Wykrywanie przeciwciał, które neutralizują wychwyt komórkowy enzymatycznych terapii zastępczych za pomocą testu komórkowego

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunogenności i bioanalizy dotyczące wpływu przeciwciał neutralizujących na bezpieczeństwo leków, skuteczność oraz profile farmakokinetyczne i farmakodynamiczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia czułą i biologicznie istotną metodę komórkową do pomiaru specyficznych dla leku przeciwciał neutralizujących w sposób półilościowy. W tej technice enzymy znakowane fluoroforem dostają się do komórek Jurkata poprzez wiązanie reszty mannozy-6-fosforanu z niezależnym od kationów receptorem mannozo-6-fosforanu lub CI-M6PR.

Przeciwciała neutralizujące, które zapobiegają interakcji receptora enzymu, indukują spadek fluorescencji mierzony za pomocą cytometrii przepływowej. Na początek wysiewaj 7,5 razy 10 do czwartego komórki Jurkata w 100 mikrolitrach pożywki do wzrostu komórek na dołek na 96-dołkowej płytce do hodowli komórek z okrągłym dnem przez 14 do 20 godzin inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla o wilgotności 95%. Próbki do oznaczania należy najpierw rozcieńczyć w podłożu bezsurowicowym w stosunku jeden do 2,5.

Następnie dodać 60 mikrolitrów każdej próbki do odpowiednich dołków 96-dołkowej białej, niewiążącej płytki polipropylenowej z okrągłym dnem. Będzie to płytka do inkubacji próbki. W przypadku próbek, które dały wynik dodatni i wymagają potwierdzenia, należy przemieszać fiolkę z kulkami Enzymatycznej Terapii Zastępczej lub ERT i dodać odpowiednią liczbę kulek do 15-mililitrowej stożkowej probówki w celu ponownego wirowania.

Następnie umieść probówkę w magnetycznym stojaku na probówki na dwie minuty i ostrożnie usuń supernatant. Po czwartym praniu dodaj 100 mikrolitrów koralików do odpowiednich dołków nowej białej 96-dołkowej, niewiążącej płyty polipropylenowej z okrągłym dnem. Gdy wszystkie kulki zostaną platerowane, umieść płytkę na 96-dołkowym magnesie z bocznymi osłonami i pozwól kulkom uformować się w osad przed ostrożnym usunięciem przezroczystego supernatantu.

Następnie dodać 140 mikrolitrów każdej próbki do odpowiednich studzienek i uszczelnić płytkę folią z tworzywa sztucznego do wytrząsania przez co najmniej 60 minut na wytrząsarce obrotowej przy około 800 obr./min w temperaturze pokojowej. Następnie umieść płytkę potwierdzającą na 96-dołkowym magnesie z bocznymi osłonami, aby kulki mogły uformować kolejną osadówkę i dodaj 60 mikrolitrów próbki do odpowiednich dołków 96-dołkowej białej, okrągłej, niewiążącej płytki inkubacyjnej z polipropylenu. W przypadku próbek, które zostały poddane badaniom przesiewowym i potwierdzono ich wynik pozytywny, można przeprowadzić serię mian.

Aby przygotować serię miana, należy seryjnie rozcieńczyć próbkę w zbiorczej matrycy wystarczającą ilość razy, aby przekroczyć wcześniej określony punkt odcięcia miana i dodać 60 mikrolitrów każdej rozcieńczonej próbki do odpowiednich dołków na płytce inkubacyjnej próbki i 60 mikrolitrów odpowiednich stężeń ERT znakowanej fluoroforem do odpowiednich dołków nowej 96-dołkowej białej, okrągłodennej, niewiążącej płytki polipropylenowej z 96 dołkami zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie kilkakrotnie odpipetować roztwór próbki fluoroforu ERT, aby wymieszać i zawinąć płytki w folię na 14 do 20 godzin inkubacji w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza. Następnego ranka podgrzej płytki próbek w kąpieli perełkowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 do 15 minut i sprawdź posiane komórki pod odwróconym mikroskopem, aby potwierdzić, że komórki są zdrowe i równomiernie rozmieszczone w studzienkach.

Gdy płytki się ogrzeją, dodać 100 mikrolitrów próbki i znakowanej fluoroforem mieszaniny ERT do płytki komórkowej zgodnie z mapą płytki eksperymentalnej i zwrócić komórki do inkubatora do hodowli komórkowych na kolejne trzy godziny i 15 minut. Pod koniec inkubacji osadzać komórki przez odwirowanie i potwierdzać obecność osadu na dnie każdej studzienki. Trzymając płytkę pod kątem od 30 do 45 stopni, ostrożnie usuń supernatant z każdej studzienki, nie naruszając granulek i umyj komórki trzy razy w 200 mikrolitrach DPBS na studzienkę na wirowanie.

Po ostatnim praniu dodaj 100 mikrolitrów żywej martwej plamy do każdej studzienki na 15-minutową inkubację w temperaturze pokojowej w ciemności. Pod koniec inkubacji osadzać komórki przez odwirowanie i przemywać komórki 200 mikrolitrami DPBS na studzienkę. Ponownie zawiesić umyte granulki w 100 mikrolitrach od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza 1% paraformaldehydu na studzienkę i uszczelnić płytkę w celu delikatnego wirowania impulsowego.

Następnie zawiń płytkę w folię na 10-minutowe utrwalenie w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza. Aby przeanalizować żywotność komórek za pomocą cytometrii przepływowej, wymieszaj komórki z 50 mikrolitrami DPBS na studzienkę, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki i odczytaj komórki na cytometrze przepływowym zgodnie ze standardowymi protokołami cytometrii przepływowej. Wychwyt ERT sprzężony z fluoroforem można następnie ocenić na podstawie mediany intensywności fluorescencji lub MFI żywych pojedynczych komórek.

Przed badaniem w teście oblicza się eksperymentalny punkt odcięcia w badaniu przesiewowym jako próg do określenia próbek dodatnich i ujemnych. W tym przykładzie pokazano kontrole jakości wzbogacone o wysokie lub niskie ilości przeciwciał neutralizujących. Próbki dodatnie są następnie testowane w teście potwierdzającym przy użyciu sprzężonych z lekiem kulek magnetycznych w celu usunięcia przeciwciała specyficznego dla leku z próbek.

Próbki, w których współczynnik odzysku jest większy niż potwierdzający punkt odcięcia, uważa się za dodatnie. Próbki, które przeszły badania przesiewowe i potwierdziły wynik pozytywny, są seryjnie rozcieńczane i testowane w teście miana w celu określenia względnego miana przeciwciał neutralizujących w każdej próbce. Miano to wartość interpolowana między dwoma rozcieńczeniami, które przecinają punkt odcięcia miana.

Pokazane tutaj żywe jednokomórkowe MIF oceniały wychwyt ERT sprzężony z fluoroforem. Na przykład w tym eksperymencie matryca wzbogacona przeciwciałem kontroli pozytywnej hamowała wychwyt ERT sprzężony z fluoroforem, co skutkowało niską medianą intensywności fluorescencji. Natomiast komórki inkubowane z matrycą przy braku przeciwciała kontroli pozytywnej wykazywały wyższą medianę intensywności fluorescencji, co świadczy o wychwytywaniu ERT sprzężonego z fluoroforem.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zachowaniu ścisłych okien inkubacji, aby uzyskać wiarygodne i spójne wyniki. Ważne jest również, aby zoptymalizować test dla każdej enzymatycznej terapii zastępczej. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się immunogennością i bioanalizą w opracowywaniu leków w celu zbadania wpływu przeciwciał neutralizujących wychwyt komórek na bezpieczeństwo i skuteczność ERT.

Nie zapominaj, że praca z próbkami ludzkimi może być niezwykle niebezpieczna i że wszystkie próbki powinny być traktowane tak, jakby były potencjalnie zakaźne podczas wykonywania tej procedury.