Mikroskopia fluorescencyjna arkuszy świetlnych w celu uchwycenia 4-wymiarowych obrazów wpływu modulacji naprężeń ścinających na rozwijające się serce danio pręgowanego
10 sierpnia 2018
Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji rozwijających się serc u danio pręgowanego w 4-Dimensions (4-D). Obrazowanie 4D, za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z arkuszami świetlnymi (LSFM), wykonuje trójwymiarowe (3-D) obrazy w czasie, aby zrekonstruować rozwijające się serca. Pokazujemy jakościowo i ilościowo, że naprężenie ścinające aktywuje sygnalizację wsierdzia Notch podczas rozwoju komory, co sprzyja trabekulacji serca.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwojowej mechanobiologii serca, takie jak modulacja naprężeń ścinających w trabekulacji serca poprzez sygnalizację karbu przy użyciu mikroskopu 4D z arkuszami świetlnymi. Główną zaletą tej techniki jest to, że oświetla ona cienki fragment próbki płaszczyzną pięciu mikronów, co prowadzi do mniejszego wybielania fotograficznego i uszkodzeń fotograficznych. Ponadto nasz algorytm obliczeniowy pozwala nam zrekonstruować 4D bijące serce danio pręgowanego.
Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozy wrodzonych chorób serca, ponieważ pozwala na sekwencyjną wizualizację trabekulacji serca in vivo we wczesnym etapie rozwoju aż do późniejszego fenotypu. Ogólnie rzecz biorąc, ludzie, którzy są nowicjuszami w tej technice, stwierdzą, że myślenie w trzech wymiarach w czasie jest trudne do wyobrażenia. Ponadto stworzenie systemu i dokładne jego wyrównanie wymaga czasu.
Na początek oddziel samce i samice danio pręgowanego w zbiornikach hodowlanych za pomocą przegrody. Następnie podnieś przegrodę i pozwól samcowi i samicom danio pręgowanego rozmnażać się. Zebrać zarodki danio pręgowanego i wstrzyknąć do zarodka morpholino oligo w celu zahamowania trabekulacji.
Następnie przygotuj jednoprocentowy żel agarozowy, dodając jeden gram agarozy do 100 mililitrów wody destylowanej i podgrzewaj go, aż cała agaroza się rozpuści. Pozwól agarozie ostygnąć, a następnie użyj pipety o pojemności 20 mikrolitrów, aby załadować małą plastikową rurkę jednym z przygotowanych zarodków i agarozą. Przymocuj rurkę do stolika mikroskopu i użyj obiektywu dziesięć x.
Wyreguluj obiektyw za pomocą pokrętła tak, aby górna część zarodka była ostra. Rób zdjęcia całego zarodka ryby w wielu cyklach bicia serca, używając cienkiego arkusza światła o grubości pięciu mikronów. Zbierz 500 klatek xy z czasem naświetlania wynoszącym dziesięć milisekund.
Następnie przesuń stopień o jeden mikron w dostępie z z do nowej warstwy i powtórz procedurę obrazowania. Kontynuuj, wyobraź sobie 500 klatek na płaszczyznę z, aż całe serce zostanie w pełni zobrazowane. Następnie otwórz oprogramowanie do przetwarzania obrazu i zacznij układać obrazy w 3D.
Aby to osiągnąć, najpierw kliknij otwarte dane. Tutaj wybierz wszystkie obrazy, które mają zostać ułożone w stos w 3D, a następnie wybierz załaduj. Następnie dodaj rozmiar woksela 0,65 na 0,65 na jeden mikron i kliknij OK.
Wprowadzenie prawidłowego rozmiaru woksela ma kluczowe znaczenie dla dokładnej analizy obrazów 3D. Teraz kliknij pole podglądu multiplanera i zwizualizuj obraz 3D. Kliknij prawym przyciskiem myszy niebieskie pole tiff z jedną kropką, wybierz opcję wyświetlanie, a następnie kliknij volran.
W menu edycji wybierz opcje, a następnie edytuj mapę kolorów. Dostosuj kolor za pomocą pól, a następnie kliknij w porządku. Będąc nadal w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu, kliknij plik i otwórz dane szeregów czasowych.
Wybierz pliki 3D, które zostały właśnie utworzone, klikając przycisk Załaduj, i wprowadź ten sam rozmiar woksela co poprzednio. Kliknij prawym przyciskiem myszy niebieskie pole tiff z jedną kropką, a następnie wybierz polecenie wyświetlanie, a następnie volran. Teraz kliknij edytuj.
Wybierz opcje. A następnie wybierz opcję edytuj mapę kolorów. Dostosuj kolor za pomocą pól, a następnie kliknij w porządku.
Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy kontrolkę szeregów czasowych, kliknij polecenie Movie Maker i naciśnij przycisk odtwarzania, aby obejrzeć film. Aby zakończyć, dodaj nazwę pliku, rozmiar klatki, liczbę klatek na sekundę, jakość równą jeden i wprowadź monoskopijny. Następnie kliknij przycisk Zastosuj.
Na koniec wyeksportuj wideo. Siły biomechaniczne, takie jak hemodynamiczne naprężenie ścinające, są ściśle związane z morfogenezą serca. W tym przypadku zastosowano mikroskopię fluorescencyjną w arkuszach świetlnych do wizualizacji grzbietów beleczkowych wystających do światła komory po 75 godzinach od zapłodnienia.
Po 100 godzinach od zapłodnienia wyraźnie widać siatkę beleczkową. W zarodku leczonym mikroiniekcją gata1aMO hematopoeza i lepkość są zmniejszone o 90 procent. To zmniejszone lepkość osłabiało hemodynamiczne naprężenia ścinające, co skutkowało opóźnioną inicjacją i mniej gęstą siecią beleczkową.
To opóźnienie i gęstość sieci beleczkowej można było odzyskać poprzez regulację ekspresji genów związanych z karbem, ratując tworzenie się beleczkowania po 75 godzinach od zapłodnienia i po 100 godzinach po zapłodnieniu. W ten sposób oligonukleotydy morfolinowe gata1a zmniejszyły siły hemodynamiczne, prowadząc do regulacji w dół sygnalizacji notch, podczas gdy Nrg1-mRNA ratuje regulowane geny związane z karbem i ponownie zainicjowało beleczkowanie. Po opanowaniu tej techniki obrazowania można ukończyć w ciągu około dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się rozwojem serca do badania czynników w genie notch, które są odpowiedzialne za prawidłowe powstawanie beleczki u danio pręgowanego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak pozyskiwać obrazy za pomocą mikroskopii selektywnego oświetlenia płaszczyznowego i tworzyć pliki obrazów 4D. Nie zapominaj, że praca z laserami może być bardzo niebezpieczna.
Podczas tej procedury należy zawsze zachowywać środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiednich okularów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół wizualizowania rozwijających się serc u rybki labiryntowej za pomocą 4-D mikroskopi fluorescencyjnej warstwy świetlnej (LSFM). Metoda ta pozwala na rekonstrukcję rozwoju serca w czasie, ujawniając rolę stresu ścinającego w aktywowaniu sygnalizacji Notch w endokardrium podczas rozwoju komór.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia rozwojowa
- Mechanobiologia układu krążenia
- Techniki obrazowania
Tło
- Rozumienie rozwoju serca jest kluczowe dla diagnozowania wrodzonych chorób serca.
- Stres ścinający wpływa na trabekularyzację serca poprzez sygnalizację Notch.
- 4-D obrazowanie zapewnia wgląd w dynamiczne procesy biologiczne.
- Mikroskopia warstwy świetlnej minimalizuje blaknięcie świetlne i uszkodzenia.
Cel badania
- Wizualizowanie rozwoju serca u rybki labiryntowej w czasie rzeczywistym.
- Badanie wpływu stresu ścinającego na trabekularyzację serca.
- Opracowanie algorytmu komputerowego do rekonstrukcji serca 4-D.
Zastosowane metody
- 4-D mikroskopia fluorescjencyjna warstwy świetlnej (LSFM).
- Rekonstrukcja bijących serc rybki labiryntowej za pomocą algorytmów komputerowych.
- Sekwencyjne wizualizowanie etapów rozwoju serca.
- Analiza wpływu stresu ścinającego na sygnalizację Notch.
Główne wyniki
- Stres ścinający aktywuje sygnalizację Notch w endokardrium podczas rozwoju komór serca.
- Technika 4-D obrazowania umożliwia szczegółową obserwację trabekularyzacji serca.
- Zmniejszone blaknięcie świetlne i uszkodzenia poprawiają jakość obrazu.
- Metoda pomaga w zrozumieniu mechanizmów wrodzonych chorób serca.
Wnioski
- Technika 4-D LSFM jest potężnym narzędziem do badania rozwoju serca.
- Zdobyte wglądy mogą prowadzić do lepszych metod diagnostycznych wrodzonych chorób serca.
- Przyszłe zastosowania mogą rozciągnąć się na inne dziedziny biologii rozwojowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding hemodynamic forces in cardiac development provides mechanistic insights into congenital heart disease pathways, supporting target validation in preclinical models. Light-sheet fluorescence microscopy enables quantitative, dynamic visualization of shear stress effects on Notch signaling, a pathway implicated in ventricular non-compaction. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking biomechanical inputs to molecular outputs in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the causal relationship between hemodynamic shear stress and Notch signaling in trabeculation formation.
- Operational Value: Enables phenotypic screening of genetic and pharmacological modulators of cardiac morphogenesis.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by visualizing how reduced shear stress down-regulates Notch target genes and attenuates trabeculation.
- Operational Value: Facilitates rescue experiments, such as Nrg1 mRNA co-injection, to confirm target pathway specificity and reversibility.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative 4-D readouts of trabecular density and initiation timing for dose-response analysis.
- Operational Value: Standardizes imaging protocols across experimental conditions using synchronized light-sheet acquisition and voxel-based reconstruction.
- Scientific Value: Enables shear stress modulation via gata1a-MO to create controlled hypodynamic conditions for assay validation.
- Operational Value: Produces scalable, reproducible 3D+time datasets suitable for high-content analysis pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects endothelial Notch gene expression under pulsatile flow to in vivo trabeculation phenotypes, strengthening translational continuity.
- Operational Value: Provides a preclinical zebrafish model for studying Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy mechanisms.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by correlating molecular rescue (e.g., Nrg1) with phenotypic recovery of trabeculation.
- Operational Value: Supports cross-functional collaboration through shared 4-D visualization platforms for cardiology, genetics, and bioengineering teams.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of mechanotransduction pathways in cardiac development, bridging phenotypic screening to target validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing how shear stress modulates Notch signaling during ventricular chamber formation.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs on trabecular network dynamics for compound or genetic modifier evaluation.
- Analytics: Generates synchronized 4-D image stacks with voxel-scale precision, enabling statistical comparison of hemodynamic conditions.
- Translational Research: Links in vivo trabeculation phenotypes to in vitro endothelial flow responses, supporting biomarker alignment studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for studying hemodynamic influences across developmental and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanobiological pathway interpretation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through synchronized 4-D acquisition and computational reconstruction.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early phenotypic assessment of cardiac morphogenesis modifiers.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets involved in shear stress-Notch-trabeculation axes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, microinjection techniques, and light-sheet microscopy alignment.
- Dependent on specialized instrumentation including selective plane illumination microscopy and high-speed sCMOS cameras.
- Necessitates cross-team standardization of image acquisition parameters, voxel sizing, and time-series synchronization.
- Involves adaptation considerations when translating protocols across different genetic backgrounds or disease models.
- Limited by the physical accessibility of the embryonic heart and the need for precise temporal sampling across cardiac cycles.
