In Situ Hybrydyzacja w celu precyzyjnej lokalizacji transkryptów w roślinach

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja wzorców ekspresji mRNA na poziomie komórkowym z wysoką czułością i swoistością. Osiąga się to poprzez najpierw przeprowadzenie formalnych i utrwalonych oraz zatopionych w parafinie skrawków tkanek przez szereg roztworów w celu usunięcia wosku, przeniknięcia tkanek i zablokowania dodatnio naładowanych mniejszych grup w tkankach, które mogą dawać sygnał tła. Następnie sondy RNA znakowane DIG specyficzne dla genu będącego przedmiotem zainteresowania są infiltrowane do skrawków tkanki, a szkiełka są hybrydyzowane w ciągu nocy.

Następnie szkiełka są traktowane RNA. A w celu usunięcia niespecyficznie związanej sondy z sekcji, a następnie inkubowanej z przeciwciałem anty DIG. Pozwala to na wizualizację zhybrydyzowanej sondy za pomocą reakcji chemicznej o wskaźniku koloru.

Wyniki pokazują ciemnoniebieski sygnał wykrywalny przez mikroskopię świetlną, szczególnie w tych komórkach w tkance, w których wyrażany jest interesujący gen. Główną zaletą tej techniki naszej innej analizy ekspresji, takiej jak R-T-P-C-R, mikroray lub sekwencjonowanie nowej generacji, jest to, że pokazany tutaj protokół hybrydyzacji I ujawnia wzorzec ekspresji interesującego genu w jego kontekście tkankowym. Metody te obejmują wiele kroków, których najlepiej nauczyć się poprzez demonstracje wizualne.

Pokażemy, jak ciąć i osadzać tkankę, a także kluczowe kroki w protokole Al Hybridization pro, które są trudne do opanowania na własną rękę. Metoda osadzania tkanek utrwalonych paraldehydem będzie się różnić w zależności od rodzaju tkanki, która ma być analizowana. Najważniejszą kwestią jest tutaj upewnienie się, że próbki są prawidłowo zorientowane do późniejszego cięcia.

Jedną z metod zatapiania jest użycie plastikowych form i pierścieni. Aby rozpocząć tę procedurę, rozgrzej foremki na płycie grzewczej o temperaturze 60 stopni Celsjusza, a następnie wlej do nich stopioną parafinę. Następnie za pomocą rozgrzanych kleszczyków przenieś próbkę tkanki do każdej formy i ustaw ją w żądanej pozycji.

Ostrożnie przenieś formę z talerza na ławkę i umieść biały pierścień na formie. Dodaj więcej mola i wosku. Pozwól woskowi ostygnąć i stopniowo stwardnieć przed podziałem.

Podgrzej bloki do temperatury pokojowej, a następnie przytnij każdy blok do kształtu trapezu, pozostawiając około jednego milimetra wosku wokół próbki. Umieść przycięty blok na mikrotomie tak, aby dłuższa z dwóch równoległych ścian znajdowała się na dole. Ostrożnie przesuń klocek do przodu do ostrza i upewnij się, że powierzchnia bloku jest równoległa do sekcji ostrza.

O grubości od ośmiu do 10 mikronów. Dopasuj wstążki woskowe do nieprzywierającej powierzchni, takiej jak folia aluminiowa, i wybierz interesujące Cię sekcje pod zakresem sekcji. Następnie zaznacz ołówkiem slajdy prob bon plus.

Nie używaj pisaków na markerach, ponieważ zostaną one usunięte podczas protokołu hybrydyzacji INI two. Rozprowadź jeden mililitr czystej wody milli Q na każdym szkiełku. Ostrożnie unosić interesujące Cię sekcje na powierzchni wody w temperaturze pokojowej.

Upewnij się, że błyszcząca strona jest skierowana w stronę wody. Powoli przenieś szkiełko na podgrzewacz do slajdów. Ustaw na 35 do 37 stopni Celsjusza.

Ten zakres temperatur, w przeciwieństwie do powszechnie stosowanych 42 stopni Celsjusza, zapobiega tworzeniu się pęcherzyków pod sekcjami. Po pięciu minutach ostrożnie wylej wodę, ale jednym płynnym ruchem, tak aby wstążka została opuszczona na zjeżdżalnię. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na co najmniej kilka godzin lub na noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby tkanka przylegała do przygotowanych skrawków tkanki.

W przypadku hybrydyzacji in situ są one najpierw depa i ponownie uwodnione w celu finalizacji depa. Inkubować szkiełka w dwóch zmianach w postaci klarownego roztworu przez 10 minut każda. Aby nawodnić skrawki tkanki, przepuszczaj szkiełka przez serię zmniejszających się stężeń etanolu przez 30 sekund każda.

Podczas leczenia proteazą, które nie jest pokazane na tym filmie, przygotuj szklane naczynie z 0,1 molowym roztworem aminy triathlonowej i ustaw je na talerzu mieszającym w dygestorium. Bezpośrednio przed umieszczeniem metalowego stojaka na szkiełka w roztworze dodaj 1,25 mililitra bezwodnika octowego do aminy triathlonowej, bufora i klatki schodowej. Ponadto należy ustawić system mocowania i stojak do trzymania stojaka na prowadnice.

Zmniejsz prędkość Starr clamp stojak przesuwny na stojaku i opuść stojak do roztworu, trzymając go uniesiony nad prętem mieszającym. Kontynuuj powolne mieszanie przez 10 minut po wypłukaniu w PBS i ponownym odwodnieniu za pomocą serii etanolu. Wycinki tkanek są gotowe do hybrydyzacji.

Umieść szkiełka na czystej powierzchni i pozostaw do całkowitego wyschnięcia na powietrzu przez pięć do 10 minut. Przygotować mieszaninę buforu hybrydyzacyjnego sondy, dodając zdenaturowaną sondę do 80 mikrolitrów buforu hybrydyzacyjnego. Dla każdego szkiełka dobrze wymieszaj, pipetując plus, unikając tworzenia pęcherzyków.

Odpipetować bufor hybrydyzacyjny sondy. Wymieszaj na prawej krawędzi szkiełka. Stopniowo opuszczaj szkiełko nakrywkowe na szkiełko, upewniając się, że roztwór hybrydyzacyjny pokrywa wszystkie sekcje bez pęcherzyków.

Delikatnie postukaj palcem w nożyce do okładki w miejscu, w którym tworzą się bąbelki, aby przemieścić je ze wszystkich odcinków tkanki. Nie odrywaj noża do pokrywy, ponieważ spowoduje to uszkodzenie sekcji. Umieść szkiełka w komorze wilgotnościowej zawierającej papier watman zwilżony wodą UE i w dużej mierze pokryty paramem.

Zamknij pudełko, szczelnie inkubuj szkiełka w żądanej temperaturze hybrydyzacji, zwykle od 50 do 55 stopni Celsjusza przez 16 do 20 godzin. Po zakończeniu protokołu hybrydyzacji ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe ze szkiełek. Szkiełko nakrywkowe może po prostu spaść, gdy prowadnica jest ustawiona pionowo, ale jeśli nie, nie zdejmuj szkiełka nakrywkowego, ponieważ spowoduje to uszkodzenie sekcji.

Zamiast tego zanurz szkiełko w ciepłym 0,2 razy SSC na jedną lub dwie minuty, aby zmyć szkiełko nakrywkowe po zdjęciu szkiełek nakrywkowych, umieść szkiełka w stojaku i umyj kilka razy w 0,2 razy SSC w temperaturze 55 stopni Celsjusza. Po zabiegu RNA przenieś szkiełka ze stojaka na dno płaskiego plastikowego pudełka i przykryj minimalną objętością roztworu blokującego. Zablokuj szkiełka na 45 minut w temperaturze pokojowej na powoli trzęsącej się platformie.

Następnie nanieść minimalną objętość roztworu przeciwciał bezpośrednio na każde szkiełko. Inkubuj szkiełka w ciemności przez dwie do trzech godzin w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji przenieść szkiełka do czystego, płaskiego pudełka i umyć je czterokrotnie minimalną objętością buforu myjącego na platformie do wytrząsania w temperaturze pokojowej.

Opłucz szkiełka raz w TBS i dwa razy w ofercie buforowej TN, aby nałożyć świeżo przygotowany roztwór barwiący na szkiełka. Najpierw wlej roztwór barwiący do małego plastikowego naczynia do ważenia. Następnie ułóż dwie prowadnice razem z sekcjami skierowanymi do siebie.

Zanurz kanapkę w roztworze, pozwalając, aby działanie kapilarne podciągnęło roztwór. Odcedź szkiełka na chusteczce kim. Napełnij szkiełka roztworem barwiącym.

Ponownie, może być konieczne stukanie w szkiełka, gdy roztwór napływa, aby uniknąć pęcherzyków, umieść szkiełka w plastikowym pudełku i przechowuj w temperaturze pokojowej w ciemności. Reprezentatywne wyniki uzyskane za pomocą różnych sond i tkanek Arabidopsy przedstawiono tutaj. Fioletowy sygnał zapewnia bezpośrednią wizualizację w rozdzielczości komórkowej wzorca ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania.

Panel A pokazuje lokalizację transkryptów pędu one w wierzchołku pędu wegetatywnego. Zwróć uwagę na obecność fioletowo-niebieskiego sygnału w nieokreślonym merystemie i brak sygnału w otaczających liściach. Panele B 2D to skrawki zarodków w stadium torpedy Arabidopsi, gdzie B wykazuje ekspresję covata three w kilku embrionalnych komórkach macierzystych.

C wykazuje ekspresję T ML jednej w warstwie naskórka, a D wykazuje brak sygnału w odcinkach badanych losowym RNA kontroli negatywnej. Kolejne obrazy pokazały wyniki uzyskane za pomocą różnych sond na tkankach labiryntu. Panel E pokazuje lokalizację węzła węzełkowego STM Humalog w rozwijającym się zarodku labiryntu.

Należy zwrócić uwagę na silny sygnał specyficzny dla embrionalnych odcinków podłużnych łodygi i korzenia mes przez wierzchołek zsypu wegetatywnego, który pokazuje, że ARF trzy A jest wyrażony na osiowej dolnej powierzchni liścia w panelu F, a A T ML jeden homolog OCL cztery jest wyrażony specyficznie w naskórku. W oczekiwanym panelu G.As nie zaobserwowano sygnału hybrydyzacji dla sondy kontroli ujemnej w panelu H. Oczekiwane wyniki różnych punktów kontrolnych podczas transkrypcji sond in vitro przedstawiono tutaj. Sondy do hybrydyzacji in situ są sprawdzane na standardowym żelu ARAZ po transkrypcji in vitro po obróbce DNA i późniejszym oczyszczeniu reakcji transkrypcji in vitro Po hydrolizie węglanów i gdy są gotowe do użycia dla sond o długości ponad 250 par zasad, takich jak sonda pierwsza, hydroliza węglanowa da szereg mniejszych fragmentów sondy.

Rysunek ten przedstawia wyniki kwalifikacji kolorystycznej i metrycznej sond za pomocą analizy punktowej rozcieńczeń w zakresie od 10 do minus jeden do 10 do minus pięciu 100 nanogramów na mikrolitr sondy kontrolnej i trzech, nowo znakowanych sond znakowanych DIG jest wykrywanych na membranie transferowej inkubowanej z przeciwciałem anty DIG i testem. Analiza sugeruje szacunkowe stężenie 100 nanogramów na mikrolitr dla sondy, dwa 10 nanogramów na mikrolitr dla sondy trzeciej i jeden nanogram na mikrolitr dla sondy czwartej, co wskazuje, że jest mało prawdopodobne, aby sonda czwarta dała dobry sygnał inea do hybrydyzacji. Wreszcie, te podłużne przekroje przez wierzchołek zsypu wegetatywnego z Mace zapewniają porównanie między niespecyficznym sygnałem tła a dobrze działającym panelem sondy.

A pokazuje niespecyficzny sygnał tła, podczas gdy panel B pokazuje specyficzny sygnał hybrydyzacji in situ dla sondy OC five w zewnętrznej warstwie komórek. Po obejrzeniu tego powinieneś mieć dobre wyczucie, jak wykonać wiele trudnych kroków w protokołach hybrydyzacji init, tak aby móc określić dokładne wzorce ekspresji czasowej ciśnienia swoich ulubionych nastolatków.