórek</td></tr><tr><td>Ortowanadan sodu</td><td>MP Biomedicals</td><td>159664</td><td>Do buforu do lizy komórek</td></tr><tr><td>Pirofosforan sodu dekahydrat</td><td>Alfa Aesar</td><td>33385</td><td>Do buforu do lizy komórek</td></tr><tr><td>Sód &beta;-glicerofosforan</td><td>Alfa Aesar</td><td>L03425</td><td>Do buforu do lizy komórek</td></tr><tr><td>SpectraMax M2e&nbsp;</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>M2E</td><td>Czytnik mikropłytek</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Tłuczek do mielenia tkanek</td><td>Kimble Chase</td><td>885301-0007</td><td>Do izolacji mitochondriów</td></tr><tr><td>Rurka do mielenia tkanek</td><td>Kimble Chase</td><td>885303-0007</td><td>Do izolacji mitochondriów</td></tr><tr><td>Roztwór kwasu trichlorooctowego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0699</td><td>TCA</td></tr><tr><td>Tris</td><td>MP Biomedicals</td><td>103133</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Teknova</td><td>T1105</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Calbiochem</td><td>650211</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon Imager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9558-09</td><td>Laserowy skaner żelowy do 2D-DIGE</td></tr><tr><td>Ubiquinone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7956</td><td></td></tr></tbody></table>

eksperymentalne podejścia do badania lokalizacji mitochondrialnej i funkcji kinazy jądrowego cyklu komórkowego, cdk1

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Chociaż mitochondria posiadają własną maszynerię transkrypcyjną, tylko 1% białek mitochondrialnych jest syntetyzowanych wewnątrz organelli. Białka kodowane jądrowo są transportowane do mitochondriów kierowanych przez sekwencje ukierunkowane na mitochondria (MTS); jednak większość zlokalizowanych białek mitochondrialnych nie ma możliwego do zidentyfikowania MTS. Niemniej jednak fakt, że MTS może instruować białka, aby przedostały się do mitochondriów, stanowi cenne narzędzie do badania funkcji mitochondrialnych normalnie jądrowych i/lub cytoplazmatycznych białek. Niedawno zidentyfikowaliśmy kompleks kinazy cyklu komórkowego CyclinB1 / Cdk1 w mitochondriach. Aby dokładnie zbadać funkcje mitochondrialne tego kompleksu, niezbędna była nadekspresja mitochondriów i knockdown tego kompleksu bez ingerencji w jego funkcje jądrowe lub cytoplazmatyczne. Znakując CyclinB1 / Cdk1 za pomocą MTS, byliśmy w stanie osiągnąć nadekspresję mitochondrialną tego kompleksu, aby zbadać jego cele mitochondrialne, a także funkcje. Poprzez znakowanie dominująco-ujemnego Cdk1 za pomocą MTS, osiągnięto hamowanie aktywności Cdk1, szczególnie w mitochondriach. Potencjalne cele mitochondrialne kompleksu CyclinB1/Cdk1 zidentyfikowano przy użyciu podejścia proteomicznego opartego na żelu. W przeciwieństwie do tradycyjnej analizy żelowej 2D, zastosowaliśmy technologię dwuwymiarowej różnicowej elektroforezy żelowej (2D-DIGE), a następnie barwienie fosfoprotein, aby fluorescencyjnie znakować różnie fosforylowane białka w mitochondrialnych komórkach eksprymujących Cdk1. Identyfikacja plam fosfoproteinowych, które zostały zmienione w typie dzikim w porównaniu z dominującymi ujemnymi mitochondriami zawierającymi Cdk1, ujawniła tożsamość mitochondrialnych celów Cdk1. Wreszcie, aby określić wpływ lokalizacji mitochondrialnej CyclinB1 / Cdk1 w progresji cyklu komórkowego, zastosowano test proliferacji komórek przy użyciu syntetycznego analogu tymidyny EdU (5-etynylo-2′-deoksyurydyny) w celu monitorowania komórek w trakcie cyklu komórkowego i replikacji ich DNA. W sumie zademonstrowaliśmy różne dostępne podejścia do badania lokalizacji mitochondriów i aktywności kinazy cyklu komórkowego. Są to zaawansowane, ale łatwe do naśladowania metody, które będą korzystne dla wielu badaczy biologii komórki.

Submitochondrialna lokalizacja CyclinB1 i Cdk1
Ekstrakcję węglanem sodu stosuje się w celu ustalenia, czy białko znajduje się wewnątrz mitochondriów, czy na ich powierzchni zewnętrznej, a konkretnie w błonie zewnętrznej. Po wykazaniu lokalizacji białka wewnątrz mitochondriów, dalsze określenie lokalizacji submitochondrialnej można przeprowadzić poprzez mitoplastykę w połączeniu z trawieniem proteazą. Aby określi...

Tutaj opisujemy, jak badać mitochondrialną lokalizację kinazy (cyklu komórkowego) i jak określić jej submitochondrialne położenie, a także potencjalne substraty/cele mitochondrialne. Wymuszona ekspresja białek w mitochondriach stanowi użyteczne narzędzie do badania funkcjonalnych konsekwencji mitochondrialnej lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Eksperymentalne podejścia do badania lokalizacji mitochondrialnej i funkcji kinazy jądrowego cyklu komórkowego, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Ogólnym celem poniższej procedury jest określenie lokalizacji submitochondrialnej kinazy cyklu komórkowego, która zazwyczaj znajduje się w jądrze komórkowym, a następnie analiza wpływu jej lokalizacji mitochondrialnej na przebieg cyklu komórkowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny badań nad mitochondriami, takie jak sposób komunikacji jądra z mitochondriami podczas cyklu komórkowego. Dzięki znakowaniu białek sekwencją kierującą do mitochondriów możemy wykorzystać specyficzną nadekspresję białek w mitochondriach, co pozwala na badanie ich funkcji specyficznych dla tych organelli.Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w targetowanie określonych białek do mitochondriów, może być ona również zastosowana do innych organelli, takich jak jądro komórkowe, ER, aparat Golgiego oraz lizosomy. Po hodowli, homogenizacji i wirowaniu komórek zgodnie z protokołem tekstowym, przenieś supernatant do nowej probówki. Następnie odwiruj próbkę przy 7 000 g i 4 stopniach Celsjusza przez 10 minut.Następnie należy użyć 200 µL lodowatego buforu IBC do resuspensji osadu, a homogenat podzielić na dwie alikwoty. Próbki ponownie odwiruj przy 7 000 g i 4 °C przez 10 minut. Następnie powtórz etap przemywania.Po odlaniu supernatantu, do jednego z osadów należy dodać 30 µL buforu do lizy komórek, a następnie przechowywać lizat w temperaturze -80 °C do analizy immunoblottingowej. Aby przeprowadzić ekstrakcję węglanem sodu z drugiego osadu w celu oddzielenia białek rozpuszczalnych od białek związanych z błoną, należy dodać 250 µL 0,1 M węglanu sodu o pH 11,0 i inkubować na lodzie przez 30 minut. Następnie odwiruj próbkę przy 100 000 g przez 20 minut.Następnie należy zebrać nadosad i dodać równą objętość świeżo przygotowanego, 20% kwasu trójchlorooctowego w celu wytrącenia białek. Przechowywać w lodzie przez 30 minut. W międzyczasie dodać 30 µL buforu do lizy komórek do pelletu i poddać sonikacji zgodnie z protokołem tekstowym przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C do analizy immunoblottingowej.Po 30-minutowej inkubacji z TCA odwiruj mieszaninę reaction przy 15 000 g przez 10 minut. Odlej supernatant, a następnie użyj 80 µl buforu do lizy komórek, aby resuspendować osad. Po wyizolowaniu frakcji mitochondrialnych z komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym, podziel frakcje mitochondrialne na 10 równych części.Odwiruj próbki z prędkością 7 000 g w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 10 minut. Do rozpuszczenia każdego osadu użyj 30 µL hipotonicznych buforów sacharozowych o różnych stężeniach, z dodatkiem trypsyny lub bez niej. Następnie inkubuj na lodzie przez 30 minut.Do probówek zawierających trypsynę dodaj 3 µL PMSF o stężeniu 10 mM, aby zatrzymać trawienie trypsyną. Następnie inkubuj na lodzie przez 10 minut. Odwiruj próbki przy 14 000 g i 4 °C przez 10 minut.Następnie przenieść supernatant do nowej probówki. Aby zlizować pellet, dodać 30 µL buforu do lizy komórek. Próbki poddać sonikacji zgodnie z opisem w protokole tekstowym i przechowywać w temperaturze -80 °C.Aby skonstruować wektory cyclinB-1 Cdk-1 z GFP/RFP ukierunkowane na mitochondria, należy sklonować sekwencję ukierunkowującą na mitochondria z prekursora ludzkiej podjednostki 8A cytochromu c oksydazy i połączyć ją z końcem n-końcowym GFP lub RFP w miejscach Nhe1 i BamH1 w wektorach pEGFP-N1 lub pERFP-N1, stosując standardowe techniki klonowania molekularnego. Wykorzystując primery opisane w protokole tekstowym, należy namnożyć geny Cdk1 i cyclinB1 zgodnie ze standardowymi metodami. Następnie produkty PCR należy poddać trawieniu enzymem BamH1.Przeprowadź reakcje na żelu agarozowym o stężeniu 1%, a następnie za pomocą żyletki wytnij fragmenty DNA o odpowiedniej wielkości. Następnie użyj zestawu do ekstrakcji z żelu, aby oczyścić DNA. W kolejnym kroku poddaj jeden mikrogram plazmidów MTS-pEGFP-N1 oraz MTS-pERFP-N1 trawieniu 1 µL BamH1 w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.Następnie dodaj 1 µL fosfatazy alkalicznej z jelit cielęcych i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po rozdzieleniu produktów trawienia na 1% żelu agarozowym i oczyszczeniu DNA zgodnie z powyższym opisem, przygotuj reakcję ligacji, używając odczynników wymienionych w protokole tekstowym. Następnie inkubuj reakcję w temperaturze 4 °C przez noc.Przeprowadź transformację kompetentnych komórek e. coli dH5-alpha przy użyciu 10 µL mieszaniny ligacji. Następnie wysiej bakterie na płytki z agarem LB z dodatkiem 10 mg/mL kanamycyny i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc.Następnego dnia za pomocą sterylnego grotu pipety pobierz kolonię z płytki i wprowadź grot do probówki zawierającej 5 mililitrów LB z kanamycyną. Inkubuj kulturę przez noc, a następnego ranka użyj zestawu do mini-prepu zgodnie z protokołem tekstowym, aby wyizolować plazmid.Aby przeprowadzić transfekcję komórek MCF-10A w fazie wykładniczego wzrostu, należy użyć plazmidów Cdk1 lub cyclinB-1 do przygotowania odczynnika do transfekcji plazmidowej w stosunku 1:2 w 100 µL pożywki bez surowicy i antybiotyków. Następnie należy przeprowadzić transfekcję komórek i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 48 godzin. Mitochondria należy barwić i wizualizować zgodnie z protokołem opisanym w tekście.Aby przeprowadzić sortowanie komórek, należy transfektować 2 x 10⁵ komórek odpowiednimi wektorami w płytce 6-dołkowej, stosując stosunek DNA do odczynnika transfekcyjnego 1:2 w 2,5 ml pożywki bez surowicy i antybiotyków. Po 48-godzinnej inkubacji po transfekcji należy wykorzystać cytometrię przepływową do sortowania żywych komórek stabilnie ekspresujących białka Cdk-1 z tagiem GFP oraz cyklinę B1 z tagiem RFP zgodnie z protokołem tekstowym. W celu pomiaru długości cyklu komórkowego przy użyciu testu cytometrii przepływowej z znakowaniem EdU, należy wysiać posortowane komórki w płytkach 6-dołkowych w gęstości 2,5 x 10⁵ komórek na dołek.Po inkubacji przez noc dodać EdU do pożywki hodowlanej do stężenia końcowego 25 µM i inkubować przez kolejną godzinę. Następnie w odstępach dwugodzinnych przemyć jedną studnią z komórkami roztworem 1% BSA w 500 µL PBS. Następnie zebrać zawartość do probówki 1,5 ml.Odwirować komórki przy 350 g przez 5 minut. Następnie odrzucić nadsącz. Resuspender osad poprzez dodanie 100 µl roztworu utrwalającego.Wymieszać dokładnie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie przemyć komórki trzykrotnie, używając 1 ml 1% BSA w PBS. Potem użyć 0,5 ml 70% etanolu, aby utrwalić komórki w temperaturze 4°C przez noc.Podczas przeprowadzania znakowania EdU w komórkach transfekowanych białkami z znacznikami GFP i RFP, kluczowe jest wygaszenie sygnałów fluorescencyjnych GFP i RFP. Aby to osiągnąć, wprowadzamy dodatkowy etap całonocnej fiksacji komórek przy użyciu 70% ethanol. Następnego dnia, po przemyciu i permeabilizacji komórek zgodnie z protokołem tekstowym, do każdej probówki należy dodać 0,5 milliliters koktajlu reakcyjnego i dokładnie wymieszać.Po inkubacji w ciemności i kolejnym przemyciu, należy użyć 50 µg/mL jodku propidyny lub PI w 1% BSA PBS w celu barwienia DNA. Komórki należy przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej, aby śledzić populację EdU-dodatnią. Przedstaw wykres punktowy (scatter plot) komórek znakowanych EdU, zabarwionych pod kątem zawartości DNA oraz EdU.Użyj kanału APC dla Alexa 647 EdU, wykorzystując filtr pasmowy 670 30, w którym wszystkie docierające światło ma długość fali poniżej 685 nanometrów, oraz kanał fikoerytryny dla PI z filtrem pasmowym 581 15, w którym wszystkie docierające światło ma długość fali poniżej 600 nanometrów. Stosując standardową strategię bramkowania dla akwizycji, wykreśl powierzchnię FSC względem powierzchni SSC w celu oceny morfologii, a następnie PI względem Alexa 647 EdU w celu analizy barwienia komórek. Rejestruj dane dla wszystkich probówek jedna po drugiej, zbierając 10 000 zdarzeń na próbkę.Na tej rycinie białko macierzy mitochondrialnej Hsp60 oraz białko przestrzeni międzybłonowej Timm13 posłużyły jako markery lokalizacji submitochondrialnej. Podobnie jak w przypadku Hsp60, lecz w przeciwieństwie do Timm13, cyclinB1 i Cdk1 zostały chronione przed trawieniem trypsyną, co wskazuje na ich lokalizację w macierzy mitochondrialnej. Jak pokazano tutaj, za pomocą Western blottingu wyizolowanych frakcji mitochondrialnych, z wykorzystaniem konstruktów cyclinB1 i Cdk-1 znakowanych MTS i GFP, osiągnięto nadekspresję cyclinB1 i/lub Cdk-1 w mitochondriach.Z wykorzystaniem testu EdU pulse chase wykazano, że znakowane komórki w fazie S przeszły przez fazę G2M i pojawiły się w fazie G1 już po 4 godzinach w komórkach wykazujących ekspresję mitochondrialnej cyclinB1 Cdk-1 typu dzikiego. W porównaniu do tego czasu, w komórkach transfekowanych wektorem kontrolnym lub zmutowaną cyclinB1 Cdk-1 proces ten trwał 6 godzin, co wskazuje, że zwiększenie ilości mitochondrialnej cyclinB1 Cdk-1 przyspiesza progresję cyklu komórkowego. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak pomiar generowania ATP w mitochondriach, zużycia tlenu, potencjału błonowego oraz poziomu reaktywnych form tlenu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące tego, w jaki sposób lokalizacja mitochondrialna kinazy cyklu komórkowego Cdk-1 wpływa na oddychanie mitochondrialne i wydajność energetyczną.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak badać lokalizację mitochondrialną oraz funkcje specyficzne dla mitochondriów kinazy jądrowej.

experimental-approaches-to-study-mitochondrial-localization-function

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Reportery oparte na FRET są coraz częściej wykorzystywane do monitorowania aktywności kinaz i fosfataz w żywych komórkach. W niniejszej pracy opisujemy metodę wykorzystania reporterów opartych na FRET do oceny zmian w fosforylacji celu zależnych od cyklu komórkowego.

Monitorowanie aktywności kinaz i fosfataz w cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego FRET

Przejście z metafazy do anafazy jest inicjowane poprzez zależną od kompleksu anafazy-promującego (APC/C) ubikwitynację i następującą po niej degradację cykliny B. W niniejszej pracy opracowaliśmy system, który po zastosowaniu znakowania metodą pulse-chase umożliwia monitorowanie proteolizy cykliny B w całych populacjach komórek oraz ułatwia wykrywanie interferencji wywołanej przez punkt kontrolny mitozy.

Badanie proteolizy cykliny B na poziomie pojedynczej komórki w populacjach całych komórek

Analiza zależności między strukturą a funkcją mitochondriów jest niezbędna do dokładnego zrozumienia mechanizmów regulacyjnych funkcjonalności mitochondriów. W artykule opisano i zademonstrowano specyficzne metody badania struktury i funkcji mitochondriów w żywych i utrwalonych jajnikach Drosophila.

Badanie struktury i funkcji mitochondriów w jajnikach Drosophila

Ten protokół opisuje strategię optogenetyczną do modulowania aktywności kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus. Metoda ta pozwala na odwracalną aktywację szlaku sygnałowego MAPK w hodowli komórek ssaków oraz w wielokomórkowych organizmach żywych, takich jak zarodki Xendopus, z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Odwracalna modulacja szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem za pośrednictwem światła podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus

Przedstawiamy protokół podwójnej synchronizacji komórek HeLa z tymidyną, a następnie analizę za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości. Metoda ta jest kluczem do uzyskania dużej liczby komórek, które przechodzą synchronicznie z fazy S do mitozy, umożliwiając badania nad mitotycznymi rolami wielofunkcyjnych białek, które również pełnią funkcje interfazowe.

Połączenie mitotycznej synchronizacji komórek i mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania roli wielofunkcyjnych białek cyklu komórkowego podczas mitozy

Kinaza zależna od cykliny 1 (Cdk1) jest aktywowana w fazie G2 cyklu komórkowego i reguluje wiele szlaków komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół testu kinazy in vitro z Cdk1, który umożliwia identyfikację miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 w celu ustalenia celów komórkowych tej ważnej kinazy.

Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla kinazy 1 zależnej od cykliny za pomocą testu kinazy in vitro

Tutaj prezentujemy protokół do oceny dynamiki powstawania wrzeciona i progresji mitotycznej. Nasze zastosowanie obrazowania poklatkowego umożliwia użytkownikowi identyfikację komórek na różnych etapach mitozy, śledzenie i identyfikację defektów mitotycznych oraz analizę dynamiki wrzeciona i losu komórek mitotycznych po ekspozycji na leki antymitotyczne.

Obrazowanie żywych komórek w celu oceny dynamiki czasu metafazy i losu komórki po perturbacjach wrzeciona mitotycznego

Genom mitochondrialny drożdży piekarskich koduje osiem polipeptydów. Celem obecnego protokołu jest oznaczenie ich wszystkich, a następnie wizualizacja ich jako oddzielnych pasm.

Znakowanie i wizualizacja produktów ekspresji genomu mitochondrialnego w drożdżach piekarskich Saccharomyces cerevisiae

Cybrydy transcyondryjne to hybrydowe komórki uzyskane przez fuzję komórek zubożonych w mitochondrialne DNA (mtDNA) (komórki rho0) z cytoplastami (komórkami wyłuszczonymi) pochodzącymi od pacjentów dotkniętych zaburzeniami mitochondrialnymi. Pozwalają one na określenie jądrowego lub mitochondrialnego pochodzenia choroby, ocenę aktywności biochemicznej oraz potwierdzenie patogenetycznej roli wariantów związanych z mtDNA.

Podejście in vitro do badania dysfunkcji mitochondriów: model Cybrid

Ten protokół zapewnia ustandaryzowane podejście do obrazowania morfologii mitochondriów w wielu tkankach C. elegans podczas starzenia.

Obrazowanie i ilościowe określanie morfologii mitochondriów u C. elegans podczas starzenia

Artykuł ten opisuje wykorzystanie mikroskopii konfokalnej oraz ImageJ do oceny dynamiki rozszczepienia i fuzji mitochondriów za pomocą fluorescencji przełączającej się foto Dendra2.

Ocena dynamiki rozszczepienia/fuzji mitochondrialnej w komórkach rurkowatych nerek bliższych

Poznaj metodę badania lokalizacji mitochondrialnej kinazy cyklu komórkowego Cdk1 i jej wpływu na przebieg cyklu. Technika ta pozwala analizować komunikację między jądrem a mitochondriami.

Eksperymentalne podejścia do badania lokalizacji mitochondrialnej i funkcji kinazy jądrowego cyklu komórkowego, Cdk1

Przeglądaj więcej filmów