Wykrywanie przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego infekcji pseudowirusem

Opisany tutaj protokół przedstawia szybką i skuteczną metodę pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko białku kolca SARS-CoV-2 poprzez ocenę zdolności próbek surowicy rekonwalescencyjnej do hamowania infekcji przez wzmocniony wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej znakowany zielonym fluorescencyjnym białkiem, pseudotypowany glikoproteiną kolca.

Metoda ta pozwala odpowiedzieć na jedno z ważniejszych pytań dotyczących opracowywanych szczepionek przeciwko SARS-koronawirus-2. Czy szczepionka jest w stanie wywołać neutralizującą odpowiedź przeciwciał? Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykonać w obiekcie o drugim poziomie zabezpieczenia.

Jest również stosunkowo szybki i niedrogi, dzięki czemu doskonale nadaje się do analizy wielu próbek jednocześnie. Demonstrując procedurę neutralizacji kwasu, mamy Ricardo Mariusa, starszego technika w laboratorium i Taylora Jamiesona, doktoranta medycyny medycyny. Zacznij od hodowli komórek Vero E6 w DMEM uzupełnionym 10% FBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Aby przejść przez komórki, najpierw umyj je, dodając 10 mililitrów PBS i delikatnie kołysząc naczyniem cztery do pięciu razy. Po zaessaniu PBS dodaj trzy mililitry trypsyny EDTA i kołysz naczyniem, aby upewnić się, że cała powierzchnia jest pokryta przed inkubacją w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po odłączeniu komórek dezaktywuj trypsynę, dodając siedem mililitrów DMEM uzupełnionego 10% FBS, a następnie ponownie zawieś komórki, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół.

Usunąć trypsynę przez odwirowanie i odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego przed ponownym zawieszeniem komórek w 10 mililitrach świeżego DMEM. Po policzeniu dodaj około raz 10 do siódmych komórek na każdą 15-centymetrową płytkę i inkubuj kulturę przez jeden do dwóch dni, aż komórki będą w 100% zlewne. Aby przygotować pseudowirusa EGFP skoku VSV do mianowania, należy zainfekować komórki przy 0,01 wielokrotności infekcji podstawowym wirusem rozcieńczonym w 12 mililitrach DMEM bez surowicy.

Po dodaniu wirusa inkubuj komórki przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, od czasu do czasu kołysząc. Pod koniec inkubacji zastąp inokulum świeżym DMEM uzupełnionym 2% FBS i 20 milimolowymi hałdami, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 34 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Następnego dnia użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby uwidocznić ekspresję EGFP w zainfekowanych komórkach.

Po zaobserwowaniu rozległego efektu cytopatycznego i oderwania komórek, należy zebrać supernatant kultury i usunąć zanieczyszczenia przez odwirowanie. Aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, należy podwielokrotnić supernatant przed przechowywaniem w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby określić miano wirusa, umieść komórki Vero E6 na płytkach sześciodołkowych z gęstością wysiewu sześć razy 10 do piątej komórki na studzienkę i inkubuj przez noc.

Następnego dnia należy przeprowadzić dziesięciokrotną serię seryjnych rozcieńczeń materiału wirusowego, dodając 900 mikrolitrów pożywki do siedmiu mikroprobówek wirówkowych i dodając 100 mikrolitrów wywaru wirusowego do pierwszej probówki. Po krótkim wirowaniu przenieś 100 mikrolitrów rozcieńczonego wirusa do każdej kolejnej probówki, wirując między każdą probówką. Następnie zastąpić supernatant w każdym dołku płytki hodowlanej Vero E6 500 mikrolitrami 10 do minus sekundy do 10 do minus siódmych rozcieńczeń wirusa.

Po 45 minutach inkubacji w inkubatorze do hodowli komórkowych z delikatnym kołysaniem co 15 minut, zastąp inokulum roztworem nakładkowym i inkubuj komórki w temperaturze 34 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 48 godzin. Pod koniec inkubacji, aby uwidocznić blaszki za pomocą barwienia fioletem krystalicznym, umyj komórki jeden raz PBS, a następnie dodaj dwa mililitry 0,1% fioletu krystalicznego do każdej studzienki. Umieść płytkę na kołysce na około 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie delikatnie umyj każdą studzienkę dwa razy PBS.

Po ostatnim przemyciu pozostaw płytki do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej godzinę przed użyciem wzoru, jak wskazano, w celu obliczenia miana wirusa w każdym dołku w jednostkach tworzących płytkę nazębną na mililitr. Aby ułożyć komórki na płytki do testu neutralizacji, użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 100 mikrolitrów komórek Vero E6 do każdej studzienki 96-dołkowej płytki o gęstości dwa razy 10 do piątej komórki na mililitr i inkubuj płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia należy poddać działaniu ciepła próbki surowicy pacjenta, które mają być badane w łaźni wodnej o temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Następnie należy ustawić dziesięciokrotną serię rozcieńczeń próbek surowicy pacjenta na pustej 96-dołkowej płytce do hodowli tkankowej, dodając osiem mikrolitrów surowicy do 72 mikrolitrów DMEM bez surowicy z antybiotykami w każdym dołku rzędu A. Następnie dodać 40 mikrolitrów DMEM bez surowicy do każdej studzienki w rzędach od B do G i 80 mikrolitrów do każdej studzienki rzędu H. Używając 12-dołkowej pipety wielokanałowej, wymieszać próbki w rzędzie A, a następnie przenieść 40 mikrolitrów próbki z każdej studzienki rzędu A do każdej studzienki rzędu B. Po wymieszaniu powtórzyć rozcieńczenie dla każdego kolejnego rzędu studzienek aż do rzędu F. Następnie dodać 40 mikrolitrów kolca VSV EGFP przy 0,05 wielokrotności infekcji do każdej studzienki w rzędach A do G, i mieszać pipetując cztery do pięciu razy przed inkubacją płytki przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Pod koniec inkubacji ostrożnie zassać supernatant z każdej studzienki płytki hodowlanej Vero E6 i przenieść 60 mikrolitrów mieszaniny wirusa przeciwciał z każdej studzienki płytki do rozcieńczania próbki do odpowiedniego dołka płytki do hodowli komórkowej. Po przeniesieniu wszystkich próbek umieść płytkę do hodowli komórkowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na jedną godzinę z kołysaniem co 20 minut.

Po zakończeniu inkubacji dodać 140 mikrolitrów roztworu nakładki karboksymetylocelulozy do każdego dołka płytki do hodowli komórkowej i przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 34 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po 24 godzinach zobrazuj płytki na automatycznym obrazowniku fluorescencyjnym o długości fali 488 nanometrów i użyj funkcji automatycznego zliczania kamery, aby określić ilościowo poszczególne ogniska EGFP. W tym reprezentatywnym przykładzie jako kontrolę pozytywną zastosowano komercyjnie dostępne przeciwciało neutralizujące przeciwko domenie wiążącej receptor kolca SARS-koronawirusa-2 wraz z IgG jako kontrolą negatywną.

Procentowe zahamowanie obliczono na podstawie liczby ognisk EGFP wykrytych za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Neutralizacja pseudowirusa przez rekonwalescentów pobrane około trzech miesięcy po zakażeniu koronawirusem SARS-2 wykazała, że hospitalizowani pacjenci wykazywali zwiększoną zdolność neutralizacji w porównaniu z tymi, którzy nie wymagali hospitalizacji. Procedura ta może być również wykorzystana do oceny innych środków zapobiegawczych i terapeutycznych COVID-19, które mają na celu zablokowanie infekcji wirusowej.