Name: To, gdzie tniesz, ma znaczenie: przewodnik po sekcji i analizie orientacji przestrzennej siatkówki myszy na podstawie punktów orientacyjnych oczu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Poznaj metodę precyzyjnej orientacji siatkówki myszy wykorzystującą punkty orientacyjne oka i gradient S-opsyny. Technika ta umożliwia dokładne określenie biegunów siatkówki w badaniach neurobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Brittany Day i Jessice Onyak za ich pomoc techniczną oraz Dr. Liu za uprzejme umożliwienie nam korzystania ze swojego mikroskopu epifluorescencyjnego. Podziękowania za wsparcie: NIH R15EY026255-01 oraz Fundacja Karla Kirchgessnera.

<ol><li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+A+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: A single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li>
<li>Hughes, S., Watson, T. S., Foster, R. G., Peirson, S. N., Hankins, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonuniform+distribution+and+spectral+tuning+of+photosensitive+retinal+ganglion+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonuniform distribution and spectral tuning of photosensitive retinal ganglion cells of the mouse retina.</a> Curr Biol. 23 (17), 1696-1701 (2013).</li>
<li>Sondereker, K. B., Onyak, J. R., Islam, S. W., Ross, C. L., Renna, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin+ganglion+cell+outer+retinal+dendrites%3A+Morphologically+distinct+and+asymmetrically+distributed+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Melanopsin ganglion cell outer retinal dendrites: Morphologically distinct and asymmetrically distributed in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 525 (17), 3653-3665 (2017).</li>
<li>Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+space+is+represented+by+nonmatching+topographies+of+distinct+mouse+retinal+ganglion+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types.</a> Current Biology. 24 (3), 310-315 (2014).</li>
<li>Warwick, R. A., Kaushansky, N., Sarid, N., Golan, A., Rivlin-Etzion, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhomogeneous+Encoding+of+the+Visual+Field+in+the+Mouse+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhomogeneous Encoding of the Visual Field in the Mouse Retina.</a> Curr Biol. 28 (5), 655-665 (2018).</li>
<li>Valiente-Soriano, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+melanopsin+positive+neurons+in+pigmented+and+albino+mice%3A+evidence+for+melanopsin+interneurons+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Distribution of melanopsin positive neurons in pigmented and albino mice: evidence for melanopsin interneurons in the mouse retina.</a> Front Neuroanat. 8, 131(2014).</li>
<li>Sabbah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retinal+code+for+motion+along+the+gravitational+and+body+axes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A retinal code for motion along the gravitational and body axes.</a> Nature. 546 (7659), 492-497 (2017).</li>
<li>Vaney, D. I., Sivyer, B., Taylor, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direction+selectivity+in+the+retina%3A+Symmetry+and+asymmetry+in+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direction selectivity in the retina: Symmetry and asymmetry in structure and function.</a> Nat Rev Neurosci. 13 (3), 194-208 (2012).</li>
<li>Huberman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62 (3), 327-334 (2009).</li>
<li>Ueki, Y., Ramirez, G., Salcedo, E., Stabio, M. E., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Ikbkap+causes+slow%2C+progressive+retinal+degeneration+in+a+mouse+model+of+familial+dysautonomia%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Loss of Ikbkap causes slow, progressive retinal degeneration in a mouse model of familial dysautonomia.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li>
<li>Maiorano, N. A., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+perinatal+retinal+degeneration+induces+retina+reshaping+and+correlated+structural+rearrangement+of+the+retinotopic+map%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Restricted perinatal retinal degeneration induces retina reshaping and correlated structural rearrangement of the retinotopic map.</a> Nat Commun. 4, 1938(2013).</li>
<li>Hadj-Said, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+topographical+analysis+of+the+losses+of+cone+photoreceptors+and+retinal+ganglion+cells+under+taurine+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative and topographical analysis of the losses of cone photoreceptors and retinal ganglion cells under taurine depletion.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4692-4703 (2016).</li>
<li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+temporal+topography+of+the+N-Methyl-+N-nitrosourea+induced+photoreceptor+degeneration+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The temporal topography of the N-Methyl- N-nitrosourea induced photoreceptor degeneration in mouse retina.</a> Sci Rep. 5, 18612(2015).</li>
<li>Risner, M. L., Pasini, S., Cooper, M. L., Lambert, W. S., Calkins, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axogenic+mechanism+enhances+retinal+ganglion+cell+excitability+during+early+progression+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Axogenic mechanism enhances retinal ganglion cell excitability during early progression in glaucoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2018).</li>
<li>Estevez, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form+and+function+of+the+M4+cell%2C+an+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cell+type+contributing+to+geniculocortical+vision%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Form and function of the M4 cell, an intrinsically photosensitive retinal ganglion cell type contributing to geniculocortical vision.</a> J Neurosci. 32 (39), 13608-13620 (2012).</li>
<li>Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transretinal+ERG+recordings+from+mouse+retina%3A+Rod+and+cone+photoresponses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transretinal ERG recordings from mouse retina: Rod and cone photoresponses.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Lin, B., Wang, S. W., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+type%2C+size%2C+and+spacing+can+be+specified+independent+of+homotypic+dendritic+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell type, size, and spacing can be specified independent of homotypic dendritic contacts.</a> Neuron. 43 (4), 475-485 (2004).</li>
<li>Ortin-Martinez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+distribution+of+mouse+retinal+cone+photoreceptors%3A+differences+between+an+albino+%28Swiss%29+and+a+pigmented+%28C57%2FBL6%29+strain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain.</a> PLoS One. 9 (7), 102392(2014).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+degeneration+and+apoptosis+patterns+of+cone+photoreceptors+in+rd11+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The degeneration and apoptosis patterns of cone photoreceptors in rd11 Mice.</a> J Ophthalmol. 2017, 9721362(2017).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+spatial+organization+of+Muller+glia+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anatomy and spatial organization of Muller glia in mouse retina.</a> J Comp Neurol. 525 (8), 1759-1777 (2017).</li>
<li>Stabio, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+map+of+the+mouse+eye+for+orienting+retinal+topography+in+anatomical+space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space.</a> J Comp Neurol. 526 (11), (2018).</li>
<li>Lamb, T. D., Collin, S. P., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+vertebrate+eye%3A+Opsins%2C+photoreceptors%2C+retina+and+eye+cup%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evolution of the vertebrate eye: Opsins, photoreceptors, retina and eye cup.</a> Nat Rev Neurosci. 8 (12), 960-976 (2007).</li>
<li>Sterratt, D. C., Lyngholm, D., Willshaw, D. J., Thompson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+anatomical+and+visual+space+for+the+mouse+retina%3A+Computational+reconstruction+and+transformation+of+flattened+retinae+with+the+Retistruct+package%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Standard anatomical and visual space for the mouse retina: Computational reconstruction and transformation of flattened retinae with the Retistruct package.</a> PLoS Comput Biol. 9 (2), 1002921(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nie ma kompleksowego, ustandaryzowanego protokołu do określania i oznaczania orientacji izolowanej siatkówki myszy w przestrzeni anatomicznej. Szczegółowo opisany tutaj protokół próbuje wypełnić tę pustkę poprzez standaryzację i uszczegółowienie, w jaki sposób używać głębokich anatomicznych punktów orientacyjnych jako punktów odniesienia do wiarygodnej identyfikacji orientacji siatkówki. Wykazano, że głębokie anatomiczne punkty orientacyjne w tym protokole zapewniają dokładniejszą i bardziej wiarygodną metodę orientacji siatkówki myszy niż powierzchowne punkty orientacyjne, takie jak oparzenia rogówki22. Tak więc badania, które opierały się na oparzeniach rogówki w celu orientacji siatkówki, mogły mieć większe błędy w orientacji niż badania, które opierały się na punktach orientacyjnych, takich jak mięśnie proste i szczelina naczyniówki. Ta rozbieżność podkreśla potrzebę i znaczenie tego ustandaryzowanego protokołu w odniesieniu do interpretacji wyników i dokonywania porównań między badaniami, które zależą od dokładnej orientacji siatkówki. Ogólnie rzecz biorąc, ustandaryzowany protokół zapewni wspólną metodę do naśladowania przez badaczy wzroku, eliminując w ten sposób obecność zmiennej zakłócającej w pozyskiwaniu danych, która może wystąpić przy użyciu niestandardowych metod identyfikacji orientacji siatkówki.
Przedstawione tutaj metody są łatwo powtarzalne i mają zastosowanie do wielu typów protokołów eksperymentalnych. W rzeczywistości jedną z największych zalet tego protokołu jest jego zdolność adaptacji. Ponieważ stwierdzono, że szczelina naczyniówki, ekspresja s-opsyny i mięsień prosty niezawodnie identyfikują orientację siatkówki22 , punkt orientacyjny, który najlepiej odpowiada parametrom eksperymentalnym, można wybrać w celu optymalizacji pozyskiwania danych (Tabela 1). Dodatkowo metody preparacji można łączyć, aby jeszcze bardziej wyjaśnić orientację siatkówki. Na przykład nacięcia szczeliny naczyniówki można połączyć z immunohistochemią s-opsyny w celu zorientowania wszystkich czterech biegunów siatkówki: półkule nosowe i skroniowe można zidentyfikować po nacięciach szczeliny naczyniówki, a immunohistochemia s-opsyny może zidentyfikować półkule brzuszne i grzbietowe. Jednak zdolność adaptacyjna tego protokołu może być ograniczona przez wrażliwy na czas charakter eksperymentów fizjologicznych. Ponieważ czas potrzebny na zidentyfikowanie punktu orientacyjnego, oparzenie rogówki i wykonanie cięcia łagodzącego może spowodować znaczną śmierć tkanki w eksperymentach ex vivo , niektóre z tych metod preparacji mogą być mniej niż optymalne. Na szczęście, gdy sekcja zapozna się ze szczeliną naczyniówki lub metodą rozwarstwienia mięśnia prostego górnego, identyfikacja głębokich punktów orientacyjnych i szybkie wykonanie nacięć łagodzących staje się częścią rutyny preparacji i nie wydłuża znacząco sekcji. Chociaż przyznajemy, że opisane tutaj kroki mogą przyspieszyć eksperymenty, w których czas jest bardzo wrażliwy, sugerujemy użycie gradientu s-opsyny do orientacji siatkówki post hoc , gdy żywotność tkanki nie stanowi już problemu (ryc. 3). Barwienie siatkówki pod kątem s-opsyny jest skutecznym sposobem orientacji siatkówki, ponieważ może zidentyfikować wszystkie cztery bieguny: barwienie s-opsyny dzieli siatkówkę na bieguny grzbietowe i brzuszne i pozwala na identyfikację biegunów nosowych i skroniowych w zależności od tego, czy siatkówka pochodzi z prawego, czy lewego oka (ryc. 3). Dlatego uważamy, że ten protokół zapewnia niezawodny i powtarzalny zestaw metod dokładnej orientacji siatkówki, które mogą spełnić dowolne parametry eksperymentalne.
Podobnie jak w przypadku każdej zmodyfikowanej sekcji siatkówki, ważność metody rozwarstwienia jest ograniczona przez dokładność sekcji i jakość wyizolowanej tkanki. Jeśli jakakolwiek tkanka zostanie utracona podczas sekcji lub siatkówka jest zbyt zniekształcona, aby można ją było dokładnie zrekonstruować, Retistruct i program MATLAB nie będą w stanie wiarygodnie zrekonstruować lub zorientować siatkówki. Dlatego ważne jest, aby przećwiczyć metodę sekcji przed użyciem jej do eksperymentów zbierających dane. Chociaż wyjaśnione tutaj rodzaje sekcji nie są trudne, należy je ćwiczyć, aby zapewnić powtarzalność identyfikacji orientacji siatkówki z konkretnym punktem orientacyjnym. Ponadto ważne jest, aby w ramach procedury przeprowadzania sekcji przeprowadzono wizualną identyfikację anatomicznych punktów orientacyjnych przed rozpoczęciem zbierania danych, aby upewnić się, że używany jest właściwy punkt orientacyjny. Jednym ze sposobów sprawdzenia dokładności konkretnego rozgałęzienia jest wykonanie nacięć szczeliny naczyniówki lub nacięć mięśnia prostego górnego, a następnie porównanie lokalizacji nacięć z gradientem s-opsyny, ponieważ jest to stały marker, a zatem nie zależy od dokładności sekcji. Potencjalne dyssektory mogą również porównać swoje zrekonstruowane siatkówki z przykładami zrekonstruowanych siatek z dokładnymi cięciami punktów orientacyjnych, które pokazano na rycinach 1 i 2. Zasadniczo, potencjalna sekcja powinna wykonać kroki opisane w tym protokole dla określonego typu sekcji, niezależnie od tego, czy jest to górny mięsień prosty, czy metoda szczeliny naczyniówki, i porównać wyniki z gradientem s-opsyny w celu ustalenia ważności konkretnego rozsektorowania. Ponieważ jeśli sekcja nie ma pewności co do lokalizacji punktu orientacyjnego, może to spowodować niedokładną orientację siatkówki, która domyślnie wpłynie na gromadzenie i interpretację danych.

Ważnym i czasami pomijanym aspektem neuronauki siatkówki jest prawidłowa orientacja i analiza izolowanej siatkówki całomocnej, czy to orientacji siatkówki w komorze rejestrującej elektrofizjologię, czy na szkiełku histologicznym. Jest to szczególnie ważne w przypadku badań z udziałem siatkówki myszy, która jest obecnie najpowszechniej wykorzystywanym modelem do badań układu wzrokowego ssaków. Ostatnie odkrycia ujawniają, że siatkówka myszy nie jest jednorodna przestrzennie, ale ma gradienty gęstości i wielkości funkcjonalnie odrębnych typów komórek siatkówki, takich jak komórki zwojowe melanopsyny, przejściowe komórki zwojowe OFF-alfa i stożkowe opsyny1,2,3,4,5. W związku z tym metoda zastosowana do określenia orientacji siatkówki może mieć wpływ na wyniki eksperymentalne dotyczące typu komórki lub rozkładu opsyny2,3,6, dostrajanie kierunku selektywnych komórek zwojowych7,8,9 oraz topograficzne wzorce zwyrodnienia siatkówki10,11,12,13,14. W rzeczywistości nieinformowanie o tym, w jaki sposób zgłaszana jest orientacja siatkówki, może powodować rozbieżności w literaturze i zamieszanie podczas próby porównania danych między badaniami. Dlatego tak ważne jest, aby naukowcy przedstawili metodę identyfikacji orientacji siatkówki, aby można było dokładnie zinterpretować wyniki takich badań.
Orientacja siatkówki jest zwykle identyfikowana na podstawie oceny rogówki grzbietowej, brzusznej, nosowej lub skroniowej przed enukleacją oka1,3,12,15,16,17,18,19 lub wycinając lub barwiąc głębokie anatomiczne punkty orientacyjne oka, takie jak mięśnie zewnątrzgałkowe6,7, szczelina naczyniówki20,21, lub gradient s-opsin2,3. Mięśnie proste można wykorzystać do identyfikacji siatkówki grzbietowej, brzusznej, nosowej i skroniowej poprzez wykonanie głębokiego cięcia łagodzącego, które przecina na pół przyczep odpowiednio mięśnia prostego górnego, prostego dolnego, prostego przyśrodkowego lub bocznego mięśnia prostego. Jednak w większości eksperymentów użycie jednego mięśnia prostego jest wystarczające do orientacji siatkówki22. Szczelina naczyniówki, która jest pozostałością po rozwoju oka, może być postrzegana jako słaba pozioma linia z tyłu oka. Każdy koniec tej linii kończy się na biegunie nosowym lub skroniowym globu23. Wreszcie, ekspresja s-opsyny jest asymetrycznie rozprowadzana do brzusznej siatkówki u myszy, a przeciwciała s-opsyny mogą być użyte do odsłonięcia siatkówki brzusznej w eksperymentach immunohistochemicznych1.
Ostatnia praca Stabio, et al.22 wykazał, że powierzchowne punkty orientacyjne oka, takie jak oparzenia rogówki, są mniej wiarygodną metodą orientowania siatkówki w przestrzeni anatomicznej, najprawdopodobniej z powodu błędu ludzkiego i zmienności w powodowaniu oparzenia rogówki podczas używania skroniowej i przyśrodkowej kanty jako punktów odniesienia. W przeciwieństwie do tego, wykazano, że głębokie punkty orientacyjne, takie jak mięsień prosty górny, szczelina naczyniówki i gradient s-opsyny, są bardziej wiarygodnymi i dokładnymi punktami orientacyjnymi do orientacji siatkówki22. Jednak identyfikacja tych anatomicznych punktów orientacyjnych wymaga unikalnych etapów sekcji, które nie są szczegółowo opisane w literaturze. Dlatego celem tego protokołu jest zapewnienie kompleksowego samouczka na temat tego, jak używać mięśnia prostego górnego, szczeliny naczyniówki i gradientu s-opsyny do dokładnej identyfikacji orientacji przestrzennej siatkówki myszy. Ponadto dołączyliśmy porównanie skuteczności dwóch przeciwciał s-opsyny, a także protokół immunohistochemii s-opsyny.
Dodatkowym wyzwaniem dla badań opierających się na precyzyjnej orientacji siatkówki są duże nacięcia odciążające wymagane do spłaszczenia całych siatkówk na komorze rejestracyjnej, czaszy lub szkiełku. Może to stanowić wyzwanie dla analizy tego, co naturalnie jest strukturą trójwymiarową, gdy jest obrazowane jako płaska struktura dwuwymiarowa. Program o nazwie Retistruct24 może być użyty do przywrócenia płaskiej, całościowej siatkówki do jej trójwymiarowej struktury, zanim zebrane z niej dane zostaną przeanalizowane. W związku z tym sekcja tego protokołu jest poświęcona podkreśleniu kroków, które są niezbędne do użycia oprogramowania Retistruct do rekonstrukcji siatkówek myszy barwionych immunologicznie s-opsyną. Dołączyliśmy również sekcję protokołu do korzystania z naszego niestandardowego skryptu MATLAB, który został opracowany do dokładnego obracania i orientowania siatkówek myszy zabarwionych s-opsyną.

<table><tbody><tr><td>0,1 M sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P5244</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny Axioplan2</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bezbarwny lakier do paznokci</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Corning LSE Low Speed Orbital Shaker</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS6780FP</td><td></td></tr><tr><td>Costar 24-dołkowe płytki z powłoką TC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3524</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty-kozioł Alexa 594</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty-Królik Alexa 594</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>Osioł Normalna surowica</td><td>miliporowa</td><td>566460</td><td>Stosować w dawce 5,2% (52 &mu; L z 86 &mu; L 20% Triton X-100 i 863 &mu; L 0,1 M PBS na 1 ml roztworu blokującego)</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand Superfrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-s-opsyna</td><td>Santa Cruz Biotechnologies&nbsp;</td><td>sc-14363</td><td>Niedostępne komercyjnie od 2017</td></tr> r. <tr><td>Graefe Zakrzywione kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ lub FIJI</td><td>National Institute of Health</td><td>N/A</td><td>Bezpłatnie dostępne oprogramowanie</td></tr><tr><td>Kauteryzacja niskotemperaturowa Okulistyczny kauteryzator z cienką końcówką</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA00</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>Przynajmniej wersja 2007b lub nowsze</td></tr><tr><td>Okulary Micro Cover &nbsp;</td><td>VWR International</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotacki przesuwne</td><td>VWR International</td><td>82020-913</td><td></td></tr><tr><td>Ultracienkie kleszcze Moira</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej&nbsp;</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa</td><td>Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15714-S Stosować</td><td>przy 4% (25 &mu; L oraz 875 &mu; L 0,1 M PBS na 1 ml utrwalacza</td></tr>)<tr><td>Igła PrecisionGlide 20G (0,90 mm x 25 mm)&nbsp;</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Szkło Pyrex Szalka Petriego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3160152</td><td></td></tr><tr><td>R</td><td>Projekt R do obliczeń statystycznych</td><td>Nie dotyczy</td><td>Bezpłatnie dostępne oprogramowanie; wersja 3.4.3 lub nowsza</td></tr><tr><td>Anty-s-opsin królika</td><td>Millipore</td><td>ABN1660</td><td></td></tr><tr><td>Retiga R3 Kamera mikroskopowa</td><td>Qimaging</td><td>01-RET-R3-R-CLR-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Retistruct</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Swobodnie dostępne oprogramowanie&nbsp; kompatybilne z Windows 7 lub Windows 10</td></tr><tr><td>Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-390-5</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Użyj 1.7% (86 &mu; L 20% Triton-X z 52 &mu; L Surowicy Normalnej Osła i 863 &mu; L 0,1 M PBS na 1 ml roztworu blokującego)</td></tr><tr><td>Nożyczki do rozwarstwiania Vannas Spring&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop USB 5MP Aparat cyfrowy</td><td>AmScope</td><td>MU500</td><td>Do użytku z mikroskopem preparacyjnym Olympus</td></tr></tbody></table>

to, gdzie tniesz, ma znaczenie: przewodnik po sekcji i analizie orientacji przestrzennej siatkówki myszy na podstawie punktów orientacyjnych oczu

Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

Dokładne i niezawodne identyfikowanie orientacji przestrzennej izolowanej siatkówki myszy jest ważne dla wielu badań w neuronauce wizualnej, w tym analizy gradientów gęstości i wielkości typów komórek siatkówki, dostrajania kierunku selektywnych komórek zwojowych oraz badania topograficznych wzorców degeneracji w niektórych chorobach siatkówki. Istnieje jednak wiele różnych metod rozwarstwiania oka opisanych w literaturze, które są używane do identyfikacji i oznaczania orientacji siatkówki w siatkówce myszy. Chociaż metoda orientacji stosowana w takich badaniach jest często pomijana, nieraportowanie, w jaki sposób określa się orientację siatkówki, może powodować rozbieżności w literaturze i zamieszanie podczas próby porównania danych między badaniami. Powierzchowne punkty orientacyjne oka, takie jak oparzenia rogówki, są powszechnie stosowane, ale ostatnio wykazano, że są mniej wiarygodne niż głębsze punkty orientacyjne, takie jak mięśnie proste, szczelina naczyniówki lub gradient s-opsyny. W tym miejscu przedstawiamy obszerny przewodnik dotyczący korzystania z głębokich punktów orientacyjnych oka w celu dokładnego przeanalizowania i udokumentowania orientacji przestrzennej izolowanej siatkówki myszy. Porównaliśmy również skuteczność dwóch przeciwciał s-opsyny i dołączyliśmy protokół immunohistochemii s-opsyny. Ponieważ orientacja siatkówki zgodnie z gradientem s-opsyny wymaga rekonstrukcji siatkówki za pomocą oprogramowania Retistruct i rotacji za pomocą niestandardowego kodu, przedstawiliśmy ważne kroki wymagane do korzystania z obu tych programów. Ogólnie rzecz biorąc, celem tego protokołu jest dostarczenie niezawodnego i powtarzalnego zestawu metod dokładnej orientacji siatkówki, który można dostosować do większości protokołów eksperymentalnych. Nadrzędnym celem tej pracy jest standaryzacja metod orientacji siatkówki na potrzeby przyszłych badań.

Pojedyncze nacięcie odciążające, które przecina mięsień prosty górny, pozwala na dokładną i niezawodną identyfikację grzbietowej części siatkówki (Rycina 1). Szczelina naczyniówki umożliwia dokładną i niezawodną identyfikację nosowej i skroniowej części siatkówki dzięki głębokim nacięciom odciążającym wzdłuż skroniowej i nosowej szczeliny naczyniówki (Rycina 2). W tym przykładzie wykonano również nacięcie odciążające w grzbietowej części siatkówki w celu zidentyfikowania osi grzbietowo-brzusznej siatkówki (Rycina 2D, strzałka pionowa). Kroki tych procesów zostały przedstawione w celu umożliwienia ich powtórzenia przez przyszłych badaczy wykonujących preparaty. Połączenie immunohistochemii s-opsyny (Rycina 3A oraz 3D), rekonstrukcji za pomocą oprogramowania Retistruct (3B, 3E) oraz precyzyjnej rotacji przy użyciu niestandardowego kodu MATLAB (3C, 3F) pozwala na identyfikację brzusznej i grzbietowej połowy siatkówki, a także biegunów nosowego i skroniowego, jeśli wiadomo, czy siatkówka pochodzi z prawego, czy z lewego oka (Rycina 3). Porównaliśmy również dwa powszechnie stosowane przeciwciała pierwszorzędowe przeciwko s-opsynie pod kątem skuteczności w znakowaniu czopków s-opsynowych (Rycina 4A-D): zarówno kozie przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko s-opsynie, jak i królicze przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko s-opsynie skutecznie znakują czopki s-opsynowe (Rycina 4E) u tej samej myszy.
Nacięcia odciążające zidentyfikowano na zrekonstruowanych siatkówkach barwionych immunohistochemicznie na s-opsynę, a ich lokalizację porównano z orientacją wyznaczoną przez gradient s-opsyny. Przy użyciu autorskiego kodu MATLAB (patrz Materiały uzupełniające), siatkówki zostały precyzyjnie obrócone tak, aby najwyższe stężenie barwienia s-opsyny znajdowało się brzusznie, co pozwoliło wyznaczyć prawdziwą stronę grzbietową na 90° (dla mięśnia prostego górnego), prawdziwą stronę nosową na 0° (dla nosowej szczeliny naczyniówkowej) oraz prawdziwą stronę skroniową na 180° (dla skroniowej szczeliny naczyniówkowej). Wartość kąta każdego poszczególnego nacięcia odciążającego określono za pomocą narzędzia do pomiaru kątów w programie ImageJ po obrocie siatkówek zgodnie z gradientem s-opsyny. Obliczono średni kąt dla każdego rodzaju nacięcia odciążającego, a następnie naniesiono średnią wartość dla każdego typu nacięcia na wykres polarny (Rycina 6). Średnio nacięcia mięśnia prostego górnego wyznaczyły biegun grzbietowy na 96,3 ± 4,3° (n = 11) (Rycina 6). Nosowa szczelina naczyniówkowa wyznaczyła biegun nosowy na 6,7 ± 5,8°, a skroniowa szczelina naczyniówkowa wyznaczyła biegun skroniowy na 172,0 ± 4,4° (n = 9; Rycina 6).
<img alt="Badanie optyczne anatomii oka; obraz mikroskopowy przedstawiający wypalenie grzbietowe i wpływ mięśnia prostego górnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Wykorzystanie mięśnia prostego górnego do dokładnej identyfikacji siatkówki grzbietowej prawego oka. (A) Przykład grzbietowego wypalenia rogówki w pobliżu granicy rogówkowo-twardówkowej wykonanego za pomocą pisaka z końcówką kauteryzacyjną (biała strzałka). W tym widoku widoczny jest również mięsień prosty górny (biała strzałka). (B) Przykład całej zamontowanej siatkówki z nacięciem odciążającym wykonanym w siatkówce grzbietowej poprzez przecięcie mięśnia prostego górnego. Strzałka wskazuje głębokie nacięcie odciążające wykonane w siatkówce grzbietowej poprzez przecięcie mięśnia prostego górnego. Siatkówka została zabarwiona przeciwciałem pierwszorzędowym kozim anty-s-opsin (patrz Tabela materiałów) oraz przeciwciałem wtórnym oslim anty-kozim Alexa 594 (patrz Tabela materiałów; wzbudzenie: 590 nm; emisja: 620 nm) (cyjan). Obraz siatkówki wykonano za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego z filtrem Texas Red (595 nm). (C) Siatkówka zrekonstruowana w programie Retistruct i obrócona za pomocą niestandardowego kodu MATLAB (patrz Materiały uzupełniające) z widocznym nacięciem odciążającym mięśnia prostego górnego (biała strzałka). D: grzbietowo (dorsal), V: brzusznie (ventral), T: skroniowo (temporal), N: nosowo (nasal). Paski skali = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat anatomii oka przedstawiający analizę grzbietowego wypalenia i szczeliny naczyniówki w badaniu rozwojowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Wykorzystanie szczeliny naczyniówki do dokładnej identyfikacji bieguna nosowego i skroniowego siatkówki prawego oka. (A) Przykład grzbietowego wypalenia rogówki w pobliżu granicy rogówkowo-twardówkowej wykonanego za pomocą pisaka kauteryzacyjnego. (B) Szczelina naczyniówki widoczna na twardówce z tyłu oka (biała strzałka). W tym widoku widoczne jest również grzbietowe wypalenie rogówki, znajdujące się około 90° od skroniowej szczeliny naczyniówki. (C) Szczelina naczyniówki widoczna na twardówce z tyłu oka, biegnąca od nerwu wzrokowego do granicy rogówkowo-twardówkowej. (D) Siatkówka barwiona przeciwciałem kozim anty-s-opsin (patrz Tabela materiałów) oraz przeciwciałem wtórnym oslim anty-kozie Alexa 594 (patrz Tabela materiałów; wzbudzenie: 590 nm; emisja: 620 nm) (cyjan) z nacięciami szczeliny naczyniówki (strzałki poziome) i grzbietowym nacięciem odciążającym (strzałka pionowa). Obrazowanie siatkówki wykonano za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego z filtrem Texas Red (595 nm). (E) Siatkówka zrekonstruowana w programie Retistruct i obrócona za pomocą niestandardowego kodu MATLAB (patrz Materiały uzupełniające), z widocznym grzbietowym nacięciem odciążającym oraz nacięciami nosowej i skroniowej szczeliny naczyniówki (białe strzałki). D: grzbietowy, V: brzuszny, T: skroniowy, N: nosowy. Paski skali = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat mapowania siatkówki; przedstawia wzorce prawej i lewej siatkówki z siatkami współrzędnych biegunowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wykorzystanie gradientu s-opsyny do identyfikacji wszystkich czterech biegunów siatkówki. (A) Przykład siatkówki wypreparowanej z prawego oka, która została poddana immunobarwieniu w celu znakowania s-opsyny i zobrazowana za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego z filtrem Texas Red (595 nm). Cięcia w tej siatkówce są przypadkowe, ponieważ orientacja topograficzna jest określana przez gradient s-opsyny. (B) Wyniki rekonstrukcji siatkówki z panelu A przy użyciu programu Retistruct. Zauważmy, że gradient s-opsyny nie jest prawidłowo wyrównany, ponieważ siatkówka nie została przetworzona za pomocą niestandardowego kodu MATLAB (patrz Materiały uzupełniające). (C) Wyniki obrotu siatkówki z panelu A za pomocą niestandardowego kodu. Siatkówka została obrócona tak, aby najwyższe stężenie barwienia s-opsyny znajdowało się na dole i zostało zidentyfikowane jako część brzuszna siatkówki. Ponieważ siatkówka pochodzi z prawego oka, biegun skroniowy znajduje się 90° przeciwnie do ruchu wskazówek zegara od bieguna grzbietowego, a biegun nosowy znajduje się 90° zgodnie z ruchem wskazówek zegara od bieguna grzbietowego. (D) Przykład siatkówki wypreparowanej z lewego oka, która została poddana immunobarwieniu w celu znakowania s-opsyny i zobrazowana za pomocą filtra Texas Red (595 nm). Cięcia w tej siatkówce są przypadkowe, ponieważ orientacja topograficzna jest określana przez gradient s-opsyny. (E) Wyniki cyfrowej rekonstrukcji siatkówki z panelu D przy użyciu programu Retistruct. Zauważmy, że gradient s-opsyny nie jest prawidłowo wyrównany, ponieważ siatkówka nie została obrócona za pomocą niestandardowego kodu. (F) Wyniki obrotu siatkówki z panelu D za pomocą niestandardowego kodu. Siatkówka została obrócona tak, aby najwyższe stężenie barwienia s-opsyny znajdowało się na dole i zostało zidentyfikowane jako część brzuszna siatkówki. Ponieważ siatkówka pochodzi z lewego oka, biegun nosowy znajduje się 90° przeciwnie do ruchu wskazówek zegara od bieguna grzbietowego, a biegun skroniowy znajduje się 90° zgodnie z ruchem wskazówek zegara od bieguna grzbietowego. D: grzbietowy, V: brzuszny, T: skroniowy, N: nosowy. Paski skali = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza immunohistochemiczna; przeciwciała kozie vs królicze przeciwko s-opsyninie; diagram i wykres słupkowy wyników." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Porównanie dwóch pierwszorzędowych przeciwciał przeciwko s-opsyninie w znakowaniu czopków s-opsyninowych. (A) Siatkówka barwiona kozim pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko s-opsyninie (patrz Tabela materiałów). (B) Druga siatkówka tej samej myszy barwiona króliczym pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko s-opsyninie (patrz Tabela materiałów). (C) Reprezentatywny obszar (0,1 x 0,1 mm2) z siatkówki barwionej kozim pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko s-opsyninie. Obraz wykonany za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego przy powiększeniu 40X. (D) Reprezentatywny obszar (0,1 x 0,1 mm2) z siatkówki barwionej króliczym przeciwciałem przeciwko s-opsyninie (patrz Tabela materiałów), alternatywnym przeciwciałem pierwszorzędowym. Obraz wykonany za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego przy powiększeniu 40X. (E) Oba przeciwciała znakują taką samą liczbę segmentów zewnętrznych czopków s, ponieważ nie stwierdzono istotnej różnicy w liczbie immunopozytywnych czopków s barwionych przez kozie przeciwciało przeciwko s-opsyninie i królicze przeciwciało przeciwko s-opsyninie przy żadnej z badanych ekscentryczności siatkówki (n = 2; ANOVA z testem post hoc Bonferroniego; p &gt;0,05). Paski skali = 1 mm (A-B); 25 µm (C-D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Interfejs oprogramowania do śledzenia i analizy neuronów; schematy przedstawiające drogi nerwowe i wykresy biegunowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Przewodnik wizualny po użytkowaniu oprogramowania Retistruct w celu rekonstrukcji siatkówek poddanych immunobarwieniu na s-opsynę. (A) Siatka otwarta w programie Retistruct z widocznym obrysem i dodanym „rozdarciem” (Tear). Punkty „rozdarcia” są wskazane nałożonymi białymi strzałkami. Wszystkie nacięcia w tej siatce są przypadkowe, ponieważ podczas sekcji nie wykorzystano żadnego konkretnego punktu orientacyjnego do oznaczenia orientacji siatkówki. Ważne przyciski są obramowane na czerwono. (B) Siatka ze wszystkimi dodanymi „rozdarciami” i zidentyfikowaną częścią grzbietową siatkówki, oznaczoną literą „D” na krawędzi. Zauważ, że przycisk „Reconstruct Retina” jest teraz widoczny. Ważne przyciski są obramowane na czerwono. (C) Proces rekonstrukcji siatkówki. Po prawej stronie pojawi się wykres biegunowy zrekonstruowanej siatkówki, pokazujący nacięcia odciążające w kolorze cyjanowym (nałożone niebieskie strzałki wyjaśniają lokalizację nacięć). (D) Końcowy wynik przetwarzania siatkówki w programie Retistruct. Oryginalna siatkówka w preparacie całego organu (wholemount) pozostaje po lewej stronie, a zrekonstruowana siatkówka pojawia się po prawej. Nacięcia odciążające są widoczne w kolorze cyjanowym (nałożone białe strzałki wyjaśniają lokalizację nacięć). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat mięśni gałki ocznej pokazujący średnie kąty mięśni; wykres kołowy z markerami kierunkowymi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Mięsień prosty górny oraz szczelina naczyniówkowa mogą być wykorzystane do precyzyjnej orientacji siatkówki myszy. Wykres polarny kątów uzyskanych z nacięć odciążających mięśnia prostego górnego lub nacięć szczeliny naczyniówkowej w siatkówkach zrekonstruowanych za pomocą programu Retistruct. Nacięcia odciążające zidentyfikowano na zrekonstruowanych siatkówkach z immunobarwieniem s-opsyny, a ich położenie porównano z położeniem gradientu s-opsyny. Wykorzystując specjalistyczny kod MATLAB do precyzyjnego obrotu siatkówek tak, aby najwyższe stężenie barwienia s-opsyny znajdowało się brzusznie, dla każdej siatkówki określono rzeczywistą stronę grzbietową (90° dla mięśnia prostego górnego), rzeczywistą stronę nosową (0° dla nosowej szczeliny naczyniówkowej) oraz rzeczywistą stronę skroniową (180° dla skroniowej szczeliny naczyniówkowej). Wartość kąta każdego pojedynczego nacięcia odciążającego określono w programie ImageJ, a następnie obliczono średni kąt dla każdego rodzaju nacięcia odciążającego. Nacięcia mięśnia prostego górnego wskazały biegun grzbietowy przy 96,3 ± 4,3° (n = 11). Nosowa szczelina naczyniówkowa wskazała biegun nosowy przy 6,7 ± 5,8°, a skroniowa szczelina naczyniówkowa wskazała biegun skroniowy przy 172,0 ± 4,5° (n = 9). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Głęboki Punkt Orientacyjny</td>
			<td>Lokalizacja oparzenia rogówki</td>
			<td>Zidentyfikowano biegun siatkówki</td>
			<td>Zastosowanie eksperymentalne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mięsień prosty górny</td>
			<td>Grzbietowy</td>
			<td>Grzbietowy</td>
			<td>Żywe lub utrwalone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szczelina naczyniówkowa nosowa </td>
			<td>Grzbietowy</td>
			<td>Nosowy</td>
			<td>Żywe lub utrwalone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przednia szczelina naczyniówkowa kąta skroniowego </td>
			<td>Grzbietowy</td>
			<td>Czasowy</td>
			<td>Żywe lub utrwalone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gradient S-opsyny</td>
			<td>Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.</td>
			<td>Grzbietowy, brzuszny, nosowy, skroniowy</td>
			<td>Utrwalony</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Głębokie punkty orientacyjne, identyfikowany przez nie biegun siatkówki oraz informacja, czy mogą być one stosowane w tkance żywej lub utrwalonej.

Ten protokół dostarcza obszernego przewodnika po sekcji i analizie do wykorzystania głębokich punktów orientacyjnych oka, immunohistochemii s-opsyn, Retistruct i niestandardowego kodu do dokładnej i niezawodnej orientacji izolowanej siatkówki myszy w przestrzeni anatomicznej.

To, gdzie tniesz, ma znaczenie: przewodnik po sekcji i analizie orientacji przestrzennej siatkówki myszy na podstawie punktów orientacyjnych oczu

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

Celem tego protokołu preparacji jest zapewnienie znormalizowanej metodologii wykorzystania anatomicznych punktów orientacyjnych oka, takich jak mięśnie proste, szczelina naczyniówki i gradient S-opsyny do orientacji topograficznej siatkówki myszy. Główną zaletą tych technik jest to, że zapewniają one niezawodny sposób dokładnej identyfikacji biegunów grzbietowych, brzusznych, nosowych i skroniowych izolowanej siatkówki myszy. Zacznij od zidentyfikowania punktu na grzbietowej rogówce w pobliżu granicy twardówki rogówki oraz między kantą nosową a skroniową.Dotknij rogówki rozgrzanym pisakiem do kauteryzacji na mniej niż sekundę, aby utworzyć ślad oparzenia w celach orientacyjnych. Powtórz dla drugiego oka. Obecność oparzenia grzbietowego pozwala na identyfikację mięśnia prostego górnego.Do enukleacji użyj zakrzywionych kleszczy, aby delikatnie wypchnąć oko z oczodołu i chwycić gałkę od spodu. Następnie powoli wyjmij kulę ziemską z gniazda, jednocześnie delikatnie przesuwając ją od lewej do prawej, aż kula zostanie zwolniona z gniazda. Przenieś kulę ziemską z dołączonymi mięśniami prostymi na szalkę Petriego zawierającą podłoże preparacyjne.Jeśli pracujesz z oboma oczami, pamiętaj, aby śledzić, które oko jest lewym okiem, a które prawym okiem. W zakresie sekcji zlokalizuj wzrokowo oparzenie grzbietowej rogówki i zidentyfikuj mięsień prosty górny, z którym jest związany. Za pomocą nożyczek preparacyjnych lub igły o rozmiarze 20 przebij rogówkę w miejscu oparzenia.Następnie wykonaj głębokie nacięcie łagodzące w kuli ocznej w kierunku nerwu wzrokowego, aby przeciąć mięsień górny. Izolowana siatkówka z tym cięciem jest widoczna tutaj, a zrekonstruowana siatkówka z tym cięciem jest pokazana tutaj. Użyj dwóch zestawów kleszczy, aby rozpocząć izolację siatkówki, delikatnie rozrywając otwór wykonany za pomocą nakłucia, aż część siatkówki zostanie odsłonięta.Następnie oddziel siatkówkę od twardówki, aż twardówka zostanie całkowicie usunięta. Usuń tęczówkę, soczewkę, ciało szkliste i wszelkie pozostałe struktury, aż siatkówka zostanie całkowicie odizolowana. Obecność oparzenia grzbietowego pozwala na identyfikację szczeliny naczyniówki nosowej i skroniowej.W przypadku pracy z prawym okiem szczelina naczyniówki nosa znajduje się po prawej stronie oparzenia, a skroniowa szczelina naczyniówki znajduje się po lewej stronie oparzenia. Jest to odwrotność pracy z lewym okiem. Aby użyć punktu orientacyjnego szczeliny naczyniówki do określenia orientacji siatkówki, zlokalizuj i zidentyfikuj szczelinę naczyniówki z tyłu oka.Ustaw kulę ziemską tak, aby ślad oparzenia grzbietowego znajdował się na górnym biegunie, tak jak by to było, gdyby oko nadal znajdowało się w myszy. Następnie użyj nożyczek do rozwarstwiania lub igły o rozmiarze 20, aby wykonać jedno nakłucie w kuli ziemskiej, najpierw w miejscu, w którym znajduje się oparzenie grzbietowe. Następnie wykonaj płytkie cięcie łagodzące w kierunku nerwu wzrokowego, w którym znajduje się oparzenie grzbietowej rogówki.Następnie wykonaj następujące dwa głębokie nacięcia łagodzące w kierunku nerwu wzrokowego. Jeden przez wyrównanie ostrzy nożyczek preparacyjnych do linii skroniowej szczeliny naczyniówki z tyłu oka, a drugi przez wyłożenie ostrzy nożyczek preparacyjnych do linii szczeliny naczyniówki nosowej z tyłu oka. Nacięcia te są pokazane tutaj na izolowanej i zrekonstruowanej siatkówce.Po wykonaniu tych nacięć użyj dwóch zestawów kleszczy, aby delikatnie oderwać otwory po nakłuciu, aż część siatkówki zostanie odsłonięta. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj cztery odciążające nacięcia w siatkówce, tak aby leżała płasko. Zamontuj siatkówkę, komórką zwojową do góry, na membranie nitrocelulozowej, delikatnie dociskając każdy róg siatkówki do błony za pomocą kleszczy.Następnie za pomocą kleszczy zanurz zamontowaną siatkówkę w jednym mililitrze 4% paraformaldehydu zawartego w pierwszym dołku 24-dołkowej płytki. Umieść 24-dołkową płytkę na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej i utrwal siatkówkę dokładnie na 40 minut. Po utrwaleniu przenieś siatkówkę do drugiego dołka płytki, który jest wypełniony jednym mililitrem 0,1 molowego PBS i myj siatkówkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Po zakończeniu mycia przenieś zamontowaną siatkówkę do piątej studzienki zawierającej jeden mililitr roztworu blokującego i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia dodać pierwszorzędowe przeciwciało anty-S-opsyny królika do roztworu blokującego w stężeniu od jednego do 500 i inkubować przez trzy dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po trzydniowej inkubacji przemyj nadmiar przeciwciała pierwszorzędowego z siatkówki sześć razy, umieszczając je kolejno w sześciu studzienkach wypełnionych jednym mililitrem PBS na 10 minut każdy w temperaturze pokojowej.Następnie umieść umytą siatkówkę w studzience ze świeżym roztworem blokującym i dodaj przeciwciało wtórne przeciwko królikowi Alexa 594. Inkubuj siatkówkę z przeciwciałem drugorzędowym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji przemyj siatkówkę w PBS sześć razy, tak jak poprzednio.Za pomocą kleszczy przenieś zamontowaną siatkówkę na szalkę Petriego zawierającą PBS. Uwolnij siatkówkę z błony nitrocelulozowej, delikatnie wkładając końcówki kleszczyków między siatkówkę a błonę, aż siatkówka przestanie być przyczepiona. Zanurz szklane szkiełko mikroskopowe w PBS i zamontuj siatkówkę na szkiełku, unosząc ją na szkiełku i delikatnie szturchając kleszkami, aż siatkówka przyklei się do szkła.Przykryj siatkówkę na szkiełku podłożem montażowym i umieść szkiełko nakrywkowe 1,5. Umieść szkiełko w tacce na suwaki i pozostaw je w temperaturze pokojowej na godzinę. Po godzinie umieść tackę na szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po przykryciu szkiełka na 24 godziny użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić boki szkiełka, aby zapobiec wysuszeniu. Jest to przykład siatkówki wyizolowanej z prawego oka, która została wybarwiona immunologicznie w celu znakowania S-opsyny i zobrazowana za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. Ważne jest, aby pamiętać, że nacięcia w tej siatkówce są arbitralne, ponieważ orientację topograficzną można zidentyfikować za pomocą gradientu S-opsyny.Uzyskany obraz siatkówki może być następnie zrekonstruowany cyfrowo za pomocą oprogramowania ReadiStruct. Oryginalne cięcia są pseudo-pokolorowane na czerwono na tym obrazie. Zauważ, że plik wyjściowy tego programu nie wyrównuje prawidłowo siatkówki.Po przepuszczeniu siatkówki przez niestandardowy kod maty laboratoryjnej, siatkówka jest obracana tak, aby najwyższe stężenie barwienia S-opsyny było umieszczane na dole i identyfikowane jako siatkówka brzuszna. To zdjęcie pokazuje siatkówkę z lewego oka. Biegun skroniowy znajduje się pod kątem 90 stopni w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara od bieguna brzusznego, a biegun nosowy znajduje się 90 stopni zgodnie z ruchem wskazówek zegara od bieguna brzusznego.Po opanowaniu, te techniki preparowania można wykonać dość szybko w ciągu zaledwie kilku minut, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak dokładnie i niezawodnie zorientować siatkówkę myszy przy użyciu górnego mięśnia prostego, szczeliny naczyniówki lub gradientu S-opsin jako punktu orientacyjnego.

where-you-cut-matters-dissection-analysis-guide-for-spatial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Formalna prezentacja sekcji oka myszy, prowadząca do uzyskania preparatu całego nabłonka barwnikowego siatkówki.

Disekcja oka myszy w celu wykonania preparatu całego zamontowania nabłonka pigmentowego siatkówki

Source: Jagodzińska, J., et. al., optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy . J. Vis. Exp. (2017)  W tym filmie pokazujemy zastosowanie optycznej koherentnej tomografii w domenie spektralnej (SD-OCT) do obrazowania warstw siatkówki i oceny zmian strukturalnych w genetycznie zmodyfikowanym modelu myszy z neuropatią nerwu wzrokowego.

Obrazowanie in vivo siatkówki myszy za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Usunięcie oczu, zwane również enukleacją, stanowi użyteczną strategię do badania aspektów plastyczności wizualnej, międzymodalnej i rozwojowej wzdłuż układu wzrokowego ssaków, ponieważ powoduje nieodwracalną częściową (jednooczną) lub całkowitą (obuoczną) utratę wzroku. W tym miejscu opisujemy wysoce powtarzalne i proste podejście do przeprowadzania enukleacji in vivo.

Wysoce powtarzalna i prosta metoda wykonywania enukleacji oka in vivo u myszy po otwarciu oka

Opracowaliśmy poziome przygotowanie siatkówki dorosłego ssaka z płaszczyzną przekroju równoległą do powierzchni siatkówki. Pola dendrytyczne neuronów siatkówki o orientacji niepromieniowej nie zostały obcięte, co pozwoliło na badanie przetwarzania sygnału za pomocą patch-clamp i technik obrazowania.

Przygotowanie poziomych wycinków siatkówki dorosłej myszy do badań elektrofizjologicznych

Ten manuskrypt opisuje protokół obrazowania in vivo siatkówki myszy za pomocą optycznej koherentnej tomografii spektralnej o wysokiej rozdzielczości (SD-OCT). Koncentruje się na komórkach zwojowych siatkówki (RGC) w okolicy okołobrodawkowatej, z opisanymi kilkoma podejściami do skanowania i kwantyfikacji.

Optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy in vivo

Ten raport opisuje kompleksowe metody przygotowania zamrożonych wycinków siatkówki myszy do immunohistochemii (IHC).  Opisane metody obejmują rozwarstwienie tylnej części gałki ocznej, utrwalanie paraformaldehydu, osadzanie w pożywkach o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i orientację tkanki, cięcie i barwienie immunologiczne.

Przygotowanie kriosekcji siatkówki myszy do immunohistochemii

Tutaj opisujemy użycie optycznej koherentnej tomografii spektralnej (SD-OCT) do wizualizacji struktur siatkówki i oka in vivo w modelach zwyrodnienia siatkówki, jaskry, retinopatii cukrzycowej i krótkowzroczności.

Strukturalne oceny in vivo chorób oczu w modelach gryzoni przy użyciu optycznej koherentnej tomografii

Tutaj opisujemy technikę obrazowania in vivo wykorzystującą optyczną koherentną tomografię ułatwiającą diagnozę i ilościowy pomiar retinopatii u myszy.

Zastosowanie optycznej koherentnej tomografii do mysiego modelu retinopatii

Ten artykuł przedstawia protokół mikropreparacji oka u gryzoni. Proces ten polega na wyłuszczeniu gałki ocznej wraz z błoną naszywkową (tj. Trzecią powieką). Następnie następuje oddzielenie tylnej i przedniej części gałki ocznej.

Mikrodysekcja oka gryzonia

Obecny protokół przedstawia kroki do wyrównania in vivo obrazów światłowodowej optycznej koherentnej tomografii koherentnej (vis-OCTF) in vivo z obrazami konfokalnymi ex vivo tej samej siatkówki myszy w celu weryfikacji obserwowanej morfologii pęczka aksonów komórek zwojowych siatkówki na obrazach in vivo.

Wyrównanie światłowodów światłowodowej koherentnej tomografii koherentnej w świetle widzialnym z obrazami konfokalnymi tej samej siatkówki myszy

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Poznaj metodę precyzyjnej orientacji siatkówki myszy wykorzystującą punkty orientacyjne oka i gradient S-opsyny. Technika ta umożliwia dokładne określenie biegunów siatkówki w badaniach neurobiologicznych.

To, gdzie tniesz, ma znaczenie: przewodnik po sekcji i analizie orientacji przestrzennej siatkówki myszy na podstawie punktów orientacyjnych oczu (Wideo) | JoVE Journal

To, gdzie tniesz, ma znaczenie: przewodnik po sekcji i analizie orientacji przestrzennej siatkówki myszy na podstawie punktów orientacyjnych oczu

Przeglądaj więcej filmów