Analiza funkcji komórek beta za pomocą obrazowania wapnia w rozdzielczości pojedynczej komórki na wysepkach danio pręgowanego
3 lipca 2018
Funkcjonalność komórek beta jest ważna dla homeostazy glukozy we krwi, która jest oceniana w rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą genetycznie zakodowanego reportera dla napływu wapnia.
Ta metoda może pomóc w zrozumieniu ważnych pytań w dziedzinie komórek beta. Takich jak funkcja heterogenowa IT między pojedynczymi komórkami beta w obrębie wysepki. Główną zaletą tej techniki jest rozdzielczość przestrzenna i czasowa zapewniana przez obrazowanie komórek beta na żywo.
Możemy uchwycić oscylacje wapnia w poszczególnych komórkach beta. Po eutanazji ryby zgodnie z protokołem tekstowym przenieś ją na szalkę Petriego zawierającą roztwór HBSS z wapniem i magnezem. Następnie pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w lampę fluorescencyjną i czerwoną kostkę filtra, za pomocą ostrych kleszczy przeciąć skórę od ust do płetwy odbytowej.
Oderwij przeciętą skórę po prawej stronie, aby odsłonić brzuch, który odsłoni narządy wewnętrzne. Następnie, używając czerwonej fluorescencji do identyfikacji ekspresji mKO2 w komórkach beta, zlokalizuj wysepki. Oczyść pierwotną wyspę trzustkową, ostrożnie usuwając otaczające tkanki, takie jak wątroba i adipocyty.
Podejmij środki ostrożności, aby nie zranić ani nie szturchnąć wysepki. Następnie odpipetuj 30 mikrolitrową kroplę HBSS na środek naczynia ze szklanym dnem. Następnie przenieś rozciętą wysepkę do kropli.
W przypadku HBSS ostrożnie umyj wysepkę raz, a następnie użyj 30 mikrolitrów roztworu roboczego fibrynogenu, aby ją raz umyć. Unikaj suszenia wysepki podczas etapów mycia, ponieważ może to spowodować śmierć komórki. Powoli i delikatnie dodaj 10 mikrolitrów po 10 jednostek na mililitr roztworu trombiny do wysepki.
Pozostaw wysepkę i naczynie nietknięte na 15 do 20 minut. Obserwuj, że kropla trombiny fibrynogenu stanie się lepka i stabilna. Należy zapewnić wystarczającą ilość czasu, aby trombina mogła spolimeryzować w roztworze fibrynogenu.
W przeciwnym razie forma nie zapewni stabilności podczas sesji obrazowania. Aby przeprowadzić obrazowanie na żywo ex vivo fluorescencji GCaMP, dodaj 200 mikrolitrów HBSS na wierzch formy i ostrożnie umieść naczynie na uchwycie płytki mikroskopu konfokalnego. Następnie, mając obiektyw błędny 20X 0,8 NA i opcję jasnego pola, zlokalizuj wysepkę.
Użycie filtra do czerwonej fluorescencji, aby zobaczyć fluorescencję jądrową mKO2 w komórkach beta, skoncentruj się na wysepce. Poszczególne jądra powinny być wyraźnie widoczne. Zlokalizuj wyraźną płaszczyznę obrazowania, ręcznie przesuwając się przez grubość wysepki wzdłuż jej osi Z.
Upewnij się, że płaszczyzna obrazowania zawiera od 50 do 100 komórek beta do obrazowania, a jasność fluorescencji jądrowej mKO2 jest jednolita, szczególnie w środku wysepki. Następnie w menu inteligentnych ustawień ustaw sekwencyjną akwizycję dla fluorescencji GCaMP6 i mKO2, korzystając z następujących ustawień. Dla GCaMP6 wybierz wzbudzenie 488 nanometrów i przybliżoną emisję od 500 do 555 nanometrów.
W obszarze fałszywy kolor wybierz opcję GFP. Dla mKO2 wybierz wzbudzenie 561 nanometrów i emisję od 570 do 630 nanometrów. Jako fałszywy kolor wybierz mCherry.
W trybie akwizycji ustaw rozdzielczość obrazu na 1 024 na 1 024 piksele, szybkość na 10, a średnią na jeden. Zainicjuj nagrywanie ciągłe, wybierając opcję Szeregi czasowe i ustawiając czas trwania na 500 cykli z około dwusekundowym czasem akwizycji na klatkę. Miej oko na cykl obrazowania.
Po pierwszych 50 klatkach bez zakłócania akwizycji obrazu, delikatnie odpipetuj pięć mikrolitrów 200-milimolowego roztworu D-glukozy na wierzchu żelu przytrzymującego wyspę trzustkową. Następnie zdobądź 150 ramek przy 10 milimolowym poziomie glukozy. Pierwsze 50 klatek szeregu czasowego odpowiada aktywności komórek beta przy pięciomilimolowym poziomie glukozy.
To jest podstawowa aktywność. Reagująca komórka beta będzie wykazywać przybywanie i zanikanie zielonej fluorescencji z czasem. Przy 200 klatkach zwiększ stężenie glukozy do 20 milimolów, delikatnie dodając 10 mikrolitrów 200 milimolowej D-glukozy.
Następnie zdobądź 150 ramek przy stężeniu 20 milimolowym. Aby otworzyć plik obrazu w FIDŻI, wybierz Wtyczka, LSM Toolbox, pokaż LSM Toolbox. W przyborniku LSM kliknij opcję Otwórz LSM i wybierz plik obrazu.
W obszarze Narzędzia w menu Analizuj otwórz Menedżera zwrotu z inwestycji. Za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów znajdującego się na pasku narzędzi ręcznie narysuj ROI. Narysuj ROI w czerwonym kanale tak, aby obejmował obszar większy niż jądro, aby uwzględnić część cytoplazmy komórki.
Upewnij się, że pozycja ROI jest spójna między ramkami i dostosuj pozycję, jeśli to konieczne. Dodaj wybrane ROI do Menedżera ROI, klikając przycisk Dodaj. Wybierz i dodaj wiele ROI, aby uzyskać dane z wielu komórek.
Następnie z menu Analizuj wybierz opcję Ustaw pomiary. Następnie wybierz Gęstość zintegrowana, aby określić ekstrakcję całkowitej intensywności fluorescencji w obszarze. Przejdź do zielonego kanału zawierającego fluorescencję GCaMP i w Menedżerze ROI wybierz Multi Measure.
Zapewni to pomiary intensywności dla komórek w całym szeregu czasowym. Zapisz dane wyjściowe FIJI jako plik tekstowy oddzielony przecinkami. Z przybornika LSM Toolbox uzyskaj znaczniki czasu ramek obrazu.
Użyj opcji Zastosuj znaczniki, Zastosuj znaczniki t, Nazwa pliku, Zrzut do pliku tekstowego, aby uzyskać znaczniki czasu. Zapisz znaczniki czasu za pomocą opcji Zapisz jako lub skopiuj je do arkusza kalkulacyjnego. Po skompilowaniu wartości intensywności dla wszystkich komórek wykonuj analizę po jednej komórce na raz lub automatycznie.
Zapoznaj się z protokołem tekstowym, aby uzyskać dodatkowe informacje. W tym eksperymencie poszczególne pierwotne komórki beta wysp trzustkowych z 45 linii transgenicznej DPF eksprymującej jądrowe mKO2 i GCaMP6 specyficznie w komórkach beta, stymulowano rampą glukozy, a następnie depolaryzowano chlorkiem potasu. Analizie poddano aktywność komórek.
Za pomocą FIJI i oprogramowania do analizy danych wyekstrahowano i znormalizowano intensywność fluorescencji GCaMP6 poszczególnych komórek beta. Jak widać na podstawie tego śladu intensywności fluorescencji, poszczególne komórki beta wykazują oscylacje fluorescencji GCaMP6 po stymulacji glukozą, a dodatek chlorku potasu stabilizuje fluorescencję. Technika ta zapewnia komórkową rozdzielczość reakcji komórek beta na glukozę i wgląd w ich funkcjonalność.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 45 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zweryfikować żywotność komórek beta. Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak manipulacje genetyczne, aby zrozumieć rolę określonych genów w funkcjonowaniu komórek beta.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć odpowiedź glukozy w poszczególnych komórkach beta.
Przegląd
To badanie ocenia funkcjonalność komórek beta i ich reaktywność na glukozę na poziomie pojedynczych komórek przy użyciu technik obrazowania na żywo. Metoda ta umożliwia obserwację oscylacji wapnia w pojedynczych komórkach beta, dostarczając informacji na temat ich niejednorodności i funkcjonalności.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Endokrynologia
Tło
- Komórki beta odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy glukozy we krwi.
- Rozumienie zachowania pojedynczych komórek beta jest niezbędne dla badań nad cukrzycą.
- Techniki obrazowania na żywo poprawiają badania dynamiki komórkowej.
- Nadmiar wapnia jest kluczowym wskaźnikiem aktywności komórek beta.
Cel badania
- Zbadanie funkcjonalnej niejednorodności komórek beta.
- Analiza oscylacji wapnia w odpowiedzi na stymulację glukozą.
- Opracowanie niezawodnej metody wykonywania obrazowania komórek beta ex vivo.
Zastosowane metody
- Sekcja pierwotnych wysp z transgennych ryb ekspresujących mKO2 i GCaMP6.
- Wykonywanie obrazowania na żywo przy użyciu mikroskopii konfokalnej w celu uchwycenia sygnałów fluorescencyjnych.
- Sekwencyjne pozyskiwanie fluorescencji GCaMP6 i mKO2.
- Analiza danych przy użyciu oprogramowania FIJI w celu zmierzenia intensywności fluorescencji.
Główne wyniki
- Poszczególne komórki beta wykazywały różne oscylacje fluorescencji GCaMP6.
- Stymulację glukozą wywoływała różne reakcje wśród komórek beta.
- Dodanie chlorku potasu stabilizowało sygnały fluorescencyjne.
- Technika ta umożliwia szczegółową analizę funkcjonalności komórek beta.
Wnioski
- Ta metoda dostarcza informacji na temat reaktywności komórek beta na glukozę.
- Podkreśla znaczenie analizy pojedynczych komórek w rozumieniu zachowania komórek beta.
- Technika ta może być wydajnie przeprowadzona w krótkim czasie.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Single-cell calcium imaging in zebrafish islets enables high-resolution functional assessment of beta-cell heterogeneity and glucose responsiveness, directly informing early diabetes target validation. This approach provides predictive confidence for mechanistic de-risking and supports translational continuity from discovery biology to preclinical model development. The method's quantitative outputs and scalability position it as a reusable platform for portfolio-wide interrogation of beta-cell function and dysfunction.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of beta-cell functional heterogeneity at single-cell resolution.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying glucose-stimulated calcium influx dynamics.
- Facilitates identification of candidate targets affecting insulin secretion pathways.
- Provides a platform for genetic and environmental perturbation studies in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, quantitative readouts of calcium oscillations for assay standardization.
- Enables reproducible measurement of beta-cell responses under controlled glucose conditions.
- Supports scalability for compound screening and functional genomics workflows.
- Prepares robust biological systems for downstream phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant endpoints by modeling beta-cell dysfunction in a vertebrate system.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of beta-cell targets.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative functional biomarkers.
- Provides mechanistic insights that inform translational biomarker strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This calcium imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational model development for diabetes research.
- Discovery Biology: Quantifies beta-cell calcium dynamics to clarify insulin secretion pathways and validate functional hypotheses.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Enables extraction of single-cell fluorescence intensity data for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Connects functional readouts in zebrafish islets to preclinical biomarker development.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable platform for repeated interrogation of beta-cell function across genetic and environmental contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in beta-cell target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable imaging workflows for functional assessment.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing quantitative, disease-relevant data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of beta-cell targets and functional pathways for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and zebrafish islet dissection.
- Needs access to confocal microscopy and quantitative image analysis software.
- Demands cross-team standardization of imaging and data extraction protocols.
- Adaptation may be needed for other model systems or genetic backgrounds.
- Viability and consistency of islet preparation are critical for reproducible outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:33
Zebrafish Primary Islet Dissection and Mounting
2:20
Ex Vivo Live-imaging of GCaMP Fluorescence Intensity in Zebrafish Primary Islets
5:11
Quantification of GCaMP Fluorescence Trace for Individual Beta-cells
7:14
Results: Single-cell Calcium Imaging in Zebrafish Islet Beta Cells
8:15
Conclusion
