Name: In Situ Techniki hybrydyzacji próbek dorosłych koralowców zanurzonych w parafinie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Poznaj technikę hybrydyzacji in situ w tkankach koralowców zanurzonych w parafinie. Ta metoda umożliwia wizualizację ekspresji RNA w określonych tkankach i komórkach, dostarczając cennych informacji o biologii koralowców.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez nagrodę nr. OCE-1323652 w ramach stypendium podoktorskiego National Science Foundation Ocean Science i nagrody nr 1012629 z Burroughs Wellcome Fund Postdoctoral Enrichment Program.

1. Usuwanie parafiny
Uwaga: Wykonaj następujące kroki pod wyciągiem.
<ol>
	<li>Odparafinować cienkowarstwowe szkiełka zatopione w parafinie ze 100% ksylenem pod pokrywą w szklanych słoikach Coplin przez 10 minut. Nie używaj plastikowych słoików Coplin, ponieważ ksylen topi plastik. Przed użyciem wysterylizuj słoiki Coplin w autoklawie.</li>
	<li>Przygotuj cztery sterylne szklane słoiki Coplin z następującymi elementami: 100% etanolu, 80% etanolu, 70% etanolu i 60% etanolu. Rozcieńczyć etanol wodą wolną od RNaz.
	<ol>
		<li>Przełóż szkiełka do sterylnego szklanego słoika Coplin ze 100% etanolem i moczyć je przez 10 minut. Po 10 minutach opróżnij szklany słoik Coplin i zastąp go nowym 100% etanolem. Ponownie namocz szkiełka przez 10 minut.</li>
		<li>Przenieś szkiełka do sterylnego szklanego słoika Coplin z 80% etanolem na 1 min.</li>
		<li>Przenieś szkiełka do sterylnego szklanego słoika Coplin z 70% etanolem na 1 min.</li>
		<li>Przenieś szkiełka do sterylnego szklanego słoika Coplin z 60% etanolem na 1 min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wstępna obróbka preparatów w celu przygotowania hybrydyzacji sondy RNA
<ol>
	<li>Wykonaj następujące prania w temperaturze pokojowej, chyba że określono inaczej. Wykonuj mycie w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z małą prędkością. Do prania szkiełek należy używać sterylnych kopert do szkiełek z miejscem na maksymalnie pięć szkiełek.</li>
	<li>Przenieść szkiełka do sterylnego szkiełka pocztowego z 18 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Prać przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wylej 1x PBS i natychmiast potraktuj tkankę na szkiełkach proteinazą K, aby umożliwić penetrację tkanki przez sondę. Dodać około 18 ml roztworu proteinazy K do szkiełka (patrz Tabela 1 dla stężenia roztworu roboczego). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Nie potrząsać.
	<ol>
		<li>Podczas inkubacji szkiełek przygotuj bufor prehybrydyzacyjny (Prehybe Buffer). Umieść bufor Prehybe we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut, a następnie schładzaj w łaźni lodowej przez 5 minut. Receptura buforu Prehybe znajduje się w Tabeli 1.</li>
		<li>Zatrzymać trawienie reakcji proteinazy K poprzez wylanie roztworu proteinazy K i natychmiast dodać 18 ml 0,2% roztworu glicyny-PBS do szkiełka pocztowego. Pozostaw suwak w temperaturze pokojowej na 5 minut.</li>
		<li>Wylej 0,2% roztwór glicyny-PBS i dodaj 18 ml 2x roztworu cytrynianu sodu (SSC) do każdego szkiełka pocztowego. Myć szkiełka w 2x SSC przez 10 minut w temperaturze pokojowej, wstrząsając przy 100-150 obr./min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Prehybrydyzacja preparatów w ramach przygotowań do hybrydyzacji sondą RNA
<ol>
	<li>Podczas mycia szkiełek za pomocą 2x SSC, zaopatrz się w nową sterylną kopertę do szkiełek i umieść około 18 ml buforu Prehybe w maszynie do przenoszenia. Umieść szkiełko w piecu do hybrydyzacji w temperaturze hybrydyzacji. 
	UWAGA: Temperatura hybrydyzacji będzie zależeć od używanej sondy, ale zwykle waha się od 50-60 °C.</li>
	<li>Po zakończeniu mycia 2x SSC, wylej 2x SSC i umieść szkiełka w komorze do szkiełek w buforze Prehybe w piecu do hybrydyzacji na 1 godzinę.</li>
</ol>
4. Hybrydyzacja sondy RNA
<ol>
	<li>Podczas gdy szkiełka inkubują się z buforem Prehybe w piecu do hybrydyzacji, przygotuj roztwór sondy hybrydyzacyjnej.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć każdą sondę w buforze hybrydyzacyjnym (0,5 μl sondy z 24,5 μl buforu hybrydyzacyjnego). 
		UWAGA: Przepis na bufor hybrydyzacyjny znajduje się w tabeli 1. Przykład przygotowania i stężeń sondy można znaleźć w Traylor-Knowles i wsp.11.</li>
		<li>Umieść rozcieńczoną sondę na bloku grzewczym o temperaturze 86-90 °C na 12 minut, a następnie schłodzić przez 1 minutę na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjmij szkiełko z pieca do hybrydyzacji i pojedynczo wyjmij szkiełka z pudełka do przenoszenia za pomocą sterylnej pęsety. Połóż szkiełka płasko na ręczniku papierowym i ostrożnie zetrzyj nadmiar buforu Prehybe wokół próbek tkanek. Należy uważać, aby nie dotykać próbek i pracować szybko, aby zapobiec wysuszeniu próbek tkanek.</li>
	<li>Owiń tkankę za pomocą wstrzykiwacza PAP. Nanieść pipetą 25 μl rozcieńczonego roztworu sondy i przykryć próbkę plastikowym szkiełkiem nakrywkowym.
	<ol>
		<li>Umieścić próbki w szkiełkowej komorze wilgotnościowej z 4x SSC + 50% roztworem formamidu na dnie komory.</li>
		<li>Po dodaniu sond do wszystkich szkiełek, umieścić komorę wilgotnościową szkiełka w piecu do hybrydyzacji na co najmniej 24 godziny w temperaturze hybrydyzacji 50-60 °C. Czas inkubacji może się różnić w zależności od stężenia sondy, ale powinien wynosić co najmniej 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po całonocnej inkubacji z rozcieńczonymi sondami wyjmij szkiełkową komorę wilgotnościową z pieca do hybrydyzacji.
	<ol>
		<li>Usuń szkiełka nakrywkowe z każdego z szkiełek, uważając, aby nie przesunąć tkanki. W pipecie o pojemności 1000 μl dodaj 1000 μl roztworu 2x SSC i delikatnie zmyj szkiełko.</li>
		<li>Umieścić szkiełko w sterylnym pudełku pocztowym z 18 ml 2x roztworu SSC na 5 minut w temperaturze pokojowej. Wylej roztwór i zastąp go 18 ml świeżego 2x SSC. Powtórzyć inkubację ponownie przez 5 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.</li>
		<li>Wylej 2x roztwór SSC. Dodaj 18 ml 1x roztworu SSC i myj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wylej 1x roztwór SSC i zastąp go 18 ml świeżego roztworu 1x SSC. Powtarzać inkubację przez 5 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.</li>
		<li>Wylej 1x SSC. Dodać 18 ml 0,5x SSC i prać przez 10 minut w temperaturze 42 °C bez wstrząsania. Wylej 0,5x SSC i zastąp go 18 ml świeżego 0,5x SSC. Prać ponownie przez 10 minut w temperaturze 42 °C bez wstrząsania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Wizualizacja sondy RNA
UWAGA: Do wizualizacji sondy, podczas procesu rozwoju zostanie użyty fioletowy BM. Jednak przed tym krokiem wymagane jest kilka prań, aby przygotować próbki do barwienia.
<ol>
	<li>Przemyć szkiełka 18 ml alkalicznego buforu fosfatazy (bufor AP) bez MgCl2 przez 1 minutę. Wylać bufor AP bez MgCl2 i dodać 18 ml 1x buforu blokującego Boehringera-Mannheima rozcieńczonego buforem kwasu maleinowego. Inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej w szkiełku pocztowym, delikatnie wstrząsając. 
	UWAGA: Zastosowany bufor blokujący Boehringer-Mannheim i bufor kwasu maleinowego zostały wstępnie przygotowane i zakupione w zestawie buforowym DIG Wash and Block (dostępnym w sprzedaży).
	<ol>
		<li>Alternatywnie można przeprowadzić inkubację przez noc w temperaturze 4 °C. Dłuższy okres blokowania zmniejszy pojawianie się niespecyficznego wiązania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 20 ml rozcieńczonych fragmentów DIG anty-digoksygeniny-AP Fab (przeciwciało anty-DIG = 2 μl przeciwciała anty-DIG + 20 ml 1x bufor blokujący Boehringera-Mannheima). To wystarczy do użycia w 1 plastikowej skrzynce pocztowej. Więcej tego rozwiązania należy przygotować, jeśli ma być użyty więcej niż jeden folder do przenoszenia slajdów.</li>
	<li>Dodać przeciwciało anty-DIG do nowego sterylnego szkiełka pocztowego i przenieść szkiełka do koperty z roztworem przeciwciała anty-DIG. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 godziny, delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Po inkubacji wylać przeciwciało anty-DIG i umyć szkiełka w skrzynce do szkiełek 18 ml buforu AP bez MgCl2 przez 5 minut, delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Wylej AP-Buffer bez MgCl2 i dodaj 18 ml AP-Buffer. Myć przez 5 minut, delikatnie wstrząsając. Po 5 minutowej inkubacji odlać AP-Buffer, zastąpić go 18 ml świeżego AP-Buffera i myć przez 5 minut, delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>W ciemności wylej bufor AP i dodaj 18 ml fioletowego BM do koperty do slajdów. Inkubuj szkiełka w temperaturze pokojowej w ciemności, sprawdzając rozwój fioletowego koloru co 1/2 godziny. Czas reakcji na wizualizację będzie się różnić w zależności od opracowywanej sondy. 
	UWAGA: Zamiast fioletowej wizualizacji BM, roztwór rozwojowy można wykonać przy użyciu 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-fosforanu (BCIP) i niebieskiego tetrazolu nitro (NBT). Instrukcje znajdują się w Tabeli 1.</li>
	<li>Zatrzymaj wywoływanie koloru, przenosząc szkiełka do nowego sterylnego szkiełka pocztowego z 18 ml buforu Tris-EDTA (TE) przez 5 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.</li>
	<li>Odlej bufor TE i dodaj 18 ml wody wolnej od RNaz do szkiełka i myj przez 1 minutę w ciemności.</li>
	<li>Wyjmij szkiełka z wody i wysusz je wokół krawędzi tkanki. Dodaj podłoże mocujące glicerolu i umieść szkiełka nakrywkowe. Przechowuj preparaty w temperaturze 4 °C, aż zdjęcia będą gotowe do zrobienia.</li>
</ol>

<ol><li>Hughes, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Climate+Change%2C+Human+Impacts%2C+and+the+Resilience+of+Coral+Reefs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs.</a> Science. 301 (5635), 933(2003).</li>
<li>Chen, P. -Y., Chen, C. -C., Chu, L., McCarl, B. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959378014001782">Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs.</a> Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).</li>
<li>Hoegh-Guldberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coral+Reefs+Under+Rapid+Climate+Change+and+Ocean+Acidification%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification.</a> Science. 318 (5857), 1742(2007).</li>
<li>Grasso, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+identifies+candidate+genes+for+key+roles+in+coral+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development.</a> BMC Genomics. 9 (1), 540(2008).</li>
<li>Miller, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+innate+immune+repertoire+in+Cnidaria+-+ancestral+complexity+and+stochastic+gene+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss.</a> Genome Biology. 8 (4), R59(2007).</li>
<li>Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox+genes+in+the+coral+Acropora+millepora%3A+divergent+expression+patterns+reflect+differences+in+developmental+mechanisms+within+the+Anthozoa%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa.</a> BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311(2008).</li>
<li>Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+and+expression+of+four+coral+G+protein-coupled+receptors+distinct+from+all+classifiable+members+of+the+rhodopsin+family%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family.</a> Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22In+situ+hybridization+protocols%22">In situ hybridization protocols</a>. Darby, I. A., Hewitson, T. D. , Humuna Press. Towtowa, New Jersey. (2006).</li>
<li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aValentino%2C+KL+%22In+situ+hybridization%22">In situ hybridization</a>. , Oxford University Press. (1987).</li>
<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li>
<li>Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+specificity+of+gene+expression+in+the+response+to+heat+stress+in+corals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals.</a> Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).</li>
<li>Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+spatiotemporal+expression+of+RNAs+and+proteins+in+the+starlet+sea+anemone%2C+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis.</a> Nature Protocols. 8, 900(2013).</li>
<li>Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+multiple+Sox+genes+through+embryonic+development+in+the+ctenophore+Mnemiopsis+leidyi+is+spatially+restricted+to+zones+of+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation.</a> EvoDevo. 5 (1), 15(2014).</li>
<li>Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-specific+and+developmental+expression+of+Dmrt+genes+in+the+starlet+sea+anemone%2C+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis.</a> EvoDevo. 6 (1), (2015).</li>
<li>Barry, S. N., Crow, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+HoxA11+and+HoxA13+in+the+evolution+of+novel+fin+morphologies+in+a+representative+batoid+%28Leucoraja+erinacea%29%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea).</a> EvoDevo. 8 (1), 24(2017).</li>
<li>Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdivision+of+arthropod+cap-n-collar+expression+domains+is+restricted+to+Mandibulata%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata.</a> EvoDevo. 5 (1), 3(2014).</li>
<li>Piatigorsky, J., Kozmik, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cubozoan+jellyfish%3A+an+Evo%2FDevo+model+for+eyes+and+other+sensory+systems%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems.</a> The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda opisana w tym protokole została zmodyfikowana w stosunku do wcześniejszych prac w medycznych i ewolucyjnych badaniach rozwojowych 8,9,10,12,17. Protokół ten koncentruje się na niuansach hybrydyzacji in situ z sondą antysensowną RNA znakowaną DIG na dorosłych koralowcach, które zostały zakonserwowane i osadzone w parafinie. Metodę tę można łatw...

Koralowce są kluczowymi budowniczymi ekosystemów i ważnymi dla różnorodności biologicznej w oceanach i zdrowiu ludzi1,2,3. Są zagrożone ze względu na zmiany klimatyczne i inne antropogeniczne czynniki stresogenne, a wiele gatunków koralowców uważa się za krytycznie zagrożone. W związku z tym istnieje znaczne zapotrzebowanie na narzędzia komórkowe i molekularne do diagnozowania koralowców w stresie. Ponadto niewiele wiadomo na temat tego, gdzie geny ulegają ekspresji w tkance dorosłego koralowca, a zatem niewiele wiadomo o funkcjach tych genów. Aby rozwiązać ten problem, dostosowaliśmy protokół hybrydyzacji in situ (ISH), powszechnie stosowany w medycynie ludzkiej i ewolucyjnej biologii rozwoju, do stosowania na próbkach tkanek zatopionych w parafinie dorosłych koralowców. Ta technika jest najskuteczniejsza, gdy jest stosowana na dorosłych koralowcach, które przeszły stresujące wydarzenie, takie jak narażenie na stres cieplny. Jednak technika ta może być stosowana w szerokim zakresie tkanek i etapów życia koralowców i nie ogranicza się tylko do koralowców narażonych na stres cieplny4,6,7. Ponadto technika ta może być stosowana na tkankach lub komórkach dowolnego metazoanu, o ile dostępne są informacje o sekwencji cDNA.
Celem tej metody jest wizualizacja sond RNA w tkance dorosłego koralowca, która została zakonserwowana i zatopiona w parafinie i pocięta na szkiełka. Ta metoda jest potężnym narzędziem diagnostycznym, które pozwala na wizualizację kwasów nukleinowych w tkance dorosłego koralowca. Początkowo metoda ta została opracowana do diagnostyki medycznej i od tego czasu stała się popularnym narzędziem w dziedzinach takich jak biologia rozwojowa i ewolucyjna biologia rozwojowa8,9,10. ISH jest również metodą krytyczną, szczególnie w systemach niemodelowych, gdy dostępne są dane dotyczące sekwencji genomicznych i transkryptomicznych, ale przestrzenne wzorce ekspresji genów są nieznane. W przypadku prac diagnostycznych w systemach niemodelowych technika ta jest skuteczna, ponieważ może wskazać, które komórki i tkanki wyrażają interesujący nas gen i może prowadzić do bardziej ukierunkowanych podejść terapeutycznych8,9,10,11,12. Wreszcie, ta technika jest jakościowa i skuteczniejsza w połączeniu z ilościowymi danymi dotyczącymi ekspresji genów11.
Podejście opisane w tym artykule będzie interesujące dla badaczy, którzy już zaprojektowali sondę RNA znakowaną digoksygeniną (DIG) (zarówno sondę sensowną, jak i antysensowną) i są teraz gotowi do przeprowadzenia hybrydyzacji sond in situ z próbką. Aby wykonać tę metodę, dla każdej badanej sondy potrzebne będą dwa szeregowe odcinki tkanki koralowca parafinowego. Jedna sekcja będzie używana dla sondy czujnikowej, a druga dla sondy antysensownej. Sonda wykrywania będzie kontrolką wskazującą niespecyficzne powiązanie. Jeśli w sondzie zmysłowej obserwuje się barwienie, oznacza to, że sonda antysensowna nie jest specyficzna dla interesującego RNA. Sondy mogą być zaprojektowane dla każdego genu ulegającego ekspresji. W tym protokole wykorzystano kilka przykładów, które wcześniej stwierdzono jako ulegające ekspresji podczas stresu cieplnego u koralowców: homolog onkogenu wirusa kostniakomięsaka myszy FBJ (Fos-B), białko aktywujące (AP1) i receptor czynnika martwicy nowotworu 41 (TNFR 41)11. ISH przy użyciu sond RNA znakowanych DIG jest preferowany w porównaniu z sondami radioaktywnymi, ponieważ ich obsługa jest znacznie bezpieczniejsza10. Ponadto technika ta jest bardzo czuła i może być wykonywana na szerokim zakresie tkanek i zarodków poza dorosłymi koralowcami narażonymi na stres cieplny13,14,15,16.

<table><tbody><tr><td>Roztwór Denhardta</td><td>Affymetrix</td><td>70468 50 ML</td><td></td></tr><tr><td>Bioworld Bufor fosfatazy alkalicznej</td><td>Fisher</td><td>50-198-724</td><td></td></tr><tr><td>Koperty do slajdów</td><td>Fisher</td><td>12-587-17B</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosfatazy alkalicznej Bioworld</td><td>Fisher</td><td>50-198-724</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówki Falcon</td><td>Fisher</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Roztwór DNA plemników łososia</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>PBS - Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10X) pH 7,4</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Woda destylowana wolna od DNaz/RNaz, 10 x 500 ml</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Woda destylowana wolna od DNaz/RNaz, 10 x 500 ml</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Roztwór DNA plemników łososia</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Slide White Apex Superior Adhesive</td><td>Leica Biosystems</td><td>3800080</td><td></td></tr><tr><td>roztwór PBS, pH 7,4</td><td>Life Technologies</td><td>10010072</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K, klasa molekularna, 2 ml</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Super Pap Pen Liquid Blocker</td><td>Promega</td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>DIG Anti-Digoxigenin-AP Fragmenty Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple, 100 ml</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>DIG Zestaw do mycia i blokowania</td><td>Roche</td><td>11585762001</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>roztwór formaldehydu, rozmiar 500 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Bufor SSC o stężeniu 20X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639-1L</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Trietanoloamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny z błony śluzowej jelit świń</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Ksyleny, AR (ACS), do stosowania</td> <td>histologicznegoVWR</td><td>MK866806</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>EM-EX0276-4S</td><td></td></tr><tr><td>Bufor TE</td><td></td><td></td> Piec hybrydyzacyjny VWR PAV6232 <td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>97005-252, 97005-254</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka oscylacyjna</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ techniki hybrydyzacji próbek dorosłych koralowców zanurzonych w parafinie

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

Koralowce są ważnymi bezkręgowcami oceanicznymi, które są kluczowe dla ogólnego zdrowia oceanów, jak również dla zdrowia ludzi. Jednak ze względu na wpływ człowieka, taki jak wzrost temperatury oceanów i zakwaszenie oceanów, koralowce są coraz bardziej zagrożone. Aby sprostać tym wyzwaniom, postępy w biologii komórkowej i molekularnej okazały się kluczowe dla diagnozowania stanu zdrowia koralowców. Modyfikacja niektórych technik powszechnie stosowanych w medycynie ludzkiej może znacznie poprawić zdolność naukowców do leczenia i ratowania koralowców. Aby temu zaradzić, protokół hybrydyzacji in situ, stosowany głównie w medycynie ludzkiej i ewolucyjnej biologii rozwoju, został dostosowany do stosowania u dorosłych koralowców w warunkach stresu.
Celem tej metody jest wizualizacja przestrzennej ekspresji sondy RNA w tkance dorosłego koralowca, która została zanurzona w parafinie i pocięta na szkiełka podstawowe. Metoda ta koncentruje się na usunięciu parafiny i ponownym uwodnieniu próbki, wstępnej obróbce próbki w celu zapewnienia przepuszczalności próbki, inkubacji przed hybrydyzacją, hybrydyzacji sondy RNA i wizualizacji sondy RNA. Jest to potężna metoda w przypadku wykorzystania organizmów niemodelowych do odkrycia, gdzie ulegają ekspresji określone geny, a protokół można łatwo dostosować do innych organizmów niemodelowych. Metoda ta jest jednak ograniczona, ponieważ jest przede wszystkim jakościowa, ponieważ intensywność wyrażania może się różnić w zależności od ilości czasu użytego podczas etapu wizualizacji i stężenia sondy. Ponadto wymagana jest cierpliwość, ponieważ ten protokół może zająć do 5 dni (a w wielu przypadkach dłużej) w zależności od używanej sondy. Wreszcie, powszechne jest niespecyficzne barwienie tła, ale to ograniczenie można przezwyciężyć.

Po wykonaniu niniejszego protokołu zostanie zidentyfikowane miejsce ekspresji badanej sondy RNA w komórkach i tkankach. Reprezentatywne wyniki dla tego protokołu dotyczą AP-1, FosB i TNFR41. Wyniki te, opublikowane wcześniej przez Traylor-Knowles et al.11, pokazują przestrzenną ekspresję sond RNA w dorosłych koralowcach poddanych stresowi cieplnemu. Na Ryc. 1 przedstawiono dwa przykłady różnych typów barwienia. <strong class="...

Celem tego protokołu jest przeprowadzenie hybrydyzacji in situ na próbkach dorosłych koralowców, które zostały zatopione w parafinie i pocięte na szkiełka podstawowe. Jest to metoda jakościowa stosowana do wizualizacji ekspresji przestrzennej sondy antysensownej RNA w tkankach zanurzonych w parafinie.

In Situ Techniki hybrydyzacji próbek dorosłych koralowców zanurzonych w parafinie

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii komórek koralowców, takie jak to, jakie typy tkanek i komórek wyrażają określone typy genów. Główną zaletą tej techniki jest to, że masz wizualną informację na temat ekspresji RNA. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w przestrzenną ekspresję genów u dorosłych koralowców, może być również stosowana na innych etapach życia koralowców, a także w innych systemach bezkręgowców.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ jest tak wiele kroków i rozwiązań, które należy śledzić. Muszą więc zwracać uwagę na to, gdzie są w protokole i dobrze śledzić czas podczas prania. Kevin Rodriguez, technik w moim laboratorium, będzie demonstrował tę procedurę.Na początek odparafinuj cienkowarstwowe szkiełka zatopione w parafinie ze 100% ksylenem w szklanych słoikach Coplin przez 10 minut pod maską. Następnie napełnij cztery sterylne szklane słoiki Coplin odpowiednio 100% etanolem, 80% etanolem, 70% etanolem i 60% etanolem. Najpierw przenieś szkiełka do słoika Coplin zawierającego 100% etanolu i pozwól im moczyć się przez 10 minut.Następnie przenieś szkiełka do innego słoika

in-situ-hybridization-techniques-for-paraffin-embedded-adult-coral

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Przedstawiono kombinację różnych technik w celu maksymalizacji zakresu gromadzonych danych z tkanki mysiej.

Łączenie barwnika lipofilowego, hybrydyzacji in situ, immunohistochemii i histologii

Niniejszy protokół hybrydyzacji in situ w preparatach całych określa krytyczne etapy zapewniające powtarzalne, wysokiej jakości wyniki w badaniach ekspresji genów w embrionach myszy w wieku od E8.5 do E11.5 dnia.

Hybrydyzacja in situ w całym preparacie zarodków myszy od E8.5 do E11.5

Opisany tutaj protokół hybrydyzacji in situ umożliwia bezpośrednią lokalizację ekspresji mRNA i małych RNA na poziomie komórkowym z wysoką czułością i swoistością. Procedura została zoptymalizowana dla przekrojów tkanek roślinnych zatopionych w parafinie, ma zastosowanie do szerokiego zakresu roślin i tkanek oraz może zostać ukończona w ciągu dziesięciu dni.

Hybrydyzacja in situ w celu precyzyjnej lokalizacji transkrypty w roślinach

Łącząc metody hybrydyzacji in situ i histologii całego RNA, ekspresja genów może być powiązana z decyzjami dotyczącymi losu komórki w rozwijającym się zarodku.  Metody te zostały dostosowane do morskich zwierząt spodoustych i ułatwiają wykorzystanie tych zwierząt jako organizmów modelowych do badań biomedycznych, toksykologicznych i porównawczych.

Hybrydyzacja RNA in situ w całych zarodkach Mount i histologia komórek dostosowana do morskich spodoustych

Danio pręgowany, mała tropikalna ryba, stała się popularnym modelem do badania funkcji genów podczas rozwoju i choroby kręgowców. Czasową i przestrzenną ekspresję genów docelowych można określić za pomocą hybrydyzacji in situ. Nasz ulepszony protokół pozwala na wykrywanie mało obfitych transkryptów z niskim niespecyficznym sygnałem tła.

Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

Zintegrowany zestaw technik obrazowania został zastosowany do określenia morfologii polipów i struktury tkanek u karaibskich koralowców Montastraeaannularis i M. faveolata. Fluorescencja, szeregowa powierzchnia blokowa i dwufotonowa konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa pozwoliły zidentyfikować strukturę płatów, ściany polipów oraz oszacować gęstości i rozkłady chromatoforów i zooksantelli.

Multimodalne metody mikroskopii optycznej ujawniają morfologię i strukturę tkanek polipowych w karaibskich koralowcach budujących rafy

Ten protokół opisuje skuteczne podejście do hybrydyzacji in situ w celu wykrycia poziomów ekspresji mRNA i wzorców przestrzennych docelowych genów w płynie celomicznym Sipunculus nudus.

Hybrydyzacja in situ dla Sipunculus nudus Płyn celomiczny

Ten protokół opisuje, jak uzyskać obrazy poprzez połączenie hybrydyzacji in situ i immunohistochemii odcinków embrionalnych danio pręgowanego. Przed kriosekcją przeprowadzono hybrydyzację in situ, a następnie barwienie przeciwciałami. Przydatne jest wykrycie wzorców ekspresji dwóch genów u danio pręgowanego, jeśli występuje niedobór przeciwciał.

In Situ Hybrydyzacja połączona z immunohistochemią w kriosekcji zarodków danio pręgowanego

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji komórek proliferujących podobnych do macierzystych u meduzy Cladonema. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ z pełnym montowaniem z markerem komórek macierzystych pozwala na wykrycie komórek macierzystych, a znakowanie 5-etynylo-2'-deoksyurydyną umożliwia identyfikację komórek proliferujących. Razem można wykryć aktywnie proliferujące komórki macierzyste.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ i znakowanie 5-etynylo-2'-deoksyurydyny komórek macierzystych w meduzie hydrozoan Cladonema pacificum

Ten artykuł przedstawia dwie metody oparte na fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu określenia zawartości chromosomu X komórek jajnika w nieprzeszczepionej i przeszczepionej tkance kory jajnika od kobiet z aberracjami chromosomu X.

Badanie aberracji chromosomowych X w komórkach jajnika za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Tutaj prezentujemy ekstrakcję i przygotowanie polarnych i półpolarnych metabolitów z holobiontu koralowca, a także wydzielonych tkanek gospodarza koralowców i frakcji komórek Symbiodiniaceae, do analizy metodą chromatografii gazowej i spektrometrii mas.

Ukierunkowana metabolomika próbek koralowców twardych oparta na chromatografii gazowej i spektrometrii mas

Poznaj technikę hybrydyzacji in situ w tkankach koralowców zanurzonych w parafinie. Ta metoda umożliwia wizualizację ekspresji RNA w określonych tkankach i komórkach, dostarczając cennych informacji o biologii koralowców.

In Situ Techniki hybrydyzacji próbek dorosłych koralowców zanurzonych w parafinie

Przeglądaj więcej filmów