Wizualizacja morfogenezy oka za pomocą mikroskopii Lightsheet przy użyciu transgenicznego danio pręgowanego rx3:GFP

Nasz protokół dostarcza zarówno wizualnych, jak i w czasie rzeczywistym informacji o tym, jak przebiega proces morfogenezy oka zarówno w normalnych, jak i patologicznych warunkach. Nasz protokół pozwala na szybkie pozyskiwanie z-stacków, co skraca czas między każdym obrazem 3D w zbiorze danych. Zapewnia to zwiększoną rozdzielczość czasową zachodzi morfogeneza oka.

Umieszczenie zarodka w kapilarze może być trudne ze względu na jego kulisty kształt na etapie pojedynczego somitu, dlatego ważne jest, aby załadować wiele zarodków do naczynia włosowatego, aby upewnić się, że przynajmniej jeden z nich jest we właściwej orientacji. Aby przeprowadzić badanie przesiewowe na obecność somitów po 10 godzinach od zapłodnienia, umieść zarodki pod mikroskopem stereoskopowym i użyj adaptera fluorescencyjnego, aby potwierdzić obecność transgenu rx3:GFP. Po zidentyfikowaniu od trzech do pięciu pojedynczych zarodków somitu z dodatnim wynikiem GFP, należy użyć cienkich kleszczy do dekoracji zarodków.

Aby osadzić zarodki w agarozie, przenieś zarodki do probówki mikrowirówkowej zawierającej 500 mikrolitrów buforu zarodków E3 uzupełnionego 168 mikrogramami na mililitr trikainy i dodaj 500 mikrolitrów schłodzonej, ale płynnej agarozy o niskiej temperaturze topnienia 2% i buforu E3 do probówki z delikatnym mieszaniem. Użyj szklanej kapilary o średnicy jednego milimetra z tłokiem z PTFE, aby wciągnąć zarodki osadzone w agarozie do naczynia włosowatego i pozwól agarozie zestalać się przez 30 do 60 sekund w temperaturze pokojowej. Następnie umieść kapilary w zlewce z buforem E3 uzupełnionym trikainą.

Aby skonfigurować mikroskop lightsheet do obrazowania zarodków, umieść kapilarnę w uchwycie próbki kapilarnej i kliknij metalową osłonę pośrodku metalowego dysku uchwytu. Umieść dwa gumowe korki w osłonie tak, aby szczeliny były skierowane w stronę końców osłony i wsuń kapilary przez środek gumowych korków. Gdy marker znajdzie się u podstawy metalowej osłony, użyj metalowej nasadki, aby zabezpieczyć kapilarnę na miejscu i umieść uchwyt na górze mikroskopu tak, aby białe znaki były wyrównane.

Zamknij pokrywę uchwytu na próbkę i kliknij przycisk lokalizacji kapilary w interfejsie oprogramowania mikroskopu. Za pomocą panelu sterowania Ergo Drive przesuń kapilarnę tuż nad obiektyw. Po otwarciu pokrywy delikatnie wciśnij tłok, aż część agarozy zawierająca zarodek zwisa poniżej dna naczynia włosowatego przed obiektywem.

Wyłącz opcję lokalizuj kapilar i kliknij przycisk zlokalizuj próbkę, aby przełączyć widok z kamery internetowej komory próbki na obiektyw mikroskopu i użyć tego widoku do bardziej precyzyjnego dostosowania położenia próbki. Następnie wyłącz lokalizację próbki i przejdź do zakładki akwizycji. Zaznacz pola Z-stack i szeregi czasowe.

W oknie parametrów trybu akwizycji wybierz ustawienie dwustronnego arkusza świetlnego i zaznacz pola wyboru dla dwustronnego łączenia online i skanowania obrotowego. Kliknij przycisk ciągły, aby wyświetlić podgląd zarodka na żywo. W oknie kanału wybierz kanał 488 i ustaw moc lasera na jeden, a czas naświetlania na 7,5 milisekundy.

Użyj panelu sterowania Ergo Drive, aby dostosować położenie zarodka, aż pole oka będzie skierowane bezpośrednio w stronę aparatu, a następnie dostosuj lewe i prawe arkusze świetlne w parametrach kanałów, aż pole oka będzie wystarczająco ostre. Ustaw pierwszą i ostatnią pozycję Z około 500 mikrometrów poza ostatnim wykrywalnym sygnałem fluorescencyjnym i kliknij optymalny, aby ustawić rozmiar kroku na 0,477 mikrometra. Aby ustawić parametry inkubacji, należy zaznaczyć pole dla jednostki Peltiera, aby utrzymać temperaturę na poziomie 28 stopni Celsjusza.

W oknie szeregów czasowych wybierz odpowiednią częstotliwość eksperymentalną i interwał czasu, aby uzyskać obrazy. Kliknij Rozpocznij eksperyment. Wybierz folder, w którym chcesz zapisać zestaw obrazów i ustaw prefiks obrazu, a następnie kliknij przycisk Zapisz, aby rozpocząć obrazowanie.

Aby przeprowadzić analizę obrazu, zaimportuj pliki obrazów do odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazów 4D i kliknij moduł przeglądarki 4D, pasek skali i ikonę wideo, aby otworzyć pasek zadań serii ujęć. Wybierz opcję dodaj sekwencję klatek kluczowych i określ czas trwania filmu w sekundach. Odznacz pole Utwórz rotację i zaznacz opcję Użyj progresji czasowej, aby uwzględnić określone punkty czasowe w filmie.

Zapisz scenorys, aby zastosować te same parametry do wielu zestawów obrazów. Kliknij przycisk eksportuj film, aby zapisać film z obrazowania poklatkowego i określić ustawienia eksportu filmu, w tym nazwę pliku i lokalizację, format wideo, rozdzielczość wideo, liczbę klatek na sekundę, rozdzielczość danych. W razie potrzeby dodaj znaczniki czasu i wybierz rekord.

Aby utworzyć filmy z rotacją w określonych punktach czasowych, dodaj sekwencję klatek kluczowych, jak pokazano poniżej, ale zaznacz pole Utwórz obrót i odznacz pole Użyj progresji czasowej. Aby renderować obraz o wysokiej rozdzielczości w dowolnej orientacji i w dowolnym punkcie czasowym, wybierz ikonę kamery w przeglądarce 4D. Aby utworzyć potok do analizy, wybierz pozycję kolba w celu uzyskania dostępu do panelu analizy, a następnie otwórz menu operacji analizy, aby wybrać sekwencję operacji, które Cię

Kliknij niebieski trójkąt, aby zainicjować potok. Na końcu uruchomienia kliknij kolumny funkcji w oknie podręcznym, aby wyświetlić listę obiektów, które mogą dostarczyć informacji o interesującym Cię obiekcie, a następnie kliknij przycisk Eksportuj, aby wyeksportować dane do arkusza kalkulacyjnego. W tej reprezentatywnej analizie transgeniczny zarodek rx3:GFP był obrazowany z grzbietowego punktu obserwacyjnego co pięć minut od jednego stadium somitowego przez 24 godziny po zapłodnieniu, w sumie przez 14 godzin.

Jak zaobserwowano, przeprowadzenie procesu przetwarzania obrazów uchwyconych w wyniku tej analizy ułatwiło wygenerowanie maski rozwijającego się oka. Należy zauważyć, że gdy pole oka jest podzielone na dwa pęcherzyki wzrokowe, można zaobserwować trzeci region rx3:GFP dodatni w przodomózgowiu, który przyczynił się do powstania podwzgórza. Informacje te zaobserwowano również w danych objętościowych i można je łatwo oddzielić od danych dotyczących pęcherzyków wzrokowych, ponieważ były one znacznie mniejsze niż obserwowane dla któregokolwiek z pęcherzyków wzrokowych.

Procedura ta może być kontynuowana przez dodatkowe analizy, na przykład śledzenie pojedynczych komórek w zbiorze danych obrazu.