Analiza funkcji komórek beta za pomocą obrazowania wapnia w rozdzielczości pojedynczej komórki na wysepkach danio pręgowanego

Ta metoda może pomóc w zrozumieniu ważnych pytań w dziedzinie komórek beta. Takich jak funkcja heterogenowa IT między pojedynczymi komórkami beta w obrębie wysepki. Główną zaletą tej techniki jest rozdzielczość przestrzenna i czasowa zapewniana przez obrazowanie komórek beta na żywo.

Możemy uchwycić oscylacje wapnia w poszczególnych komórkach beta. Po eutanazji ryby zgodnie z protokołem tekstowym przenieś ją na szalkę Petriego zawierającą roztwór HBSS z wapniem i magnezem. Następnie pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w lampę fluorescencyjną i czerwoną kostkę filtra, za pomocą ostrych kleszczy przeciąć skórę od ust do płetwy odbytowej.

Oderwij przeciętą skórę po prawej stronie, aby odsłonić brzuch, który odsłoni narządy wewnętrzne. Następnie, używając czerwonej fluorescencji do identyfikacji ekspresji mKO2 w komórkach beta, zlokalizuj wysepki. Oczyść pierwotną wyspę trzustkową, ostrożnie usuwając otaczające tkanki, takie jak wątroba i adipocyty.

Podejmij środki ostrożności, aby nie zranić ani nie szturchnąć wysepki. Następnie odpipetuj 30 mikrolitrową kroplę HBSS na środek naczynia ze szklanym dnem. Następnie przenieś rozciętą wysepkę do kropli.

W przypadku HBSS ostrożnie umyj wysepkę raz, a następnie użyj 30 mikrolitrów roztworu roboczego fibrynogenu, aby ją raz umyć. Unikaj suszenia wysepki podczas etapów mycia, ponieważ może to spowodować śmierć komórki. Powoli i delikatnie dodaj 10 mikrolitrów po 10 jednostek na mililitr roztworu trombiny do wysepki.

Pozostaw wysepkę i naczynie nietknięte na 15 do 20 minut. Obserwuj, że kropla trombiny fibrynogenu stanie się lepka i stabilna. Należy zapewnić wystarczającą ilość czasu, aby trombina mogła spolimeryzować w roztworze fibrynogenu.

W przeciwnym razie forma nie zapewni stabilności podczas sesji obrazowania. Aby przeprowadzić obrazowanie na żywo ex vivo fluorescencji GCaMP, dodaj 200 mikrolitrów HBSS na wierzch formy i ostrożnie umieść naczynie na uchwycie płytki mikroskopu konfokalnego. Następnie, mając obiektyw błędny 20X 0,8 NA i opcję jasnego pola, zlokalizuj wysepkę.

Użycie filtra do czerwonej fluorescencji, aby zobaczyć fluorescencję jądrową mKO2 w komórkach beta, skoncentruj się na wysepce. Poszczególne jądra powinny być wyraźnie widoczne. Zlokalizuj wyraźną płaszczyznę obrazowania, ręcznie przesuwając się przez grubość wysepki wzdłuż jej osi Z.

Upewnij się, że płaszczyzna obrazowania zawiera od 50 do 100 komórek beta do obrazowania, a jasność fluorescencji jądrowej mKO2 jest jednolita, szczególnie w środku wysepki. Następnie w menu inteligentnych ustawień ustaw sekwencyjną akwizycję dla fluorescencji GCaMP6 i mKO2, korzystając z następujących ustawień. Dla GCaMP6 wybierz wzbudzenie 488 nanometrów i przybliżoną emisję od 500 do 555 nanometrów.

W obszarze fałszywy kolor wybierz opcję GFP. Dla mKO2 wybierz wzbudzenie 561 nanometrów i emisję od 570 do 630 nanometrów. Jako fałszywy kolor wybierz mCherry.

W trybie akwizycji ustaw rozdzielczość obrazu na 1 024 na 1 024 piksele, szybkość na 10, a średnią na jeden. Zainicjuj nagrywanie ciągłe, wybierając opcję Szeregi czasowe i ustawiając czas trwania na 500 cykli z około dwusekundowym czasem akwizycji na klatkę. Miej oko na cykl obrazowania.

Po pierwszych 50 klatkach bez zakłócania akwizycji obrazu, delikatnie odpipetuj pięć mikrolitrów 200-milimolowego roztworu D-glukozy na wierzchu żelu przytrzymującego wyspę trzustkową. Następnie zdobądź 150 ramek przy 10 milimolowym poziomie glukozy. Pierwsze 50 klatek szeregu czasowego odpowiada aktywności komórek beta przy pięciomilimolowym poziomie glukozy.

To jest podstawowa aktywność. Reagująca komórka beta będzie wykazywać przybywanie i zanikanie zielonej fluorescencji z czasem. Przy 200 klatkach zwiększ stężenie glukozy do 20 milimolów, delikatnie dodając 10 mikrolitrów 200 milimolowej D-glukozy.

Następnie zdobądź 150 ramek przy stężeniu 20 milimolowym. Aby otworzyć plik obrazu w FIDŻI, wybierz Wtyczka, LSM Toolbox, pokaż LSM Toolbox. W przyborniku LSM kliknij opcję Otwórz LSM i wybierz plik obrazu.

W obszarze Narzędzia w menu Analizuj otwórz Menedżera zwrotu z inwestycji. Za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów znajdującego się na pasku narzędzi ręcznie narysuj ROI. Narysuj ROI w czerwonym kanale tak, aby obejmował obszar większy niż jądro, aby uwzględnić część cytoplazmy komórki.

Upewnij się, że pozycja ROI jest spójna między ramkami i dostosuj pozycję, jeśli to konieczne. Dodaj wybrane ROI do Menedżera ROI, klikając przycisk Dodaj. Wybierz i dodaj wiele ROI, aby uzyskać dane z wielu komórek.

Następnie z menu Analizuj wybierz opcję Ustaw pomiary. Następnie wybierz Gęstość zintegrowana, aby określić ekstrakcję całkowitej intensywności fluorescencji w obszarze. Przejdź do zielonego kanału zawierającego fluorescencję GCaMP i w Menedżerze ROI wybierz Multi Measure.

Zapewni to pomiary intensywności dla komórek w całym szeregu czasowym. Zapisz dane wyjściowe FIJI jako plik tekstowy oddzielony przecinkami. Z przybornika LSM Toolbox uzyskaj znaczniki czasu ramek obrazu.

Użyj opcji Zastosuj znaczniki, Zastosuj znaczniki t, Nazwa pliku, Zrzut do pliku tekstowego, aby uzyskać znaczniki czasu. Zapisz znaczniki czasu za pomocą opcji Zapisz jako lub skopiuj je do arkusza kalkulacyjnego. Po skompilowaniu wartości intensywności dla wszystkich komórek wykonuj analizę po jednej komórce na raz lub automatycznie.

Zapoznaj się z protokołem tekstowym, aby uzyskać dodatkowe informacje. W tym eksperymencie poszczególne pierwotne komórki beta wysp trzustkowych z 45 linii transgenicznej DPF eksprymującej jądrowe mKO2 i GCaMP6 specyficznie w komórkach beta, stymulowano rampą glukozy, a następnie depolaryzowano chlorkiem potasu. Analizie poddano aktywność komórek.

Za pomocą FIJI i oprogramowania do analizy danych wyekstrahowano i znormalizowano intensywność fluorescencji GCaMP6 poszczególnych komórek beta. Jak widać na podstawie tego śladu intensywności fluorescencji, poszczególne komórki beta wykazują oscylacje fluorescencji GCaMP6 po stymulacji glukozą, a dodatek chlorku potasu stabilizuje fluorescencję. Technika ta zapewnia komórkową rozdzielczość reakcji komórek beta na glukozę i wgląd w ich funkcjonalność.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 45 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zweryfikować żywotność komórek beta. Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak manipulacje genetyczne, aby zrozumieć rolę określonych genów w funkcjonowaniu komórek beta.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć odpowiedź glukozy w poszczególnych komórkach beta.