Wysokoprzepustowy test cytometrii przepływowej oparty na komórkach do wykrywania przeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu lub receptorowi dopaminy-2 w ludzkiej surowicy

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykrycie neuronalnych przeciwciał anty D, 2 R lub N-M-D-A-R w próbkach pacjentów przy użyciu wysokoprzepustowego testu cytometrii przepływowej opartego na komórkach. Osiąga się to poprzez sub lling, pełną sekwencję CDNA ludzkiego D two R lub N-M-D-A-R w plazmidzie. W drugim etapie dochodzi do transfekcji ludzkiej linii komórkowej, która prowadzi do ekspresji antygenów neuronalnych na powierzchni komórki.

Następnie transfekowane komórki są inkubowane z surowicą pacjenta i odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym przed akwizycją cytometrii przepływowej. W celu wykrycia wiązania przeciwciał z antygenami powierzchniowymi komórek uzyskuje się wyniki na podstawie analizy cytometrii przepływowej. Ten nasz test oparty na komórkach cytometrii z trzema portami przepływu jest szybki, ilościowy i wydajny w przypadku dużych kohort próbek pacjentów.

Jest to znacząca zaleta w porównaniu z użyciem testu komórkowego z immunochemią i analizą konfokalną. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą zmagać się z utratą komórek w trakcie eksperymentu, aby uzyskać odpowiednią liczbę komórek na cytometrze przepływowym. Uważaj, aby nie zasysać komórek między praniami.

Wybierz wektor ekspresyjny, który jest odpowiedni do ekspresji białek transbłonowych i umożliwia komórkową koekspresję antygenów i białka zielonej fluorescencji oddzielnie. Na przykład wektor ten ma ulepszony reporter GFP pod kontrolą wewnętrznego miejsca wejścia rybosomu, który subklonuje ludzki CD NA na pełnej długości do wektora przy użyciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych po zweryfikowaniu klonów przez sekwencjonowanie, wytwarza zapasy plazmidu, które są odpowiednie do użycia w hodowli transfekcyjnej. HEK 2 93 komórki w kompletnym DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą.

Zbierz komórki za pomocą trypsyny po jednym myciu, odwiruj komórki i ponownie zawiesij osad komórkowy w świeżym, kompletnym DMM. Policz komórki, a następnie wysiewaj dwie mililitrowe kultury na sześciostudzienkowych płytkach z płynnością około 70% Co, przypisz dołki komórek HEK 2 93 do transfekcji z konstruktami ekspresji, a także wektorem kontrolnym. Zachowaj część na transfekowanych komórkach HEK 2 93 w celu późniejszej kompensacji.

Przygotować mieszanki transfekcyjne składające się z 200 mikrolitrów 0,9% chlorku sodu, 2,5 mikrograma DNA i czterech mikrogramów na mililitr polietylenu. Natychmiast wirować przez 10 sekund i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut przed dodaniem mieszanki transfekcyjnej do każdej studzienki o pojemności dwóch mililitrów świeżego kompletnego DMM. Przykryj płytkę, owiń boki perfilem i odwiruj w temperaturze 280 GS przez pięć minut, aby wspomóc transfekcję komórek.

Następnie usuń folię para, a następnie umieść płytkę w warunkach hodowli na 18 godzin. Zastąp pożywkę hodowlaną świeżym, kompletnym DM EM i utrzymuj w kulturze przez kolejne 72 godziny. Aby odłączyć komórki, dodaj 500 mikrolitrów żylaków do każdej studzienki i inkubuj przez około pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie ponownie zawieś komórki każdej studzienki w dwóch mililitrach 2% FBS w PBS i przenieś komórki do stożkowej rurki po trzech płukaniach. Ponownie zawiesić palety komórek na poziomie 1 miliona komórek na mililitr w 2% roztworze FBS. Teraz zaprojektuj 96-dołkową matrycę do akwizycji cytometrii przepływowej w taki sposób, aby różne linie komórkowe były traktowane każdą próbką pacjenta lub pierwotnym przeciwciałem.

Następnie wysiewaj 50 000 komórek na studzienkę w 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V, osadzaj komórki, wirując w temperaturze 450 G przez pięć minut. Przechyl płytkę pod kątem i delikatnie wyjmij nadnatynkę, uważając, aby nie zassać osadu komórkowego. Następnie dodać szeregowe rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego w celu oceny ekspresji powierzchniowej antygenu.

A następnie próbki pacjenta w celu wykrycia przeciwciał, inkubować komórki przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności po trzech myciach w 170 mikrolitrach 2% roztworu FBS, dodać odpowiednie sprzężone przeciwciało drugorzędowe AF 6 47 anty-ludzkie IgG dla pacjenta i anty-US. IgG dla przeciwciał pierwszorzędowych. Hybrydyzuj przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności po trzech praniach.

Resus zawiesić komórki w 35 mikrolitrach 2% roztworu FBS w celu akwizycji komórek cytometrii przepływowej na cytometrze przepływowym. Najpierw skonfiguruj próbnik o wysokiej przepustowości. Zdobądź 10 000 zdarzeń na studzienkę zgodnie z szablonem akwizycji cytometrii przepływowej.

Eksportuj, a następnie analizuj dane za pomocą pakietu oprogramowania do cytometrii przepływowej, bramkując żywe komórki HEK 2 93 w oparciu o rozproszenia wewnętrzne do przodu. Bramka o wysokiej dodatniości GFP, aby przeanalizować tylko transfekowane komórki. Określić średnią intensywność fluorescencji kanału AF 6 47 w żywych komórkach GFP-dodatnich.

Następnie wyeksportuj dane do Excela lub pryzmatu w celu analizy. Wykreślić stężenia przeciwciał pierwszorzędowych w funkcji MFI uzyskanych z odpowiednich próbek dla każdego pacjenta i próbki kontrolnej. Określić delta MFI obliczyć próg dodatniego wyniku przeciwciała, dodając trzy odchylenia standardowe powyżej średniej delta MFI kohorty kontrolnej.

Następnie narysuj na wykresie poszczególne próbki pogrupowane według grupy pacjentów. W tym miejscu należy przedstawić próg jako linię. Komórki wyrażające receptor n metylodasparaginianu lub receptor dopaminy dwa zostały pozyskane na cytometrze przepływowym przy użyciu próbnika o wysokiej przepustowości.

Podczas analizy komórki zostały bramkowane na podstawie rozproszenia do przodu dla rozmiaru i rozrzutu bocznego dla szczegółowości. TRANSFEKOWANE HK 2 9 3 komórki wykazywały ekspresję cząsteczki reporterowej GFP w cytoplazmie, a transfekowane komórki UNT zostały wyłączone z analizy w obrębie chodu GFP dodatniego. MFI związany z wiązaniem przeciwciał anty-ludzkich IgG sprzężonych z AF 6 47 mierzono w celu wyeliminowania fluorescencji tła podczas analizy surowic ludzkich.

MFI delta obliczono poprzez odjęcie MFI tła komórek kontrolnych. Ten test oparty na komórkach cytometrii przepływowej opiera się na wykrywaniu przeciwciał antygenu powierzchniowego komórki będącego przedmiotem zainteresowania. Na przykład komórki a GK 2 93 transfekowane plazmidem ekspresyjnym dla N-M-D-A-R wykazywały wysoką ekspresję powierzchni i metylu de receptora.

Podobnie, komórki transfekowane D dwa R wyrażały receptor dopaminy dwa, podczas gdy komórki kontrolowane nie wyrażały żadnego z tych antygenów. W tym badaniu klinicznym oceniano kohortę pacjentów z zapaleniem mózgu N-M-D-A-R, kohortę pacjentów z zapaleniem mózgu związanym z przeciwciałami D 2 R oraz kohortę kontrolną z innymi niezapalnymi chorobami neurologicznymi. Należy zauważyć, że żaden z pacjentów z dodatnim wynikiem nie był podwójnie dodatni na obecność przeciwciał.

Celowanie w N-M-D-A-R-M-D dwa R zgodnie z oczekiwaniami. Przeciwciała N-M-D-A-R i D two R nie zostały wykryte w żadnej z analizowanych kontroli. Po opanowaniu technikę tę można wykonać prawidłowo w ciągu pięciu godzin z godzinną akwizycją przepływu dla około 80 próbek po jej opracowaniu.

Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie neuroimmunologii do odkrycia nowych celów przeciwciał w zaburzeniach o podłożu immunologicznym.