Eksperymentalne podejścia do badania lokalizacji mitochondrialnej i funkcji kinazy jądrowego cyklu komórkowego, Cdk1

Ogólnym celem poniższej procedury jest określenie lokalizacji submitochondrialnej kinazy cyklu komórkowego, która zazwyczaj znajduje się w jądrze komórkowym, a następnie analiza wpływu jej lokalizacji mitochondrialnej na przebieg cyklu komórkowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny badań nad mitochondriami, takie jak sposób komunikacji jądra z mitochondriami podczas cyklu komórkowego. Dzięki znakowaniu białek sekwencją kierującą do mitochondriów możemy wykorzystać specyficzną nadekspresję białek w mitochondriach, co pozwala na badanie ich funkcji specyficznych dla tych organelli.

Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w targetowanie określonych białek do mitochondriów, może być ona również zastosowana do innych organelli, takich jak jądro komórkowe, ER, aparat Golgiego oraz lizosomy. Po hodowli, homogenizacji i wirowaniu komórek zgodnie z protokołem tekstowym, przenieś supernatant do nowej probówki. Następnie odwiruj próbkę przy 7 000 g i 4 stopniach Celsjusza przez 10 minut.

Następnie należy użyć 200 µL lodowatego buforu IBC do resuspensji osadu, a homogenat podzielić na dwie alikwoty. Próbki ponownie odwiruj przy 7 000 g i 4 °C przez 10 minut. Następnie powtórz etap przemywania.

Po odlaniu supernatantu, do jednego z osadów należy dodać 30 µL buforu do lizy komórek, a następnie przechowywać lizat w temperaturze -80 °C do analizy immunoblottingowej. Aby przeprowadzić ekstrakcję węglanem sodu z drugiego osadu w celu oddzielenia białek rozpuszczalnych od białek związanych z błoną, należy dodać 250 µL 0,1 M węglanu sodu o pH 11,0 i inkubować na lodzie przez 30 minut. Następnie odwiruj próbkę przy 100 000 g przez 20 minut.

Następnie należy zebrać nadosad i dodać równą objętość świeżo przygotowanego, 20% kwasu trójchlorooctowego w celu wytrącenia białek. Przechowywać w lodzie przez 30 minut. W międzyczasie dodać 30 µL buforu do lizy komórek do pelletu i poddać sonikacji zgodnie z protokołem tekstowym przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C do analizy immunoblottingowej.

Po 30-minutowej inkubacji z TCA odwiruj mieszaninę reaction przy 15 000 g przez 10 minut. Odlej supernatant, a następnie użyj 80 µl buforu do lizy komórek, aby resuspendować osad. Po wyizolowaniu frakcji mitochondrialnych z komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym, podziel frakcje mitochondrialne na 10 równych części.

Odwiruj próbki z prędkością 7 000 g w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 10 minut. Do rozpuszczenia każdego osadu użyj 30 µL hipotonicznych buforów sacharozowych o różnych stężeniach, z dodatkiem trypsyny lub bez niej. Następnie inkubuj na lodzie przez 30 minut.

Do probówek zawierających trypsynę dodaj 3 µL PMSF o stężeniu 10 mM, aby zatrzymać trawienie trypsyną. Następnie inkubuj na lodzie przez 10 minut. Odwiruj próbki przy 14 000 g i 4 °C przez 10 minut.

Następnie przenieść supernatant do nowej probówki. Aby zlizować pellet, dodać 30 µL buforu do lizy komórek. Próbki poddać sonikacji zgodnie z opisem w protokole tekstowym i przechowywać w temperaturze -80 °C.

Aby skonstruować wektory cyclinB-1 Cdk-1 z GFP/RFP ukierunkowane na mitochondria, należy sklonować sekwencję ukierunkowującą na mitochondria z prekursora ludzkiej podjednostki 8A cytochromu c oksydazy i połączyć ją z końcem n-końcowym GFP lub RFP w miejscach Nhe1 i BamH1 w wektorach pEGFP-N1 lub pERFP-N1, stosując standardowe techniki klonowania molekularnego. Wykorzystując primery opisane w protokole tekstowym, należy namnożyć geny Cdk1 i cyclinB1 zgodnie ze standardowymi metodami. Następnie produkty PCR należy poddać trawieniu enzymem BamH1.

Przeprowadź reakcje na żelu agarozowym o stężeniu 1%, a następnie za pomocą żyletki wytnij fragmenty DNA o odpowiedniej wielkości. Następnie użyj zestawu do ekstrakcji z żelu, aby oczyścić DNA. W kolejnym kroku poddaj jeden mikrogram plazmidów MTS-pEGFP-N1 oraz MTS-pERFP-N1 trawieniu 1 µL BamH1 w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.

Następnie dodaj 1 µL fosfatazy alkalicznej z jelit cielęcych i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po rozdzieleniu produktów trawienia na 1% żelu agarozowym i oczyszczeniu DNA zgodnie z powyższym opisem, przygotuj reakcję ligacji, używając odczynników wymienionych w protokole tekstowym. Następnie inkubuj reakcję w temperaturze 4 °C przez noc.

Przeprowadź transformację kompetentnych komórek e. coli dH5-alpha przy użyciu 10 µL mieszaniny ligacji. Następnie wysiej bakterie na płytki z agarem LB z dodatkiem 10 mg/mL kanamycyny i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc.

Następnego dnia za pomocą sterylnego grotu pipety pobierz kolonię z płytki i wprowadź grot do probówki zawierającej 5 mililitrów LB z kanamycyną. Inkubuj kulturę przez noc, a następnego ranka użyj zestawu do mini-prepu zgodnie z protokołem tekstowym, aby wyizolować plazmid.

Aby przeprowadzić transfekcję komórek MCF-10A w fazie wykładniczego wzrostu, należy użyć plazmidów Cdk1 lub cyclinB-1 do przygotowania odczynnika do transfekcji plazmidowej w stosunku 1:2 w 100 µL pożywki bez surowicy i antybiotyków. Następnie należy przeprowadzić transfekcję komórek i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 48 godzin. Mitochondria należy barwić i wizualizować zgodnie z protokołem opisanym w tekście.

Aby przeprowadzić sortowanie komórek, należy transfektować 2 x 10⁵ komórek odpowiednimi wektorami w płytce 6-dołkowej, stosując stosunek DNA do odczynnika transfekcyjnego 1:2 w 2,5 ml pożywki bez surowicy i antybiotyków. Po 48-godzinnej inkubacji po transfekcji należy wykorzystać cytometrię przepływową do sortowania żywych komórek stabilnie ekspresujących białka Cdk-1 z tagiem GFP oraz cyklinę B1 z tagiem RFP zgodnie z protokołem tekstowym. W celu pomiaru długości cyklu komórkowego przy użyciu testu cytometrii przepływowej z znakowaniem EdU, należy wysiać posortowane komórki w płytkach 6-dołkowych w gęstości 2,5 x 10⁵ komórek na dołek.

Po inkubacji przez noc dodać EdU do pożywki hodowlanej do stężenia końcowego 25 µM i inkubować przez kolejną godzinę. Następnie w odstępach dwugodzinnych przemyć jedną studnią z komórkami roztworem 1% BSA w 500 µL PBS. Następnie zebrać zawartość do probówki 1,5 ml.

Odwirować komórki przy 350 g przez 5 minut. Następnie odrzucić nadsącz. Resuspender osad poprzez dodanie 100 µl roztworu utrwalającego.

Wymieszać dokładnie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie przemyć komórki trzykrotnie, używając 1 ml 1% BSA w PBS. Potem użyć 0,5 ml 70% etanolu, aby utrwalić komórki w temperaturze 4°C przez noc.

Podczas przeprowadzania znakowania EdU w komórkach transfekowanych białkami z znacznikami GFP i RFP, kluczowe jest wygaszenie sygnałów fluorescencyjnych GFP i RFP. Aby to osiągnąć, wprowadzamy dodatkowy etap całonocnej fiksacji komórek przy użyciu 70% ethanol. Następnego dnia, po przemyciu i permeabilizacji komórek zgodnie z protokołem tekstowym, do każdej probówki należy dodać 0,5 milliliters koktajlu reakcyjnego i dokładnie wymieszać.

Po inkubacji w ciemności i kolejnym przemyciu, należy użyć 50 µg/mL jodku propidyny lub PI w 1% BSA PBS w celu barwienia DNA. Komórki należy przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej, aby śledzić populację EdU-dodatnią. Przedstaw wykres punktowy (scatter plot) komórek znakowanych EdU, zabarwionych pod kątem zawartości DNA oraz EdU.

Użyj kanału APC dla Alexa 647 EdU, wykorzystując filtr pasmowy 670 30, w którym wszystkie docierające światło ma długość fali poniżej 685 nanometrów, oraz kanał fikoerytryny dla PI z filtrem pasmowym 581 15, w którym wszystkie docierające światło ma długość fali poniżej 600 nanometrów. Stosując standardową strategię bramkowania dla akwizycji, wykreśl powierzchnię FSC względem powierzchni SSC w celu oceny morfologii, a następnie PI względem Alexa 647 EdU w celu analizy barwienia komórek. Rejestruj dane dla wszystkich probówek jedna po drugiej, zbierając 10 000 zdarzeń na próbkę.

Na tej rycinie białko macierzy mitochondrialnej Hsp60 oraz białko przestrzeni międzybłonowej Timm13 posłużyły jako markery lokalizacji submitochondrialnej. Podobnie jak w przypadku Hsp60, lecz w przeciwieństwie do Timm13, cyclinB1 i Cdk1 zostały chronione przed trawieniem trypsyną, co wskazuje na ich lokalizację w macierzy mitochondrialnej. Jak pokazano tutaj, za pomocą Western blottingu wyizolowanych frakcji mitochondrialnych, z wykorzystaniem konstruktów cyclinB1 i Cdk-1 znakowanych MTS i GFP, osiągnięto nadekspresję cyclinB1 i/lub Cdk-1 w mitochondriach.

Z wykorzystaniem testu EdU pulse chase wykazano, że znakowane komórki w fazie S przeszły przez fazę G2M i pojawiły się w fazie G1 już po 4 godzinach w komórkach wykazujących ekspresję mitochondrialnej cyclinB1 Cdk-1 typu dzikiego. W porównaniu do tego czasu, w komórkach transfekowanych wektorem kontrolnym lub zmutowaną cyclinB1 Cdk-1 proces ten trwał 6 godzin, co wskazuje, że zwiększenie ilości mitochondrialnej cyclinB1 Cdk-1 przyspiesza progresję cyklu komórkowego. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak pomiar generowania ATP w mitochondriach, zużycia tlenu, potencjału błonowego oraz poziomu reaktywnych form tlenu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące tego, w jaki sposób lokalizacja mitochondrialna kinazy cyklu komórkowego Cdk-1 wpływa na oddychanie mitochondrialne i wydajność energetyczną.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak badać lokalizację mitochondrialną oraz funkcje specyficzne dla mitochondriów kinazy jądrowej.