In Situ Techniki hybrydyzacji próbek dorosłych koralowców zanurzonych w parafinie

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii komórek koralowców, takie jak to, jakie typy tkanek i komórek wyrażają określone typy genów. Główną zaletą tej techniki jest to, że masz wizualną informację na temat ekspresji RNA. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w przestrzenną ekspresję genów u dorosłych koralowców, może być również stosowana na innych etapach życia koralowców, a także w innych systemach bezkręgowców.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ jest tak wiele kroków i rozwiązań, które należy śledzić. Muszą więc zwracać uwagę na to, gdzie są w protokole i dobrze śledzić czas podczas prania. Kevin Rodriguez, technik w moim laboratorium, będzie demonstrował tę procedurę.

Na początek odparafinuj cienkowarstwowe szkiełka zatopione w parafinie ze 100% ksylenem w szklanych słoikach Coplin przez 10 minut pod maską. Następnie napełnij cztery sterylne szklane słoiki Coplin odpowiednio 100% etanolem, 80% etanolem, 70% etanolem i 60% etanolem. Najpierw przenieś szkiełka do słoika Coplin zawierającego 100% etanolu i pozwól im moczyć się przez 10 minut.

Następnie przenieś szkiełka do innego słoika Coplin zawierającego 100% etanolu. Powtórz ten proces z każdym ze słoików Coplin w kolejności malejącej stężenia etanolu. Najpierw przenieś szkiełka do sterylnego pudełka na szkiełka z 18 ml PBS.

Następnie myj szkiełka przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie odlej 1 objętość PBS i dodaj około 10 ml roztworu proteinazy K do koperty. Następnie inkubuj kopertę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Podczas inkubacji szkiełek umieść bufor prehyb we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut. Następnie pozostaw bufor do ostygnięcia w łaźni lodowej przez 5 minut. Aby zatrzymać trawienie w reakcji proteinazy K, usuń proteinazę K i dodaj 18 ml 0,2% roztworu PBS glicyny do koperty.

Następnie pozostaw kopertę w temperaturze pokojowej na 5 minut. Następnie usuń roztwór PBS glicyny i zastąp go 18 ml 2x soli fizjologicznej cytrynianu sodu lub SSC. Myć szkiełka w SSC przez 10 minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przy 100-150 obr./min.

Podczas gdy szkiełka inkubują się w piecu do hybrydyzacji, rozcieńczyć sondy w buforze hybrydyzacyjnym. Następnie umieść rozcieńczone sondy na bloku grzewczym w temperaturze 86-90 stopni Celsjusza na 12 minut i pozwól im ostygnąć na lodzie przez minutę. Następnie wyjmij kopertę do szkiełek z pieca do hybrydyzacji i wyjmij każde szkiełko sterylną pęsetą.

Połóż szkiełka na ręczniku papierowym i ostrożnie usuń nadmiar buforu wokół próbek tkanek. Za pomocą pisaka PAP narysuj okrąg wokół każdej próbki tkanki. Następnie za pomocą pipety nałóż 25 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu sondy i przykryj każdą próbkę plastikowym szkiełkiem nakrywkowym.

Następnie dodaj 4x SSC i 50% roztwór formamidu na dnie szkiełka wilgotnościowego. Następnie umieść szkiełka w komorze wilgotnościowej. Płukać szkiełka 18 ml alkalicznego buforu fosfatazy bez chlorku magnezu przez 1 minutę.

Następnie wylej bufor i zastąp go 18 ml buforu blokującego Boehringer Mannheim rozcieńczonego buforem kwasu maleinowego. Inkubować szkiełko przez noc w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Następnie przygotuj 20 ml rozcieńczonych fragmentów DIG anty-deoksygeniny-AP Fab.

Dodaj przeciwciało zapobiegające kopaniu do nowego sterylnego pudełka na szkiełka i przenieś szkiełka ze starej koperty. Następnie inkubuj szkiełka w temperaturze pokojowej przez trzy godziny, delikatnie wstrząsając. Po okresie inkubacji wylać przeciwciało zapobiegające kopaniu i przemywać szkiełka 18 ml buforu AP bez chlorku magnezu przez pięć minut, delikatnie wstrząsając.

Następnie wylać bufor AP bez chlorku magnezu i dodać 18 ml buforu AP. Myj szkiełka przez pięć minut, delikatnie potrząsając. Następnie wyjmij stary bufor AP, zastąp go 18 ml świeżego bufora AP i powtórz pranie.

W ciemnym pomieszczeniu wylej bufor AP i dodaj 18 ml BM-Purple do koperty. Następnie inkubuj szkiełka w temperaturze pokojowej, sprawdzając rozwój fioletowego koloru co pół godziny. Aby zatrzymać rozwój koloru, przenieś szkiełka do nowego sterylnego koperty z 18 ml buforu TE.

Pozostaw szkiełka w ciemności w temperaturze pokojowej na pięć minut. Następnie wylej bufor TE, dodaj 18 ml wody wolnej od RNaz do koperty i myj szkiełka przez minutę. Następnie wyjmij szkiełka z wody i osusz je chusteczką.

Dodaj podłoże mocujące glicerolu i umieść szkiełko nakrywkowe na każdym szkiełku. Na koniec przechowuj slajdy w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aż zdjęcia będą gotowe do zrobienia. Korzystając z tego protokołu, zidentyfikowano tkankę koralową narażoną na stres cieplny wykazującą ekspresję AP-1, FosB i TNFR41.

Jak wskazuje rozlane barwienie tkanek, ekspresja antysensownego AP-1 znajduje się w całym naskórku i jamie ustnej. Barwienie specyficzne dla komórek zaobserwowano również w ekspresji FosB i TNFR41. FosB barwił parzydełka i był specyficzny zarówno dla spirocytów, które wytwarzają spirocysty, jak i nematocytów, które wytwarzają mikropodstawowe organelle mastigoforu.

Podobnie TNFR41 ulegał również ekspresji w nematocytach i spirocytach. Próbując tej procedury, należy pamiętać, aby się z niczym nie spieszyć, ponieważ mycie i inkubacja wymagają czasu.