Name: Mikroskopia fluorescencyjna arkuszy świetlnych w celu uchwycenia 4-wymiarowych obrazów wpływu modulacji naprężeń ścinających na rozwijające się serce danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Odkryj metodę 4-D mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych do rekonstrukcji bijącego serca danio pręgowanego. Algorytm obliczeniowy umożliwia wizualizację wpływu naprężeń ścinających na sygnalizację Notch podczas rozwoju komór serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną wyrazić wdzięczność Williamowi Talbotowi z Uniwersytetu Stanforda za dostarczenie stylu Human <em="font-size: 14px;">Nrg1 cDNA oraz Deborah Yelon z UCSD za dostarczenie wea mutantów. Autorzy chcieliby również podziękować Cynthii Chen za pomoc w pozyskiwaniu obrazu. Badanie to było wspierane przez granty NIH HL118650 (dla T.K. Hsiai), HL083015 (dla T.K. Hsiai), HD069305 (dla N.C. Chi i T.K. Hsiai), HL111437 (dla T.K. Hsiai i N.C. Chi), HL129727 (dla T.K. Hsiai), T32HL007895 (dla R.R. Sevag Packard), HL 134613 (dla V. Messerschmidta) oraz finansowanie University of Texas System STARS (dla J. Lee).

<ol><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+domain+computational+fluid+dynamics+to+interface+with+an+embryonic+model+of+cardiac+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis.</a> PLoS One. 8 (8), e72924(2013).</li>
<li>Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+cardiac+trabeculation+on+neuregulin+signaling+and+blood+flow+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Dependence of cardiac trabeculation on neuregulin signaling and blood flow in zebrafish.</a> Dev Dyn. 240 (2), 446-456 (2011).</li>
<li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nat Rev Genet. 9 (1), 49-61 (2008).</li>
<li>Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Gata1+but+Not+Gata2+Converts+Erythropoiesis+to+Myelopoiesis+in+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of Gata1 but Not Gata2 Converts Erythropoiesis to Myelopoiesis in Zebrafish Embryos.</a> Developmental Cell. 8 (1), 109-116 (2005).</li>
<li>Chi, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+conduction+is+required+to+preserve+cardiac+chamber+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cardiac conduction is required to preserve cardiac chamber morphology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (33), 14662(2010).</li>
<li>Paffett-Lugassy, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17579187">Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish.</a> Blood. 110 (7), 2718(2007).</li>
<li>De Luca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZebraBeat%3A+a+flexible+platform+for+the+analysis+of+the+cardiac+rate+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos.</a> Scientific Reports. 4, 4898(2014).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+role+for+ErbB2+signaling+in+cardiac+trabeculation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A dual role for ErbB2 signaling in cardiac trabeculation.</a> Development. 137 (22), 3867-3875 (2010).</li>
<li>Samsa, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+contraction+activates+endocardial+Notch+signaling+to+modulate+chamber+maturation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cardiac contraction activates endocardial Notch signaling to modulate chamber maturation in zebrafish.</a> Development. 142 (23), 4080-4091 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+genetic+analysis+in+mice+unveils+central+role+for+cilia+in+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease.</a> Nature. 521, 520(2015).</li>
<li>Sifrim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+genetic+architectures+for+syndromic+and+nonsyndromic+congenital+heart+defects+identified+by+exome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Distinct genetic architectures for syndromic and nonsyndromic congenital heart defects identified by exome sequencing.</a> Nature Genetics. 48, 1060(2016).</li>
<li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+association+study+identifies+two+risk+loci+for+congenital+heart+malformations+in+Han+Chinese+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A genome-wide association study identifies two risk loci for congenital heart malformations in Han Chinese populations.</a> Nature Genetics. 45, 818(2013).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development (Cambridge, England). 136 (12), 1963-1975 (2009).</li>
<li>Panier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+functional+imaging+of+multiple+brain+regions+in+intact+zebrafish+larvae+using+Selective+Plane+Illumination+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 65(2013).</li>
<li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACT-PRESTO%3A+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+%283D%29+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Scientific Reports. 6, 18631(2016).</li>
<li>Kelley, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+confocal+microscopy+and+quantitative+4D+image+analysis+of+anchor-cell+invasion+through+the+basement+membrane+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 12, 2081(2016).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li>
<li>Lavagnino, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4D+%28x-y-z-t%29+imaging+of+thick+biological+samples+by+means+of+Two-Photon+inverted+Selective+Plane+Illumination+Microscopy+%282PE-iSPIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">4D (x-y-z-t) imaging of thick biological samples by means of Two-Photon inverted Selective Plane Illumination Microscopy (2PE-iSPIM).</a> Scientific Reports. 6, 23923(2016).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007(2004).</li>
<li>Hove, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracardiac+fluid+forces+are+an+essential+epigenetic+factor+for+embryonic+cardiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis.</a> Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).</li>
<li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).</li>
<li>BioRad. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22General+Protocol+for+Western+Blotting%22">General Protocol for Western Blotting</a>. 6376, 
 <a target="_blank" href="http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf">http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf</a> (2018).</li>
<li>GeneTools. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Gene+Tools+Oligo+Design+Website%22">Gene Tools Oligo Design Website</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://oligodesign.gene-tools.com/request/ ">https://oligodesign.gene-tools.com/request/ </a> (2018).</li>
<li>Mullins, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMullins%2C+M+%22Zebrafish+Course%22">Zebrafish Course</a>. , ed University of Chicago (2013).</li>
<li>Grenander, U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGrenander%2C+U+%22Probability+and+Statistics%3A+The+Harald+Cram%C3%A9r+Volume%22">Probability and Statistics: The Harald Cramér Volume</a>. , Alqvist & Wiksell. (1959).</li>
<li>Fei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Light-Sheet+Fluorescent+Microscopy+for+Multi-Scale+and+Rapid+Imaging+of+Architecture+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cardiac Light-Sheet Fluorescent Microscopy for Multi-Scale and Rapid Imaging of Architecture and Function.</a> Scientific Reports. 6, 22489(2016).</li>
<li>Liebling, M., Forouhar , A. S., Gharib, M., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-dimensional+cardiac+imaging+in+living+embryos+via+postacquisition+synchronization+of+nongated+slice+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Four-dimensional cardiac imaging in living embryos via postacquisition synchronization of nongated slice sequences.</a> Journal of Biomedical Optics. 10 (5), (2005).</li>
<li>Adeoye, A. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0044848616302757">Combined effects of exogenous enzymes and probiotic on Nile tilapia (Oreochromis niloticus) growth, intestinal morphology and microbiome.</a> Aquaculture. 463, 61-70 (2016).</li>
<li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23382350">Anesthesia and Euthanasia in Zebrafish.</a> ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li>
<li>Singleman, C., Holtzman, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Dissection+in+Larval%2C+Juvenile+and+Adult+Zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (55), e3165(2011).</li>
<li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbed+Flow+Induces+Autophagy%2C+but+Impairs+Autophagic+Flux+to+Perturb+Mitochondrial+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 23 (15), 1207-1219 (2015).</li>
<li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25147335">Shear Stress-Activated Wnt-Angiopoietin-2 Signaling Recapitulated Vascular Repair in Zebrafish Embryos.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34 (10), 2268-2275 (2014).</li>
<li>Baek, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-Responsive+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor-Protein+Kinase+C+Isoform+Epsilon+Signaling+Mediates+Glycolytic+Metabolites+for+Vascular+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Flow-Responsive Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-Protein Kinase C Isoform Epsilon Signaling Mediates Glycolytic Metabolites for Vascular Repair.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 28 (1), 31-43 (2018).</li>
<li>Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+transmission+of+a+myocardium-specific+GFP+transgene+reveals+critical+regulatory+elements+in+the+cardiac+myosin+light+chain+2+promoter+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 228 (1), 30-40 (2003).</li>
<li>Vermot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversing+blood+flows+act+through+klf2a+to+ensure+normal+valvulogenesis+in+the+developing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart.</a> PLoS Biol. 7 (11), (2009).</li>
<li>Grego-Bessa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+is+essential+for+ventricular+chamber+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Notch signaling is essential for ventricular chamber development.</a> Dev Cell. 12 (3), 415-429 (2007).</li>
<li>Berdougo, E., Coleman, H., Lee, D. H., Stainier, D. Y. R., Yelon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+weak+atrium%2Fatrial+myosin+heavy+chain+disrupts+atrial+function+and+influences+ventricular+morphogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutation of weak atrium/atrial myosin heavy chain disrupts atrial function and influences ventricular morphogenesis in zebrafish.</a> Development. 130 (24), 6121(2003).</li>
<li>Arnaout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+model+for+human+long+QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Zebrafish model for human long QT syndrome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (27), 11316-11321 (2007).</li>
<li>Chi, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+physiologic+dissection+of+the+vertebrate+cardiac+conduction+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system.</a> PLoS Biol. 6 (5), e109(2008).</li>
<li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+gene+cloche+acts+upstream+of+a+flk-1+homologue+to+regulate+endothelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation.</a> Development. 124 (2), 381-389 (1997).</li>
<li>Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloche%2C+an+early+acting+zebrafish+gene%2C+is+required+by+both+the+endothelial+and+hematopoietic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages.</a> Development. 121 (10), 3141-3150 (1995).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Light Sheet Fluorescence Microscopy: A Review.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).</li>
<li>Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+enhancement+in+a+light-sheet-based+microscope+%28SPIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM).</a> Optics Letters. 31 (10), 1477-1479 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym protokole wykazaliśmy, że obrazowanie 4D może być wykorzystywane do śledzenia rozwoju sieci beleczkowej w odpowiedzi na zmiany sił biomechanicznych. W szczególności naprężenie ścinające doświadczane przez komórki śródbłonka inicjuje kaskadę sygnalizacyjną Notch, która z kolei sprzyja trabekulacji. W tym manuskrypcie wykazaliśmy, że (1) wstrzyknięcie GATA1a MO zmniejszyło hematopoezę, a zatem zmniejszyło naprężenie ścinające ścianę, (2) wstrzyknięcie TNNTT2a MO hamowało funkcję kurczliwości komór w...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/57763/light-sheet-fluorescence-microscopy-to-capture-4-dimensional-images">Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart</a>.&#160;Additional author names were added, and an author affiliation was updated.
The author list was updated from:
Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1
to:
Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1
The author affiliation for Rongsong Li was updated from:
Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA
to:
College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57763/light-sheet-fluorescence-microscopy-to-capture-4-dimensional-images">Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart</a>. Additional&#160;author names were&#160;added, and an author affiliation was updated.

Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Siły biomechaniczne, takie jak hemodynamiczne naprężenia ścinające, są ściśle związane z morfogenezą serca. W odpowiedzi na hemodynamiczne siły ścinające, grzbiety i rowki mięśnia sercowego rozwijają się w falistej sieci beleczkowej zgodnie z kierunkiem naprężenia ścinającego w poprzek zastawki przedsionkowo-komorowej (AV)1. Trabekulacja serca jest niezbędna do zwiększenia funkcji skurczowej i masy mięśnia sercowego2. Mutacje w szlakach sygnałowych Notch powodują wrodzone wady serca u ludzi i innych kręgowców3. Na przykład wykazano, że gata1a4 i tnnt2a5 oligonukleotydy morfolino (MO) zmniejszają erytropoezę, podczas gdy mRNA erytropoetyny (EPO)6 i Isoproterenol (ISO)7 zwiększają odpowiednio czerwone krwinki i częstość akcji serca, a tym samym naprężenie ścinające ścianę (WSS). Co więcej, sygnalizacja ErbB2, za Notch, promuje proliferację i różnicowanie kardiomiocytów w celu wytworzenia siły skurczowej, która z kolei aktywuje sygnalizację Notch8,9. Sugeruje się, że naprężenie ścinające rządzi trabekulacją sterowaną sygnalizacją Notch dla rozwoju komór. Obecnie istnieje wiele badań, które próbują lepiej zrozumieć zdarzenia związane z programowaniem genetycznym prowadzące do wrodzonych wad serca (CHD)10,11,12, ale bardzo niewiele z nich bada, jak siły mechaniczne wpływają na formujące się serce.
Aby zbadać siły mechaniczne działające na wsierdzie, należy przeprowadzić ścisłą obserwację w okresie rozwoju. Jednak uzyskanie dobrej jakości obrazów próbek in vivo jest trudne ze względu na nieodłączność tradycyjnej mikroskopii13. Aby zaobserwować rozwój w czasie w próbce, konieczne jest zatem fizyczne przecięcie i barwienie13,14,15. Chociaż mikroskopia konfokalna jest szeroko stosowana do obrazowania trójwymiarowej struktury próbek14,16, akwizycja tych systemów obrazowania jest nadal ograniczona przez niskie prędkości skanowania.
Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszem świetlnym (LSFM) to unikalna technika obrazowania, która pozwala na wizualizację dynamicznych zdarzeń in vivo przy dużej odległości roboczej13. Technika ta wykorzystuje mikroskopię fluorescencyjną z arkuszem świetlnym do optycznego przekroju próbki17. Ze względu na oświetlenie tylko cienkiego arkusza światła na próbce, następuje zmniejszenie fotowybielania i fototoksyczności13,18. Duże pole widzenia i duża odległość robocza pozwalają na to, aby duże próbki pozostały nienaruszone podczas ich obrazowania13,14,17. Małe powiększenie pozwala na obrazowanie większego obszaru, podczas gdy duża odległość robocza pozwala na obrazowanie grubszych próbek bez uszczerbku dla stosunku sygnału do szumu. Wiele grup używało LSFM do obrazowania całych embrionów17, brains14,18, muscle and hearts19 wśród innych tkanek, pokazując różne rodzaje próbek, które można obrazować.
Chociaż poprzednie badania wykazały zmniejszenie hemodynamicznej siły ścinającej poprzez zasłanianie ścieżek dopływu lub odpływu serca danio pręgowanego, informacje są wyłącznie jakościowe. Powoduje to nieprawidłową trzecią komorę, zmniejszone zapętlenie serca i upośledzone tworzenie zastawek20. Obrazy 4D LSFM dają nową perspektywę na sposób, w jaki hemodynamiczne siły ścinające wpływają na rozwój tkanki serca. Te siły mechaniczne mogą aktywować wrażliwe na siłę cząsteczki sygnałowe i indukować tworzenie grzbietów beleczkowych. Ze względu na dodatkowy aspekt czasowy obrazowania 4D, można śledzić zmiany w rozwoju w czasie rzeczywistym, co może prowadzić do nowych odkryć, które wcześniej pozostały niezauważone. Danio pręgowany jest idealnym modelem do obrazowania, ponieważ naukowcy mogą obserwować całe zwierzę kręgowe, a nie tylko interakcje komórka-komórka. Tlen może również dyfundować przez cały zarodek, co pozwala na rozwój bez zależności od układu naczyniowego, w przeciwieństwie do rozwoju ssaków. Mimo że serce danio pręgowanego nie ma narządów płucnych, które wymagają czterokomorowego serca, istnieje duża liczba genów sercowych, które są zachowane między danio pręgowanym a ludźmi21.
W tym manuskrypcie opisujemy, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem lekkiego arkusza do obrazowania rozwijających się beleczek w sercach danio pręgowanego w różnych okolicznościach. Po pierwsze, w celu obniżenia lepkości krwi, a tym samym WSS, użyto wstrzyknięcia gata1a4 lub tnnt2a5 MO. Następnie zarejestrowano morfologię serca. W osobnej grupie ryb zwiększyliśmy WSS, podając mRNAEPO="xref">6 lub isoproterenol7 i obserwowaliśmy wyniki. Przeprowadziliśmy również badanie komórek o różnych natężeniach przepływu pulsacyjnego lub oscylacyjnego. Po zobrazowaniu każdej grupy stwierdziliśmy, że WSS wyczuwany przez wsierdzie za pośrednictwem sygnalizacji Notch inicjuje trabekulację.

<table><tbody><tr><td>Premiks Clontech Hifi PCR&nbsp;</td><td>Takara&nbsp;</td><td>639298</td><td>PCR mastermix 1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4</td></tr><tr><td>Ludzki Nrg1 cDNA</td><td>Prezent od Williama Talbota, Uniwersytet Stanforda, Stanford, Kalifornia, USA</td><td>Nie dotyczy</td><td>Używany do ratownictwa trabekulacyjnego 1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1</td></tr><tr><td>CFX Connect&trade; System wykrywania PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Bio-Rad</td><td>1855201</td><td>Maszyna do PCR 1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2</td></tr><tr><td>pCS2</td>+<td>GE Health</td><td></td><td>Plazmid używany do syntezy mRNA 1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania nukleospiny&nbsp; &nbsp;</td><td>Clontech</td><td>740609.25</td><td>Oczyszczanie DNA 1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2</td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4&nbsp;</td><td>Clontech</td><td>2011A</td><td>Roztwór do ligacji PCR 1.1.2.5</td></tr><tr><td>Gwiezdne kompetentne komórki</td><td>Clontech</td><td>636763</td><td>E. Komórki coli używane do transformacji 1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668027</td><td>Odczynnik do transfekcji 1.1.4</td></tr><tr><td>Zestaw mMessage SP6</td><td>Invitrogen</td><td>AM1340</td><td>Zestaw do syntezy mRNA 1.1.6.3</td></tr><tr><td>Aurum Total RNA Mini Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>7326820</td><td>Oczyszcza RNA&nbsp; 1.1.6.4, 3.1.2</td></tr><tr><td>GeneTools 4.3.8</td><td>GeneTools</td><td>N/A</td><td>Oprogramowanie do projektowania starterów 1.2.1, 3.1.3</td></tr><tr><td>EPO cDNA</td><td>Creative Biogene</td><td>CDFH006026</td><td>zwiększa WSS 1.2.2, 1.2.3, 1.1.7</td></tr><tr><td>AG1478</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T4182</td><td>Inhibitor ErbB 1.3.1</td></tr><tr><td>E3 pożywka</td><td></td><td></td><td>Do hodowli zarodków 1.3.1, 1.3.2, 5.1.5</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D5942</td><td>&gamma;-inhibitor sekretazy 1.3.2</td></tr><tr><td>Agaroza&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9539</td><td>Służy do montażu zarodków 2.1.1.1</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 LT&nbsp; Cyfrowa kamera CMOS</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-42U</td><td>Służy do przechwytywania obrazów 2.1.1.2, 2.1.1.3</td></tr><tr><td>Amira Software</td><td>FEI Software</td><td>Nie dotyczy</td><td>Wizualizacja i analiza obrazów w 3D i 4D 2.1.5.1.1-2.1.5.2.8</td></tr><tr><td>Tricaone mesylate&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>886-86-2</td><td>Służy do humanitarnego uspokojenia lub uśmiercenia embrionów 3.1.1</td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy cDNA iScript</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td>syntetyzuje cDNA 3.1.2</td></tr><tr><td>Mikrowirówka Eppendorf 5424</td><td>Eppendorf</td><td>05-400-005</td><td>Mikrowirówka 4.1.1.3</td></tr><tr><td>GI254023X</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>260264-93-5</td><td>Inhibitor ADAM10 4.1.2, 4.1.3&nbsp;</td></tr><tr><td>Chlorowodorek izoprenaliny</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>I5627</td><td>Izoproterenol zwiększa WSS 5.1.5</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>N/A</td><td>Analiza mechaniki serca</td></tr></tbody></table>

mikroskopia fluorescencyjna arkuszy świetlnych w celu uchwycenia 4-wymiarowych obrazów wpływu modulacji naprężeń ścinających na rozwijające się serce danio pręgowanego

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Siły hemodynamiczne doświadczane przez serce wpływają na rozwój serca, szczególnie na trabekulację, która tworzy sieć rozgałęziających się wyrostków z mięśnia sercowego. Wady genetyczne programu w kaskadzie sygnalizacyjnej Notch są zaangażowane w wady komór, takie jak kardiomiopatia niezagęszczona lewej komory lub zespół hipoplazji lewego serca. Korzystając z tego protokołu, można określić, że trabekulacja sterowana naprężeniem ścinającym i sygnalizacja Notch są ze sobą powiązane. Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z arkuszami świetlnymi możliwa była wizualizacja rozwijającego się serca danio pręgowanego. W niniejszej pracy oceniono, czy siły hemodynamiczne modulują inicjację trabekulacji poprzez sygnalizację Notch, a tym samym zachodzi wpływ funkcji kurczliwości. W celu jakościowej i ilościowej analizy naprężeń ścinających uzyskano obrazy 4D (3-D + czas) podczas morfogenezy serca danio pręgowanego, a zintegrowana mikroskopia fluorescencyjna arkusza świetlnego z synchronizacją 4D uchwyciła ruch komór. Lepkość krwi została zmniejszona poprzez mikroiniekcję GATA1a-morfolinooligonukleotydów (MO) w celu zmniejszenia naprężeń ścinających, a tym samym regulacji w dół sygnalizacji Notch i tłumienia trabekulacji. Jednoczesne wstrzyknięcie mRNA Nrg1 z gata1a MO uratowało geny związane z Notch, aby przywrócić trabekulację. Aby potwierdzić, że sygnalizacja Notch napędzana naprężeniem ścinającym wpływa na trabekulację, skurcz kardiomiocytów został dodatkowo zatrzymany przez tnnt2a-MO w celu zmniejszenia sił hemodynamicznych, a tym samym obniżenia docelowych genów Notch w celu rozwoju niebelekulatowanego mięśnia sercowego. Wreszcie, potwierdzenie wzorców ekspresji genów Notch reagujących na stres ścinający przeprowadzono poprzez poddanie komórek śródbłonka przepływowi pulsacyjnemu. W ten sposób mikroskopia świetlna 4D ujawniła siły hemodynamiczne leżące u podstaw sygnalizacji Notch i trabekulacji, co ma znaczenie kliniczne dla kardiomiopatii bez zagęszczenia.

W niniejszej pracy wykorzystano LSFM w celu uzyskania dwu- i trójwymiarowych obrazów o wysokiej rozdzielczości. Jak pokazano na Rysunku 1A i 1B, soczewka oświetlająca kieruje arkusz światła na próbkę. Ze względu na niewielką grubość arkusza światła, oświetlona zostaje tylko jedna płaszczyzna. Soczewka detekcyjna jest ustawiona prostopadle do soczewki oświetlającej i jest ogniskowana na oświetlonej płaszczyźnie (Rysunek 1B...

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji rozwijających się serc u danio pręgowanego w 4-Dimensions (4-D). Obrazowanie 4D, za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z arkuszami świetlnymi (LSFM), wykonuje trójwymiarowe (3-D) obrazy w czasie, aby zrekonstruować rozwijające się serca. Pokazujemy jakościowo i ilościowo, że naprężenie ścinające aktywuje sygnalizację wsierdzia Notch podczas rozwoju komory, co sprzyja trabekulacji serca.

Mikroskopia fluorescencyjna arkuszy świetlnych w celu uchwycenia 4-wymiarowych obrazów wpływu modulacji naprężeń ścinających na rozwijające się serce danio pręgowanego

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwojowej mechanobiologii serca, takie jak modulacja naprężeń ścinających w trabekulacji serca poprzez sygnalizację karbu przy użyciu mikroskopu 4D z arkuszami świetlnymi. Główną zaletą tej techniki jest to, że oświetla ona cienki fragment próbki płaszczyzną pięciu mikronów, co prowadzi do mniejszego wybielania fotograficznego i uszkodzeń fotograficznych. Ponadto nasz algorytm obliczeniowy pozwala nam zrekonstruować 4D bijące serce danio pręgowanego.Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozy wrodzonych chorób serca, ponieważ pozwala na sekwencyjną wizualizację trabekulacji serca in vivo we wczesnym etapie rozwoju aż do późniejszego fenotypu. Ogólnie rzecz biorąc, ludzie, którzy są nowicjuszami w tej technice, stwierdzą, że myślenie w trzech wymiarach w czasie jest trudne do wyobrażenia. Ponadto stworzenie systemu i dokładne jego wyrównanie wymaga czasu.Na początek oddziel samce i samice danio pręgowanego w zbiornikach hodowlanych za pomocą przegrody. Następnie podnieś przegrodę i pozwól samcowi i samicom danio pręgowanego rozmnażać się. Zebrać zarodki danio pręgowanego i wstrzyknąć do zarodka morpho

light-sheet-fluorescence-microscopy-to-capture-4-dimensional-images

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikroskopia fluorescencyjna z lekkim arkuszem jest doskonałym narzędziem do obrazowania rozwoju embrionalnego. Pozwala na nagrywanie długich filmów poklatkowych żywych zarodków w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Demonstrujemy jego zastosowanie do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego w szerokich skalach czasoprzestrzennych i przedstawiamy potok do fuzji i dekonwolucji zestawów danych multiview.

Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego

Tutaj dostępny jest protokół do obrazowania poklatkowego morfogenezy oka za pomocą dostępnego na rynku mikroskopu lightsheet i stacji roboczej do przetwarzania obrazu w celu analizy uzyskanych danych. Protokół ten szczegółowo opisuje procedury znieczulenia zarodka, zatopienia w agarozie o niskiej temperaturze topnienia, zawieszenia w komorze obrazowania, ustawienia parametrów obrazowania i wreszcie analizy danych obrazowania za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Wizualizacja morfogenezy oka za pomocą mikroskopii Lightsheet przy użyciu transgenicznego danio pręgowanego rx3:GFP

Opisujemy zoptymalizowane narzędzia do badania serca danio pręgowanego in vivo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego. W szczególności sugerujemy jasne transgeniczne linie serca i prezentujemy nowe techniki delikatnego osadzania i unieruchamiania, które pozwalają uniknąć wad rozwojowych i wad serca. Przewidziano również możliwy potok pozyskiwania i analizy danych dostosowany do obrazowania serca.

Mikroskopia świetlna szybkiej dynamiki serca w zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół wykorzystuje obrazowanie za pomocą arkusza świetlnego do badania funkcji skurczu serca u larw danio pręgowanego i uzyskania wglądu w mechanikę serca poprzez śledzenie komórek i interaktywną analizę.

Obrazowanie 4D Light-sheet skurczu serca danio pręgowanego

Zaprojektowano cykliczny bioreaktor ciśnieniowy, który umożliwia poddawanie tkanki zastawek serca fizjologicznym oraz patologicznym warunkom ciśnieniowym. Program LabVIEW pozwala użytkownikom na kontrolowanie wartości, amplitudy oraz częstotliwości ciśnienia. Urządzenie to może być wykorzystywane do badania mechanobiologii tkanki zastawek serca lub izolowanych komórek.

Projekt cyklicznego bioreaktora ciśnieniowego do badań ex vivo zastawek tętniczych serca

Opracowaliśmy technologię opartą na cienkiej warstwie krzemionki mezoporowatej do selektywnego odzyskiwania białek i peptydów o niskiej masie cząsteczkowej z surowicy ludzkiej. Właściwości fizykochemiczne naszych chipów mezoporowatych zostały precyzyjnie dostrojone, aby zapewnić znaczną kontrolę nad wzbogacaniem peptydów, a w konsekwencji umożliwić profilowanie proteomu surowicy do celów diagnostycznych.

Wzbogacanie białek o niskiej masie cząsteczkowej na cienkich warstwach mezoporowatej krzemionki w celu odkrywania biomarkerów

Opisano metodę montażu adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów w komorze mikroskopowej do badań migracji żywych komórek. Zaprojektowane środowisko łączy powierzchnie przeciwporostowe i ścieżki adhezyjne z gradientami roztworu, a tym samym pozwala określić względne znaczenie wskazówek naprowadzających.

Tworzenie adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do obrazowania migracji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

W tym protokole wideo śledzimy - z dużą prędkością i w trzech wymiarach - fluorescencyjnie znakowane lizosomy w żywych komórkach, używając metody śledzenia orbitalnego w zmodyfikowanym mikroskopie dwufotonowym.

Śledzenie orbitalne 3D w zmodyfikowanym mikroskopie dwufotonowym: zastosowanie do śledzenia pęcherzyków wewnątrzkomórkowych

Przestrzenny rozkład i czasowa dynamika białek błony komórkowej i lipidów to gorący temat w biologii. W tym przypadku problem ten został rozwiązany za pomocą czasoprzestrzennej analizy fluktuacji obrazu, która zapewnia koncepcyjnie te same fizyczne wielkości śledzenia pojedynczych cząstek, ale wykorzystuje małe znaczniki molekularne i standardowe konfiguracje mikroskopowe.

Od szybkiego obrazowania fluorescencyjnego do prawa dyfuzji molekularnej na żywych błonach komórkowych w komercyjnym mikroskopie

Przygotowanie funkcjonalizowanych białkiem płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym, określenie ruchliwości białek w ich obrębie i pomiar gęstości białek jest pokazane tutaj. Nakreślono mapę drogową budowy mikroskopu całkowitego wewnętrznego odbicia z redukcją szumów, który umożliwia wizualizację pojedynczych dwuwarstwowych fluorochromów o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

Odkryj metodę 4-D mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych do rekonstrukcji bijącego serca danio pręgowanego. Algorytm obliczeniowy umożliwia wizualizację wpływu naprężeń ścinających na sygnalizację Notch podczas rozwoju komór serca.

Mikroskopia fluorescencyjna arkuszy świetlnych w celu uchwycenia 4-wymiarowych obrazów wpływu modulacji naprężeń ścinających na rozwijające się serce danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal

Mikroskopia fluorescencyjna arkuszy świetlnych w celu uchwycenia 4-wymiarowych obrazów wpływu modulacji naprężeń ścinających na rozwijające się serce danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów