Name: In Situ Hybrydyzacja w celu precyzyjnej lokalizacji transkryptów w roślinach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Poznaj metodę in situ hybridization do wizualizacji ekspresji mRNA w tkankach roślinnych z wysoką czułością i specyficznością. Technika ta pozwala precyzyjnie lokalizować transkrypty na poziomie komórkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania w laboratorium M.T. są wspierane z grantów National Science Foundation (DBI-0820610 oraz IOS-1022102) i Departamentu Zdrowia stanu Nowy Jork (NYSTEM-C024308). C.M. otrzymał stypendia podoktorskie od hiszpańskiego Ministerstwa Edukacji i Nauki (2007-0937) oraz Fundacji Rafael del Pino w Hiszpanii.

<ol><li>Rensink, W. A., Buell, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+expression+profiling+resources+for+plant+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Plant.+Sci%22%5BJournal%5D)">Microarray expression profiling resources for plant genomics.</a> Trends. Plant. Sci. 10, 603-609 (2005).</li>
<li>Li, P., Ponnala, L., Gandotra, N., Wang, L., Si, Y., Tausta, S. L., Kebrom, T. H., Provart, N., Patel, R., Myers, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+dynamics+of+the+maize+leaf+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome.</a> Nat. Genet. 42, 1060-1067 (2010).</li>
<li>Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+integrated+single-base+resolution+maps+of+the+epigenome+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis.</a> Cell. 133, 523-536 (2008).</li>
<li>Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+root+spatiotemporal+map+reveals+dominant+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns.</a> Science. 318, 801-806 (2007).</li>
<li>Brooks, L., Strable, J., Zhang, X., Ohtsu, K., Zhou, R., Sarkar, A., Hargreaves, S., Elshire, R. J., Eudy, D., Pawlowska, T., Ware, D., Janick-Buckner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+of+shoot+meristem+functional+domains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Genet%22%5BJournal%5D)">Microdissection of shoot meristem functional domains.</a> PLoS. Genet. 5, e1000476-e1000476 (2009).</li>
<li>Galbraith, D. W., Birnbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+studies+of+cell+type-specific+gene+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Global studies of cell type-specific gene expression in plants.</a> Annu. Rev. Plant. Biol. 57, 451-475 (2006).</li>
<li>Ohtsu, K., Smith, M., Emrich, S., Borsuk, L., Zhou, R., Chen, T., Zhang, X., Timmermans, M., Beck, J., Buckner, B., Janick-Buckner, D., Nettleton, D., Scanlon, M., Schnable, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+analysis+of+the+shoot+apical+meristem+of+maize+%28Zea+mays+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant.+J%22%5BJournal%5D)">Global gene expression analysis of the shoot apical meristem of maize (Zea mays L.).</a> Plant. J. 52, 391-404 (2007).</li>
<li>Juarez, M. T., Kui, J. S., Thomas, J., Heller, B. A., Timmermans, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-mediated+repression+of+rolled+leaf1+specifies+maize+leaf+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">microRNA-mediated repression of rolled leaf1 specifies maize leaf polarity.</a> Nature. 428, 84-88 (2004).</li>
<li>Kramer, E. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+genetic+mechanisms+controlling+petal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolution of genetic mechanisms controlling petal development.</a> Nature. 399, 144-148 (1999).</li>
<li>Stuurman, J., Jäggi, F., Kuhlemeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shoot+meristem+maintenance+is+controlled+by+a+GRAS-gene+mediated+signal+from+differentiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Shoot meristem maintenance is controlled by a GRAS-gene mediated signal from differentiating cells.</a> Genes Dev. 16, 2213-2218 (2002).</li>
<li>Kim, M., McCormick, S., Timmermans, M., Sinha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+domain+of+PHANTASTICA+determines+leaflet+placement+in+compound+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The expression domain of PHANTASTICA determines leaflet placement in compound leaves.</a> Nature. 424, 438-443 (2003).</li>
<li>Kramer, E. M., Holappa, L., Gould, B., Jaramillo, M. A., Setnikov, D., Santiago, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elaboration+of+B+gene+function+to+include+the+identity+of+novel+floral+organs+in+the+lower+eudicot+Aquilegia%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Elaboration of B gene function to include the identity of novel floral organs in the lower eudicot Aquilegia.</a> Plant Cell. 19, 750-766 (2007).</li>
<li>Lippman, Z. B., Cohen, O., Alvarez, J. P., Abu-Abied, M., Pekker, I., Paran, I., Eshed, Y., Zamir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+making+of+a+compound+inflorescence+in+tomato+and+related+nightshades%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The making of a compound inflorescence in tomato and related nightshades.</a> PLoS Biol. 6, e288-e288 (2008).</li>
<li>Kidner, C., Timmermans, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+as+a+tool+to+study+the+role+of+microRNAs+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization as a tool to study the role of microRNAs in plant development.</a> Methods. Mol. Biol. 342, 159-179 (2006).</li>
<li>Jackson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+labeling+of+KNOTTED1+mRNA+and+protein+reveals+multiple+potential+sites+of+protein+trafficking+in+the+shoot%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Double labeling of KNOTTED1 mRNA and protein reveals multiple potential sites of protein trafficking in the shoot.</a> 129, 1423-1429 (2002).</li>
<li>Jensen, W. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJensen%2C+WA+%22Botanical+Histochemistry%22">Botanical Histochemistry</a>. , Freeman. San Francisco. 408-408 (1962).</li>
<li>Jackson, D. In situ hybridization in plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJackson%2C+D+%22Molecular+Plant+Pathology%3A+A+Practical+Approach%22">Molecular Plant Pathology: A Practical Approach</a>. Bowles, D. J., Gurr, S. J., McPherson, M. , University Press. Oxford. 163-174 (1991).</li>
<li>Chitwood, D. H., Nogueira, F. T., Howell, M. ontgomery, Carrington, T. A., C, J., Timmermans, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+via+small+RNA+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Pattern formation via small RNA mobility.</a> Genes. Dev. 23, 549-554 (2009).</li>
<li>Piette, D., Hendrickx, M., Willems, E., Kemp, C. R., Leyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+procedure+for+whole-mount+in+situ+hybridization+on+mouse+embryos+and+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">An optimized procedure for whole-mount in situ hybridization on mouse embryos and embryoid bodies.</a> Nat. Protoc. 3, 1194-1201 (2008).</li>
<li>Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PIN+auxin+efflux+facilitator+network+controls+growth+and+patterning+in+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots.</a> Nature. 433, 39-44 (2005).</li>
<li>Jackson, D., Hake, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+phyllotaxy+in+maize+by+the+abphyl1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Control of phyllotaxy in maize by the abphyl1 gene.</a> Development. , 126-315 (1999).</li>
<li>Chuck, G., Whipple, C., Jackson, D., Hake, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maize+SBP-box+transcription+factor+encoded+by+tasselsheath4+regulates+bract+development+and+the+establishment+of+meristem+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The maize SBP-box transcription factor encoded by tasselsheath4 regulates bract development and the establishment of meristem boundaries.</a> Development. 137, 1243-1250 (2010).</li>
<li>Long, J. A., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+apical+embryonic+pattern+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The development of apical embryonic pattern in Arabidopsis.</a> Development. 125, 3027-3035 (1998).</li>
<li>Nogueira, F. T., Chitwood, D. H., Madi, S., Ohtsu, K., Schnable, P. S., Scanlon, M. J., Timmermans, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+small+RNA+accumulation+in+the+maize+shoot+apex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of small RNA accumulation in the maize shoot apex.</a> PLoS Genet. 5, e1000320-e1000320 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Opisana tutaj metoda hybrydyzacji in situ umożliwia bezpośrednią wizualizację spatiotemporalnego wzorca ekspresji dowolnego genu zainteresowania z wysoką rozdzielczością komórkową, dużą czułością i specyficznością. Protokół ten nie pozwala na ilościowe porównanie poziomów ekspresji między poszczególnymi genami. Jednakże wysoka czułość i rozdzielczość tej metody mogą ujawnić gradienty ekspresji genów w obrębie tkanki8, 18, co nie jest możliwe w przypadku większości innych metod analizy ekspresji genów.
Protokół obejmuje wiele etapów, co może utrudniać rozwiązywanie problemów. Najbardziej krytycznymi krokami protokołu są fiksacja tkanki oraz wybór i znakowanie sondy. Niewłaściwie infiltrowane tkanki oraz sondy o niskim stopniu wbudowania DIG dadzą bardzo słabe sygnały, które mogą być trudne do wykrycia powyżej tła. Dla każdego nowego genu docelowego zaleca się przetestowanie kilku różnych sond pochodzących z różnych regionów transkryptu. Okazycznie konieczne może być połączenie dwóch lub trzech sond celujących w różne, mniejsze regiony genu, aby uzyskać silny i specyficzny sygnał hybrydyzacji. Ponadto warunki hybrydyzacji, takie jak temperatura i skład buforu do hybrydyzacji, mogą być optymalizowane dla każdego genu lub tkanki w celu obniżenia lub zwiększenia rygorystyczności hybrydyzacji. Również etap traktowania proteazą jest zmienną i może zostać zmodyfikowany, aby dostosować protokół do różnych gatunków roślin lub do wykrywania transkryptów o bardzo niskiej obfitości. Zastosowanie zarówno dodatnich, jak i ujemnych sond kontrolnych będzie pomocne w identyfikacji problematycznych punktów protokołu.
Procedura została zoptymalizowana dla przekrojów tkanek roślinnych zatopionych w parafinie, lecz po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji może być również stosowana do hybrydyzacji in situ w preparatach całych tkanek. Choć hybrydyzacja in situ w preparatach całych tkanek jest powszechnie stosowana w badaniach nad zwierzętami19, w przypadku roślin jej zastosowanie będzie ograniczone do tkanek, które można łatwo infiltrować, takich jak embriony, korzenie lub młode tkanki merystematyczne20,21. Protokół można również łatwo zmodyfikować, aby jednocześnie wykrywać dwa różne mRNA lub lokalizować transkrypty wraz z białkami15,22,23. Wreszcie istnieje możliwość rozszerzenia zastosowania tej metody na wizualizację wzorców ekspresji małych RNA w roślinach. Wzorce ekspresji miRNA zostały określone przy użyciu tego protokołu zarówno w kukurydzy, jak i w Arabidopsis8,14. W ostatnim czasie sondy transkrybowane in vitro zastąpiono dostępnymi komercyjnie, znakowanymi DIG sondami oligonukleotydowymi z blokowanymi kwasami nukleinowymi (LNA), które zwiększają czułość sygnału18, 24.

<table><tbody><tr><td>Cytoseal 60 4oz</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-244-256</td><td>8310-4 na bazie toluenu</td></tr><tr><td>Histoclear</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90147</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Path Paraplast Plus </td><td>Fisher Scientific</td><td>23-021-400</td><td></td></tr><tr><td> membrana nylonowa N+ Hybond-N+ </td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>RNase OUT; 40 j./&amp;mu;L </td><td>Invitrogen</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 DNaza wolna od RNaz; 1 U/&amp;mu;L </td><td>Promega Corp.</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Kontrolny RNA znakowany DIG </td><td>Grupa Roche</td><td>11585746910</td><td></td></tr><tr><td>mieszanina do znakowania RNA DIG</td><td>Grupa Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>polimeraza RNA SP6 1 000 U </td><td>Grupa Roche</td><td>10810274001</td><td></td></tr><tr><td>polimeraza RNA T3 1 000 U </td><td>Grupa Roche</td><td>11031163001</td><td></td></tr><tr><td>polimeraza RNA T7 1 000 U </td><td>Grupa Roche</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A </td><td>Grupa Roche</td><td>109142</td><td>rozpuścić w glicerolu 50% w 100mM Tris pH 8,0</td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący </td><td>Grupa Roche</td><td>1 096 176</td><td>Podgrzać do 70&amp;#x00B0;C w buforze TBS</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-digoksigenina-AP, fragmenty Fab od owcy 150 U </td><td>Grupa Roche</td><td>1 093 274</td><td></td></tr><tr><td>roztwór zapasu NBT/BCIP </td><td>Grupa Roche</td><td>1 681 451</td><td></td></tr><tr><td>kolumny do szybkiego wirowania RNA mini Quick Spin </td><td>Grupa Roche</td><td>11814427001</td><td></td></tr><tr><td>tRNA z&lt;em&gt; *E. coli*&lt;/em&gt; </td><td>Grupa Roche</td><td>109541</td><td></td></tr><tr><td>Triton&amp;#174;X-100 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Dejonizowany formamid </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza z &lt;em&gt;Streptomyces griseus&lt;/em&gt; Typ XIV </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td>Rozcieńczyć w wodzie milliQ i poddać wstępnemu trawieniu przez 4 godziny w temperaturze 37°C&amp;#x00B0;C </td></tr><tr><td>Trietanoloamina </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90279</td><td>Rozcieńczyć w wodzie, doprowadzić do pH 8,0 za pomocą HCl</td></tr><tr><td>Bezwodnik octowy </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6404</td><td></td></tr><tr><td> Sód dextranu siarczan otrzymany z &lt;em&gt;Leuconostoc spp.&lt;/em&gt; </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906-5G</td><td>Siarczan dekstranu należy podgrzać do 80&amp;#x00B0;C do rozpuszczania.</td></tr><tr><td>Denhardt&amp;rsquo;roztwór 50x koncentrat </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2532</td><td></td></tr><tr><td>Albumina z surowicy bydlęcej - &amp;#8805;98% </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>sód dwuwodoroeozyny Y</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4382</td><td>Rozpuścić w etanolu 96-100% do momentu nasycenia </td></tr><tr><td>Paraformaldehyd </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absolutny 200 proof </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenol/chloroform </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formy podstawowe </td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>62352-15</td><td></td></tr><tr><td>Pierścienie do zatapiania </td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-197</td><td></td></tr><tr><td>jednorazowe fiolki scyntylacyjne 20 ml z nakrętkami </td><td>VWR international</td><td>66020-326</td><td></td></tr><tr><td>Przeszkiełka z nałożoną sondą (probe-on-plus slides) </td><td>Fisher Scientific</td><td>22-230-900</td><td></td></tr><tr><td>Koleczki mikroskopowe 24x50 mm </td><td>VWR international</td><td>48404-452</td><td></td></tr><tr><td>papier Whatman 3 mm </td><td>VWR international</td><td>89022-360</td><td></td></tr><tr><td>Trzy szalki szklane i jedna statywa na preparaty ze stali nierdzewnej </td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71420-25</td><td>Do zabiegu w histoclear niezbędne są dwie szalki szklane, a ostatnia służy do zabiegu z użyciem bezwodnika octowego.</td></tr><tr><td>18 czystych plastikowych pojemników </td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>2 lub 3 duże, płaskie plastikowe pojemniki z uszczelnianymi pokrywkami </td><td></td><td></td><td>wymagane do etapów hybrydyzacji i inkubacji z przeciwciałami</td></tr><tr><td>Pędzle precyzyjne </td><td></td><td></td><td>Pomoc w obchodzeniu się z wstążkami woskowymi</td></tr><tr><td>Mikrotom </td><td></td><td></td><td>Leica</td></tr><tr><td>Samoczyszczący się system odsysania na sucho </td><td>Welch Allyn</td><td>2025</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewacz do szkiełek </td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy </td><td></td><td></td><td>wymagane przy 60&amp;#x00B0;C i 85&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Inkubator w temperaturze 58–60°C&amp;#x00B0;C </td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>W przypadku etapów z wykorzystaniem stopionego Paraplastu</td></tr><tr><td>Piece lub łaźnie wodne ustawione na 55°C&amp;#x00B0;C i 37&amp;#x00B0;C </td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Wymagane są dwie sztuki ze względu na szybką zmianę temperatury</td></tr><tr><td>Wirówka (4&amp;#x00B0;C - 20&amp;#x00B0;C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dygestorium</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hybrydyzacja in situ w celu precyzyjnej lokalizacji transkrypty w roślinach

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

Wraz z postępami w badaniach genomiki w ciągu ostatniej dekady, biologia roślin stała się obszarem licznych studiów prezentujących wielkoskalowe analizy ilościowe ekspresji genów. Metody mikromacierzy oraz sekwencjonowania następnej generacji są wykorzystywane do badania procesów rozwojowych, fizjologicznych i odpowiedzi na stres, analizowania szlaków epigenetycznych i małych RNA oraz budowania rozbudowanych sieci regulacji genów1-3. Chociaż techniki te umożliwiają jednoczesną analizę dużych zestawów genów, zazwyczaj oferują one bardzo ograniczoną rozdzielczość czasowo-przestrzenną zmian ekspresji genów. Ograniczenie to można częściowo zniwelować, stosując dowolną z tych metod profilowania w połączeniu z mikrosekcją laserową lub sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją4-7. Jednakże, aby w pełni zrozumieć biologiczną rolę genu, niezbędna jest wiedza o jego czasowo-przestrzennym wzorcu ekspresji na poziomie komórkowym. Szczególnie istotna może stać się szczegółowa analiza wzorca ekspresji genu podczas badania rozwoju, efektów bodźców środowiskowych lub mutantów. Na przykład subtelne różnice ilościowe w poziomach ekspresji kluczowych genów regulatorowych mogą prowadzić do drastycznych fenotypów, gdy wiążą się z utratą lub nabyciem ekspresji w specyficznych typach komórek. 
Do szczegółowego badania wzorców ekspresji genów rutynowo stosuje się kilka metod. Jedną z nich jest analiza transgenicznych linii reporterowych. Taka analiza może jednak stać się czasochłonna w przypadku badania wielu genów lub pracy z roślinami opornymi na transformację. Ponadto zazwyczaj wymagana jest niezależna walidacja, aby upewnić się, że wzorzec ekspresji transgenu naśladuje wzorzec genu endogennego. Immunohistochemiczna lokalizacja białek lub hybrydyzacja mRNA in situ stanowią stosunkowo szybkie alternatywy dla bezpośredniej wizualizacji ekspresji genów w komórkach i tkankach. Ta druga metoda ma wyraźną zaletę w postaci możliwości łatwego zastosowania w odniesieniu do dowolnego genu zainteresowania. Hybrydyzacja in situ umożliwia wykrycie docelowych mRNA w komórkach poprzez hybrydyzację z znakowaną antysensowną sondą RNA, uzyskaną w drodze transkrypcji in vitro badanego genu.
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół wysokoczułej i specyficznej lokalizacji ekspresji genów in situ w roślinach. Został on zoptymalizowany do stosowania w przypadku przekrojów utrwalonych paraformaldehydem i zatopionych w parafinie, co zapewnia doskonałą konserwację histologiczną, oraz sond znakowanych DIG, które są wizualizowane za pomocą immunodetekcji i kolorymetrycznej reakcji z fosfatazą alkaliczną. Protokół ten został z powodzeniem zastosowany w wielu tkankach z szerokiego zakresu gatunków roślin i może być wykorzystywany do analizy ekspresji zarówno mRNA, jak i małych RNA8-14.

Opisany tutaj protokół hybrydyzacji in situ umożliwia bezpośrednią lokalizację ekspresji mRNA i małych RNA na poziomie komórkowym z wysoką czułością i swoistością. Procedura została zoptymalizowana dla przekrojów tkanek roślinnych zatopionych w parafinie, ma zastosowanie do szerokiego zakresu roślin i tkanek oraz może zostać ukończona w ciągu dziesięciu dni.

Hybrydyzacja in situ w celu precyzyjnej lokalizacji transkrypty w roślinach

Wraz z postępami w badaniach genomiki w ciągu ostatniej dekady, w biologii roślin pojawiło się wiele opracowań prezentujących wielkoskalowe analizy ilościowe genów...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja wzorców ekspresji mRNA na poziomie komórkowym z wysoką czułością i specyficznością. Osiąga się to poprzez poddanie formalinowo utrwalonych i zatopionych w parafinie przekrojów tkankowych serii kąpieli w roztworach w celu usunięcia wosku, permeabilizacji tkanek oraz blokowania dodatnio naładowanych grup mniejszościowych w tkankach, które mogłyby generować sygnał tła. Następnie do przekrojów tkankowych wprowadza się znakowane DIG sondy RNA specyficzne dla badanego genu, a preparaty poddawane są hybrydyzacji przez noc.Następnie preparaty na szkiełkach są przemywane, aby usunąć nieswoiście związaną sondę z sekcji, a następnie inkubowane z przeciwciałem anty-DIG. Pozwala to na wizualizację zhybrydyzowanej sondy za pomocą kolorymetrycznej reakcji chemicznej.Wyniki wykazują ciemnoniebieski sygnał wykrywalny w mikroskopii świetlnej specyficznie w tych komórkach tkanki, w których ekspresjonowany jest badany gen. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z naszymi innymi analizami ekspresji, takimi jak R-T-P-C-R, mikromacierze lub metody Next Generation Sequencing, jest to, że przedstawiony tutaj protokół hybrydyzacji in situ ujawnia wzorzec ekspresji badanego genu w kontekście tkankowym. Metody te obejmują wiele etapów, których najlepiej uczyć się poprzez demonstracje wizualne.Pokażemy, jak przygotowywać skrawki i zatapiać tkanki, a także omówimy kluczowe kroki w protokole hybrydyzacji AI, które są trudne do opanowania samodzielnie. Metoda zatapiania tkanek utrwalonych paraldehydem będzie się różnić w zależności od rodzaju analizowanej tkanki. Najważniejszym punktem jest tutaj zapewnienie prawidłowej orientacji próbek pod kątem późniejszego skrawania.Jedną z metod zatapiania jest zastosowanie form i pierścieni plastikowych. Aby rozpocząć tę procedurę, należy ogrzać formy na płycie grzewczej o temperaturze 60 °C, a następnie wlać do nich stopioną parafinę. Następnie, używając podgrzanej pęsety, należy przenieść próbkę tkanki do każdej formy i ustawić ją w pożądanej pozycji.Ostrożnie przenieś formę z płytki na blat i nałóż biały pierścień na formę. Dodaj kolejną porcję moli oraz wosku. Pozostaw wosk do stopniowego ostygnięcia i utwardzenia przed przystąpieniem do sekcjonowania.Ogrzać bloki do temperatury pokojowej, a następnie przyciąć każdy z nich do kształtu trapezu, pozostawiając około jednego milimetra wosku wokół próbki. Umieścić przycięty blok w mikrotomie w taki sposób, aby dłuższa z dwóch równoległych ścian znajdowała się na dole. Ostrożnie przesunąć blok w stronę noża i upewnić się, że powierzchnia bloku jest równoległa do krawędzi tnącej noża.O grubości od 8 do 10 mikronów. Ułóż woskowe wstęgi na nieprzywierającej powierzchni, takiej jak folia aluminiowa, i wybierz interesujące fragmenty pod stereomikroskopem. Następnie oznacz odpowiednie szkiełka przedmiotowe ołówkiem.Nie należy używać pisaków do zaznaczania, ponieważ zostaną one usunięte podczas protokołu hybrydyzacji INI dwa. Nanieś jeden mililitr czystej wody milli Q na każdy preparat. Ostrożnie umieść wybrane skrawki na powierzchni wody w temperaturze pokojowej.Upewnij się, że błyszcząca strona jest skierowana w stronę wody. Powoli przenieś preparat na podgrzewacz do szkiełek. Ustaw temperaturę w zakresie od 35 do 37 °C.Zastosowanie tego zakresu temperatur, w przeciwieństwie do powszechnie stosowanych 42 °C, zapobiega powstawaniu pęcherzyków powietrza pod skrawkami. Po pięciu minutach ostrożnie, ale jednym płynnym ruchem, odlej wodę, tak aby wstęga opadła na szkiełko przedmiotowe. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia przez co najmniej kilka godzin lub przez noc w temperaturze 37 °C, aby tkanka dobrze przylgnęła do podłoża przed przygotowaniem skrawków tkankowych.W przypadku hybrydyzacji in situ, preparaty są najpierw odtłuszczane i rehydratowane w celu sfinalizowania procesu odtłuszczania. Inkubuj slajdy w dwóch zmianach roztworu Histiclear przez 10 minut każda. Aby zrehydratować skrawki tkanki, przepuść slajdy przez serię roztworów etanolu o malejących stężeniach, inkubując je po 30 sekund w każdym.Podczas obróbki proteazą, która nie jest pokazana w tym filmie, przygotuj szklaną płytkę z 0,1 molarnym roztworem trietoksyloaminy i ustaw ją na mieszadle magnetycznym w dygestorium. Bezpośrednio przed umieszczeniem metalowego statywu na szkiełka w roztworze, dodaj 1,25 mililitrów bezwodnika octowego do trietoksyloaminy, buforu i mieszadła. Dodatkowo przygotuj system zaciskowy oraz statyw do utrzymania koszyka na szkiełka.Zmniejsz prędkość mieszania, zaklempsuj statyw z preparatami do stojaka i opuść go do roztworu, utrzymując go powyżej mieszadełka magnetycznego. Kontynuuj powolne mieszanie przez 10 minut, a następnie przepłucz preparaty w PBS i ponownie odwodnij, stosując serię stężeń etanolu. Przekroje tkanek są gotowe do hybrydyzacji.Umieścić preparaty na czystej powierzchni i pozostawić do całkowitego wyschnięcia przez 5 do 10 minut. Przygotować mieszaninę buforu do hybrydyzacji sondy, dodając zdenaturowaną sondę do 80 µL buforu do hybrydyzacji. W przypadku każdego preparatu wymieszać dokładnie za pomocą pipety, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza.Nanieś pipetą bufor do hybrydyzacji sond. Wymieszaj go na prawej krawędzi szkiełka. Stopniowo opuść szkiełko nakrywką na preparat, upewniając się, że roztwór do hybrydyzacji pokrywa wszystkie sekcje i nie ma w nim pęcherzyków powietrza.Lekko stuknij palcem w szkiełko nakrywkowe w miejscach, w których tworzą się pęcherzyki powietrza, aby usunąć je ze wszystkich przekrojów tkanki. Nie odrywaj szkiełka nakrywkowego, ponieważ uszkodzi to przekroje. Umieść preparaty w komorze wilgotnościowej zawierającej papier Watmana zwilżony wodą UE i w znacznym stopniu pokryty param.Szczelnie zamknij pudełko i inkubuj preparaty w żądanej temperaturze hybrydyzacji, zazwyczaj od 50 do 55 °C przez 16 do 20 godzin. Po zakończeniu protokołu hybrydyzacji ostrożnie zdejmij szkiełka nakrywkowe z preparatów. Szkiełko nakrywkowe może po prostu odpaść po ustawieniu preparatu pionowo, lecz jeśli tak się nie stanie, nie odrywaj go, aby nie uszkodzić skrawków.Zamiast tego, zanurz preparat w ciepłym 0,2-krotnym roztworze SSC przez jedną lub dwie minuty, aby wypłukać szkiełko nakrywkę. Po usunięciu szkiełek nakrywek umieść preparaty w statywie i kilkakrotnie wypłucz w 0,2-krotnym SSC w temperaturze 55 °C. Po obróbce RNAs przenieś preparaty ze statywu na dno płaskiego plastikowego pudełka i przykryj minimalną objętością roztworu blokującego. Inkubuj preparaty w celu blokowania przez 45 minut w temperaturze pokojowej na platformie z wolnymi wstrząsami.Następnie nanieś minimalną objętość roztworu przeciwciał bezpośrednio na każdy preparat. Inkubuj preparaty w ciemności przez dwie do trzech godzin w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji przenieś preparaty do czystego, płaskiego pudełka i przemyj je czterokrotnie minimalną objętością buforu piorącego na platformie wytrząsowej w temperaturze pokojowej.Przepłucz preparaty raz w TBS i dwukrotnie w buforze TN, a następnie nałóż na nie świeżo przygotowany roztwór barwiący. Najpierw wlej roztwór barwiący do małego plastikowego naczynia wagowego. Następnie złącz dwa preparaty tak, aby skrawki były skierowane ku sobie.Zanurz kanapkę w roztworze, pozwalając, aby siły kapilarne wciągnęły ciecz do środka. Osusz preparaty na chusteczce typu kim wipe. Wypełnij przestrzeń między szkiełkami roztworem barwiącym.Ponownie, podczas wpływania roztworu może być konieczne delikatne opukiwanie preparatów w celu uniknięcia pęcherzyków powietrza; następnie należy umieścić preparaty w plastikowym pudełku i przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki uzyskane przy użyciu różnych sond i tkanek arabidopsis. Purpurowy sygnał umożliwia bezpośrednią wizualizację wzorca ekspresji badanego genu w rozdzielczości komórkowej.Panel A przedstawia lokalizację transkryptów shoot Meli one w wegetatywnym wierzchołku pędu. Zwróć uwagę na obecność purpurowo-niebieskiego sygnału w części niedookreślonej merystemu oraz brak sygnału w otaczających liściach. Panele B-D to przekroje embrionów Arabidopsis w stadium torpedy, gdzie panel B pokazuje ekspresję covata three w nielicznych embrionalnych komórkach macierzystych.Na zdjęciu C widoczna jest ekspresja T ML one w warstwie epidermy, a na zdjęciu D brak sygnału w przekrojach poddanych badaniu z użyciem losowego negatywnego RNA kontrolnego. Kolejne obrazy przedstawiają wyniki uzyskane przy użyciu różnych sond w tkankach kukurydzy. Panel E pokazuje lokalizację STM Humalog knotted one w rozwijającym się embrionie kukurydzy.Zauważmy, że silny sygnał widoczny szczególnie w podłużnych przekrojach przez embrionalną łodygę i korzeń oraz wierzchołek pędu wegetatywnego wskazuje, że ARF3A wykazuje ekspresję na osiowej dolnej powierzchni liścia w panelu F, natomiast homolog ATML1, OCL4, wykazuje ekspresję specyficznie w epidermie w panelu G. Zgodnie z oczekiwaniami, w panelu H nie zaobserwowano sygnału hybrydyzacji dla sondy kontrolnej negatywnej. Przedstawiono tutaj oczekiwane wyniki poszczególnych etapów kontrolnych podczas transkrypcji sond in vitro. Sondy do hybrydyzacji in situ są sprawdzane na standardowym żelu agarozowym po transkrypcji in vitro, po traktowaniu DNazą i późniejszym oczyszczaniu reakcji transkrypcji in vitro oraz po hydrolizie węglanowej; w przypadku sond o długości powyżej 250 par zasad, takich jak sonda 1, hydroliza węglanowa spowoduje powstanie szeregu mniejszych fragmentów sondy.Na tej rycinie przedstawiono wyniki walidacji kolorymetrycznej i ilościowej sond metodą dot blot. Rozcieńczenia od 10⁻¹ do 10⁻⁵ sondy kontrolnej o stężeniu 100 ng/µL oraz trzech nowo znakowanych sond DIG naniesiono na membranę transferową inkubowaną z przeciwciałami anty-DIG. Analiza sugeruje szacowane stężenie 100 ng/µL dla sondy 2, 10 ng/µL dla sondy 3 oraz 1 ng/µL dla sondy 4, co wskazuje, że sonda 4 prawdopodobnie nie zapewni wystarczająco silnego sygnału hybrydyzacji in situ. Na koniec, te przekroje podłużne przez wierzchołek pędu wegetatywnego z Mace stanowią porównanie między niespecyficznym sygnałem tła a panelem prawidłowo działających sond.Na panelu A widoczny jest nieswoisty sygnał tła, podczas gdy panel B przedstawia swoisty sygnał hybrydyzacji in situ dla sondy OC five w zewnętrznej warstwie komórkowej. Po obejrzeniu tego materiału powinni Państwo mieć dobre wyobrażenie o tym, jak przeprowadzić wiele z trudniejszych etapów w protokołach hybrydyzacji init, aby móc określić precyzyjne wzorce ekspresji czasowo-przestrzennej wybranych genów.

in-situ-hybridization-for-precise-localization-transcripts

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

In Situ Hybrydyzacja w celu precyzyjnej lokalizacji transkryptów w roślinach

Opisujemy zmodyfikowany protokół hybrydyzacji in situ z użyciem DIG, który jest szybki i możliwy do zastosowania u szerokiego zakresu gatunków roślin, w tym u świerka pospolitego. Dzięki kilku korektom, obejmującym m.in. zmienioną obróbkę RNazą oraz stężenie proteinazy K, protokół ten może być wykorzystywany w badaniach różnych tkanek i gatunków.

Protokół niepromiennej hybrydyzacji in situ stosowalny dla świerka pospolitego i szeregu gatunków roślin

Niniejszy protokół jest z powodzeniem stosowany do ilościowego wykrywania poziomów i wzorców przestrzennych ekspresji mRNA w wielu typach tkanek u różnych gatunków kręgowców. Metoda ta umożliwia wykrywanie transkryptów o niskiej zawartości oraz jednoczesne przetwarzanie setek preparatów. Przedstawiamy ten protokół na przykładzie profilowania ekspresji podczas formowania się embrionalnego mózgu ptaków.

Radioaktywna hybrydyzacja in situ w celu wykrywania różnorodnych wzorców ekspresji genów w tkance

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Danio pręgowany, mała tropikalna ryba, stała się popularnym modelem do badania funkcji genów podczas rozwoju i choroby kręgowców. Czasową i przestrzenną ekspresję genów docelowych można określić za pomocą hybrydyzacji in situ. Nasz ulepszony protokół pozwala na wykrywanie mało obfitych transkryptów z niskim niespecyficznym sygnałem tła.

Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

Opisujemy tutaj prostą metodę fluorescencji in situ (FISH) do lokalizacji wirusów i bakterii w tkankach owadów i roślin. Protokół ten można rozszerzyć o wizualizację mRNA w całych ujęciach i przekrojach mikroskopowych.

Fluorescencyjne hybrydyzacje in situ (FISH) do lokalizacji wirusów i bakterii endosymbiotycznych w tkankach roślinnych i owadzich

Hybrydyzacja in situ (ISH) RNA umożliwia wizualizację RNA w komórkach i tkankach. Tutaj pokazujemy, jak połączenie RNAscope ISH z immunohistochemią lub barwnikami histologicznymi może być z powodzeniem wykorzystane do wykrywania mRNA zlokalizowanych na aksonach w odcinkach mózgu myszy i człowieka.

Wykrywanie aksonalnie zlokalizowanych mRNA w skrawkach mózgu za pomocą hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości

Ten protokół opisuje prostą metodę cięcia tkanek metodą Hybrid-Cut, która jest przydatna dla opornych tkanek roślinnych. Dobrej jakości skrawki tkanek umożliwiają badania anatomiczne i inne badania biologiczne, w tym hybrydyzację in situ (ISH).

Hybrid-Cut: ulepszona metoda cięcia opornych próbek tkanek roślinnych

Opisany protokół hybrydyzacji RNA in situ pozwala na wykrycie RNA w całych zarodkach Drosophila lub wypreparowanych tkankach. Korzystając z 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych i wzmocnienia sygnału tyramidu, transkrypty mogą być wykrywane z wysoką rozdzielczością, czułością i przepustowością oraz przy stosunkowo niskich kosztach.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach Drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego

Ten manuskrypt opisuje metodę znakowania pojedynczych transkryptów informacyjnego RNA (mRNA) za pomocą fluorescencyjnie znakowanych sond DNA, do wykorzystania w eksperymentach z hybrydyzacją fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ (smFISH) u E. coli. smFISH to metoda wizualizacji, która pozwala na jednoczesne wykrywanie, lokalizację i kwantyfikację pojedynczych cząsteczek mRNA w utrwalonych pojedynczych komórkach.

Metoda znakowania transkryptów w poszczególnych komórkach Escherichia coli do eksperymentów hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano dwukolorową hybrydyzację in situ w całym preparacie (whole mount in situ hybridization), metodę umożliwiającą wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji dwóch różnych genów w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Davida Wilkinsona, Domingosa Henrique, Phila Inghama i Davida Ish-Horowicza.

Podwójna hybrydyzacja in situ całego preparatu wczesnych zarodków kurczego

Poznaj metodę in situ hybridization do wizualizacji ekspresji mRNA w tkankach roślinnych z wysoką czułością i specyficznością. Technika ta pozwala precyzyjnie lokalizować transkrypty na poziomie komórkowym.

Hybrydyzacja in situ w celu precyzyjnej lokalizacji transkrypty w roślinach

Przeglądaj więcej filmów