Name: Wysokoprzepustowy test cytometrii przepływowej oparty na komórkach do wykrywania przeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu lub receptorowi dopaminy-2 w ludzkiej surowicy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową cytometrię przepływową do wykrywania przeciwciał przeciwko receptorom NMDA-R i D2R w ludzkiej surowicy. Ta metoda umożliwia szybką, ilościową analizę dużych kohort pacjentów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Australijską Narodową Radę Zdrowia i Badań Medycznych, Star Scientific Foundation (Australia), Stowarzyszenie Zespołu Tourette'a (USA), The Trish Multiple sclerosis Research Foundation i Multiple Sclerosis Research Australia, Petre Foundation (Australia), Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation (Australia). Dziękujemy wszystkim pacjentom i członkom ich rodzin, którzy dostarczyli próbki do naszego badania.

1. Strategia subklonowania w celu skonstruowania kodowania wektorowego pIRES2-EGFP D2R lub NMDAR
<ol>
	<li>Uzyskaj pełnowymiarowy klon cDNA ludzkiej podjednostki D2R lub NMDAR 1 (NR1).</li>
	<li>Wybierz wektor ekspresyjny, taki jak pIRES2-EGFP, który jest odpowiedni do ekspresji białek transbłonowych ze wzmocnionym reporterem białka zielonej fluorescencji (GFP) pod kontrolą wewnętrznego miejsca wejścia rybosomu (IRES), umożliwiając koekspresję zarówno antygenów, jak i GFP w komórkach oddzielnie.</li>
	<li>Subklon ludzkiego cDNA w wektorze pIRES2-EGFP.
	<ol>
		<li>Aby sklonować cDNA, użyj odpowiednich enzymów restrykcyjnych (na przykład NheI i XhoI dla ludzkiego cDNA D2R).</li>
		<li>Wstawienie cDNA cięte przez ligat w ograniczonym wektorze pIRES2-EGFP.</li>
		<li>Sekwencja ligowana wektorem pIRES2-EGFP, D2R lub NMDAR, aby sprawdzić, czy wektor zawiera poprawną sekwencję.</li>
		<li>Oczyść i amplifikuj wektor pIRES2-EGFP, D2R lub NMDAR do późniejszego wykorzystania w transfekcji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Transfekcja komórek HEK293 do ekspresji antygenu neuronalnego
<ol>
	<li>Hodowla komórek HEK293 w kolbach do hodowli tkankowej ze świeżym zmodyfikowanym podłożem Dulbecco's Eagle Medium (1x) (DMEM) w komplecie z 4,5 g/L D-glukozy, L-glutaminą i 110 mg/L pirogronianu sodu uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM GlutaMAX i 50 μg/ml gentamycyny.</li>
	<li>Odłącz komórki HEK293 za pomocą trypsyny i przenieś do stożkowej rurki.
	<ol>
		<li>Przemyć przez odwirowanie komórek w stężeniu 250 x g przez 6 minut i ponownie zawiesić osad komórkowy w świeżym, kompletnym DMEM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Policz komórki i zasiaj 6-dołkowe płytki w temperaturze około 8 x 105 komórek/basenik i hoduj przez noc w 2 ml DMEM w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze.</li>
	<li>Gdy osiągną około 70% konfluencji, transfekuj komórki HEK293 za pomocą pIRES2-EGFP NR1 (komórki HEK293NMDAR +), pIRES2-EGFP D2R (komórki HEK293D2R +) i pIRES2-EGFP (komórkiCTL HEK293; kontrola wektorowa) w następujący sposób. Zachowaj kilka nietransfekowanych komórek HEK293 w celu późniejszej kompensacji.
	<ol>
		<li>Przygotować wymaganą objętość mieszanki do transfekcji składającej się z 2,5 μg DNA, 200 μl 0,9% chlorku sodu i 4 μg/ml polietyleneniminy/basenika (każda zawiera 2 ml świeżej kompletnej substancji DMEM).</li>
		<li>Natychmiast wirować mieszaninę przez 10 sekund i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut, przed dodaniem objętości mieszanki transfekcyjnej do odpowiednich studzienek.</li>
		<li>Przykryj płytkę, owiń boki Parafilmem i odwiruj przy 280 x g przez 5 minut, aby wspomóc transfekcję komórek.</li>
		<li>Usunąć parafilm, a następnie umieścić w inkubatorze w celu wyhodowania go w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zastąp pożywkę hodowlaną 18 godzin później świeżym, kompletnym DMEM i utrzymuj w kulturze przez kolejne 72 godziny.</li>
		<li>Opcjonalnie: 72 godziny po transfekcji, transfekowane komórki można wybrać przez hodowlę w kompletnym DMEM uzupełnionym 250 μg/ml Geneticin, w celu uzyskania poliklonalnego stabilnego transfektantu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test komórkowy oparty na cytometrii przepływowej do wykrywania przeciwciał przeciwko powierzchniowym antygenom neuronalnym
<ol>
	<li>Odłączyć komórkiCTL HEK293NMDAR+, HEK293D2R+ i HEK293 przez inkubację z 500 μl/basenik Versene przez około 5 minut w temperaturze 37 °C.
	<ol>
		<li>Zawiesić w 2 ml / studzienkę PBS (-Ca2 + / -Mg2 +) uzupełnionego 2% FBS (PBS / FBS) i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml lub 50 ml.</li>
		<li>Przemyć komórki przez odwirowanie przy 250 x g przez 6 minut i ponownie zawiesić osad komórkowy w 15-50 ml PBS/FBS. Powtórz pranie 2x.</li>
		<li>Policz komórki, a następnie ponownie zawieś w PBS/FBS w stężeniu 1 x 106 komórek/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaprojektuj 96-dołkową matrycę do akwizycji cytometrii przepływowej, biorąc pod uwagę, że komórki HEK293D2R+ lub HEK293NMDAR+, a także komórkiCTL HEK293 będą musiały być inkubowane z każdą próbką pacjenta lub przeciwciałem pierwotnym.</li>
	<li>Komórki nasienne w 96-dołkowej płytce z dnem V przy 50 000 komórek / dołku zgodnie z szablonem akwizycji cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Osadzać komórki, odwirowując 96-dołkową płytkę o gramaturze 450 x g przez 5 minut i delikatnie usunąć supernatant za pomocą elektronicznej lub ręcznej pipety wielokanałowej, przechylając płytkę pod kątem i uważając, aby nie zassać osadu komórkowego.</li>
	<li>Inkubować komórkiCTL HEK293D2R+, HEK293NMDAR+ i HEK293 przez 1 godzinę w RT w ciemności z:
	<ol>
		<li>Seryjne rozcieńczenia przeciwciała pierwszorzędowego w celu oceny ekspresji powierzchniowej antygenu.</li>
		<li>Próbki od pacjenta w celu wykrycia przeciwciał.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stosować odpowiednie kontrole kompensacji cytometrii przepływowej, np. niebarwione nietransfekowane komórki HEK293, komórki GFP+ HEK293 (AF647-) i nietransfekowane komórki AF647+ HEK293 (GFP).</li>
	<li>Przemyć komórki przez odwirowanie przy 450 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad komórek w 170 μl PBS/FBS. Powtórz krok prania jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 1 godzinę w RT w ciemności z rozcieńczeniem 1:100 przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z AF647 (anty-ludzka IgG dla surowicy pacjenta i anty-mysie IgG dla pierwotnych przeciwciał anty-NR1 lub anty-D2R).</li>
	<li>Umyć komórki trzy razy, jak w kroku 3.7, i ponownie zawiesić w 35 μl PBS/FBS w celu pobrania komórek metodą cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Skonfigurować próbnik o wysokiej przepustowości (HTS) na cytometrze przepływowym (BDLSRII).</li>
	<li>Zdobądź 10 000 zdarzeń/odwiert zgodnie z szablonem akwizycji cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Eksportuj, a następnie analizuj dane do analizy za pomocą pakietu oprogramowania do cytometrii przepływowej, takiego jak FlowJo v7.5:
	<ol>
		<li>Najpierw bramkują żywe komórki HEK293 na podstawie rozproszeń do przodu (rozmiar) i bocznych (ziarnistość).</li>
		<li>Dalsze bramkowanie żywych komórek HEK293 w oparciu o wysoki dodatni wynik GFP, aby przeanalizować tylko transfekowane komórki.</li>
		<li>Określ średnią intensywność fluorescencji (MFI) kanału AF647 w żywych komórkach GFP-dodatnich.</li>
		<li>Eksport danych do Excela lub Prism w celu analizy:
		<ol>
			<li>Wykreślić stężenia przeciwciała pierwszorzędowego (przeciwciało anty-NMDAR lub przeciwciało anty-D2R) w funkcji MFI uzyskanego z komórek inkubowanych z tymi przeciwciałami.</li>
			<li>Dla każdego pacjenta i próbki kontrolnej należy określić ΔMFI, odejmując MFI komórekCTL HEK293 od MFI odpowiednio komórek HEK293D2R+ lub HEK293NMDAR+.</li>
			<li>Obliczyć próg dodatniego wyniku przeciwciał, dodając trzy odchylenia standardowe powyżej średniego ΔMFI kohorty kontrolnej.</li>
			<li>Wykreślić na wykresie poszczególne próbki pogrupowane według ich rodzaju surowicy i przedstawić próg w postaci linii.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encephalitis+and+antibodies+to+synaptic+and+neuronal+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins.</a> Neurol. 77, 179-189 (2011).</li>
<li>Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+associated+with+diseases+of+the+CNS%3A+new+developments+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges.</a> Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+encephalitis%3A+case+series+and+analysis+of+the+effects+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies.</a> Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraneoplastic+anti-N-methyl-D-aspartate+receptor+encephalitis+associated+with+ovarian+teratoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma.</a> Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).</li>
<li>Dale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methyl-D-aspartate+receptor+antibodies+in+pediatric+dyskinetic+encephalitis+lethargica%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica.</a> Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).</li>
<li>Lancaster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+the+GABA%28B%29+receptor+in+limbic+encephalitis+with+seizures%3A+Case+series+and+characterisation+of+the+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen.</a> Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).</li>
<li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+antibodies+in+limbic+encephalitis+alter+synaptic+receptor+location%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location.</a> Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).</li>
<li>Irani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+Kv1+potassium+channel-complex+proteins+leucine-rich%2C+glioma+inactivated+1+protein+and+contactin-associated+protein-2+in+limbic+encephalitis%2C+Morvan%E2%80%99s+syndrome+and+acquired+neuromyotonia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan’s syndrome and acquired neuromyotonia.</a> Brain. 133, 2734-2748 (2010).</li>
<li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+LGI1+as+the+antigen+in+limbic+encephalitis+previously+attributed+to+potassium+channels%3A+a+case+series%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series.</a> Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).</li>
<li>Lancaster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+metabotropic+glutamate+receptor+5+in+the+Ophelia+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome.</a> Neurol. 77, 1698-1701 (2011).</li>
<li>Dale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+surface+dopamine-2+receptor+in+autoimmune+movement+and+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders.</a> Brain. , (2012).</li>
<li>Titulaer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+and+prognostic+factors+for+long-term+outcome+in+patients+with+anti-NMDA+receptor+encephalitis%3A+an+observational+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study.</a> Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).</li>
<li>Hughes, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+synaptic+mechanisms+of+anti-NMDA+receptor+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis.</a> J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).</li>
<li>Bien, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunopathology+of+autoantibody-associated+encephalitides%3A+clues+for+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis.</a> Brain. 135, 1622-1638 (2012).</li>
<li>Waters, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serologic+diagnosis+of+NMO%3A+a+multicenter+comparison+of+aquaporin-4-IgG+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays.</a> Neurol. 78, 665-671 (2012).</li>
<li>McLaughlin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Dependent+B+Cell+Autoimmunity+to+a+Myelin+Surface+Antigen+in+Pediatric+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis.</a> J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).</li>
<li>Probstel, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+MOG+are+transient+in+childhood+acute+disseminated+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis.</a> Neurol. 77, 580-588 (2011).</li>
<li>Cho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-terminal+Region+of+Dopamine+D2+Receptor%2C+a+Rhodopsin+Family+GPCR%2C+Regulates+Proper+Integration+into+Plasma+Membrane+and+Endocytic+Routes%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+pharmacology%22%5BJournal%5D)">N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes.</a> British journal of pharmacology. , (2011).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pathogenic+antibody+response+to+native+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).</li>
<li>Brilot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+native+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+in+children+with+inflammatory+demyelinating+central+nervous+system+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease.</a> Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).</li>
<li>Boronat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encephalitis+and+Antibodies+to+Dipeptidyl-Peptidase-Like+Protein-6%2C+a+Subunit+of+Kv4.2%5BTitle%5D)+AND+%22Potassium+Channels.+Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2.</a> Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).</li>
<li>Hinson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4-binding+autoantibodies+in+patients+with+neuromyelitis+optica+impair+glutamate+transport+by+down-regulating+EAAT2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2.</a> J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).</li>
</ol>

Konflikt interesów: F.B. i R.C.D. (University of Sydney) złożyły wniosek patentowy, w którym twierdzą, że D2R jest celem dla autoprzeciwciał.

W artykule opisano nowatorskie zastosowanie testu cytometrii przepływowej opartej na żywych komórkach do wykrywania przeciwciał skierowanych przeciwko określonym białkom neuronalnym na powierzchni komórki za pomocą próbnika o wysokiej przepustowości. Korzystając z tej techniki, informujemy, że podgrupa pacjentów dotkniętych autoimmunologicznymi chorobami OUN ma przeciwciała w surowicy do powierzchniowego NMDAR lub do powierzchniowego D2R.
Niezbędne kroki do optymalnego wykrywania przeciwciał p...

W ostatnich latach zidentyfikowano autoimmunologiczne formy chorób ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Wykazano, że choroby te są związane i definiowane przez obecność autoprzeciwciał. Przeciwciała te wiążą się z receptorami neuronalnymi lub białkami synaptycznymi zaangażowanymi w neuroprzekaźnictwo1,2. Wykryto różne antygeny, takie jak receptor N-metylo-D-asparaginianu (NMDAR)3-5, receptor6 receptora kwasu γ-aminomasłowego B (GABAB) 6, receptor7 kwasu α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazolopropionowego (AMPA) 7, białka związane z kanałem potasowym bramkowanym napięciem (VGKC): białko aktywowane glejakiem 1 bogate w leucynę (LGL-1) i białko związane z kontaktyną 2 (capsr2)8,9, receptorglutaminianu 5,10 i receptor dopaminy-2 ( D2R)11. W przeszłości te autoimmunologiczne zaburzenia OUN (zwane głównie zapaleniem mózgu) były często niezdiagnozowane i nieleczone. Te nowe biomarkery przeciwciał, np. przeciwciało NMDAR lub przeciwciało D2R, znacznie poprawiły diagnostykę i świadomość oraz otworzyły możliwości leczenia dla pacjentów. Rzeczywiście, wczesne leczenie immunoterapiami wiąże się z poprawą wyników11,12.
Tradycyjne metody wykrywania przeciwciał, takie jak test immunoenzymatyczny (ELISA) i western blot, były używane do wykrywania przeciwciał w surowicach. Jednak nie umożliwiają one łatwo rozpoznania epitopów zewnątrzkomórkowych lub powierzchniowych, a raczej mogą ujawniać immunoreaktywność w stosunku do epitopu wewnątrzkomórkowego. Ponadto przeciwciała, które wiążą się z domeną zewnątrzkomórkową ważnych białek biorących udział w neuroprzekaźnictwie, mogą być chorobotwórcze2,3,7,13,14. Dlatego kluczowe znaczenie ma opracowanie dokładnych i czułych testów w celu wykrycia odpowiednich celów przeciwciał powierzchniowych lub zewnątrzkomórkowych u pacjentów. Złoty standard w tej dziedzinie opiera się na wykorzystaniu żywych komórek w tak zwanych "testach komórkowych". Metoda ta polega na ekspresji antygenu na powierzchni komórek ssaków (najczęściej ludzkich embrionalnych komórek nerki 293 (HEK293)) w jego natywnej postaci poprzez transfekcję wektorów zawierających pełną sekwencję cDNA badanego antygenu. Żywe nieprzepuszczalne komórki są następnie inkubowane z rozcieńczoną surowicą pacjenta, a następnie z przeciwciałem drugorzędowym anty-ludzkiej immunoglobuliny (Ig) sprzężonym z fluorochromem. Następnie wykrywana jest intensywność lub poziom fluorescencji, który jest powiązany z poziomem wiązania autoprzeciwciał. Ta technika jest specyficzna, ponieważ tylko jeden antygen ulega nadekspresji w komórkach. Najpowszechniej stosowanym "odczytem" jest analiza mikroskopii konfokalnej po immunocytochemii4,5,8-10. Jednak testy oparte na komórkach cytometrii przepływowej są z powodzeniem stosowane do wykrywania przeciwciał u pacjentów z chorobami demielinizacyjnymi15-17. W szczególności Waters i wsp.15 porównało wykrywanie przeciwciał przy użyciu panelu technik wykrywania przeciwciał, w tym testów komórkowych, a następnie analiz mikroskopowych lub cytometrii przepływowej, i wykazało, że test oparty na komórkach cytometrii przepływowej jest najbardziej czułą, dokładną i wiarygodną metodą. Dlatego test oparty na komórkach cytometrii przepływowej jest korzystny, ponieważ jest ilościowy, nie zależy od badacza i nie wiąże się z użyciem materiału radioaktywnego. Jest to również wygodne, ponieważ umożliwia badanie dużych kohort pacjentów w krótkim czasie.
Ostatnio zoptymalizowaliśmy wysokoprzepustowy test oparty na komórkach cytometrii przepływowej, aby wykrywać przeciwciała NMDAR i przeciwciała D2R u pacjentów z autoimmunologicznymi chorobami OUN11. Nasza grupa niedawno wykryła przeciwciało NMDAR w surowicy pacjenta za pomocą testu opartego na komórkach cytometrii przepływowej. Te surowice dodatnie pod kątem przeciwciał NMDAR były wcześniej analizowane przy użyciu mikroskopii konfokalnej i również okazały się dodatnie11. Protokół ten przedstawia test oparty na komórkach cytometrii przepływowej do wykrywania wrażliwych na konformację przeciwciał OUN w surowicy pacjenta przy użyciu zautomatyzowanego próbnika o wysokiej przepustowości.

<table><tbody><tr><td>Wektor pIRES2-EGFP</td><td>Clontech</td><td>6029-1</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki receptor HA-dopaminy-2 (D2R) cDNA</td><td>Missouri S& Centrum Zasobów T cDNA</td><td>DRD020TN00</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka podjednostka 1 cDNA</td><td></td><td></td> NMDAR (NR1) <td>Dar od prof. A. Vincenta&nbsp; (Oksford, Wielka Brytania)</td></tr><tr><td>Monoklonalne, oczyszczone mysie przeciwciało anty-ludzkie NR1 (klon: 54.1)</td><td>BD Pharmingen</td><td>556308</td><td></td></tr><tr><td>Mysz oczyszczone monoklonalne przeciwciało anty-DRD2 IgG (klon: 1B11)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WH0001813M1-50UG</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 osło anty-mysie IgG (H + L)</td><td>Invitrogen</td><td>A31571</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 kozie anty-ludzkie IgG (H + L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21445</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modyfikowane podłoże Eagle (1x) 4,5 g/L D-glukozy, L-glutamina i 110 mg/L pirogronian sodu</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca dla płodu</td><td>Invitrogen</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15710-072</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Invitrogen</td><td>10131-035</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (1x) (-Ca2+/-Mg2+)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express (1x) z czerwienią fenolową</td><td>Invitrogen</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>0,9% Chlorek sodu</td><td>Baxter</td><td>AHF7975</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine</td><td>Polysciences Inc</td><td>9002-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Invitrogen</td><td>15040-066</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>Roche</td><td>10899194001</td><td></td></tr><tr><td>NheI</td><td>Roche</td><td>10885843001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania PureLink PCR</td><td>Invitrogen</td><td>K3100-01</td><td></td></tr><tr><td>JetQuick Gel Extraction Spin Kit</td><td>Genomed</td><td>420050</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Roche</td><td></td><td></td>10481220001</tr><tr><td>Plazmid&nbsp; Plus&nbsp; Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa sprzętu/oprogramowania</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Model/wersja</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy z wysokoprzepustowym systemem próbników</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>BDLSRII z HTS</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td></td><td>CKX41 (z lampą rtęciową i zasilaczem U-RFLT50)</td></tr><tr><td>Elektroniczna pipeta wielokanałowa (15-300 &mu; l)</td> <td>Eppendorf</td><td>613-2240P</td><td>12-kanałowy Xplorer Plus</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>2010</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td>v4</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Treestar</td><td></td><td>v7.5 50</td></tr><tr><td>ml polipropylenowe probówki stożkowe</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych (T75)</td><td>BD Biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pechiney Plastikowe opakowanie</td><td>PM-992</td><td></td></tr><tr><td>V-bottom 96-dołkowe płyta</td><td>Corning</td><td>651180</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy test cytometrii przepływowej oparty na komórkach do wykrywania przeciwciał przeciwko receptorowi n-metylo-d-asparaginianu lub receptorowi dopaminy-2 w ludzkiej surowicy

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

W ostatnich latach przeciwciała przeciwko białkom powierzchniowym i konformacyjnym zaangażowanym w neurotransmisję zostały wykryte w autoimmunologicznych chorobach OUN u dzieci i dorosłych. Przeciwciała te zostały wykorzystane do kierowania diagnozą i leczeniem. Testy komórkowe poprawiły wykrywanie przeciwciał w surowicy pacjenta. Opierają się one na powierzchniowej ekspresji antygenów mózgowych na komórkach eukariotycznych, które są następnie inkubowane z rozcieńczoną surowicą pacjenta, a następnie z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluorochromem. Po przemyciu wtórne wiązanie przeciwciał jest następnie analizowane za pomocą cytometrii przepływowej. Nasza grupa opracowała wysokoprzepustowy test cytometrii przepływowej opartej na żywych komórkach, aby niezawodnie wykrywać przeciwciała przeciwko określonym receptorom neuroprzekaźników. Ta metoda cytometrii przepływowej jest prosta, ilościowa, wydajna, a zastosowanie systemu próbników o wysokiej przepustowości pozwala na łatwe oznaczenie dużych kohort pacjentów w krótkim czasie. Ponadto ten test komórkowy można łatwo dostosować do wykrywania przeciwciał przeciwko wielu różnym celom antygenowym, zarówno z ośrodkowego układu nerwowego, jak i z jego peryferii. Odkrycie dodatkowych nowych biomarkerów przeciwciał umożliwi szybką i dokładną diagnozę oraz usprawni leczenie zaburzeń o podłożu immunologicznym.

Żywe komórki HEK293D2R+ oraz HEK293CTL nabyto za pomocą cytometru przepływowego z wykorzystaniem próbnika wysokoprzepustowego. Podczas analizy komórki wyodrębniano (gating) na podstawie parametrów rozproszenia światła w przód (forward scatter – wielkość) oraz rozproszenia światła pod kątem prostym (side scatter – ziarnistość) (Rycina 1A oraz 1D). Transfekowane komórki HEK293 wykazywały ekspresję cząsteczki reporterowej GFP w cytoplazmie; komórki nietransfekowane wyk...

W ostatnich latach testy oparte na żywych komórkach były z powodzeniem wykorzystywane do wykrywania przeciwciał przeciwko antygenom powierzchniowym i konformacyjnym. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą wysokoprzepustową cytometrię przepływową, umożliwiającą analizę dużych kohort pacjentów. Wykrycie nowych przeciwciał poprawi diagnostykę i leczenie zaburzeń o podłożu immunologicznym.

Wysokoprzepustowy test cytometrii przepływowej oparty na komórkach do wykrywania przeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu lub receptorowi dopaminy-2 w ludzkiej surowicy

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wykrycie neuronalnych przeciwciał anty-D2R lub N-M-D-A-R w próbkach pacjentów przy użyciu wysokoprzepustowego testu komórkowego z wykorzystaniem cytometrii przepływowej. Osiąga się to poprzez subklonowanie pełnej sekwencji cDNA ludzkiego D2R lub N-M-D-A-R do plazmidu. W drugim etapie przeprowadzana jest transfekcja ludzkiej linii komórkowej, co prowadzi do ekspresji antygenów neuronalnych na powierzchni komórek.Następnie transfektowane komórki inkubuje się z surowicą pacjenta i odpowiednim przeciwciałem wtórnym przed przeprowadzeniem analizy cytometrycznej. W celu wykrycia wiązania przeciwciał z antygenami powierzchniowymi komórek, wyniki uzyskuje się na podstawie analizy cytometrii przepływowej. Nasz wysoko wydajny tródportowy test komórkowy z wykorzystaniem cytometrii przepływowej jest szybki, ilościowy i efektywny dla dużych kohort próbek pacjentów.Stanowi to znaczącą przewagę nad zastosowaniem testu komórkowego z wykorzystaniem immunochemii i analizy konfokalnej. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mają trudności z ubytkiem komórek w trakcie eksperymentu, co utrudnia uzyskanie odpowiedniej liczby komórek w cytometrze pr

high-throughput-flow-cytometry-cell-based-assay-to-detect-antibodies

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Wysokowydajne przepływowe badanie cytometryczne oparte na komórkach do wykrywania przeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianowemu lub receptorowi dopaminy-2 w surowicy ludzkiej

Ten film opisuje technikę testu immunologicznego wykorzystującą fluorescencyjne kulki magnetyczne lub mikrosfery w połączeniu z różnymi antygenami do jednoczesnego wykrywania różnych izotypów przeciwciał w próbce surowicy. Test jest pomocny w zrozumieniu serokonwersji podczas infekcji lub po szczepieniu.

Multianalitowy test immunobealikowy: Technika testu immunologicznego oparta na przepływie do jednoczesnego wykrywania wielu podtypów przeciwciał w próbce ludzkiej surowicy

Ten film demonstruje technikę identyfikacji przeciwciał przeciwko określonym antygenom w próbce za pomocą hodowli neuronów hipokampa szczura. Poprzez wystawienie hodowanych neuronów na próbki pacjentów zawierające autoprzeciwciała skierowane przeciwko receptorom N-metylo-D-asparaginianu (NMDAR), obecność autoprzeciwciał związanych z powierzchnią neuronu ujawnia się poprzez barwienie immunologiczne.

Test do wykrywania autoprzeciwciał w surowicy ludzkiej przy użyciu hodowli neuronów hipokampa

Prezentujemy w obecnym badaniu nowatorski test oparty na fluorescencji, wykorzystujący limfocyty pochodzące od transgenicznej myszy. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) małych cząsteczek obdarzonych zdolnością hamowania lub promowania aktywacji limfocytów.

Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek

Wychwyt synaptosomalnej dopaminy i wysokosprawna chromatografia cieczowa stanowią eksperymentalne narzędzia do badania homeostazy dopaminy u myszy, oceniając odpowiednio funkcję transportera dopaminy i poziom dopaminy w tkance prążkowia. W tym miejscu przedstawiamy protokoły pomiaru zawartości dopaminy w tkance oraz oceny funkcjonalności transportera dopaminy.

Ocena homeostazy dopaminergicznej u myszy za pomocą analizy wysokosprawnej chromatografii cieczowej i wychwytu synaptosomalnego dopaminy

Ektopowo wyraziliśmy podjednostkę NR1 receptora NMDA oznaczoną zielonym białkiem fluorescencyjnym w ludzkich komórkach embrionalnych (HEK293) jako antygen do wykrywania autoprzeciwciał przeciwko receptorowi NMDA we krwi pacjentów z podejrzeniem autoimmunologicznego zapalenia mózgu. Ta prosta metoda może być odpowiednia do celów przesiewowych w warunkach klinicznych.

Prosty test immunofluorescencyjny oparty na komórkach do wykrywania autoprzeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) we krwi

Tutaj prezentujemy metodę cytometrii przepływowej opartej na komórkach do wykrywania przeciwciał neutralizujących lub innych czynników, które zakłócają pobieranie przez komórkę enzymatycznych terapii zastępczych w ludzkiej matrycy, takich jak płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) lub ludzka surowica.

Wykrywanie przeciwciał, które neutralizują wychwyt komórkowy enzymatycznych terapii zastępczych za pomocą testu komórkowego

Celem tego protokołu jest ułatwienie badania receptorów NMDA (NMDAR) na większą skalę i umożliwienie badania modulacyjnych efektów małych cząsteczek i ich zastosowań terapeutycznych.

Wysokoprzepustowy test strumienia wapnia do badania receptorów NMDA z wrażliwością na glicynę/D-serynę i glutaminian

Test komórkowy jest powszechnie stosowaną metodą wykrywania immunoglobuliny G anty-akwaporyny-4 w surowicy. Metoda ta może być stosowana w diagnostyce klinicznej i badaniach naukowych nad zaburzeniami spektrum optycznego zapalenia nerwu i szpiku.

Wykrywanie immunoglobuliny G anty-akwaporyny-4 w ludzkiej surowicy za pomocą testu komórkowego

Pobudliwość neuronów może być modulowana poprzez dynamiczny proces endo- i egzocytozy pobudzających jonotropowych receptorów glutaminianu. Opisany tutaj jest dostępny test o wysokiej zawartości do ilościowego określania puli populacji receptorów powierzchniowych i wewnętrznych.

Test o wysokiej zawartości do monitorowania transportu receptora AMPA

To badanie przedstawia nowatorskie podejście do pomiaru wielu parametrów funkcjonalnych mitochondriów na podstawie cytometrii przepływowej i podwójnego barwienia dwoma fluorescencyjnymi reporterami lub przeciwciałami w celu wykrycia zmian w objętości mitochondriów, potencjale błony mitochondrialnej, poziomie reaktywnych form tlenu, składzie mitochondrialnego łańcucha oddechowego i mitochondrialnym DNA.

Analiza cytometryczna przepływowa wielu parametrów mitochondrialnych w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach macierzystych oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych

Opisujemy niedawno opracowaną platformę testów immunologicznych opartą na zasadach bezkomórkowej biologii syntetycznej i technice dot-blot do konfigurowalnego wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych.

Bezkomórkowa plama punktowa jako praktyczna i elastyczna platforma testów immunologicznych do wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych

Poznaj wysokoprzepustową cytometrię przepływową do wykrywania przeciwciał przeciwko receptorom NMDA-R i D2R w ludzkiej surowicy. Ta metoda umożliwia szybką, ilościową analizę dużych kohort pacjentów.

Wysokoprzepustowy test cytometrii przepływowej oparty na komórkach do wykrywania przeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu lub receptorowi dopaminy-2 w ludzkiej surowicy (Wideo) | JoVE Journal

Wysokoprzepustowy test cytometrii przepływowej oparty na komórkach do wykrywania przeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu lub receptorowi dopaminy-2 w ludzkiej surowicy

Przeglądaj więcej filmów