Name: Wykrywanie przeciwciał, które neutralizują wychwyt komórkowy enzymatycznych terapii zastępczych za pomocą testu komórkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Poznaj metodę wykrywania przeciwciał neutralizujących terapie enzymatyczne przy użyciu cytometrii przepływowej i komórek Jurkat. Technika ta umożliwia półilościową analizę w ludzkich matrycach biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Macierze ludzkie zostały zakupione z komercyjnych źródeł za zgodą ich Institutional Review Board (IRB), jednak należy je traktować jako potencjalnie zakaźne. Należy upewnić się, że wykorzystywane środowisko laboratoryjne zapewnia przestrzeganie zasad bezpieczeństwa12.
1. Przed rozpoczęciem analizy
<ol>
	<li>Przygotować magnetyczne kuleczki streptawidyny sprzężone z ERT zgodnie z instrukcją producenta13.</li>
	<li>Przygotować próbki kontroli jakości (QC): dodać przeciwciało kontrolne dodatnie (PC) (np. NAb) do macierzy specyficznej dla gatunku (np. zpoolowanego płynu mózgowo-rdzeniowego lub surowicy). 
	UWAGA: Wytyczne FDA i EMA zalecają przygotowanie wysokiej i niskiej QC do walidacji testu i rutynowych badań1,14.
	<ol>
		<li>Na przykład, aby uzyskać QC o stężeniu 10 µg/mL, dodać 10 µL roztworu zapasowego kontroli dodatniej o stężeniu 1 mg/mL do 990 µL odpowiedniej macierzy (np. CSF), aby uzyskać całkowitą objętość 1 000 µL.</li>
		<li>Podzielić próbki QC na alikwoty o objętości odpowiedniej do jednorazowego użycia (np. 50 µL) i zamrozić alikwoty w temperaturze od -60 do -80 °C1.</li>
		<li>Podzielić kontrolę punktu odcięcia (CC), czyli macierz specyficzną dla gatunku, która nie była traktowana badanym preparatem (np. zpoolowany CSF lub surowica), na alikwoty do jednorazowego użycia (np. 50 µL) i zamrozić alikwoty w temperaturze od -60 do -80 °C1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić reakcję sprzęgania fluoroforu z ERT za pomocą zestawu do znakowania białek zgodnie z protokołem producenta15. Podzielić próbkę na alikwoty o objętości odpowiedniej do jednorazowego użycia (np. 50 µL) i zamrozić alikwoty w temperaturze od -60 do -80 °C.</li>
</ol>
2. Dzień 1: Wysiew komórek i przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Przygotowanie płytki z komórkami
	<ol>
		<li>W kolejnych krokach należy używać komory z laminareskim przepływem powietrza i zachować warunki aseptyczne. Każdy przedmiot umieszczany w komorze należy spryskać 70% etanolem i utrzymać czystość środowiska16,17,18.</li>
		<li>Podgrzać pożywkę do hodowli komórek (np. RPMI-1640 z 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny-streptomycyny) w kąpieli wodnej lub z kulek w temperaturze 37 °C19.</li>
		<li>Policzyć ludzkie limfocyty T linii Jurkat i wysiać 100 µL na studzienkę w stężeniu 7,5 x 105 komórek/mL w 96-dołkowej płytce do hodowli komórek z dnem okrągłym, odpowiedniej do zastosowania w cytometrze przepływowym wyposażonym w automatyczny podawacz płytek.
		<ol>
			<li>Na przykład do policzenia komórek można użyć komory countingowej lub automatycznego licznika komórek20,21.</li>
			<li>Przed rozpoczęciem eksperymentu należy upewnić się, że żywotność komórek wynosi co najmniej 70% (np. oceniając żywotność za pomocą barwienia błękitem trypanu)17.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i 95% wilgotności przez noc, od 14 do 20 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbek do przesiewu
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć próbki badane lub próbki kontrolne testu za pomocą pożywki bezsurowiczej (np. RPMI-1640). W opisanej tutaj metodzie próbki rozcieńcza się 1:2,5 w RPMI-1640, dodając 60 µL próbki do 90 µL pożywki bezsurowiczej (np. w probówkach w paskach 8-sturowych). Przejść do kroku 3.1 procedury testowej w celu przygotowania ERT znakowanego fluorochromem. 
		Uwaga: Rozcieńczenie 1:2,5 zostało określone eksperymentalnie i jest optymalne dla prezentowanej tutaj metody. Optymalne rozcieńczenia próbek powinny być określane dla każdej opracowywanej metody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kulek i próbek do potwierdzenia
	<ol>
		<li>Obliczyć liczbę kulek koniugowanych z ERT potrzebnych dla próbek potwierdzających.
		<ol>
			<li>Na przykład dla 10 próbek: 10 próbek x 100 µL kulek koniugowanych z ERT na próbkę + 30% zapasu w celu zrekompensowania strat podczas etapu płukania = 1 300 µL kulek koniugowanych z ERT.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dokładnie wymieszać kulki w wirówce typu vortex. Przenieść obliczoną liczbę kulek do stożkowej probówki 15 mL w celu płukania.</li>
		<li>Przepłukać magnetyczne kulki koniugowane z ERT, dodając 1 300 µL buforu sprzęgającego lub zgodnie z zaleceniami producenta (np. za pomocą soli fizjologicznej z buforem fosforanowym z 0,1% polisorbatasu 20), wykonując poniższe kroki13.</li>
		<li>Dokładnie wymieszać probówkę w wirówce vortex. Umieścić probówkę w magnetycznym stojaku na probówki na 2 min. Bez naruszania kulek ostrożnie odessać i usunąć nadsącz. 
		UWAGA: Roztwór zmieni kolor z ciemnobrązowego na przejrzysty, gdy kulki zostaną przyciągnięte przez magnes.</li>
		<li>Resuspendować kulki w 1 300 µL buforu sprzęgającego. Powtórzyć etapy płukania do uzyskania łącznie czterech płukań.</li>
		<li>Po ostatnim płukaniu zawiesić kulki w 1 300 µL buforu sprzęgającego (obliczonego wcześniej w kroku 2.3.1.1). Dodać 100 µL na studzienkę do 96-dołkowej, białej płytki z polipropylenu niewiążącego o dnie okrągłym, zgodnie z mapą płytki (np. jedna studzienka potwierdzająca na próbkę lub kontrolę jakości QC; próbka zostanie podzielona na duplikaty podczas inkubacji z ERT znakowanym fluorochromem).</li>
		<li>Umieścić płytkę na 96-dołkowym magnesie z bocznym wspornikiem i pozwolić kulek uformować osad. Ostrożnie odessać przejrzysty nadsącz i go usunąć. 
		UWAGA: Roztwór zmieni kolor z ciemnobrązowego na przejrzysty po około 1–2 min na magnesie z bocznym wspornikiem. Tak otrzymane kulki nazywa się kulkami „suchymi”.</li>
		<li>Jeśli próbki w przesiewie dały wynik dodatni i są potwierdzane, dodać 100 µL każdej próbki z i bez kulek koniugowanych z ERT do odpowiedniej/przypisanej studzienki. Uszczelnić płytkę folią plastikową i wstrząsać przez co najmniej 60 min na wytrząsarce rotacyjnej przy prędkości około 800 rpm w temperaturze pokojowej (RT). 
		UWAGA: Na każdej płytce powinny znaleźć się wcześniej przygotowane i zamrożone dodatnie i ujemne kontrole jakości (QC) oraz kontrola komórkowa (CC).</li>
		<li>Po inkubacji umieścić płytkę potwierdzającą na 96-dołkowym magnesie z bocznym wspornikiem i pozwolić kulkom uformować osad.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie serii rozcieńczeń miana
	<ol>
		<li>Aby przygotować serię mian, należy wykonać rozcieńczenia seryjne próbki w połączonej matrycy wystarczającą liczbę razy, aby przekroczyć predetermined titer cut point (uprzednio określony punkt odcięcia miana)1.</li>
		<li>Na przykład zmieszać 30 µL próbki z 60 µL połączonej matrycy w serii rozcieńczeń 1:3, otrzymując łącznie 8 rozcieńczeń (np. w probówkach w paskach 8-sturowych). Przejść do kroku 3.1 procedury testowej w celu przygotowania ERT znakowanego fluorochromem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Dzień 1: Procedura analizy
<ol>
	<li>Przygotuj ERT znakowane fluorochromem w medium beztłuszcznym (np. 60 µL na dołek lub około 6 mL/płytkę).
	<ol>
		<li>Na przykład, aby przygotować 10 mL roztworu ERT znakowanego fluorochromem o stężeniu 1 µg/mL, dodaj 10 µL roztworu zapasu ERT znakowanego fluorochromem o stężeniu 1 mg/mL do 9,99 mL medium beztłuszcznego (np. RPMI-1640).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do nowej płytki inkubacyjnej (np. białej płytki z polipropylenu niewiążącego, z okrągłym dnem i 96 dołkami) dodaj przygotowane próbki z kroków 2.2, 2.3 lub 2.4 oraz ERT znakowane fluorochromem w stosunku 1:1 w dołkach powtórzonych (np. przenieś 60 µL każdej przygotowanej próbki i dodaj 60 µL ERT znakowanego fluorochromem do każdego dołka). 
	UWAGA: Przykładowy schemat rozmieszczenia próbek na płytce eksperymentalnej przedstawiono na Rysunku 1.</li>
</ol>
<img alt="Układ płytki do przesiewania i potwierdzania próbek; tabela przedstawiająca wysoką, niską i brak kontrolę jakości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przykład układu płytki eksperymentalnej. Próbki oraz znakowany fluorophorem ERT inkubowano przez noc w temperaturze 2–8 °C. Kontrole, takie jak wysoka kontrola jakości (HQC), niska kontrola jakości (LQC) oraz negatywna kontrola jakości (NQC), poddano przesiewaniu i potwierdzeniu w przeciwległych narożnikach płytki w celu oceny jednorodności płytki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="3">
	<li>Wymieszaj próbki z ERT znakowanym fluoroforem, pipetując roztwór kilkakrotnie w górę i w dół za pomocą pipety wielokanałowej. Owiń płytki folią i inkubuj przez noc w temperaturze 2–8 °C przez 14–20 h.</li>
</ol>
4. Dzień 2: Dodawanie przygotowanych próbek do komórek
<ol>
	<li>Wyjąć płytkę(i) z próbkami z inkubacji w temperaturze 2–8 °C i ogrzać płytki, umieszczając je w łaźni kuleczkowej w temperaturze 37 °C na 10–15 min.</li>
	<li>Wyjąć komórki z inkubatora CO2 . Przeprowadzić wizualną kontrolę wysianych komórek za pomocą mikroskopu odwróconego, aby upewnić się, że komórki wyglądają na zdrowe i są równomiernie rozłożone w dołkach17,19.</li>
	<li>Do płytki z komórkami dodać 100 µL wcześniej wymieszanych próbek i ERT znakowanego fluoroforem zgodnie z mapą płytki eksperymentalnej.</li>
	<li>Umieścić płytkę z komórkami i dodanymi próbkami z powrotem w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C. Inkubować płytkę przez 3 h ± 15 min. 
	UWAGA: Czas ten został ustalony w laboratorium jako optymalny dla stosunku sygnału do szumu w tym teście.</li>
	<li>Wirować płytkę z komórkami przez 6 min przy 320 x g w wirówce laboratoryjnej w temperaturze 14–18 °C. Potwierdzić obecność osadu komórkowego na dnie dołków płytki.</li>
	<li>Trzymać płytkę pod kątem 30–45°. Ostrożnie usunąć nadsącz z każdego dołka, nie naruszając osadu komórkowego. Do osadu komórkowego w każdym dołku dodać 200 µL 1x DPBS w celu resuspensji komórek.</li>
	<li>Powtórzyć etapy płukania komórek łącznie 3 razy. Bezzwłocznie przejść do kroku 5 w celu przeprowadzenia barwienia żywotności komórek.</li>
</ol>
5. Dzień 2: Barwienie żywotności komórek
<ol>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej do każdego dołka dodaj 100 µL roztworu roboczego barwnika 1x Live/Dead, wybranego pod kątem długości fali emisji różnej od długości fali fluoroforu znakującego ERT i przygotowanego zgodnie z instrukcją producenta22.</li>
	<li>Inkubuj płytkę przez 15 min w RT w ciemności. Wirowarkuj płytkę przez 6 min przy 320 x g w wirówce stołowej w temperaturze 14–18 °C.</li>
	<li>Ostrożnie usuń nadsącz z każdego dołka, nie naruszając osadu komórkowego. Przemyj komórki 1x roztworem 1x DPBS.</li>
</ol>
6. Dzień 2: Fixacja komórek 1% paraformaldehydem
<ol>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej nanieś 100 µL schłodzonego (do 2–8 °C) 1% paraformaldehydu (PFA) do każdej studzienki.</li>
	<li>Uszczelnij płytki i delikatnie wymieszaj w wibratorze laboratoryjnym (vortex). Owiń płytkę folią i pozostaw w temperaturze 2–8 °C przez co najmniej 10 min w celu przeprowadzenia fiksacji. 
	UWAGA: Należy uważać, aby nie rozprysnąć roztworu na uszczelnienie płytki.</li>
	<li>Przed analizą nanieś do każdej studzienki 50 µL 1x DPBS za pomocą pipety wielokanałowej, wykonując kilka razy ruchy zasysania i wydalania cieczy.</li>
</ol>
7. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Umieść płytki w cytometrze przepływowym za pomocą automatycznego podajnika płytek i rozpocznij analizę.</li>
	<li>Nabyj i zapisz zmierzoną medianę intensywności fluorescencji (MFI) przy użyciu oprogramowania do cytometrii przepływowej (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Przykład ustawień podajnika przedstawiono na Rysunku 2. Szybkość przepływu próbki, objętość próbki, objętość mieszania, prędkości mieszania oraz liczba cykli mieszania zostały zoptymalizowane dla tego testu. Kryteria te można dostosować, korzystając z przycisków „strzałka w górę” lub „strzałka w dół” znajdujących się obok wartości każdego parametru, w zależności od wersji oprogramowania do akwizycji danych z cytometru przepływowego23.</li>
</ol>
<img alt="Układ płytki 96-dołkowej do pobierania próbek; przesiewanie wysokoprzepustowe; szczegółowy panel ustawień." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przykład ustawień automatycznego podajnika cytometru przepływowego. Ustawienia podajnika powinny być zoptymalizowane dla każdego opracowanego testu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<ol start="3">
	<li>Utworzyć analizę cytometryczną/bramki/wykresy zgodnie z Rysunkiem 3. 
	UWAGA: Sposób tworzenia i stosowania bramek może się różnić w zależności od zastosowanego oprogramowania do cytometrii przepływowej23.</li>
</ol>
<img alt="Schemat cytometrii przepływowej; proces sortowania komórek; analiza mediany intensywności fluorescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Strategia bramkowania w cytometrii przepływowej. Komórki Jurkat zostały oddzielone od wszystkich zarejestrowanych zdarzeń poprzez wykreślenie kanału rozproszenia przedniego (FSC) vs. kanału rozproszenia bocznego (SSC) i wyznaczenie bramki wokół populacji docelowej. Singlety (pojedyncze komórki) oddzielono od dubletów lub większych agregatów komórkowych przy użyciu kanałów pola powierzchni FSC (FSC-A) i wysokości FSC (FSC-H). Żywe komórki wyselekcjonowano poprzez bramkowanie komórek singletowych wykazujących brak barwienia żywotności. Medianę intensywności fluorescencji (MFI) zmierzono w pojedynczych, żywych komórkach Jurkat i przedstawiono w formie histogramu. Pokazano wartości MFI dla komórek z zablokowanym poborem leku (np. HQC) oraz komórek z kontrolnymi ilościami poboru (odpowiednio kolorem czerwonym i niebieskim). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="4">
	<li>Wyklucz martwe komórki z analizy i zarejestruj około 10 000 zdarzeń23.</li>
</ol>
8. Analiza danych
<ol>
	<li>Wyeksportuj dane (surowe MFI) do oprogramowania analitycznego (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: W zależności od wymaganej analizy, poniższa analiza danych może zostać przeprowadzona przy użyciu oprogramowania analitycznego.</li>
	<li>Oblicz średnią MFI dla dołków powtórzonych (kontroli jakości i próbek) oraz współczynnik zmienności (%CV), aby ocenić rozrzut wartości powtórzeń względem średniej. 
	<img alt="Wzór na obliczanie średniej, równanie; analiza statystyczna, schemat równania matematycznego." src="/files/ftp_upload/57777/57777eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
	<img alt="Wzór na odchylenie standardowe, Σ(x−x̄)²/(n−1), równanie analizy statystycznej." src="/files/ftp_upload/57777/57777eq2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"> 
	<img alt="Wzór na współczynnik zmienności, %CV=(SD/Średnia)×100, równanie analizy statystycznej." src="/files/ftp_upload/57777/57777eq3v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 3"></li>
	<li>Dla próbek i kontrole jakości (QC) poddanych badaniu, oblicz procent hamowania sygnału (%SI) w stosunku do średniej MFI dla połączonej macierzy kontroli kalibracyjnej (CC) dla QC. 
	<img alt='Wzór na procentową inhibicję sygnału, „%SI=(1-MFI_sample/MFI_CC)*100”, przedstawiony w formie równania.' src="/files/ftp_upload/57777/57777eq4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 4"></li>
	<li>W razie potrzeby oblicz współczynniki odzysku (RR) dla potwierdzonych próbek kontrolnych (QC) oraz próbek w odniesieniu do odpowiadających im wartości z przesiewu. 
	<img alt="Wzór współczynnika odzysku dla próbki potwierdzającej w stosunku do próbki przesiewowej, analiza równania, zastosowanie edukacyjne." src="/files/ftp_upload/57777/57777eq5v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 5"></li>
</ol>

<ol><li>CDER. <a target="_blank" href="https://www.federalregister.gov/documents/2016/04/25/2016-09449/assay-development-and-validation-for-immunogenicity-testing-of-therapeutic-protein-products-revised">Assay Development and Validation for Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products (Draft)</a>. , FDA Guidance for Industry. (2016).</li>
<li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+design%2C+optimization%2C+and+qualification+of+cell-based+assays+used+for+the+detection+of+neutralizing+antibody+responses+elicited+to+biological+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics.</a> Journal of Immunological Methods. 321, 1-18 (2007).</li>
<li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+validation+of+cell-based+assays+used+for+the+detection+of+neutralizing+antibody+immune+responses+elicited+against+biological+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 55, 878-888 (2011).</li>
<li>Pedras, A. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/presentation/895f/a1cdeee956c71f4ce362c83482babafe4027.pdf">NAb me well- FDA Regulatory Perspectives on Neutralizing Antibody Assays.</a> BEBPA Forum. , (2015).</li>
<li>Stovold, C. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/presentation/6e78/9a080ab24212417437716434d326500accf5.pdf">NAB Assay Development and Validation Immunogencity Workflow.</a> Annual BEBPA Bioassay Meeting. , (2013).</li>
<li>Kromminga, A. <a target="_blank" href="https://www.e-i-p.eu/wp-content/uploads/2013/02/symposium-2013-Arno-Kromminga.pdf">Neutralizing anti-drug antibodies Emerging Trends and Clinical Impact. Symposium</a>. , IPM Biotech. (2013).</li>
<li>Davis, R. S., Wang, Y. H., Kubagawa, H., Cooper, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+family+of+Fc+receptor+homologs+with+preferential+B+cell+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of a family of Fc receptor homologs with preferential B cell expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 9772-9777 (2001).</li>
<li>Melton, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+that+neutralize+cellular+uptake+of+elosulfase+alfa+are+not+associated+with+reduced+efficacy+or+pharmacodynamic+effect+in+individuals+with+Morquio+A+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Antibodies that neutralize cellular uptake of elosulfase alfa are not associated with reduced efficacy or pharmacodynamic effect in individuals with Morquio A syndrome.</a> Journal of Immunological Methods. 440, 41-51 (2017).</li>
<li>U.S. Department of Health and Human Services. Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). <a target="_blank" href="http://www.nihs.go.jp/dbcb/TEXT/S6.pdf">Guidance for Industry. S6 Addendum to Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Pharmaceuticals</a>. , ICH. (2012).</li>
<li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biochemical+and+pharmacological+comparison+of+enzyme+replacement+therapies+for+the+glycolipid+storage+disorder+Fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A biochemical and pharmacological comparison of enzyme replacement therapies for the glycolipid storage disorder Fabry disease.</a> Glycobiology. 13, 305-313 (2003).</li>
<li>Kirkegaard, T. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1517%2F21678707.2013.780970">Emerging therapies and therapeutic concepts for lysosomal storage diseases.</a> Expert Opinion on Orphan Drugs. 1, 385-404 (2013).</li>
<li>Miller, J. M., et al. Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories. Morbidity and Mortality Weekly Report. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su6101a1.htm">https://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su6101a1.htm</a> 1-101 (2012).</li>
<li>Invitrogen by ThermoFisher Scientific. <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/65305">Dynabeads M-270 Streptavidin</a>. , (2015).</li>
<li>European Medicines Agency. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guideline+on+Immunogenicity+assessment+of+biotechnology-derived+therapeutic+proteins%22">Guideline on Immunogenicity assessment of biotechnology-derived therapeutic proteins</a>. , European Medicines Agency. (2017).</li>
<li>ThermoFisher Scientific. <a target="_blank" href="https://www.fishersci.com/shop/products/alexa-fluor-647-protei-1-kit/a20173">Molecular Probes Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit (A20173)</a>. , (2004).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood">An Introduction to Working in the Hood.</a> Journal of Visualized Experiments. , General Laboratory Techniques (2018).</li>
<li>Invitrogen and Gibco. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cell+Culture+Basics+Handbook%22">Cell Culture Basics Handbook</a>. , ThermoFisher Scientific Inc. (2010).</li>
<li>Coecke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+on+Good+Cell+Culture+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22Alternatives+to+Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Guidance on Good Cell Culture Practice.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 33, 261-287 (2005).</li>
<li>ThermoFisher Scientific. Introduction to Cell Culture. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/introduction-to-cell-culture.html">https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/introduction-to-cell-culture.html</a> (2018).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , Basic Methods in Cellular and Molecular Biology (2018).</li>
<li>Bio-Rad Laboratories. Counting Cells with Bio-Rad's TC20(TM) Automated Cell Counter. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=sDHOL7UEL1M">https://www.youtube.com/watch?v=sDHOL7UEL1M</a> (2012).</li>
<li>ThermoFisher Scientific. <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/live_dead_fixable_dead_cell_stains_man.pdf">User Guide LIVE / DEAD Fixable Dead Cell Stain Kits</a>. , (2016).</li>
<li>Biosciences. <a target="_blank" href="https://www.bu.edu/flow-cytometry/files/2010/10/BDFACSDivaSoftwareQuickStart.pdf">Getting Started with BD FACSDiva Software</a>. , BD Biosciences. (2007).</li>
<li>Biosciences. <a target="_blank" href="http://pedsresearch.org/_files/BD_FACS_Canto_II_Users_Guide.pdf">BD FACS Canto II Instructions For Use</a>. , (2007).</li>
<li>Quirke, P. <a target="_blank" href="https://www.bu.edu/flow-cytometry/files/2010/10/BD-Flow-Cytom-Learning-Guide.pdf">Introduction to Flow Cytometry: A Learning Guide.</a> Journal of Clinical Pathology. 45 (3), (2002).</li>
<li>Bio-Rad Laboratoratories. A guide to gating in flow cytometry. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/blog/a-guide-to-gating-in-flow-cytometry.html">https://www.bio-rad-antibodies.com/blog/a-guide-to-gating-in-flow-cytometry.html</a> (2016).</li>
<li>Minor, L. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMinor%2C+LK+%22Handbook+of+Assay+Development+in+Drug+Discovery%22">Handbook of Assay Development in Drug Discovery</a>. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2006).</li>
<li>Desilva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+Bioanalytical+Method+Validation+of+Ligand-binding+Assays+to+Support+Pharmacokinetic+Assessments+of+Macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the Bioanalytical Method Validation of Ligand-binding Assays to Support Pharmacokinetic Assessments of Macromolecules.</a> Pharmaceutical Research. 20, (2003).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cell-based+and+non-cell-based+assay+platforms+for+the+detection+of+clinically+relevant+anti-drug+neutralizing+antibodies+for+immunogenicity+assessment+of+therapeutic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of cell-based and non-cell-based assay platforms for the detection of clinically relevant anti-drug neutralizing antibodies for immunogenicity assessment of therapeutic proteins.</a> Journal of Immunological Methods. 419, 1-8 (2015).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+neutralizing+assay+for+antibodies+and+sera+against+hepatitis+E+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A high-throughput neutralizing assay for antibodies and sera against hepatitis E virus.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
<li>Charles River. A Flow Cytometric Method to Assess Neutralizing Antibodies to AAV Gene-Therapy Vectors. Charles River Researcher. , (2015).</li>
<li>Biosciences. BD Biosciences Relative Fluorochrome Brightness. BD Biosciences. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bdbiosciences.com/us/applications/research/multicolor-flow/m/745795/overview">http://www.bdbiosciences.com/us/applications/research/multicolor-flow/m/745795/overview</a> 16181(2014).</li>
<li>Waritani, T., Chang, J., McKinney, B., Terato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ELISA+protocol+to+improve+the+accuracy+and+reliability+of+serological+antibody+assays%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">An ELISA protocol to improve the accuracy and reliability of serological antibody assays.</a> MethodsX. 4, 153-165 (2017).</li>
<li>Iversen, P. W., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK83783/">HTS Assay Validation.</a> Assay Guidance Manual. , 1-30 (2004).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://sevierlab.vet.cornell.edu/resources/TR0034-Ab-binding-proteins.pdf">Tech Tip #34. Binding characteristics of antibody-binding proteins: Protein A, Protein G, Protein A/G and Protein L</a>. , (2013).</li>
<li>Long, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+Immunogenicity+of+Elosulfase+Alfa+in+the+Treatment+of+Morquio+A+Syndrome%3A+Results+From+MOR-005%2C+a+Phase+III+Extension+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Long-term Immunogenicity of Elosulfase Alfa in the Treatment of Morquio A Syndrome: Results From MOR-005, a Phase III Extension Study.</a> Clinical Therapeutics. 39, (2017).</li>
<li>Schweighardt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+Elosulfase+Alfa%2C+an+Enzyme+Replacement+Therapy+in+Patients+with+Morquio+A+Syndrome%3A+Results+from+MOR-004%2C+a+Phase+III+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of Elosulfase Alfa, an Enzyme Replacement Therapy in Patients with Morquio A Syndrome: Results from MOR-004, a Phase III Trial.</a> Clinical Therapeutics. 37, (2015).</li>
<li>Schneider, Z. Importance of isoelectric point (pI) of antibodies. Antibody Society. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.antibodysociety.org/importance-isoelectric-point-pi-antibodies/">http://www.antibodysociety.org/importance-isoelectric-point-pi-antibodies/</a> (2017).</li>
<li>Mellman, I. R. A., Plutner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization+and+Degradation+of+Macrophage+Fc+Receptors+Bound+to+Polyvalent+Immune+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Internalization and Degradation of Macrophage Fc Receptors Bound to Polyvalent Immune Complexes.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1170-1177 (1984).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+antibodies+to+the+therapeutic+enzymes%3A+considerations+for+testing%2C+prevention+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Neutralizing antibodies to the therapeutic enzymes: considerations for testing, prevention and treatment.</a> Nature Biotechnology. 26, 901-908 (2008).</li>
</ol>

Autorzy są pracownikami i udziałowcami firmy BioMarin Pharmaceutical Inc.

Przeciwciała neutralizujące lub inne czynniki, które uniemożliwiają wychwyt ERT przez CI-M6PR, mogą potencjalnie wpływać na bezpieczeństwo lub skuteczność ERT1. Dlatego ważne jest, aby ocenić NAb w próbkach badanych przy użyciu solidnego modelu istotnego dla mechanizmu działania leku. My i inni odkryliśmy, że wydajność niektórych formatów testów biologicznych (np. dimeryzacja receptora, ekspresja lucyferazy itp.) nie jest zgodna z zaleceniami władzds. zdrowia dotyczącymi precyzji, odtwarzalności i czułości testu. W opisanej tutaj metodzie testu biologicznego komórki Jurkat, które wyrażają endogenny CI-M6PR, są wykorzystywane do monitorowania NAb specyficznych dla lizosomalnego wychwytu ERT. W połączeniu z odczytem cytometrii przepływowej, test ten wykorzystuje fizjologiczny model komórki o odpowiedniej precyzji testu, czułości, odtwarzalności i wysokiej przepustowości próbki. Detekcja NAb z odczytem cytometrii przepływowej została zastosowana również w innych wskazaniach. Na przykład opracowano metody wykrywania wcześniej istniejących przeciwciał przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu E i wirusowi związanego z adenowirusem (AAV)30,31.
Krytyczne kroki w protokole obejmują wybór odpowiedniego fluoroforu, włączenie LQC, który monitoruje czułość testu, zapewnienie wystarczającego poziomu żywotności komórek i utrzymanie ścisłego przestrzegania czasów inkubacji. W przedstawionym przykładzie fluorofory (np. Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647 i CypHer 5e), sprzężone z lizosomalnym ERT, różniły się znacznie pod względem wydajności. Alexa Fluor 647, który był również najjaśniejszym testowanym fluoroforem32, został wybrany do dalszego rozwoju testu. Zalecamy, aby kilka fluoroforów zostało ocenionych na wczesnym etapie opracowywania testu, aby zapewnić najlepszą czułość i zakres dynamiki. Czułość testu podczas badania próbki powinna być monitorowana poprzez włączenie LQC, która jest na tyle bliska granicy czułości, że zakończy się niepowodzeniem w 1% serii testowych1. Wraz z HQC, LQC działa również jako system kontroli jakości do monitorowania dryfu testu w czasie3. Optymalna żywotność i wydajność komórek osiąga się poprzez przygotowanie banku komórek jednorazowych podwielokrotności i kwalifikację do nowych banków komórek na podstawie porównywalnych wyników kontroli jakości 3,18. Czas inkubacji leku sprzężonego z komórkami i fluoroforem ma również kluczowe znaczenie dla spójnej wydajności testu, ponieważ wychwyt leku wzrasta wraz z czasem, w którym lek jest inkubowany z komórkami. Aby zminimalizować codzienną zmienność w przyjmowaniu leku, dane dotyczące próbek można znormalizować do zbiorczych próbek kontrolnych matrycy na każdej płytce (np. próbki kontrolne punktu odcięcia w powyższej metodzie). Innym ważnym czynnikiem w uzyskiwaniu spójnych danych za pomocą tej metody jest monitorowanie jednorodności blachy i minimalizowanie możliwych efektów krawędzi. Początkowy eksperyment może obejmować przeprowadzenie testu przy użyciu pojedynczej kontroli jakości na całej płytce, podczas gdy bardziej szczegółowe eksperymenty można przeprowadzić podczas walidacji testu (np. precyzja i dokładność)1. Świadczy to o znaczeniu układu mapy tablicowej33. Jak pokazano na przykładzie mapy płyty, próbki kontroli jakości umieszczone po obu stronach płyty monitorują jednorodność, którą można śledzić w czasie za pomocą wykresów Leveya-Jenningsa34.
Podczas gdy test ten monitoruje NAb i inne czynniki, które mogą hamować wychwyt lizosomalnej ERT, można przeprowadzić dodatkowe eksperymenty w celu potwierdzenia zahamowania wychwytu przez przeciwciała. Jedną z opcji jest traktowanie próbek białkiem A/G/L, które niespecyficznie wiąże immunoglobulinę35. Jeśli próbki nadal dają wynik dodatni po wyczerpaniu białka A/G/L, czynnik hamujący niebędący przeciwciałami może być odpowiedzialny za blokowanie wchłaniania leku. Opisana tutaj metoda została zaprojektowana do pomiaru zahamowania wychwytu za pośrednictwem przeciwciał, a kontrola pozytywna i inne parametry testu powinny być ponownie rozważone, jeśli zostanie znaleziony wysoki odsetek badanych próbek z czynnikami hamującymi niebędącymi przeciwciałami.
Test można również dalej scharakteryzować, aby wykazać transport leków znakowanych fluoroforem do odpowiedniego przedziału komórkowego w oparciu o mechanizm działania leku. W przedstawionym tutaj przykładzie oczekuje się, że ERT zwiąże CI-M6PR na powierzchni komórki i przetransportuje go do lizosomu. Wcześniej informowaliśmy o wynikach kilku eksperymentów wskazujących, że prawie cały sygnał fluorescencyjny obserwowany w metodzie wynika z ERT znakowanego fluoroforem w lizosomie8. Odkryliśmy, że znakowany fluoroforem sygnał ERT został wyeliminowany po potraktowaniu komórek cytochalazyną B, która zakłóca internalizację poprzez hamowanie reorganizacji aktyny. Również eksperymenty, w których wygaszano zewnętrzny fluorofor błękitem trypanowym lub spowalniano internalizację poprzez umieszczanie komórek w temperaturze 4 °C, wskazują, że znakowany fluoroforem ERT jest szybko internalizowany i bardzo mała fluorescencja jest spowodowana wiązaniem ERT na powierzchni komórki. Celowanie lizosomalne zostało potwierdzone poprzez wizualizację kolokalizacji barwnika lizotrackera wrażliwego na pH z lekiem sprzężonym z fluoroforem za pomocą mikroskopii konfokalnej. Swoistość dla wychwytu przez CI-M6PR można również zweryfikować przy użyciu egzogennego M6P, aby konkurować z lekami znakowanymi pod względem wiązania z receptorem. Podobne eksperymenty należy przeprowadzić w celu zweryfikowania kinetyki wychwytu i lokalizacji komórkowej leków sprzężonych z fluoroforem w innych testach.
Ta platforma testowa oparta na komórkach została wykorzystana do badania NAb dla leków terapeutycznych, które wykorzystują endocytozę za pośrednictwem receptora CI-M6PR. Niedawno przedstawiliśmy wyniki przy użyciu tej platformy testowej, które wykazały brak korelacji między rozwojem NAb a skutecznością leku dla elosulfazy alfa36,37. Aby zwalidować test do badań klinicznych, parametry, w tym czułość testu, precyzja, selektywność, swoistość, tolerancja leku, odporność i punkty odcięcia, należy ocenić zgodnie z ustalonymi wytycznymi 3,4. Należy również zauważyć, że w przypadku lizosomalnych ERT NAb mogą rozwijać się z potencjałem do zakłócania aktywności leku poprzez wiązanie w pobliżu miejsca katalitycznego enzymu. Ogólnie rzecz biorąc, uważamy, że monitorowanie tego typu NAb ma niższy priorytet, ponieważ ostre kwaśne i proteolityczne środowisko lizosomu nie sprzyja interakcjom przeciwciało-ERT 2,39,40. Możliwe jest jednak, że istnieją oporne na proteolizy NAb i mogą hamować katalityczną część leku40. Test ten monitoruje wychwyt ERT znakowany fluoroforem do lizosomu, a ograniczeniem testu jest niemożność monitorowania opornych na proteolizy NAb. Jeśli podejrzewa się ten typ NAb na podstawie danych dotyczących bezpieczeństwa lub skuteczności, należy opracować test monitorujący aktywność ERT i zastosować go do badania próbek.
Ocena immunogenności jest ważna dla zrozumienia wpływu NAb na bezpieczeństwo i skuteczność leków. Identyfikacja NAb zdolnych do hamowania wychwytu leków in vitro za pomocą CI-M6PR daje możliwość zrozumienia aktywności NAb in vivo. Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje ludzką linię komórkową, która wyraża CI-M6PR do pomiaru interferencji lizosomalnego wychwytu komórkowego ERT sprzężonego z fluoroforem. Metoda ta została już wykorzystana do monitorowania NAb dla kilku ERT przeznaczonych do leczenia lizosomalnych chorób spichrzeniowych. Ta platforma testowa może mieć zastosowanie do innych metod badania wpływu NAb na terapie biologiczne, które wymagają internalizacji komórkowej do ich prawidłowego funkcjonowania.

Ocena immunogenności jest ważną częścią programu monitorowania bezpieczeństwa i skuteczności każdego biologicznego produktu terapeutycznego, w tym ERT. U pacjentów może rozwinąć się odpowiedź immunologiczna, która może bezpośrednio wpływać na bezpieczeństwo leku, skuteczność oraz profile farmakokinetyczny/farmakodynamiczne. Podzbiór tych ADA, zwany NAb, może hamować skuteczność ERT na dwa sposoby: poprzez hamowanie wychwytu ERT do komórki docelowej lub poprzez hamowanie aktywności katalitycznej ERT. Przedstawiona tutaj metoda ma na celu pomiar NAb, które zakłócają wychwyt ERT do komórek. Aby w pełni monitorować bezpieczeństwo i skuteczność terapeutycznego ERT, ciągłe monitorowanie NAb ma kluczowe znaczenie w wyjaśnieniu wszelkich potencjalnych korelacji z wynikami klinicznymi lub efektami farmakodynamicznymi1.
Platformy do oceny NAb w porównaniu z terapiami białkowymi obejmują testy komórkowe, aktywność enzymatyczną i testy wiązania ligandów1. Optymalna platforma testowa jest wybierana na podstawie różnych kryteriów: mechanizmu działania produktu terapeutycznego, czułości platformy testowej, selektywności, precyzji i co ważne, jej zdolności do naśladowania hamującego działania NAb in vivo. Testy wiążące ligand mogą być odpowiednie w niektórych przypadkach (np. gdy nie można zidentyfikować odpowiedniej linii komórkowej lub jeśli nie można osiągnąć odpowiedniej czułości w teście komórkowym). Jednak w projekcie wytycznych FDA dla przemysłu z 2016 r. i innych akceptowanych przez branżę białych księgach zaleca się przeprowadzanie testów NAb opartych na komórkach, ponieważ mogą one lepiej odzwierciedlać biologiczny mechanizm działania leku in vivo1,2,3.
Kluczowe elementy do opracowania testu NAb opartego na cytometrii przepływowej obejmują odpowiednią linię komórkową, która reaguje na stymulację lekową, zastępczą kontrolę pozytywną NAb, która neutralizuje ERT, ERT sprzężoną z fluoroforem oraz matrycę biologiczną badanego gatunku4,5,6. Wybór linii komórkowej zależy od mechanizmu działania ERT i wiele linii komórkowych powinno być ocenianych podczas opracowywania testu3. W opisanej tutaj metodzie ludzkie limfocyty T Jurkat zostały wybrane ze względu na ich endogenną ekspresję CI-M6PR na powierzchni komórki i brak receptorów fragmentów przeciwciał (FcR), które bezkrytycznie wiążą region Fc większości przeciwciał7,8. Podczas opracowywania testu ważne jest, aby ustalić kontrolę negatywną dla badań walidacyjnych i badania próbek pobranych od pacjentów, takich jak surowica pobrana od osób, które nie były leczone testem article1. Linie komórkowe powinny również tolerować odpowiednie matryce różnych gatunków w celu zapewnienia ciągłości na nieklinicznych, klinicznych i pomarketingowych etapach opracowywania leku1. Kolejnym elementem jest wybór kontroli pozytywnej testu. Kontrola pozytywna do testu wychwytu komórek ERT została wybrana na podstawie jej zdolności do wiązania terapii i neutralizacji wychwytu przez CI-M6PR9,1. Często trudno jest uzyskać użyteczne lub trwałe ilości neutralizujących surowic odpornościowych od ludzi do wykorzystania jako kontrola testu, szczególnie w populacjach pacjentów z chorobami rzadkimi2. Alternatywy obejmują surowice odpornościowe pochodzące od hiperimmunizowanych zwierząt lub oczyszczone z powinowactwa przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne wzbogacone do odpowiedniego testu matrix1. W przypadku stosowania matrycy specyficznej dla gatunku możliwe jest, że czynniki hamujące inne niż przeciwciała obecne w matrycy mogą hamować wychwyt ERT. Innym krytycznym składnikiem testu jest ERT sprzężony z fluoroforem. Wybór fluoroforu do koniugacji ERT powinien być oceniany dla każdego ERT, w oparciu o zapotrzebowanie testu na jasność, stabilność pH i potencjalne nakładanie się widma na inne kanały cytometru przepływowego.
Test opisany tutaj jest przykładem pomiaru NAb do białka terapeutycznego, takiego jak ERT, które dostaje się do komórki przez CI-M6PR. Kilka ERT, przeznaczonych do leczenia lizosomalnych zaburzeń spichrzeniowych (LSD), wykorzystuje ten szlak do wychwytu komórek i celowania lizosomalnego, w tym elosulfaza alfa w zespole Morquio A, cerliponaza alfa w chorobie Battena CLN2, agalzydaza alfa w chorobie Fabry'ego i alglukozydaza alfa w chorobie Pompego10,11. Celem tej metody jest pomiar względnych poziomów NAb, które zakłócają wiązanie i internalizację leku poprzez CI-M6PR. Odbywa się to w wielopoziomowych krokach przesiewowych, potwierdzających i mianowych3. Próbki są najpierw badane pod kątem dodatniego wyniku NAb, a następnie potwierdzane dodatnie na etapie potwierdzającym. Na koniec próbki, które przeprowadzają badanie przesiewowe i potwierdzają wynik pozytywny, można seryjnie rozcieńczać w celu wytworzenia miana przeciwciał 1. Ten test wychwytu leku oparty na cytometrii przepływowej opartej na komórkach zapewnia czułą i mechanistycznie istotną metodę pomiaru NAb specyficznych dla leku, które mogą wpływać na profil farmakologiczny leku. Wcześniej zwalidowaliśmy metodę i przetestowaliśmy próbki kliniczne przy użyciu tej platformy dla leku elosulfaza alfa8. Poniżej opisujemy szczegółowy protokół krok po kroku, który można zastosować do innych białek terapeutycznych lub ERT.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; m jednostka filtrująca, 500 ml próżniowe kolby filtracyjne</td><td>Corning</td><td>CLS430769</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe dno 96-dołkowe płytki hodowlane</td><td>Thermo-Nunclon</td><td>163320</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne zbiorniki na odczynniki</td><td>VistaLab</td><td>3054-1004</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa biała płytka do mikropłytek z polistyrenu z okrągłym dnem</td><td>Corning</td><td>3605</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe rurki polipropylenowe, 8-rurkowe paski</td><td>Corning</td><td>4408</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczny separator kulek stojak na probówki</td><td>V& P Scientific, Inc</td><td>VP 772F2M-1, VP 772F2R-2, VP 772F2R-3</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag -2 Magnes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag -96 Magnes z listwą boczną</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Próbnik o wysokiej przepustowości (HTS)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek BioRad TC20</td><td></td><td></td> Wytrząsarka do mikropłytek BioRad 1450103 <td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>12620-928</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka Galaxy MiniStar</td><td>Hodowla tkankowa VWR</td><td>C1413</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Nuaire</td><td>NU-4750</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Labcono</td><td>Purifier Cell Logic +</td><td></td></tr> <tr><td>Jurkat Cell Line</td><td>ATCC</td><td>TIB152 i handel;</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania białek Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A20173</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M270 Streptavidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65306</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-LC-LC-Biotyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21343</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 1x Technologie średniego</td><td>życia</td><td>A10491-01-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td> <td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep (100x) płynna</td><td>formuła Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS bez wapnia i magnezu</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehydowa</td><td>mikroskopia elektronowa Science</td><td>15735-85</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Zestaw do naprawy fioletowych barwników martwych komórek, do wzbudzenia 405 nm</td><td>Life Technologies</td><td>L34955</td><td></td></tr><tr><td>Animacja 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>3059</td><td></td></tr><tr><td>Zbiorcza matryca ludzka (np. ludzka surowica lub płyn mózgowo-rdzeniowy)</td><td>Biorekulacja IVT</td><td>Poproś o wycenę ze strony internetowej</td><td></td></tr><tr><td>VWR Poliestrowa folia płytowa</td><td>VWR</td><td>60941</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelka & Przykładowa folia aluminiowa</td><td>Beckman Coulter</td><td>538619</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie przeciwciał, które neutralizują wychwyt komórkowy enzymatycznych terapii zastępczych za pomocą testu komórkowego

Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay

Podawanie pacjentom enzymatycznych terapii zastępczych (ERT) i innych terapii biologicznych może wywołać przeciwlekową odpowiedź immunologiczną. Charakterystyka tych przeciwciał przeciwlekowych (ADA), zwłaszcza tych, które mogą neutralizować aktywność biologiczną leku, określanych jako przeciwciała neutralizujące (NAbs), ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia wpływu tych przeciwciał na profil farmakologiczny leku. Protokół ten opisuje metodę cytometrii przepływowej opartej na komórkach w celu wykrycia czynników, które neutralizują wychwyt komórkowy reprezentatywnego lizosomalnego ERT w ludzkiej matrycy. Protokół składa się z trzech procedur: badania przesiewowego, etapu potwierdzającego i testów miana w celu wykrycia, zidentyfikowania i ustalenia względnego poziomu miana przeciwciał neutralizujących w próbkach badanych.
W tej metodzie, próbki są najpierw mieszane z produktem ERT sprzężonym z fluoroforem, a następnie inkubowane z komórkami [np. ludzkimi limfocytami T (komórki Jurkat)], które wyrażają niezależny od kationów receptor 6-fosforanu mannozy na powierzchni komórki (CI-M6PR), a na końcu analizowane za pomocą cytometru przepływowego. Próbka bez NAbs spowoduje wychwyt sprzężonego z fluoroforem produktu ERT za pośrednictwem CI-M6PR, podczas gdy obecność NAbs zwiąże się z lekiem i zakłóci wiązanie i wychwyt CI-M6PR. Ilość sprzężonego z fluoroforem ERT zinternalizowanego przez komórki Jurkata mierzy się za pomocą cytometrii przepływowej i ocenia jako procentowe (%) zahamowanie sygnału w porównaniu z odpowiedzią uzyskaną w obecności reprezentatywnej matrycy nieleczonej wcześniej przez lek. Na etapie potwierdzania próbki są wstępnie inkubowane z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z ERT w celu wyczerpania czynników specyficznych dla leku, które wiążą się z lekiem (takich jak NAb) przed inkubacją z komórkami. Próbki, które przeprowadzają badanie przesiewowe i potwierdzają pozytywny wynik testu na obecność specyficznych dla leku NAb, są następnie seryjnie rozcieńczane w celu wytworzenia miana przeciwciał. Półilościowe miana przeciwciał mogą być skorelowane z pomiarami bezpieczeństwa i skuteczności leku.

Pierwszego dnia metody rozmrożono i wysiano zamrożoną alikwot komórek Jurkat, a następnie przygotowano próbki testowe. Rycina 1 przedstawia przykładowy schemat płytki. Drugiego dnia próbki zmieszano z komórkami Jurkat i inkubowano w temperaturze 37 °C przez około 3 h i 15 min. Następnie komórki przemyto, utrwalono za pomocą PFA i przeanalizowano na cytometrze przepływowym. Rycina 2 przedstawia przykładowe ustawienia cytometru przepływowego.
Strategia bramkowania w cytometrii przepływowej została opracowana w celu pomiaru ilości leku sprzężonego z fluoforem w żywych pojedynczych komórkach Jurkat24 (Rycina 3). Komórki oddzielono od zanieczyszczeń poprzez wyznaczenie bramki wykluczającej debris komórkowy [zazwyczaj niskie rozproszenie przednie (FSC)] oraz martwe komórki [zazwyczaj wysokie rozproszenie boczne (SSC)], pozostawiając do analizy jedynie żywe komórki25. Następnie pojedyncze komórki oddzielono od skupisk komórkowych poprzez wyznaczenie bramki wykluczającej obszar wysokiego FSC oraz niską wysokość FSC26. Komórki poddano barwieniu na żywotność, które oznakowało wszystkie martwe lub niezdrowe komórki pozbawione nienaruszonej membrany, a następnie utworzono dodatkową bramkę w celu wykluczenia komórek martwych22. Do analizy wychwytu ERT sprzężonego z fluoforem wykorzystano MFI żywych pojedynczych komórek. Jako przykład potencjalnych wyników testu przesiewowego, macierz wzbogacona wysoką ilością dodatniej kontroli w postaci zastępczego przeciwciała przeciwlekowego [np. wysoka kontrola jakości (HQC)] zahamowała wychwyt ERT sprzężonego z fluoforem, co skutkowało niskim MFI wynoszącym około 300 (Rycina 3). W przeciwieństwie do tego, komórki inkubowane z macierzą w obecności przeciwciała kontrolnego dodatniego powinny wykazać wyższe MFI (MFI = 37 830 na Rycynie 3), co świadczy o wychwycie ERT sprzężonego z fluoforem.
Neutralizujące przeciwciało kontroli dodatniej dla niniejszego przykładu wybrano na podstawie mechanizmu działania leku (t.j. pobierania ERT poprzez CI-M6PR). W celu optymalizacji czułości i zakresu dynamicznego testu sprawdzono i porównano również panel fluoroforów1. Przetestowano CypHer 5e ze względu na zwiększoną fluorescencję w niskim pH, co w przypadku niektórych leków ERT może być istotne jako dodatkowy miernik kierowania leku do lizosomów27. Badano również zielony barwnik fluorescencyjny (np. Alexa Fluor 488) oraz barwnik fluorescencyjny w bliskiej podczerwieni (np. Alexa Fluor 647). Przykład działania różnych fluoroforów przedstawiono na Rysunku 4a i 4b. W tym przykładzie ERT z Alexa Fluor 647 wykazał najlepsze parametry ze względu na wyższą czułość (np. najwyższy %SI przy najniższym stężeniu PC) oraz szeroki zakres dynamiczny (~3 rzędy wielkości).
<img alt="Analiza inhibicji fluorescencji, wykresy zależności dawka-odpowiedź; inhibicja sygnału w funkcji MFI z miareczkowaniem kontrolnym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Przykładowe wyniki dla różnych koniugatów fluorofor-ERT. (A) Podczas opracowywania testu należy ocenić krzywą rozcieńczeń kontroli pozytywnej (PC), wykorzystując różne ERT koniugowane z fluoroforami. W przedstawionym przykładzie dwa ERT koniugowane z fluoroforami (Alexa Fluor 488 i CypHer 5e) w stężeniu 6,25 µg/mL oraz ERT koniugowany z jaśniejszym fluoroforem (Alexa Fluor 647) w stężeniu 1,56 µg/mL zostały przetestowane w obecności rosnących stężeń przeciwciał neutralizujących (NAbs) kontroli pozytywnej. (B) Ten panel przedstawia wykresy krzywych z panelu A, gdzie użyto MFI, aby wykazać znaczący wzrost zakresu dynamicznego przy zastosowaniu ERT koniugowanego z Alexa Fluor 647. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Opisana metoda stanowi wieloetapowe podejście do wykrywania, potwierdzania i interpolacji quasi-ilościowego poziomu miana NAb3. Aby ustalić, czy test jest gotowy do walidacji, należy ocenić parametry takie jak czułość, precyzja, selektywność, swoistość, tolerancja leku, odporność oraz punkty odcięcia zgodnie z ustalonymi wytycznymi1,3.
Próbki uznano za potencjalnie dodatnie w tym teście, gdy uzyskano wartości %SI przekraczające punkt odcięcia przesiewowego (SCP). SCP określono statystycznie poprzez badanie próbek od osób, które nie otrzymywały leków, pochodzących z reprezentatywnej populacji i pomiar względnego spadku intensywności sygnału (SI)3. Wytyczne (na przykład FDA) zalecają, aby SCP ustalać na poziomie 95.th percentyla dla normalnie rozłożonego zbioru danych; metody obliczania SCP zostały szczegółowo opisane w innym opracowaniu1. Każda próbka, która spowodowała spadek sygnału testowego (mierzone jako wzrost %SI) na poziomie SCP lub powyżej niego, została uznana za potencjalnie dodatnią, natomiast próbki z wynikami niższymi niż SCP (bez zmian lub ze spadkiem %SI) uznano za ujemne.
Próbki, które w badaniu przesiewowym dały wynik dodatni (%SI powyżej SCP), poddano analizie potwierdzającej w celu określenia specyficzności NAb wobec ERT. Analizę potwierdzającą przeprowadzono poprzez wstępną inkubację próbek z magnetycznymi koralikami sprzężonymi z ERT, aby usunąć przeciwciała specyficzne dla leku lub czynniki hamujące. Oceniono RR (stosunek MFI z badania potwierdzającego do MFI z badania przesiewowego), aby określić liczbę NAb usuniętych z próbki. RR wyższy niż obliczony próg dodatniości [t.j. punkt odcięcia dla badania potwierdzającego (CCP)] wskazywał na obecność NAb przeciwko lekowi. Podobnie jak w badaniu przesiewowym, CCP należy najpierw ustalić poprzez ocenę próbek od osób nieleczonych z reprezentatywnej populacji w analizie potwierdzającej. CCP oparto na statystycznie określonym 1% wskaźniku wyników fałszywie dodatnich i stanowiło ono próg wyznaczający próbkę potwierdzoną jako dodatnia (Rysunek 5)3.
Próbki, które w badaniu przesiewowym okazały się dodatnie, poddano rozcieńczeniom seryjnym i przebadano w teście miana w celu określenia względnego poziomu lub miana przeciwciał neutralizujących (NAbs) w każdej próbce. Najwyższe rozcieńczenie, przy którym próbka daje wynik dodatni po przekroczeniu wyznaczonego progu [np. punktu odcięcia miana (TCP)], stanowi miano próbki (Rysunek 5)1,3.
<img alt="Wyniki testu przeciwciał neutralizujących, sekwencja wykresów przedstawiająca porównanie inhibicji i miana." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Przykładowe wyniki badania próbek. Panele te przedstawiają przykłady próbek, które dały wynik dodatni lub ujemny w badaniu przesiewowym, powyżej lub poniżej wartości SCP wynoszącej 17.51 %SI. Próbki dodatnie poddano następnie testowi potwierdzającemu z wykorzystaniem magnetycznych kulek sprzężonych z lekiem, aby usunąć przeciwciała specyficzne dla leku z próbek przed przeprowadzeniem testu. Próbki z współczynnikiem odzysku (RR) większym niż punkt odcięcia dla testu potwierdzającego (i.e., RR = 1.315) uznano za potwierdzone dodatnie. Próbki potwierdzone jako dodatnie rozcieńczano do momentu, aż sygnał przekroczył punkt odcięcia miana (TCP), aby ustalić miano (czynnik rozcieńczenia), przy którym wynik próbki jest równy punktowi odcięcia miana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Powtarzalność i zmienność analizy testowano przez kilka dni z udziałem więcej niż jednego analityka. Próbki QC przygotowano początkowo w jednej partii, a następnie podzielono na alikwoty do jednorazowego użycia. W ciągu 3 d dwóch analityków przeprowadziło analizę z wykorzystaniem kilku zestawów QC, aby wykazać precyzję metody. W przedstawionych przykładowych danych %CV precyzji między- i wewnątrzanalizy dla próbek QC jest niższy niż zalecana w wytycznych FDA wartość %CV &lt; 20% (Rysunek 6)1.
<img alt="Tabele statystyczne HQC i LQC przedstawiające wariancje wewnątrzseryjną i międzyseryjną w pomiarach %SI." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Przykład danych precyzji kontroli jakości (QC) wygenerowanych w ciągu trzech dni przez dwóch analityków. Dane dotyczące precyzji obliczono za pomocą analizy wariancji (ANOVA), stosując wzór przedstawiony przez DeSilva et al.28. Statystyki wewnątrzseryjne (w obrębie serii) i międzyseryjne (między seriami) przedstawiono jako %CV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy metodę cytometrii przepływowej opartej na komórkach do wykrywania przeciwciał neutralizujących lub innych czynników, które zakłócają pobieranie przez komórkę enzymatycznych terapii zastępczych w ludzkiej matrycy, takich jak płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) lub ludzka surowica.

Wykrywanie przeciwciał, które neutralizują wychwyt komórkowy enzymatycznych terapii zastępczych za pomocą testu komórkowego

The administration of enzyme replacement therapies (ERTs) and other biologic therapies to patients may elicit an anti-drug immune response. The ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunogenności i bioanalizy dotyczące wpływu przeciwciał neutralizujących na bezpieczeństwo leków, skuteczność oraz profile farmakokinetyczne i farmakodynamiczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia czułą i biologicznie istotną metodę komórkową do pomiaru specyficznych dla leku przeciwciał neutralizujących w sposób półilościowy. W tej technice enzymy znakowane fluoroforem dostają się do komórek Jurkata poprzez wiązanie reszty mannozy-6-fosforanu z niezależnym od kationów receptorem mannozo-6-fosforanu lub CI-M6PR.Przeciwciała neutralizujące, które zapobiegają interakcji receptora enzymu, indukują spadek fluorescencji mierzony za pomocą cytometrii przepływowej. Na początek wysiewaj 7,5 razy 10 do czwartego komórki Jurkata w 100 mikrolitrach pożywki do wzrostu komórek na dołek na 96-dołkowej płytce do hodowli komórek z okrągłym dnem przez 14 do 20 godzin inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla o wilgotności 95%. Próbki do oznaczania należy najpierw rozcieńczyć w podłożu bezsurowicowym w stosunku jeden do 2,5.Następnie dodać 60 mikrolitrów każdej próbki do odpowiednich dołków 96-dołkowej białej, niewiążącej płytki polipropylenowej z okrągłym dnem. Będzie to płytka do inkubacji próbki. W przypadku próbek, które dały wynik dodatni i wymagają potwierdzenia, należy przemieszać fiolkę z kulkami Enzymatycznej Terapii Zastępczej lub ERT i dodać odpowiednią liczbę kulek do 15-mililitrowej stożkowej probówki w celu ponownego wirowania.Następnie umieść probówkę w magnetycznym stojaku na probówki na dwie minuty i ostrożnie usuń supernatant. Po czwartym praniu dodaj 100 mikrolitrów koralików do odpowiednich dołków nowej białej 96-dołkowej, niewiążącej płyty polipropylenowej z okrągłym dnem. Gdy wszystkie kulki zostaną platerowane, umieść płytkę na 96-dołkowym magnesie z bocznymi osłonami i pozwól kulkom uformować się w osad przed ostrożnym usunięciem przezroczystego supernatantu.Następnie dodać 140 mikrolitrów każdej próbki do odpowiednich studzienek i uszczelnić płytkę folią z tworzywa sztucznego do wytrząsania przez co najmniej 60 minut na wytrząsarce obrotowej przy około 800 obr./min w temperaturze pokojowej. Następnie umieść płytkę potwierdzającą na 96-dołkowym magnesie z bocznymi osłonami, aby kulki mogły uformować kolejną osadówkę i dodaj 60 mikrolitrów próbki do odpowiednich dołków 96-dołkowej białej, okrągłej, niewiążącej płytki inkubacyjnej z polipropylenu. W przypadku próbek, które zostały poddane badaniom przesiewowym i potwierdzono ich wynik pozytywny, można przeprowadzić serię mian.Aby przygotować serię miana, należy seryjnie rozcieńczyć próbkę w zbiorczej matrycy wystarczającą ilość razy, aby przekroczyć wcześniej określony punkt odcięcia miana i dodać 60 mikrolitrów każdej rozcieńczonej próbki do odpowiednich dołków na płytce inkubacyjnej próbki i 60 mikrolitrów odpowiednich stężeń ERT znakowanej fluoroforem do odpowiednich dołków nowej 96-dołkowej białej, okrągłodennej, niewiążącej płytki polipropylenowej z 96 dołkami zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie kilkakrotnie odpipetować roztwór próbki fluoroforu ERT, aby wymieszać i zawinąć płytki w folię na 14 do 20 godzin inkubacji w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza. Następnego ranka podgrzej płytki próbek w kąpieli perełkowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 do 15 minut i sprawdź posiane komórki pod odwróconym mikroskopem, aby potwierdzić, że komórki są zdrowe i równomiernie rozmieszczone w studzienkach.Gdy płytki się ogrzeją, dodać 100 mikrolitrów próbki i znakowanej fluoroforem mieszaniny ERT do płytki komórkowej zgodnie z mapą płytki eksperymentalnej i zwrócić komórki do inkubatora do hodowli komórkowych na kolejne trzy godziny i 15 minut. Pod koniec inkubacji osadzać komórki przez odwirowanie i potwierdzać obecność osadu na dnie każdej studzienki. Trzymając płytkę pod kątem od 30 do 45 stopni, ostrożnie usuń supernatant z każdej studzienki, nie naruszając granulek i umyj komórki trzy razy w 200 mikrolitrach DPBS na studzienkę na wirowanie.Po ostatnim praniu dodaj 100 mikrolitrów żywej martwej plamy do każdej studzienki na 15-minutową inkubację w temperaturze pokojowej w ciemności. Pod koniec inkubacji osadzać komórki przez odwirowanie i przemywać komórki 200 mikrolitrami DPBS na studzienkę. Ponownie zawiesić umyte granulki w 100 mikrolitrach od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza 1% paraformaldehydu na studzienkę i uszczelnić płytkę w celu delikatnego wirowania impulsowego.Następnie zawiń płytkę w folię na 10-minutowe utrwalenie w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza. Aby przeanalizować żywotność komórek za pomocą cytometrii przepływowej, wymieszaj komórki z 50 mikrolitrami DPBS na studzienkę, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki i odczytaj komórki na cytometrze przepływowym zgodnie ze standardowymi protokołami cytometrii przepływowej. Wychwyt ERT sprzężony z fluoroforem można następnie ocenić na podstawie mediany intensywności fluorescencji lub MFI żywych pojedynczych komórek.Przed badaniem w teście oblicza się eksperymentalny punkt odcięcia w badaniu przesiewowym jako próg do określenia próbek dodatnich i ujemnych. W tym przykładzie pokazano kontrole jakości wzbogacone o wysokie lub niskie ilości przeciwciał neutralizujących. Próbki dodatnie są następnie testowane w teście potwierdzającym przy użyciu sprzężonych z lekiem kulek magnetycznych w celu usunięcia przeciwciała specyficznego dla leku z próbek.Próbki, w których współczynnik odzysku jest większy niż potwierdzający punkt odcięcia, uważa się za dodatnie. Próbki, które przeszły badania przesiewowe i potwierdziły wynik pozytywny, są seryjnie rozcieńczane i testowane w teście miana w celu określenia względnego miana przeciwciał neutralizujących w każdej próbce. Miano to wartość interpolowana między dwoma rozcieńczeniami, które przecinają punkt odcięcia miana.Pokazane tutaj żywe jednokomórkowe MIF oceniały wychwyt ERT sprzężony z fluoroforem. Na przykład w tym eksperymencie matryca wzbogacona przeciwciałem kontroli pozytywnej hamowała wychwyt ERT sprzężony z fluoroforem, co skutkowało niską medianą intensywności fluorescencji. Natomiast komórki inkubowane z matrycą przy braku przeciwciała kontroli pozytywnej wykazywały wyższą medianę intensywności fluorescencji, co świadczy o wychwytywaniu ERT sprzężonego z fluoroforem.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zachowaniu ścisłych okien inkubacji, aby uzyskać wiarygodne i spójne wyniki. Ważne jest również, aby zoptymalizować test dla każdej enzymatycznej terapii zastępczej. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się immunogennością i bioanalizą w opracowywaniu leków w celu zbadania wpływu przeciwciał neutralizujących wychwyt komórek na bezpieczeństwo i skuteczność ERT.Nie zapominaj, że praca z próbkami ludzkimi może być niezwykle niebezpieczna i że wszystkie próbki powinny być traktowane tak, jakby były potencjalnie zakaźne podczas wykonywania tej procedury.

detection-antibodies-that-neutralize-cellular-uptake-enzyme

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie demonstrujemy test kolorymetryczny in vitro do wykrywania obecności przeciwciał neutralizujących przeciwko wektorom rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem serotypu 6 (rAAV6) w próbkach surowicy owczej. Test wykorzystuje reakcję między AAV kodującym ludzki gen fosfatazy alkalicznej łożyska a jego substratem w celu wytworzenia nierozpuszczalnego fioletowego produktu.

Test przeciwciał neutralizujących AAV na bazie komórek: technika kolorymetryczna do wykrywania przeciwciał neutralizujących przeciwko specyficznym wirusom związanym z adenowirusami w surowicy

Ten film prezentuje wykrywanie autoprzeciwciał wysp trzustkowych w ludzkiej surowicy. Przeciwciała w surowicy łączą antygen sprzężony rutenem z biotynylowanym antygenem wychwytującym, tworząc kompleksy, które są wykrywane za pomocą pomiarów elektrochemiluminescencyjnych.

Wykrywanie ludzkich autoprzeciwciał wysp trzustkowych za pomocą testu elektrochemiluminescencyjnego

W ostatnich latach testy oparte na żywych komórkach były z powodzeniem wykorzystywane do wykrywania przeciwciał przeciwko antygenom powierzchniowym i konformacyjnym. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą wysokoprzepustową cytometrię przepływową, umożliwiającą analizę dużych kohort pacjentów. Wykrycie nowych przeciwciał poprawi diagnostykę i leczenie zaburzeń o podłożu immunologicznym.

Wysokoprzepustowy test cytometrii przepływowej oparty na komórkach do wykrywania przeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu lub receptorowi dopaminy-2 w ludzkiej surowicy

Tutaj opisujemy dwa testy do pomiaru aktywacji dopełniacza indukowanej przez przeciwciała przeciwko czerwonym krwinkom. Główną przewagą nad obecnymi testami jest ich ilościowy i łatwy w interpretacji charakter.

Metody ilościowego wykrywania indukowanej przez przeciwciała aktywacji dopełniacza na krwinkach czerwonych

Protokół do określania względnej aktywności antyapoptotycznej mAb anty-TNFα przy użyciu mechanizmu neutralizacji z komórkami WEHI 164 jest przedstawiony tutaj. Protokół ten jest przydatny do porównywania siły neutralizacji różnych cząsteczek o tej samej funkcjonalności biologicznej.

Oznaczanie względnej siły działania przeciwciała monoklonalnego anty-TNF (mAb) przez neutralizację TNF przy użyciu metody bioanalitycznej in vitro

Opracowaliśmy prosty test cytometrii przepływowej do oceny wiązania przeciwciał blokujących PD-1 z limfocytami T, wymagający jedynie kropli krwi obwodowej od pacjentów z rakiem.

Monitorowanie przeciwciał blokujących PD-1 związanych z limfocytami T pochodzącymi z kropli krwi obwodowej

Opisany tutaj protokół przedstawia szybką i skuteczną metodę pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko białku kolca SARS-CoV-2 poprzez ocenę zdolności próbek surowicy rekonwalescencyjnej do hamowania infekcji przez wzmocniony wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej znakowany zielonym fluorescencyjnym białkiem, pseudotypowany glikoproteiną kolca.

Wykrywanie przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego infekcji pseudowirusem

Kompleksowy protokół laboratoryjny i przepływ pracy analizy są opisane dla szybkiego, opłacalnego i prostego testu kolorymetrycznego opartego na komórkach do wykrywania elementów neutralizujących przeciwko AAV6.

Metoda krok po kroku do wykrywania przeciwciał neutralizujących przeciwko AAV za pomocą kolorymetrycznego testu komórkowego

Ten protokół przedstawia zautomatyzowaną, opartą na obrazie technikę wysokoprzepustową do identyfikacji związków modulujących zabijanie komórek raka piersi za pośrednictwem komórek NK w obecności terapeutycznego przeciwciała anty-HER-2.

Test przesiewowy o wysokiej zawartości do identyfikacji zależnych od przeciwciał związków modyfikujących cytotoksyczność komórkową

Tutaj prezentujemy protokół dla testu cytotoksyczności zależnej od przeciwciał za pośrednictwem komórek (ADCC) przy użyciu zestawu do testów biologicznych ADCC. Metoda ta stanowi cenne narzędzie do wyjaśnienia mechanizmu ADCC i oceny potencjału terapeutycznego przeciwciał w immunoterapii nowotworów.

Ocena zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej w komórkach nowotworowych za pomocą testu biologicznego reporterowej cytotoksyczności zależnej od przeciwciał komórkowych

Prezentujemy zwalidowany test ELISA z użyciem nowych przeciwciał monoklonalnych anty-HER2. Test ten umożliwia precyzyjne określenie ilościowe związanego z komórkami i uwolnionego białka HER2 z komórek hodowanych in vitro i innych próbek, w tym krwi i tkanek.

Zwalidowany test immunochemiczny do kompleksowego określenia receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 uwalnianego z komórek i związanego z komórkami

Poznaj metodę wykrywania przeciwciał neutralizujących terapie enzymatyczne przy użyciu cytometrii przepływowej i komórek Jurkat. Technika ta umożliwia półilościową analizę w ludzkich matrycach biologicznych.

Wykrywanie przeciwciał, które neutralizują wychwyt komórkowy enzymatycznych terapii zastępczych za pomocą testu komórkowego

Przeglądaj więcej filmów