Mikroskopia fluorescencyjna arkuszy świetlnych w celu uchwycenia 4-wymiarowych obrazów wpływu modulacji naprężeń ścinających na rozwijające się serce danio pręgowanego

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwojowej mechanobiologii serca, takie jak modulacja naprężeń ścinających w trabekulacji serca poprzez sygnalizację karbu przy użyciu mikroskopu 4D z arkuszami świetlnymi. Główną zaletą tej techniki jest to, że oświetla ona cienki fragment próbki płaszczyzną pięciu mikronów, co prowadzi do mniejszego wybielania fotograficznego i uszkodzeń fotograficznych. Ponadto nasz algorytm obliczeniowy pozwala nam zrekonstruować 4D bijące serce danio pręgowanego.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozy wrodzonych chorób serca, ponieważ pozwala na sekwencyjną wizualizację trabekulacji serca in vivo we wczesnym etapie rozwoju aż do późniejszego fenotypu. Ogólnie rzecz biorąc, ludzie, którzy są nowicjuszami w tej technice, stwierdzą, że myślenie w trzech wymiarach w czasie jest trudne do wyobrażenia. Ponadto stworzenie systemu i dokładne jego wyrównanie wymaga czasu.

Na początek oddziel samce i samice danio pręgowanego w zbiornikach hodowlanych za pomocą przegrody. Następnie podnieś przegrodę i pozwól samcowi i samicom danio pręgowanego rozmnażać się. Zebrać zarodki danio pręgowanego i wstrzyknąć do zarodka morpholino oligo w celu zahamowania trabekulacji.

Następnie przygotuj jednoprocentowy żel agarozowy, dodając jeden gram agarozy do 100 mililitrów wody destylowanej i podgrzewaj go, aż cała agaroza się rozpuści. Pozwól agarozie ostygnąć, a następnie użyj pipety o pojemności 20 mikrolitrów, aby załadować małą plastikową rurkę jednym z przygotowanych zarodków i agarozą. Przymocuj rurkę do stolika mikroskopu i użyj obiektywu dziesięć x.

Wyreguluj obiektyw za pomocą pokrętła tak, aby górna część zarodka była ostra. Rób zdjęcia całego zarodka ryby w wielu cyklach bicia serca, używając cienkiego arkusza światła o grubości pięciu mikronów. Zbierz 500 klatek xy z czasem naświetlania wynoszącym dziesięć milisekund.

Następnie przesuń stopień o jeden mikron w dostępie z z do nowej warstwy i powtórz procedurę obrazowania. Kontynuuj, wyobraź sobie 500 klatek na płaszczyznę z, aż całe serce zostanie w pełni zobrazowane. Następnie otwórz oprogramowanie do przetwarzania obrazu i zacznij układać obrazy w 3D.

Aby to osiągnąć, najpierw kliknij otwarte dane. Tutaj wybierz wszystkie obrazy, które mają zostać ułożone w stos w 3D, a następnie wybierz załaduj. Następnie dodaj rozmiar woksela 0,65 na 0,65 na jeden mikron i kliknij OK.

Wprowadzenie prawidłowego rozmiaru woksela ma kluczowe znaczenie dla dokładnej analizy obrazów 3D. Teraz kliknij pole podglądu multiplanera i zwizualizuj obraz 3D. Kliknij prawym przyciskiem myszy niebieskie pole tiff z jedną kropką, wybierz opcję wyświetlanie, a następnie kliknij volran.

W menu edycji wybierz opcje, a następnie edytuj mapę kolorów. Dostosuj kolor za pomocą pól, a następnie kliknij w porządku. Będąc nadal w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu, kliknij plik i otwórz dane szeregów czasowych.

Wybierz pliki 3D, które zostały właśnie utworzone, klikając przycisk Załaduj, i wprowadź ten sam rozmiar woksela co poprzednio. Kliknij prawym przyciskiem myszy niebieskie pole tiff z jedną kropką, a następnie wybierz polecenie wyświetlanie, a następnie volran. Teraz kliknij edytuj.

Wybierz opcje. A następnie wybierz opcję edytuj mapę kolorów. Dostosuj kolor za pomocą pól, a następnie kliknij w porządku.

Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy kontrolkę szeregów czasowych, kliknij polecenie Movie Maker i naciśnij przycisk odtwarzania, aby obejrzeć film. Aby zakończyć, dodaj nazwę pliku, rozmiar klatki, liczbę klatek na sekundę, jakość równą jeden i wprowadź monoskopijny. Następnie kliknij przycisk Zastosuj.

Na koniec wyeksportuj wideo. Siły biomechaniczne, takie jak hemodynamiczne naprężenie ścinające, są ściśle związane z morfogenezą serca. W tym przypadku zastosowano mikroskopię fluorescencyjną w arkuszach świetlnych do wizualizacji grzbietów beleczkowych wystających do światła komory po 75 godzinach od zapłodnienia.

Po 100 godzinach od zapłodnienia wyraźnie widać siatkę beleczkową. W zarodku leczonym mikroiniekcją gata1aMO hematopoeza i lepkość są zmniejszone o 90 procent. To zmniejszone lepkość osłabiało hemodynamiczne naprężenia ścinające, co skutkowało opóźnioną inicjacją i mniej gęstą siecią beleczkową.

To opóźnienie i gęstość sieci beleczkowej można było odzyskać poprzez regulację ekspresji genów związanych z karbem, ratując tworzenie się beleczkowania po 75 godzinach od zapłodnienia i po 100 godzinach po zapłodnieniu. W ten sposób oligonukleotydy morfolinowe gata1a zmniejszyły siły hemodynamiczne, prowadząc do regulacji w dół sygnalizacji notch, podczas gdy Nrg1-mRNA ratuje regulowane geny związane z karbem i ponownie zainicjowało beleczkowanie. Po opanowaniu tej techniki obrazowania można ukończyć w ciągu około dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się rozwojem serca do badania czynników w genie notch, które są odpowiedzialne za prawidłowe powstawanie beleczki u danio pręgowanego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak pozyskiwać obrazy za pomocą mikroskopii selektywnego oświetlenia płaszczyznowego i tworzyć pliki obrazów 4D. Nie zapominaj, że praca z laserami może być bardzo niebezpieczna.

Podczas tej procedury należy zawsze zachowywać środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiednich okularów.