To, gdzie tniesz, ma znaczenie: przewodnik po sekcji i analizie orientacji przestrzennej siatkówki myszy na podstawie punktów orientacyjnych oczu

Ten protokół dostarcza obszernego przewodnika po sekcji i analizie do wykorzystania głębokich punktów orientacyjnych oka, immunohistochemii s-opsyn, Retistruct i niestandardowego kodu do dokładnej i niezawodnej orientacji izolowanej siatkówki myszy w przestrzeni anatomicznej.

Celem tego protokołu preparacji jest zapewnienie znormalizowanej metodologii wykorzystania anatomicznych punktów orientacyjnych oka, takich jak mięśnie proste, szczelina naczyniówki i gradient S-opsyny do orientacji topograficznej siatkówki myszy. Główną zaletą tych technik jest to, że zapewniają one niezawodny sposób dokładnej identyfikacji biegunów grzbietowych, brzusznych, nosowych i skroniowych izolowanej siatkówki myszy. Zacznij od zidentyfikowania punktu na grzbietowej rogówce w pobliżu granicy twardówki rogówki oraz między kantą nosową a skroniową.

Dotknij rogówki rozgrzanym pisakiem do kauteryzacji na mniej niż sekundę, aby utworzyć ślad oparzenia w celach orientacyjnych. Powtórz dla drugiego oka. Obecność oparzenia grzbietowego pozwala na identyfikację mięśnia prostego górnego.

Do enukleacji użyj zakrzywionych kleszczy, aby delikatnie wypchnąć oko z oczodołu i chwycić gałkę od spodu. Następnie powoli wyjmij kulę ziemską z gniazda, jednocześnie delikatnie przesuwając ją od lewej do prawej, aż kula zostanie zwolniona z gniazda. Przenieś kulę ziemską z dołączonymi mięśniami prostymi na szalkę Petriego zawierającą podłoże preparacyjne.

Jeśli pracujesz z oboma oczami, pamiętaj, aby śledzić, które oko jest lewym okiem, a które prawym okiem. W zakresie sekcji zlokalizuj wzrokowo oparzenie grzbietowej rogówki i zidentyfikuj mięsień prosty górny, z którym jest związany. Za pomocą nożyczek preparacyjnych lub igły o rozmiarze 20 przebij rogówkę w miejscu oparzenia.

Następnie wykonaj głębokie nacięcie łagodzące w kuli ocznej w kierunku nerwu wzrokowego, aby przeciąć mięsień górny. Izolowana siatkówka z tym cięciem jest widoczna tutaj, a zrekonstruowana siatkówka z tym cięciem jest pokazana tutaj. Użyj dwóch zestawów kleszczy, aby rozpocząć izolację siatkówki, delikatnie rozrywając otwór wykonany za pomocą nakłucia, aż część siatkówki zostanie odsłonięta.

Następnie oddziel siatkówkę od twardówki, aż twardówka zostanie całkowicie usunięta. Usuń tęczówkę, soczewkę, ciało szkliste i wszelkie pozostałe struktury, aż siatkówka zostanie całkowicie odizolowana. Obecność oparzenia grzbietowego pozwala na identyfikację szczeliny naczyniówki nosowej i skroniowej.

W przypadku pracy z prawym okiem szczelina naczyniówki nosa znajduje się po prawej stronie oparzenia, a skroniowa szczelina naczyniówki znajduje się po lewej stronie oparzenia. Jest to odwrotność pracy z lewym okiem. Aby użyć punktu orientacyjnego szczeliny naczyniówki do określenia orientacji siatkówki, zlokalizuj i zidentyfikuj szczelinę naczyniówki z tyłu oka.

Ustaw kulę ziemską tak, aby ślad oparzenia grzbietowego znajdował się na górnym biegunie, tak jak by to było, gdyby oko nadal znajdowało się w myszy. Następnie użyj nożyczek do rozwarstwiania lub igły o rozmiarze 20, aby wykonać jedno nakłucie w kuli ziemskiej, najpierw w miejscu, w którym znajduje się oparzenie grzbietowe. Następnie wykonaj płytkie cięcie łagodzące w kierunku nerwu wzrokowego, w którym znajduje się oparzenie grzbietowej rogówki.

Następnie wykonaj następujące dwa głębokie nacięcia łagodzące w kierunku nerwu wzrokowego. Jeden przez wyrównanie ostrzy nożyczek preparacyjnych do linii skroniowej szczeliny naczyniówki z tyłu oka, a drugi przez wyłożenie ostrzy nożyczek preparacyjnych do linii szczeliny naczyniówki nosowej z tyłu oka. Nacięcia te są pokazane tutaj na izolowanej i zrekonstruowanej siatkówce.

Po wykonaniu tych nacięć użyj dwóch zestawów kleszczy, aby delikatnie oderwać otwory po nakłuciu, aż część siatkówki zostanie odsłonięta. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj cztery odciążające nacięcia w siatkówce, tak aby leżała płasko. Zamontuj siatkówkę, komórką zwojową do góry, na membranie nitrocelulozowej, delikatnie dociskając każdy róg siatkówki do błony za pomocą kleszczy.

Następnie za pomocą kleszczy zanurz zamontowaną siatkówkę w jednym mililitrze 4% paraformaldehydu zawartego w pierwszym dołku 24-dołkowej płytki. Umieść 24-dołkową płytkę na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej i utrwal siatkówkę dokładnie na 40 minut. Po utrwaleniu przenieś siatkówkę do drugiego dołka płytki, który jest wypełniony jednym mililitrem 0,1 molowego PBS i myj siatkówkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Po zakończeniu mycia przenieś zamontowaną siatkówkę do piątej studzienki zawierającej jeden mililitr roztworu blokującego i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia dodać pierwszorzędowe przeciwciało anty-S-opsyny królika do roztworu blokującego w stężeniu od jednego do 500 i inkubować przez trzy dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po trzydniowej inkubacji przemyj nadmiar przeciwciała pierwszorzędowego z siatkówki sześć razy, umieszczając je kolejno w sześciu studzienkach wypełnionych jednym mililitrem PBS na 10 minut każdy w temperaturze pokojowej.

Następnie umieść umytą siatkówkę w studzience ze świeżym roztworem blokującym i dodaj przeciwciało wtórne przeciwko królikowi Alexa 594. Inkubuj siatkówkę z przeciwciałem drugorzędowym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji przemyj siatkówkę w PBS sześć razy, tak jak poprzednio.

Za pomocą kleszczy przenieś zamontowaną siatkówkę na szalkę Petriego zawierającą PBS. Uwolnij siatkówkę z błony nitrocelulozowej, delikatnie wkładając końcówki kleszczyków między siatkówkę a błonę, aż siatkówka przestanie być przyczepiona. Zanurz szklane szkiełko mikroskopowe w PBS i zamontuj siatkówkę na szkiełku, unosząc ją na szkiełku i delikatnie szturchając kleszkami, aż siatkówka przyklei się do szkła.

Przykryj siatkówkę na szkiełku podłożem montażowym i umieść szkiełko nakrywkowe 1,5. Umieść szkiełko w tacce na suwaki i pozostaw je w temperaturze pokojowej na godzinę. Po godzinie umieść tackę na szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po przykryciu szkiełka na 24 godziny użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić boki szkiełka, aby zapobiec wysuszeniu. Jest to przykład siatkówki wyizolowanej z prawego oka, która została wybarwiona immunologicznie w celu znakowania S-opsyny i zobrazowana za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. Ważne jest, aby pamiętać, że nacięcia w tej siatkówce są arbitralne, ponieważ orientację topograficzną można zidentyfikować za pomocą gradientu S-opsyny.

Uzyskany obraz siatkówki może być następnie zrekonstruowany cyfrowo za pomocą oprogramowania ReadiStruct. Oryginalne cięcia są pseudo-pokolorowane na czerwono na tym obrazie. Zauważ, że plik wyjściowy tego programu nie wyrównuje prawidłowo siatkówki.

Po przepuszczeniu siatkówki przez niestandardowy kod maty laboratoryjnej, siatkówka jest obracana tak, aby najwyższe stężenie barwienia S-opsyny było umieszczane na dole i identyfikowane jako siatkówka brzuszna. To zdjęcie pokazuje siatkówkę z lewego oka. Biegun skroniowy znajduje się pod kątem 90 stopni w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara od bieguna brzusznego, a biegun nosowy znajduje się 90 stopni zgodnie z ruchem wskazówek zegara od bieguna brzusznego.

Po opanowaniu, te techniki preparowania można wykonać dość szybko w ciągu zaledwie kilku minut, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak dokładnie i niezawodnie zorientować siatkówkę myszy przy użyciu górnego mięśnia prostego, szczeliny naczyniówki lub gradientu S-opsin jako punktu orientacyjnego.