Badanie aberracji chromosomowych X w komórkach jajnika za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Analiza FISH komórek jajnikowych od kobiet z aberracjami chromosomowymi X jest unikalną techniką pozwalającą uzyskać wgląd w zawartość chromosomu X w komórkach jajnika w tej konkretnej grupie. Techniki te mogą być pomocne, aby dowiedzieć się więcej o potencjale rozrodczym u kobiet z aberracjami chromosomu X. Należy wspomnieć, że obie metody mają na celu ułatwienie przyszłych badań i nie są przeznaczone do stosowania jako narzędzie diagnostyczne w praktyce klinicznej.

Procedurę zademonstrują Ronald Peek, starszy badacz z naszego laboratorium płodności, oraz Milad Intezar, analityk z naszego wydziału patologii. Na początek pokrój kriokonserwowaną lub rozmrożoną tkankę kory jajnika na małe kawałki jeden po drugim milimetr za pomocą skalpela. Enzymatycznie trawić fragmenty tkanek w czterech litrach wstępnie podgrzanego L15 przez 75 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pipetować mieszaninę wytrawiania w górę i w dół co 15 minut. Zatrzymaj trawienie enzymatyczne, dodając cztery mililitry zimnego L15 uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą lub FBS. Przemyć zdysocjowaną tkankę raz ośmioma mililitrami zimnej pożywki L15 przez odwirowanie przy 500 g, a następnie ponownie zawiesić w 500 mikrolitrach pożywki L15.

Przenieś zawiesinę komórkową zawierającą głównie pojedyncze komórki zrębu i małe pęcherzyki na plastikową szalkę Petriego i zbadaj zawiesinę pod mikroskopem stereoskopowym. Mieszki włosowe o wielkości mniejszej niż 50 mikrometrów należy pobrać ręcznie za pomocą plastikowej pipety o długości 75 mikrometrów i przenieść je do kropelki pożywki L15 uzupełnionej 10% FBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przenieś oczyszczone mieszki włosowe do roztworu 0,06% trypsyny, jednego miligrama na mililitr EDTA i jednego miligrama na mililitr glukozy i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po inkubacji uzyskaj komórki zrębu jajników z zawiesiny komórek kory mózgowej za pomocą plastikowej pipety o długości 75 mikrometrów. W przypadku fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ lub analizy FISH pojedynczych komórek jajnika, przenieś leczone pęcherzyki jajnikowe z trypsyną / EDTA / glukozą lub komórkami zrębu do kropelek pięciu mikrolitrów 0,15 milimolowego chlorku potasu i 15 mikrolitrów DPBS na szkiełku i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wysuszyć i wstępnie utrwalić szkiełko w 300 mikrolitrach 0,05 milimolowego chlorku potasu, 7,5% kwasu octowego i 22,5% metanolu przez dwie minuty.

Przykryj szkiełko metanolem octowym w proporcji trzy do jednego na dwie minuty, aby sfinalizować utrwalanie. Po utrwaleniu przemyć próbkę dwukrotnie w świeżo przygotowanym SSC w temperaturze 73 stopni Celsjusza. Przykryj go 100 mikrolitrami 2% Proteinazy K i zamknij szkiełkiem nakrywkowym.

Inkubować szkiełko przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w stacji hybrydyzacyjnej. Po inkubacji zdjąć szkiełko nakrywkowe i myć szkiełko przez pięć minut w DPBS w temperaturze pokojowej i wstrząsając. Utrwal próbkę na pięć minut za pomocą 1% formaldehydu.

Następnie umyj szkiełko w DPBS i seryjnie odwadniaj je w zwiększaniu stężenia etanolu przez dwie minuty każde. Wysuszyć próbkę na powietrzu przed hybrydyzacją za pomocą sond znakowanych fluorescencyjnie. Następnie dodać jeden mikrolitr CEPX, jeden mikrolitr CEP18 i 18 mikrolitrów buforu hybrydyzacyjnego do próbki i uszczelnić szkiełkiem nakrywkowym, które jest przyklejone do szkiełka.

Przenieś szkiełko do stacji hybrydyzacji w celu denaturacji w temperaturze 73 stopni Celsjusza przez trzy minuty, a następnie hybrydyzacji podczas nocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po hybrydyzacji usuń szkiełko nakrywkowe i pozostały klej z szkiełka. Myj szkiełko w 0,4X SSC, 0,3% Tween-20 w temperaturze 72 stopni Celsjusza przez dwie minuty, a następnie inkubuj przez minutę w 2X SSC i 0,1% Tween-20.

Odwodnić szkiełko w sposób pokazany i wysuszyć je na powietrzu w ciemności przed przykryciem go podłożem montażowym zawierającym DAPI. Umieść szkiełko w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na 10 minut przed analizą za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Aby zhybrydyzować skrawki parafiny, należy wybrać nowe sekcje przed lub po sekcji zawierającej mieszki włosowe ze wstęgi parafinowej.

Zamontuj jedną sekcję na szkiełku podstawowym i susz ją przez 45 minut na kuchence w temperaturze 56 stopni Celsjusza. Odparafinować sekcję w ksylenie przez 10 minut, następnie zanurzyć szkiełko w 99,5% etanolu i płukać przez pięć minut w wodzie z kranu. Preparat należy wstępnie potraktować roztworem do pobierania celu przez 10 minut w temperaturze 96 stopni Celsjusza.

Po wystudzeniu opłucz szkiełko w wodzie destylowanej. Traktować szkiełko przez pięć minut 0,01 molowym kwasem solnym, a następnie wytrawiać pepsynę przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ponownie przepłukać szkiełko w kwasie solnym, a następnie w PBS.

Zamocuj szkiełko w 1% formaldehydzie PBS na pięć minut. Następnie krótko przepłucz szkiełko w PBS i ponownie w wodzie demineralizowanej przed odwodnieniem w 99,5% etanolu. Nałóż pięć mikrolitrów sondy CEP18 i CEPX na wstępnie poddane obróbce szkiełko.

Następnie nałóż szkiełko nakrywkowe i uszczelnij obszar klejem fotograficznym. Umieść szkiełko w hybrydyzatorze w celu denaturacji w temperaturze 80 stopni Celsjusza na 10 minut i hybrydyzacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia przepłukać szkiełko dwa razy przez pięć minut w SSC w temperaturze 42 stopni Celsjusza, a następnie dwie minuty i jedną minutę płukać w 0,3% Nonidet P-40 w temperaturze 73 stopni Celsjusza.

Ponownie przepłucz szkiełko w 2X SSC, a następnie spłucz w wodzie destylowanej przed odwodnieniem 99,5% etanolem. Wysuszyć szkiełko na powietrzu i zamontować go w medium montażowym zawierającym DAPI. Kriokonserwowana tkanka kory jajnika u pacjenta A wykazała 50% limfocytów, miał 45, kariotyp X, a 50% miało 46, XX.In Pacjentka B, 38% limfocytów miało 45, X, 28% miało 46, XX i 34% miało 47, XXX.

Otaczające komórki zrębu analizowano również pod kątem zawartości chromosomu X. Trawienie enzymatyczne tkanki kory jajnika spowodowało zawieszenie w dużej mierze zdysocjowanych komórek, ale pozostawiając pierwotne pęcherzyki, składające się z nienaruszonego oocytu otoczonego pojedynczą warstwą komórek ziarnistości. Małe pęcherzyki powodowały trudności w interpretacji sygnałów po FISH, ze względu na zlepianie się komórek ziarnistiny.

Dodatkowe trawienie pęcherzyków z trypsyną przed FISH spowodowało skurczenie się poszczególnych komórek ziarnistości do kulistej morfologii na powierzchni pęcherzyków. Barwienie eozyną hematoksyliny wykazało morfologicznie prawidłowe pęcherzyki wtórne i antralne w tkance kory jajnika po pięciu miesiącach ksenoprzeszczepu. Zawartość chromosomu X w komórkach ziarnistości tych pęcherzyków oznaczono za pomocą analizy FISH.

Utrwalenie przeszczepionej tkanki kory jajnika w roztworze Bouina spowodowało rozmycie i w dużej mierze zasłonięte sygnały fluorescencyjne w komórkach pęcherzykowych z powodu zielonej mgiełki. Natomiast tkanka kory jajnikowej utrwalona w formaldehydzie dostarczała doskonałych sygnałów fluorescencyjnych. Głównym wyzwaniem tego protokołu jest izolacja komórek jajnika i enzymatyczne trawienie tkanki.

Odstępstwo od tego protokołu może spowodować znaczną utratę komórek jajnikowych podczas tego procesu, a tego należy szczególnie unikać u kobiet, które mają już niską rezerwę jajnikową. Dodatkowe profilowanie ekspresji genów może być pomocne, aby dowiedzieć się więcej o wpływie aneuploidalnych komórek jajnika na folikulogenezę, a tym samym proces przedwczesnej niewydolności jajników u kobiet z aberracjami chromosomu X.