Name: Badanie aberracji chromosomowych X w komórkach jajnika za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T13:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Poznaj metody FISH do analizy zawartości chromosomu X w komórkach jajnika u samic z aberracjami chromosomowymi. Techniki te ułatwiają badania nad potencjałem reprodukcyjnym w tej grupie pacjentek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef i Milanowi Intezarowi za ich ekspertyzę i pomoc techniczną. Źródła finansowania: Merck Serono (A16-1395), Goodlife i Ferring.

Protokół badania TurnerFertility został zatwierdzony przez Centralny Komitet ds. Badań z udziałem ludzi (NL57738.000.16). W tym badaniu uzyskano tkankę kory jajnikowej u 93 kobiet z TS. Materiały, które wymagają środków ostrożności, są wymienione w tabeli 1.
Tabela 1: Środki ostrożności.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>materiał</td>
			<td colspan="3">Hazard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kwas octowy</td>
			<td colspan="3">Poważne oparzenia skóry i podrażnienia układu oddechowego</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kolagenaza</td>
			<td colspan="3">Działa drażniąco na oczy, układ oddechowy i skórę</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (interfejs DAPI)</td>
			<td colspan="3">Działa drażniąco na oczy, układ oddechowy i skórę</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaza I</td>
			<td colspan="3">Działa drażniąco na oczy, układ oddechowy i skórę</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>etanol</td>
			<td colspan="3">Wysoce łatwopalny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyd</td>
			<td colspan="3">Działa toksycznie po inhalacji, spożyciu i kontakcie ze skórą</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamid 
			(w sondach fluorescencyjnych)</td>
			<td colspan="3">Może zaszkodzić nienarodzonemu dziecku</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase (Liberaza)</td>
			<td colspan="3">Działa drażniąco na oczy, układ oddechowy i skórę</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>metanol</td>
			<td colspan="3">Wysoce łatwopalny, toksyczny przez drogi oddechowe, spożycie i kontakt ze skórą</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td colspan="3">Działa drażniąco na skórę lub oczy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pepsyna</td>
			<td colspan="3">Działa drażniąco na oczy, układ oddechowy i skórę</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinaza K</td>
			<td colspan="3">Trudności w oddychaniu po inhalacji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ksylen</td>
			<td colspan="3">Wysoce łatwopalny, toksyczny po inhalacji i kontakcie ze skórą. Unikać kontaktu z oczami.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Materiały wymagające środków bezpieczeństwa.
1. RYBA na izolowanych pojedynczych komórkach kory jajnika
<ol>
	<li>Dysocjacja tkanki kory jajnika w celu uzyskania pojedynczych komórek
	<ol>
		<li>Pokrój kriokonserwowaną/rozmrożoną tkankę kory jajnika na małe kawałki o wymiarach około 1 mm x 1 mm x 1 mm za pomocą skalpela.</li>
		<li>Enzymatycznie trawić fragmenty tkanek w 4 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) podłoża L15 zawierającego 0,1 mg/ml mieszaniny enzymów dysocjacji tkanek, 10 μg/ml DNazy I i 1 mg/ml kolagenazy I z C. histolyticum przez maksymalnie 75 minut w temperaturze 37 °C. Pipetować mieszankę mineralizacyjną w górę i w dół co 15 minut.</li>
		<li>Zatrzymaj trawienie enzymatyczne, dodając 4 ml zimnego L15 uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Przemyć zdysocjowaną tkankę raz 8 ml zimnej pożywki L15 przez odwirowanie przy 500 x g i ponownie zawiesić w 500 μl pożywki L15 bez wirowania, aby uniknąć uszkodzenia komórek.</li>
		<li>Przenieś zawiesinę komórkową zawierającą głównie pojedyncze komórki zrębu i małe pęcherzyki (oocyty otoczone pojedynczą warstwą komórek ziarnistych) na plastikową szalkę Petriego i zbadaj zawiesinę komórek pod mikroskopem stereoskopowym (100-krotne powiększenie).</li>
		<li>Pobrać małe pęcherzyki (<50 μm) ręcznie za pomocą plastikowej pipety o długości 75 μm i przenieść pęcherzyki do kropelki pożywki L15 uzupełnionej 10% FBS w temperaturze 4 °C, aby zapobiec agregacji pęcherzyków. Pobieranie mieszków włosowych należy wykonywać maksymalnie przez 30 minut. Aby poprawić rozprzestrzenianie się komórek pęcherzykowych przed analizą FISH, należy przenieść oczyszczone pęcherzyki do roztworu 0,06% trypsyny, 1 mg/ml kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 1 mg/ml glukozy i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Komórki zrębu jajnika należy pobrać z zawiesiny komórek kory mózgowej za pomocą plastikowej pipety o długości 75 μm, zwracając szczególną uwagę, aby uniknąć zanieczyszczenia małymi pęcherzykami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza FISH poszczególnych komórek jajnika
	<ol>
		<li>Przenieść leczone pęcherzyki jajnikowe (zalecane n = 5-20) z trypsyną/EDTA/glukozą lub komórkami zrębu (n > 1 000) do kropelek po 5 μl 0,15 mM KCl/15 μL soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco na szkiełku i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Wysuszyć i wstępnie utrwalić szkiełka w 300 μl 0,05 mM KCl/7,5% kwasu octowego/22,5% metanolu przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT). Przykryj szkiełka metanolem/kwasem octowym (3:1) przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby sfinalizować utrwalanie.</li>
		<li>Przygotować 20x wzorcowy cytrynian sodu (SSC), dodając 876 g chlorku sodu i 441 g dwuwodnego cytrynianu trójsodowego w 5 l wody destylowanej. Następnie dodaj 100 ml 20x SSC do 900 ml wody zdemineralizowanej (demi), aby uzyskać 2x SSC. Przemyć próbkę w 2x SSC w temperaturze 73 °C, przykryć ją 100 μl 2% proteinazy K i uszczelnić szkiełkiem nakrywkowym. Inkubować szkiełka przez 10 minut w temperaturze 37 °C w stacji hybrydyzacji.</li>
		<li>Usunąć szkiełko nakrywkowe i myć szkiełka przez 5 minut w DPBS w temperaturze pokojowej. Utrwalać próbkę przez 5 minut za pomocą 1% formaldehydu w temperaturze pokojowej. Na tym etapie materiał nie jest jeszcze w pełni przymocowany do szkiełek i dlatego nie powinien być umieszczany na platformie wytrząsającej.</li>
		<li>Myj szkiełka przez 5 minut w DPBS w temperaturze pokojowej, a następnie odwadniaj kolejno 70%, 80%, 90% i 100% etanolu przez 2 minuty każde. Wysuszyć odwodnioną próbkę na powietrzu i zhybrydyzować ją za pomocą sond znakowanych fluorescencyjnie.</li>
		<li>Wybierz sondę specyficzną dla centromeru dla chromosomu X i inną sondę centromerową specyficzną dla chromosomu jako kontrolę, aby określić zawartość chromosomu X w komórkach jajnika. W tym przypadku stosuje się sondy specyficzne dla centromeru dla chromosomu X (X [DXZ1]) bezpośrednio znakowanego fluorochromem SpectrumGreen i chromosomu 18 (18 [D18Z1]) bezpośrednio znakowanego fluorochromem SpectrumOrange.</li>
		<li>Dodać 1 μl X, 1 μl 18 i 18 μl buforu hybrydyzacyjnego do próbki i uszczelnić szkiełkiem nakrywkowym, które jest przyklejone do szkiełek, aby zapobiec parowaniu sondy podczas hybrydyzacji. Przenieść szkiełka do stacji hybrydyzacji w celu denaturacji w temperaturze 73 °C przez 3 minuty, a następnie hybrydyzacji podczas całonocnej inkubacji w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Usuń szkiełko nakrywkowe i pozostały klej z szkiełka po hybrydyzacji. Myć szkiełka w 0,4x SSC/0,3% Tween-20 w temperaturze 72 °C przez 2 minuty, a następnie inkubować przez 1 minutę w 2x SSC/0,1% Tween-20 w RT.</li>
		<li>Odwodnić szkiełka przez kolejne 2-minutowe inkubacje w 70%, 80%, 90% i 100% etanolu i wysuszyć na powietrzu w ciemności. Przykryj szkiełka podłożem montażowym zawierającym 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI). Przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 10 minut przed analizą za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowania
	<ol>
		<li>Zbadaj sygnał(y) dla chromosomu X za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego połączonego z oprogramowaniem do przetwarzania obrazu.
		<ol>
			<li>Najpierw wybierz fluorochrom DAPI.
			<ol>
				<li>Uzyskaj obraz, wybierając opcję Nowa komórka > Live > Capture przy powiększeniu 630x. Pojawi się nowe okno z progiem. Ustaw niebieski pasek progu na 0, aby zminimalizować tło, a czerwony pasek na maksimum (255), aby sygnały były jaśniejsze. Kliknij Akceptuj.</li>
				<li>Pojawi się nowe okno z ulepszeniem z sugestią ciemniejszego/jaśniejszego (12), promienia (3) i głębi (1). Użyj sugerowanych wartości lub dostosuj je, jeśli nie są zadowolone.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Po drugie, wybierz fluorochrome SpectrumOrange i kliknij Przechwyć.
			<ol>
				<li>Ustaw niebieski pasek progu na 0, aby zminimalizować tło, a czerwony pasek na maksimum (255), aby sygnały były jaśniejsze. Kliknij Akceptuj.</li>
				<li>Pojawi się okno z ulepszeniem z sugestią ciemniejszego/jaśniejszego (-11), promienia (2.7) i głębi (0.6). Użyj sugerowanych wartości lub dostosuj je, jeśli nie są zadowolone.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Na koniec wybierz fluorochrome SpectrumGreen i kliknij Przechwyć.
			<ol>
				<li>Ustaw niebieski pasek progu na 0, aby zminimalizować tło, a czerwony pasek na maksimum (255), aby sygnały były jaśniejsze. Kliknij Akceptuj.</li>
				<li>Pojawi się okno z ulepszeniem z sugestią ciemniejszego/jaśniejszego (0), promienia (3) i głębi (0). Użyj sugerowanych wartości lub dostosuj je, jeśli nie są zadowolone. Zapisz obraz w nowo utworzonym pliku. 
				UWAGA: Komórki somatyczne oceniano tylko wtedy, gdy widoczne były dwa sygnały kontrolnego chromosomu 18. W większości oocytów można było wykryć tylko jeden sygnał dla każdego chromosomu.</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po analizie należy przechowywać szkiełka w ciemności w temperaturze 4 °C, aby zapobiec utracie sygnałów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. RYBA na skrawkach parafiny przeszczepionej tkanki kory jajnika
UWAGA: Jeden fragment kriokonserwowanej/rozmrożonej tkanki kory jajnika 18 samic z TS był ksenografowany myszom z ciężkim złożonym niedoborem odporności (SCID) przez 5 miesięcy. Procedura ksenoprzeszczepu została opisana wcześniej i została przeprowadzona na Université Catholique de Louvain (Bruksela, Belgia) zgodnie z lokalnymi wytycznymi Komitetu ds. Badań nad Zwierzętami dotyczącymi dobrostanu zwierząt (odniesienie 2014/UCL/MD/007)18,19.
<ol>
	<li>Selekcja wycinków ksenoprzeszczepowanej tkanki kory jajnika zawierającej pęcherzyki jajnikowe
	<ol>
		<li>Utrwalić ksenoprzeszczepioną tkankę kory jajnika w 4% formaldehydzie i zanurzyć tkankę w parafinie. Przytnij bloki skalpelem, aby usunąć nadmiar parafiny i przytnij blok parafiny do grubości 4 μm na mikrotomie rotacyjnym</li>.
		<li>Wybierz co siódmy odcinek wstęgi parafinowej do barwienia hematoksyną i eozyną (HE), aby określić, które odcinki zawierają mieszki włosowe. Umieścić wycinek w łaźni wodnej o temperaturze 40-45 °C i zamontować na szkiełkach mikroskopu immunohistochemicznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Deparafinizacja i barwienie HE
	<ol>
		<li>Umieść szkiełka na kuchence na 10 minut w temperaturze 60 °C, a następnie zanurz je w 100% ksylenie na 5 minut. Nie ma potrzeby umieszczania zjeżdżalni bezpośrednio na kuchence. Uwodnić sekcje przez 15 s w 100% etanolu, a następnie 2 x 15 s w 96% etanolu. Opłucz szkiełka w wodzie z kranu przez 2 minuty.</li>
		<li>Szkiełka należy barwić w hematoksylinie przez 10 minut, a następnie krótko spłukać szkiełka w wodzie z kranu. Na krótko zanurzyć szkiełka w roztworze wodorowęglanu (100 g siarczanu magnezu i 10 g wodorowęglanu sodu w 5 l wody destylowanej). Opłucz szkiełka w wodzie z kranu przez 5 minut.</li>
		<li>Przeciwbarwić szkiełka eozyną przez 4 minuty i trzykrotnie odwodnić szkiełka 100% etanolem, a następnie ksylenem. Nakryj szkiełko nakrywkowe plamy HE na szkiełkach i oceń skrawki HE pod mikroskopem świetlnym, aby wybrać skrawki z pęcherzykami (100-krotne powiększenie).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obróbka wstępna i hybrydyzacja skrawków parafiny dla DNA FISH
	<ol>
		<li>Wybierz nowe sekcje, które leżały przed lub po sekcji, która zawierała mieszki włosowe ze wstęgi parafiny. Zamontuj jedną sekcję na szklanym szkiełku. Suszyć skrawki parafiny przez co najmniej 45 minut na piecu w temperaturze 56 °C. Nie ma potrzeby umieszczania zjeżdżalni bezpośrednio na kuchence.</li>
		<li>Odparafinować skrawki w ksylenie przez 10 min. Zanurzyć szkiełka w 99,5% etanolu i płukać je przez 5 min w wodzie z kranu. Preparaty należy wstępnie potraktować roztworem do pobierania celu (niskie pH) przez 10 minut w temperaturze 96 °C. Po wystudzeniu szkiełka opłukać w wodzie destylowanej.</li>
		<li>Traktować szkiełka przez 5 minut 0,01 M kwasem solnym, a następnie wytrawiać pepsyną (200 U/ml) przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Ponownie płukać szkiełka w 0,01 M kwasie solnym, a następnie w PBS.</li>
		<li>Utrwal szkiełka w 1% formaldehydzie/PBS przez 5 minut. Krótko przepłucz szkiełka w PBS, a następnie ponownie w demi wodzie. Odwodnić szkiełka w 99,5% etanolu i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.</li>
		<li>Wybierz sondę specyficzną dla centromeru dla chromosomu X i inną sondę centromerową specyficzną dla chromosomu jako kontrolę, aby określić zawartość chromosomu X w komórkach ziarnistych. W tym przypadku chromosom 18 jest używany jako kontrola.</li>
		<li>Na wstępnie obrobione szkiełka nanieść 5 μl sondy 18 (D18Z1) bezpośrednio znakowanej fluorochromem SpectrumGreen i sondy X (DXZ1) bezpośrednio znakowanej fluorochromem SpectrumRed. Nałóż szkiełko nakrywkowe i uszczelnij obszar klejem fotograficznym. Umieścić szkiełka w hybrydyzatorze w celu denaturacji w temperaturze 80 °C przez 10 minut i hybrydyzacji przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Następnego dnia płukać szkiełka przez 5 minut w 2x SSC w temperaturze 42 °C, a następnie 2 minuty i 1 minutę płukać w 0,3% Nonidet P40 w temperaturze 73 °C. Odświeżyć 2x SSC i ponownie płukać szkiełka przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przykryj kuwetę tak, aby sekcje były trzymane w ciemności.</li>
		<li>Krótko opłukać szkiełka w wodzie destylowanej. Odwodnić szkiełka w 99,5% etanolu i pozostawić do ponownego wyschnięcia na powietrzu. Na koniec zamontuj prowadnice za pomocą roztworu zawierającego DAPI i medium montażowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowania
	<ol>
		<li>Przeanalizuj wyniki pod mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu 630x. Otwórz oprogramowanie do przetwarzania obrazu na komputerze. Wybierz FISH jako profil.</li>
		<li>Sprawdź, czy emisja DAPI jest ustawiona na 431 nm, a wzbudzenie na 359 nm, emisja Texas red na 613 nm i wzbudzenie na 595 nm, a emisja FITC na 519 nm i wzbudzenie na 495 nm.</li>
		<li>Uzyskaj obraz, wybierając opcję Live > Capture Single Image (Na żywo) Capture Single Image (Przechwyć pojedynczy obraz). Zoptymalizuj jakość obrazu, dostosowując ekspozycję i wzmocnienie, przesuwając suwak Ekspozycja i suwak Wzmocnienie w menu Obraz po lewej stronie (np. ekspozycja: 212 ms i wzmocnienie: 7,9). Wymagana ekspozycja i wzmocnienie mogą się różnić w zależności od obrazu; Obserwuj zmiany podczas tego procesu, aby uzyskać zoptymalizowany obraz. Zapisz obraz w nowo utworzonym pliku.</li>
		<li>Po analizie należy przechowywać szkiełka w ciemności w temperaturze 4 °C, aby zapobiec utracie sygnałów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Vander Borght, M., Wyns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertility+and+infertility%3A+Definition+and+epidemiology%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fertility and infertility: Definition and epidemiology.</a> Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).</li>
<li>Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+human+female+infertility%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Genetics of human female infertility.</a> Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).</li>
<li>Yahaya, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+abnormalities+predisposing+to+infertility%2C+testing%2C+and+management%3A+a+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+National+Research+Centre%22%5BJournal%5D)">Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review.</a> Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65(2021).</li>
<li>Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+appropriate+use+of+genetic+tests+in+infertile+couples%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples.</a> European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).</li>
<li>Heard, E., Turner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+the+sex+chromosomes+in+mammalian+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Function of the sex chromosomes in mammalian fertility.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675(2011).</li>
<li>Reynaud, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+of+ovarian+follicles+in+human+fetuses+with+the+45%2CX+karyotype%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype.</a> Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).</li>
<li>Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple+X+syndrome%3A+a+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Triple X syndrome: a review of the literature.</a> European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).</li>
<li>Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+germ+cell+apoptosis+in+sex+chromosome+aneuploid+fetal+human+gonads%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads.</a> Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).</li>
<li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+err+%28meiotically%29+is+human%3A+the+genesis+of+human+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li>
<li>Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29%3A+History%2C+limitations+and+what+to+expect+from+micro-scale+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Micro+and+Nano+Engineering%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH.</a> Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29%3A+an+increasingly+demanded+tool+for+biomarker+research+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine.</a> Biomarker Research. 2 (1), 3(2014).</li>
<li>Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescent+in+situ+hybridization+in+male+infertility%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Advances+in+Urology%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility.</a> Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).</li>
<li>Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+of+human+sperm%3A+diagnostics%2C+indications%2C+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications.</a> Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).</li>
<li>Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+aneuploidy+in+infertile+male+patients%3A+a+systematic+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature.</a> Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).</li>
<li>Schleedoorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TurnerFertility+trial%3A+PROTOCOL+for+an+observational+cohort+study+to+describe+the+efficacy+of+ovarian+tissue+cryopreservation+for+fertility+preservation+in+females+with+Turner+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Open%22%5BJournal%5D)">TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome.</a> BMJ Open. 9 (12), 030855(2019).</li>
<li>Peek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+follicles+of+young+patients+with+Turner%27s+syndrome+contain+normal+oocytes+but+monosomic+45%2CX+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Ovarian follicles of young patients with Turner's syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells.</a> Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).</li>
<li>Nadesapillai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+are+some+patients+with+45%2CX+Turner+syndrome+fertile%3F+A+young+girl+with+classical+45%2CX+Turner+syndrome+and+a+cryptic+mosaicism+in+the+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary.</a> Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).</li>
<li>Dolmans, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reimplantation+of+cryopreserved+ovarian+tissue+from+patients+with+acute+lymphoblastic+leukemia+is+potentially+unsafe%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe.</a> Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).</li>
<li>Dath, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+human+ovarian+tissue+to+nude+mice%3A+comparison+between+four+grafting+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites.</a> Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).</li>
<li>Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+tissue+damage+after+grafting%3A+systematic+review+of+strategies+to+improve+follicle+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes.</a> Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).</li>
<li>Bishop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+in+detecting+genetic+aberrations+of+medical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Horizons%22%5BJournal%5D)">Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance.</a> Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).</li>
<li>Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+consequences+of+asynapsis+for+mammalian+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The consequences of asynapsis for mammalian meiosis.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Analiza FISH jest dobrze znaną techniką wykrywania aberracji chromosomowych X w limfocytach lub komórkach policzkowych zarówno mężczyzn, jak i samic10. W kilku badaniach opisano FISH na gametach samców z aberracjami chromosomowymi X, ale nadal brakuje szczegółowych informacji uzyskanych przez FISH na komórkach jajnika od samic z aberracjami chromosomu X14. W artykule przedstawiono nowatorskie metody oparte na FISH w celu określenia, czy aneuploidia jest obecna w komórkach j...

Niepłodność to problem zdrowotny męskiego lub żeńskiego układu rozrodczego, dotykający około 186 milionów osób w wieku rozrodczym na całym świecie1. U co najmniej 35% niepłodnych par niepłodność jest spowodowana zaburzeniem żeńskiego układu rozrodczego2. Istnieje wiele czynników, które mogą powodować niepłodność kobiet, takich jak czynniki genetyczne, nieprawidłowości dróg rodnych, zaburzenia endokrynologiczne, choroby zapalne i leczenie jatrogenne3.
Nieprawidłowości genetyczne występują u około 10% niepłodnych kobiet4,5. Spośród wszystkich nieprawidłowości genetycznych, aberracje chromosomu X są najczęstszą przyczyną dysgenezji jajników2. Kilka badań wykazało, że aberracje chromosomowe X u kobiet z zespołem Turnera (TS) lub zespołem potrójnego chromosomu X są związane z przedwczesną niewydolnością jajników z powodu przyspieszonej utraty komórek rozrodczych lub upośledzonej oogenezy6,7,8.
Aberracje chromosomu X można podzielić na: 1) aberracje numeryczne, w których liczba chromosomów X jest inna, ale chromosomy X są nienaruszone; oraz 2) aberracje strukturalne, w których chromosom X zyskał lub utracił materiał genetyczny3,9. Aberracje numeryczne chromosomu X występują częściej niż nieprawidłowości strukturalne i często są spowodowane spontanicznymi błędami podczas podziału komórki3,9. Kiedy taki błąd występuje podczas mejozy, może prowadzić do aneuploidalnych gamet, a ostatecznie do potomstwa z aberracjami chromosomowymi we wszystkich komórkach. Gdy w komórkach somatycznych powstają defekty chromosomowe w wyniku błędów zachodzących podczas mitozy we wczesnych stadiach ontogenezy, może to prowadzić do mozaicyzmu. U tych osób obecne są zarówno komórki z normalną zawartością chromosomu X, jak i komórki z aberracjami chromosomowymi X.
W latach osiemdziesiątych XX wieku opracowano technikę cytogenetyczną zwaną fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) do wizualizacji i lokalizacji określonych sekwencji kwasów nukleinowych na chromosomach metafazowych i międzyfazowych10,11. Technika ta wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie sondy DNA do wiązania się z określoną sekwencją w chromosomie, którą można następnie uwidocznić za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
Obecnie FISH jest powszechnie stosowany jako kliniczne narzędzie diagnostyczne i jest uważany za złoty standard w wykrywaniu aberracji chromosomowych10. W dziedzinie medycyny reprodukcyjnej analiza FISH na nasieniu została wykorzystana do uzyskania wglądu w zawartość chromosomu X w plemnikach u mężczyzn z numerycznymi lub strukturalnymi aberracjami chromosomowymi w komórkach somatycznych12,13,14. Badania te wykazały, że mężczyźni z aberracjami chromosomowymi byli bardziej narażeni na większą częstość występowania plemników aneuploidalnych w ich nasieniu w porównaniu z samcami z prawidłowymi kariotypami12,13,14.
W przeciwieństwie do plemników, bardzo mało wiadomo o zawartości chromosomu X w komórkach jajnika (w tym oocytach, komórkach ziarnistych/osłonki i komórkach zrębu) u osób z aberracją chromosomalną, a także o możliwych konsekwencjach aneuploidii tych komórek dla ich potencjału reprodukcyjnego. Ważnym powodem skąpych informacji na temat kariotypu komórek jajnika w porównaniu z plemnikami jest fakt, że kobiety muszą poddać się inwazyjnemu zabiegowi, takiemu jak nakłucie pęcherzyka lub operacja w celu uzyskania komórek jajowych lub tkanki kory jajnikowej. Gamety żeńskie są zatem trudne do pozyskania do celów badawczych.
Obecnie w Holandii przeprowadzane jest obserwacyjne badanie interwencyjne mające na celu zbadanie skuteczności kriokonserwacji tkanki jajnikowej u młodych kobiet z TS15. Jeden fragment tkanki kory jajnikowej pacjentki był dostępny w celu zidentyfikowania zawartości chromosomu X w komórkach jajnika16,17. W ramach badania opracowano nowatorską metodę opartą na FISH zdysocjowanej tkance kory jajnikowej w celu określenia, czy aberracje chromosomowe występują w komórkach jajnika u kobiet z aberracją chromosomową w niejajnikowych komórkach somatycznych, takich jak limfocyty lub komórki policzkowe. Ponadto określono również wpływ aneuploidii w komórkach jajnika na folikulogenezę. W tym celu zmodyfikowano ustalony protokół FISH, który umożliwia analizę histologicznych odcinków tkanki kory jajnika po sztucznie wywołanej folikulogenezie podczas długotrwałej ksenotransplantacji u myszy z obniżoną odpornością. W niniejszej pracy przedstawiono dwie metody oparte na FISH do określenia zawartości chromosomu X w komórkach jajnika w nieprzeszczepionej i przeszczepionej tkance kory jajnika u kobiet z aberracjami chromosomowymi X, w celu poprawy podstaw nauki na ten temat.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy</td><td>Biosolve BV</td><td>0001070602BS</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 1200</td><td>Hettich Universal</td><td>4140</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza I</td><td>Sigma</td><td>131470</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>0631-0146</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Vector</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BE17-513Q</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>108421</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Y</td><td>Sigma</td><td>1159350100</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>EMSURE</td><td>1009832500</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Technologia Life</td><td>10100147</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny do sekcji DM4 B</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny A1</td><td>Zeiss AXIO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sondy fluorescencyjne znakowane fluorescencyjnie do komórek zdysocjowanych</td><td>Abbott Diagnostics</td><td>CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818</td><td></td></tr><tr><td>Sondy znakowane fluorescencyjnie do wycinków tkanek</td><td>Abbott Diagnostics</td><td>X (DXZ1 05J08-023 18 (D18Z1)&nbsp; 05J10-028</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Glue</td><td>Merck</td><td>108337</td><td></td></tr><tr><td>Glue (Fixogum)</td><td>Leica Microsystems</td><td>LK071A</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma</td><td>1159380025</td><td></td></tr><tr><td>Bufor hybrydyzacyjny</td><td>Abott Diagnostics</td><td>32-804826/06J67-001</td><td></td></tr><tr><td>Stacja hybrydyzacji&nbsp;</td><td>Dako</td><td>S2451</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Merck</td><td>1003171000</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazów pojedyncze komórki kory jajnika (Cytovision 7.7)</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazów na przekrojach paraffinekowych&nbsp;</td><td>Leica Application Suitex (3.7.5.24914)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Preparaty mikroskopowe immunohitochemiczne</td><td>Dako</td><td>K802021-2</td><td></td></tr><tr><td>L15</td><td>Lonza</td><td>12-700Q</td><td></td></tr><tr><td>Liberase DH</td><td>Roche</td><td>05 401 151 001</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Zeiss West Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Merck</td><td>A335586</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Honeywell</td><td>14262-1L</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe</td><td>Vectashield, Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Sigma</td><td>7385-1L</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Poth Hile</td><td>2712.20.10</td><td></td></tr><tr><td>Pepsyna</td><td>Sigma</td><td>P7000-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco</td><td>11530546</td><td></td></tr><tr><td>Plastic pipeta</td><td>CooperSurgical</td><td>7-72-4075/1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1049361000</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom rotacyjny HM 355S</td><td>Skalpel termoizolacyjny</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dahlhausen</td><td>11.000.00.515</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko do RYB na komórkach zdysocjowanych</td><td>Thermo scientific</td><td>J1810AM1JZ</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>55761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Standardowy cytrynian sodu (SSC)</td><td>Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>10515203</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop IX 70</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do odzyskiwania celu &nbsp; &nbsp;</td><td>Dako</td><td>GV80511-2</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>ThermoFisher</td><td>85113</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>BOOM 760518191000</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

badanie aberracji chromosomowych x w komórkach jajnika za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization

Miliony ludzi na całym świecie borykają się z problemami dotyczącymi płodności. Zmniejszona płodność, a nawet niepłodność, może wynikać z wielu różnych przyczyn, w tym z zaburzeń genetycznych, z których najczęściej występują nieprawidłowości chromosomalne. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) jest dobrze znaną i często stosowaną metodą wykrywania aberracji chromosomowych u ludzi. FISH jest stosowany głównie do analizy nieprawidłowości chromosomalnych w plemnikach samców z numerycznymi lub strukturalnymi aberracjami chromosomowymi. Co więcej, technika ta jest również często stosowana u kobiet w celu wykrycia aberracji chromosomowych X, o których wiadomo, że powodują dysgenezję jajników. Nadal jednak brakuje informacji na temat zawartości chromosomu X w komórkach jajnika pochodzących od kobiet z aberracjami chromosomowymi X w limfocytach i/lub komórkach policzkowych.
Celem tego badania jest postęp w podstawowych badaniach dotyczących aberracji chromosomu X u kobiet, poprzez przedstawienie dwóch metod opartych na FISH do identyfikacji zawartości chromosomu X w komórkach jajnika. Po pierwsze, opisano metodę oznaczania zawartości chromosomu X w izolowanych komórkach jajnika (oocytach, komórkach ziarnistych i komórkach zrębu) w nieprzeszczepionej tkance kory jajnika od kobiet z aberracjami chromosomowymi X. Druga metoda ma na celu ocenę wpływu aberracji chromosomowych na folikulogenezę poprzez określenie zawartości chromosomu X w komórkach jajnika nowo powstałych pęcherzyków wtórnych i antralnych w tkance jajnikowej od samic z aberracjami chromosomu X po długotrwałym przeszczepieniu myszom z obniżoną odpornością. Obie metody mogą być pomocne w przyszłych badaniach mających na celu uzyskanie wglądu w potencjał reprodukcyjny samic z aberracjami chromosomu X.

FISH w wyizolowanych komórkach jajnika przed przeszczepieniem 
Kriokonserwowana tkanka kory jajnika od kobiet z TS o kariotypie 45,X/46,XX (pacjentka A) lub 45,X/46,XX/47,XXX (pacjentka B) została wykorzystana do zilustrowania wyników uzyskanych przy użyciu tego protokołu. U pacjentki A 50% limfocytów miało kariotyp 45,X, a 50% 46,XX. U pacjentki B 38% limfocytów było 45,X, 28% 46,XX, a 34% 47,XXX. Sonda specyficzna dla centromeru chromosomu X (zielona) oraz chromosomu 18 jako kontroli (czerwona) zost...

Ten artykuł przedstawia dwie metody oparte na fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu określenia zawartości chromosomu X komórek jajnika w nieprzeszczepionej i przeszczepionej tkance kory jajnika od kobiet z aberracjami chromosomu X.

Badanie aberracji chromosomowych X w komórkach jajnika za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Millions of people worldwide deal with issues concerning fertility. Reduced fertility, or even infertility, may be due to many different causes, including ...

Analiza FISH komórek jajnikowych od kobiet z aberracjami chromosomowymi X jest unikalną techniką pozwalającą uzyskać wgląd w zawartość chromosomu X w komórkach jajnika w tej konkretnej grupie. Techniki te mogą być pomocne, aby dowiedzieć się więcej o potencjale rozrodczym u kobiet z aberracjami chromosomu X. Należy wspomnieć, że obie metody mają na celu ułatwienie przyszłych badań i nie są przeznaczone do stosowania jako narzędzie diagnostyczne w praktyce klinicznej.Procedurę zademonstrują Ronald Peek, starszy badacz z naszego laboratorium płodności, oraz Milad Intezar, analityk z naszego wydziału patologii. Na początek pokrój kriokonserwowaną lub rozmrożoną tkankę kory jajnika na małe kawałki jeden po drugim milimetr za pomocą skalpela. Enzymatycznie trawić fragmenty tkanek w czterech litrach wstępnie podgrzanego L15 przez 75 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Pipetować mieszaninę wytrawiania w górę i w dół co 15 minut. Zatrzymaj trawienie enzymatyczne, dodając cztery mililitry zimnego L15 uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą lub FBS. Przemyć zdysocjowaną tkankę raz ośmioma mililitrami zimnej pożywki L15 przez odwirowanie przy 500 g, a następnie ponownie zawiesić w 500 mikrolitrach pożywki L15.Przenieś zawiesinę komórkową zawierającą głównie pojedyncze komórki zrębu i małe pęcherzyki na plastikową szalkę Petriego i zbadaj zawiesinę pod mikroskopem stereoskopowym. Mieszki włosowe o wielkości mniejszej niż 50 mikrometrów należy pobrać ręcznie za pomocą plastikowej pipety o długości 75 mikrometrów i przenieść je do kropelki pożywki L15 uzupełnionej 10% FBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przenieś oczyszczone mieszki włosowe do roztworu 0,06% trypsyny, jednego miligrama na mililitr EDTA i jednego miligrama na mililitr glukozy i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po inkubacji uzyskaj komórki zrębu jajników z zawiesiny komórek kory mózgowej za pomocą plastikowej pipety o długości 75 mikrometrów. W przypadku fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ lub analizy FISH pojedynczych komórek jajnika, przenieś leczone pęcherzyki jajnikowe z trypsyną / EDTA / glukozą lub komórkami zrębu do kropelek pięciu mikrolitrów 0,15 milimolowego chlorku potasu i 15 mikrolitrów DPBS na szkiełku i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wysuszyć i wstępnie utrwalić szkiełko w 300 mikrolitrach 0,05 milimolowego chlorku potasu, 7,5% kwasu octowego i 22,5% metanolu przez dwie minuty.Przykryj szkiełko metanolem octowym w proporcji trzy do jednego na dwie minuty, aby sfinalizować utrwalanie. Po utrwaleniu przemyć próbkę dwukrotnie w świeżo przygotowanym SSC w temperaturze 73 stopni Celsjusza. Przykryj go 100 mikrolitrami 2% Proteinazy K i zamknij szkiełkiem nakrywkowym.Inkubować szkiełko przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w stacji hybrydyzacyjnej. Po inkubacji zdjąć szkiełko nakrywkowe i myć szkiełko przez pięć minut w DPBS w temperaturze pokojowej i wstrząsając. Utrwal próbkę na pięć minut za pomocą 1% formaldehydu.Następnie umyj szkiełko w DPBS i seryjnie odwadniaj je w zwiększaniu stężenia etanolu przez dwie minuty każde. Wysuszyć próbkę na powietrzu przed hybrydyzacją za pomocą sond znakowanych fluorescencyjnie. Następnie dodać jeden mikrolitr CEPX, jeden mikrolitr CEP18 i 18 mikrolitrów buforu hybrydyzacyjnego do próbki i uszczelnić szkiełkiem nakrywkowym, które jest przyklejone do szkiełka.Przenieś szkiełko do stacji hybrydyzacji w celu denaturacji w temperaturze 73 stopni Celsjusza przez trzy minuty, a następnie hybrydyzacji podczas nocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po hybrydyzacji usuń szkiełko nakrywkowe i pozostały klej z szkiełka. Myj szkiełko w 0,4X SSC, 0,3% Tween-20 w temperaturze 72 stopni Celsjusza przez dwie minuty, a następnie inkubuj przez minutę w 2X SSC i 0,1% Tween-20.Odwodnić szkiełko w sposób pokazany i wysuszyć je na powietrzu w ciemności przed przykryciem go podłożem montażowym zawierającym DAPI. Umieść szkiełko w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na 10 minut przed analizą za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Aby zhybrydyzować skrawki parafiny, należy wybrać nowe sekcje przed lub po sekcji zawierającej mieszki włosowe ze wstęgi parafinowej.Zamontuj jedną sekcję na szkiełku podstawowym i susz ją przez 45 minut na kuchence w temperaturze 56 stopni Celsjusza. Odparafinować sekcję w ksylenie przez 10 minut, następnie zanurzyć szkiełko w 99,5% etanolu i płukać przez pięć minut w wodzie z kranu. Preparat należy wstępnie potraktować roztworem do pobierania celu przez 10 minut w temperaturze 96 stopni Celsjusza.Po wystudzeniu opłucz szkiełko w wodzie destylowanej. Traktować szkiełko przez pięć minut 0,01 molowym kwasem solnym, a następnie wytrawiać pepsynę przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ponownie przepłukać szkiełko w kwasie solnym, a następnie w PBS.Zamocuj szkiełko w 1% formaldehydzie PBS na pięć minut. Następnie krótko przepłucz szkiełko w PBS i ponownie w wodzie demineralizowanej przed odwodnieniem w 99,5% etanolu. Nałóż pięć mikrolitrów sondy CEP18 i CEPX na wstępnie poddane obróbce szkiełko.Następnie nałóż szkiełko nakrywkowe i uszczelnij obszar klejem fotograficznym. Umieść szkiełko w hybrydyzatorze w celu denaturacji w temperaturze 80 stopni Celsjusza na 10 minut i hybrydyzacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia przepłukać szkiełko dwa razy przez pięć minut w SSC w temperaturze 42 stopni Celsjusza, a następnie dwie minuty i jedną minutę płukać w 0,3% Nonidet P-40 w temperaturze 73 stopni Celsjusza.Ponownie przepłucz szkiełko w 2X SSC, a następnie spłucz w wodzie destylowanej przed odwodnieniem 99,5% etanolem. Wysuszyć szkiełko na powietrzu i zamontować go w medium montażowym zawierającym DAPI. Kriokonserwowana tkanka kory jajnika u pacjenta A wykazała 50% limfocytów, miał 45, kariotyp X, a 50% miało 46, XX.In Pacjentka B, 38% limfocytów miało 45, X, 28% miało 46, XX i 34% miało 47, XXX.Otaczające komórki zrębu analizowano również pod kątem zawartości chromosomu X. Trawienie enzymatyczne tkanki kory jajnika spowodowało zawieszenie w dużej mierze zdysocjowanych komórek, ale pozostawiając pierwotne pęcherzyki, składające się z nienaruszonego oocytu otoczonego pojedynczą warstwą komórek ziarnistości. Małe pęcherzyki powodowały trudności w interpretacji sygnałów po FISH, ze względu na zlepianie się komórek ziarnistiny.Dodatkowe trawienie pęcherzyków z trypsyną przed FISH spowodowało skurczenie się poszczególnych komórek ziarnistości do kulistej morfologii na powierzchni pęcherzyków. Barwienie eozyną hematoksyliny wykazało morfologicznie prawidłowe pęcherzyki wtórne i antralne w tkance kory jajnika po pięciu miesiącach ksenoprzeszczepu. Zawartość chromosomu X w komórkach ziarnistości tych pęcherzyków oznaczono za pomocą analizy FISH.Utrwalenie przeszczepionej tkanki kory jajnika w roztworze Bouina spowodowało rozmycie i w dużej mierze zasłonięte sygnały fluorescencyjne w komórkach pęcherzykowych z powodu zielonej mgiełki. Natomiast tkanka kory jajnikowej utrwalona w formaldehydzie dostarczała doskonałych sygnałów fluorescencyjnych. Głównym wyzwaniem tego protokołu jest izolacja komórek jajnika i enzymatyczne trawienie tkanki.Odstępstwo od tego protokołu może spowodować znaczną utratę komórek jajnikowych podczas tego procesu, a tego należy szczególnie unikać u kobiet, które mają już niską rezerwę jajnikową. Dodatkowe profilowanie ekspresji genów może być pomocne, aby dowiedzieć się więcej o wpływie aneuploidalnych komórek jajnika na folikulogenezę, a tym samym proces przedwczesnej niewydolności jajników u kobiet z aberracjami chromosomu X.

exploring-x-chromosomal-aberrations-ovarian-cells-using-fluorescence

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Niniejszy artykuł wideo przedstawia krok po kroku sposób przetwarzania próbki nasienia w celu uzyskania wysokiej jakości hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ na ludzkich plemnikach. Otrzymane preparaty mogą być wykorzystywane do przesiewowego badania aneuploidii w ramach diagnostyki klinicznej.<br...

Protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w ludzkich plemnikach

Opisano nowatorską metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), która pozwala na jednoczesne badanie zmian numerycznych i strukturalnych chromosomów, w szczególności specyficznych translokacji chromosomowych związanych z białaczką i chłoniakiem, dla wszystkich 24 ludzkich chromosomów na jednym urządzeniu w ramach jednej hybrydyzacji.

Chromosomika: jednoczesne wykrywanie aberracji numerycznych i strukturalnych we wszystkich 24 chromosomach ludzkich z wykorzystaniem nowej metody FISH OctoChrome

Opisana jest ilościowa metoda analizy czasu replikacji chromosomów. Metoda wykorzystuje inkorporację BrdU w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu oceny czasu replikacji chromosomów ssaków. Technika ta pozwala na bezpośrednie porównanie przegrupowanych i nieprzegrupowanych chromosomów w tej samej komórce.

Czas replikacji chromosomów w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) pozwala na wykrywanie kwasów nukleinowych w ich naturalnym środowisku w komórkach. Opisujemy tutaj protokół połączonego, jednoczesnego wykrywania RNA i DNA za pomocą FISH, który może być wykorzystany do badania inaktywacji chromosomu X w embrionalnych komórkach macierzystych myszy.

Połączona fluorescencyjna hybrydyzacja in situ DNA-RNA (FISH) w celu zbadania inaktywacji chromosomu X w zróżnicowanych żeńskich embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Opracowaliśmy łatwo dostosowany protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w połączeniu z immunofluorescencją. Pozwala to na szczegółowe badanie dynamiki RNA z jednoczesnym wglądem w strukturę chromatyny, organizację jądra i regulację transkrypcji na poziomie pojedynczej komórki.

Protokół szybkiej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ dla Xist RNA w połączeniu z immunofluorescencją modyfikacji histonów w inaktywacji chromosomu X

Niniejszy protokół opisuje przydatność wielokrotnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (mFISH) i kariotypowania spektralnego (SKY) w identyfikacji stabilnych międzychromosomowych aberracji w komórkach szpiku kostnego myszy po ekspozycji na promieniowanie całego ciała.

Wykrywanie stabilnych aberracji międzychromosomowych za pomocą wielokrotnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (mFISH) i kariotypowania spektralnego (SKY) u napromieniowanych myszy

Ten manuskrypt przedstawia szczegółową metodę generowania sond ramienia chromosomu X i przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu zbadania stanu kohezji chromatydy siostrzanej w oocytach Drosophila zatrzymanych w prometafazie i metafazie I. Protokół ten jest odpowiedni do określenia, czy spójność ramienia mejotycznego jest nienaruszona, czy zakłócona w różnych genotypach.

Wykorzystanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do monitorowania stanu kohezji ramienia w oocytach prometafazy i metafazy I drosophila

Tutaj prezentujemy protokół poprawy skuteczności wykrywania hybrydyzacji fluorescencji międzyfazowej in situ na rozmazach szpiku kostnego od pacjentów ze szpiczakiem mnogim.

Fluorescencja międzyfazowa in situ Hybrydyzacja rozmazów szpiku kostnego szpiczaka mnogiego

Tutaj opisujemy metodę opartą na immunofluorescencji, która pozwala na ilościowe określenie poziomów jednoniciowego DNA w komórkach. Ta skuteczna i powtarzalna metoda może być wykorzystana do badania stresu replikacyjnego, powszechnej cechy w kilku nowotworach jajnika. Dodatkowo test ten jest kompatybilny z automatycznym potokiem analizy, co dodatkowo zwiększa jego wydajność.

Kwantyfikacja stresu replikacyjnego w komórkach raka jajnika za pomocą immunofluorescencji jednoniciowego DNA

Oogeneza Drosophila nadal jest wyjątkowo przydatna w badaniach nad proliferacją i dziedziczeniem mitochondriów. Manuskrypt ten opisuje szczegółowy protokół używany do oznaczania replikującego się mitochondrialnego DNA (mtDNA) w dorosłych jajnikach Drosophila za pomocą 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU), co ułatwia odkrycie mechanizmów związanych z dziedziczeniem mitochondriów, które wcześniej były dyskusyjne.

In Situ Znakowanie replikacji mitochondrialnego DNA w dorosłych jajnikach Drosophila za pomocą barwienia EdU

Poznaj metody FISH do analizy zawartości chromosomu X w komórkach jajnika u samic z aberracjami chromosomowymi. Techniki te ułatwiają badania nad potencjałem reprodukcyjnym w tej grupie pacjentek.

Badanie aberracji chromosomowych X w komórkach jajnika za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Przeglądaj więcej filmów