Eksperymentalny protokół badania profili reakcji behawioralnych u larw ryb: zastosowanie do neurostymulantu kofeiny
24 lipca 2018
Tutaj prezentujemy protokół do badania aktywności lokomotorycznej larw danio pręgowanego i strzebli grubogłowych oraz reakcji fotomotorycznych (PMR) za pomocą automatycznego oprogramowania śledzącego. Po włączeniu do powszechnych testów biologicznych toksykologicznych, analizy tych zachowań stanowią narzędzie diagnostyczne do badania bioaktywności chemicznej. Protokół ten jest opisany przy użyciu kofeiny, modelowego neurostymulantu.
Modele ryb mają wiele zalet i w związku z tym są coraz częściej stosowane w naukach biomedycznych. Od rozwoju po odkrywanie leków i badania toksykologiczne. Zachowanie modeli ryb jest również coraz częściej wykorzystywane w badaniach środowiskowych i biomedycznych.
W tym przypadku szczególnie ważne jest wykorzystanie dziesięcioleci doświadczeń badawczych w zakresie toksykologii wodnej i ekologii behawioralnej w celu rozwoju nauk biomedycznych o środowisku. Nasza metoda może być wykorzystana do zrozumienia bioaktywności chemikaliów oraz korzyści i zagrożeń, jakie mogą one stwarzać. Główną zaletą tego protokołu jest to, że zapewnia czułe i szybkie podejście do zrozumienia diagnostycznie działań chemicznych przydatnych dla nauk środowiskowych i biomedycznych.
Implikacje tej techniki mają na celu wsparcie diagnozy komercyjnych bioarativity i efektów behawioralnych. W większości tych substancji chemicznych często brakuje ważnych informacji o toksyczności. Można go jednak również zastosować do zrozumienia wpływu innych chemikaliów, takich jak farmaceutyki i pestycydy.
Ten aspekt jest ważny do rozważenia, ponieważ często brakuje danych porównawczych z zakresu farmakologii środowiskowej i toksykologii w odniesieniu do związków przemysłowych. Oprócz pomiaru aktywności lokomotorycznej larw podczas zmiany jasnych, ciemnych fotoperiodów, protokół ten może być stosowany do pomiaru reakcji fotomotorycznych larw. Które skutecznie badają wielkość różnicy ruchu między przejściami światła do ciemności i ciemności do światła.
Na początek rozpuść kofeinę w odtworzonej twardej wodzie. Następnie wykonaj seryjne rozcieńczenia, aby uzyskać niższy poziom kofeiny. Aby przygotować poszczególne komory ekspozycyjne, wlej 20 mililitrów roztworu do czterech 100-mililitrowych szklanych zlewek dla danio pręgowanego.
Wlej 200 mililitrów roztworu do trzech szklanych zlewek o pojemności 500 mililitrów dla rybek grubogłowych. Następnie za pomocą pipety transferowej umieść 10 zarodków danio pręgowanego w wieku od czterech do sześciu godzin po zapłodnieniu w każdej ze zlewek. Za pomocą zmodyfikowanej pipety transferowej umieścić 10 larw strzebli grubogłowych dojrzewających w ciągu 24 godzin od wyklucia się do każdej z komór ekspozycyjnych.
Umieść komory danio pręgowanego i strzebli grubogłowej w inkubatorze. Po 96 godzinach załaduj pojedyncze ryby do oddzielnych dołków z 48 i 24 dołkami. Umieścić płytkę studzienkową z co najmniej jedną larwą ryby w komorze rejestracyjnej.
Następnie w oprogramowaniu do śledzenia wideo kliknij plik generuj protokół. W polu Liczba lokalizacji w oknie dialogowym wprowadź liczbę pojedynczych studzienek na płycie studziennej. I kliknij OK.At górę ekranu, kliknij wyświetl pełny ekran.
Aby wyświetlić widok z kamery nad głową płyty studzienki. Następnie kliknij ikonę rysowania obszarów. Wybierz ikonę koła w obszarze oznaczonym etykietą.
Za pomocą kursora narysuj okrągły obszar śledzenia wideo w lewym górnym rogu płyty. Wybierz prawy górny znacznik i obrysuj obszar wyświetlania w prawym górnym rogu. Następnie wybierz dolny znak, aby dobrze obrysować prawy dolny róg.
Po zdefiniowaniu obszarów śledzenia odwiertów kliknij przycisk buduj, aby wyświetlić monit o wyznaczenie przez oprogramowanie obszarów wyświetlania pozostałych odwiertów. W obszarze kalibracji kliknij przycisk rysuj skalę i narysuj poziomą linię w poprzek płyty. Po narysowaniu linii pojawi się okno dialogowe oznaczone pomiarem kalibracji.
Wprowadź długość płytki studzienki w tym polu i kliknij przycisk OK. Kliknij przycisk Zastosuj do grupy w obszarze kalibracji. Aby wyjść z menedżera rysunków, kliknij ikonę obszarów rysowania. Następnie kliknij ikonę kafelków.
Za pomocą kursora podświetl wszystkie pola, które pojawiają się na ekranie wyświetlania, tak aby każde pole było zielone. Kliknij Widok i pełny ekran. Następnie w polu Próg wykrywania kliknij bkg i użyj paska regulacji progu, aby ustawić próg wykrywania pikseli.
Po wybraniu odpowiedniego progu kliknij przycisk Zastosuj do grupy. W polu oznaczonym próg ruchu wprowadź żądane parametry śledzenia prędkości ruchu. Po ustawieniu parametrów prędkości kliknij przycisk Zastosuj do grupy.
Następnie kliknij parametry protokołu z menu rozwijanego. W oknie dialogowym wybierz zakładkę czas i wprowadź czasy obserwacji i integracji. Kliknij OK i otwórz okno dialogowe ustawień sterownika światła, wybierając opcję Light Driving z menu rozwijanego parametrów.
Ustaw czasy okresu jasnego, ciemnego zdjęcia i intensywność światła dla każdego okresu zdjęciowego. Następnie kliknij przycisk OK. Następnie zapisz protokół obserwacji.
Najpierw umieść płytkę studzienkową zawierającą ryby doświadczalne w komorze zapisu behawioralnego. Następnie otwórz wcześniej opracowany protokół śledzenia. W przeglądarce śledzenia wideo upewnij się, że wszystkie larwy są widoczne, że w każdej studzience znajduje się tylko jedna larwa i że studzienki są wyrównane ze zdefiniowanymi obszarami obserwacji.
Następnie kliknij eksperyment i wykonaj. Określ nazwę i lokalizację zapisu danych. I kliknij ikonę kilku obrazów na żywo, aby podświetlić wszystkie predefiniowane obszary wyświetlania.
Na koniec zamknij panel komory nagrywania i kliknij tło, a następnie start na monitorze komputera. Po 96 godzinach ekspozycji na kofeinę reakcja fotomotoryczna larw strzebli grubogłowych została zmieniona przez kofeinę na niższych poziomach niż danio pręgowanego. Jednak u danio pręgowanego zainfekowano znacznie większą liczbę punktów końcowych fotomotoryki.
Dodatkowo analizowano jasną i ciemną aktywność lokomotoryczną w trzech progach prędkości dla przebytej odległości, liczby ruchów i czasu trwania ruchów. U obu gatunków kofeina hamowała aktywność w ogóle istotnie wpływając na lokomotoryczne punkty końcowe. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o powiązaniu testów behawioralnych z wąskim określonym przedziałem czasowym.
Ponieważ pora dnia może wpływać na zachowanie larw ryb. Zgodnie z tą procedurą, metody mogą być stosowane do znormalizowanych wytycznych dotyczących innych substancji chemicznych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania związane z zachowaniem ryb. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obserwować zachowania i reakcje fotomotoryczne modeli larw ryb podczas wykonywania testów biologicznych toksyczności ze znormalizowanymi wytycznymi dotyczącymi nauk środowiskowych i biomedycznych.
Nie zapominaj, że praca z niektórymi chemikaliami może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tego protokołu należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół badania aktywności lokomotorycznej oraz odpowiedzi fotomotorycznej larw zebrafisha i głowienia w użyciu zautomatyzowanego oprogramowania do śledzenia. Metoda ta ma na celu usprawnienie biotestów toksykologicznych poprzez dostarczenie informacji o bioaktywności substancji chemicznych, co zilustrowano na przykładzie stosowania kofeiny jako modelowego neurostymulanta.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Ekologia behawioralna
- Toksykologia wodna
- Badania biomedyczne
Wprowadzenie
- Modele rybie są coraz częściej wykorzystywane w naukach biomedycznych.
- Badania behawioralne u ryb mogą dostarczyć istotnych informacji dla badań środowiskowych i biomedycznych.
- Zrozumienie bioaktywności chemicznej jest kluczowe dla oceny korzyści i zagrożeń.
- Często brakuje porównawczych danych z zakresu farmakologii i toksykologii środowiskowej.
Cel badania
- Opracowanie czułej i szybkiej metody oceny aktywności chemicznej.
- Wsparcie diagnostyki komercyjnych bioaktywności i efektów behawioralnych.
- Zapewnienie zestandaryzowanego podejścia do oceny wpływu różnych substancji chemicznych.
Zastosowane metody
- Rozpuszczanie kofeiny w zrekonstytuowanej twardej wodzie w celu ekspozycji.
- Wykorzystanie zautomatyzowanego oprogramowania do śledzenia w celu analizy reakcji lokomotorycznych i fotomotorycznych.
- Przeprowadzanie rozcieńczeń seryjnych w celu oceny różnych stężeń kofeiny.
- Monitorowanie zachowania larw ryb podczas cykli światła i ciemności.
Główne wyniki
- Kofeina zmieniła reakcje fotomotoryczne u gorzaczków w niższych stężeniach niż u danio pręgowanych.
- U danio pręgowanych zaobserwowano większą liczbę zaburzeń w końcowych punktach pomiaru fotomotoryki.
- U obu gatunków odnotowano zahamowanie aktywności we wszystkich końcowych punktach pomiaru lokomocji.
- Pora dnia znacząco wpływa na zachowanie larw ryb.
Wnioski
- Protokół zapewnia ramy dla oceny efektów behawioralnych substancji chemicznych.
- Metody mogą zostać zestandaryzowane dla innych substancji chemicznych w celu zbadania dodatkowych kwestii.
- Takie podejście zwiększa zrozumienie zachowania ryb w badaniach toksykologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia szybkie profilowanie behawioralne larw ryb w celu oceny wpływu związków neuroaktywnych, co wspiera wczesną walidację celów w neurofarmakologii. Dzięki ilościowemu określeniu odpowiedzi fotomotorycznych i lokomotorycznych dostarcza on informacji o mechanizmach działania, które pomagają zredukować ryzyko związane ze związkami aktywnymi w obrębie OUN przed rozpoczęciem testów na ssakach. Porównawcza wrażliwość między danio pręgowanym a głowaczem amerykańskim daje przewagę translacyjną w zakresie gatunkowo specyficznego przesiewu behawioralnego w kontekstach środowiskowych i biomedycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez pomiar zmian behawioralnych indukowanych neurostymulantami w modelach larwalnych ryb.
- Wartość operacyjna: Umożliwienie funkcjonalnej walidacji celu poprzez mierzalne punkty końcowe w zakresie fotomotoryki i lokomocji.
- Wartość prognostyczna: Wsparcie w selekcji portfolio poprzez identyfikację związków wywołujących istotne efekty behawioralne w stężeniach istotnych środowiskowo.
Przesiewy i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane testy behawioralne do późniejszego przesiewu związków z wykorzystaniem automatycznego śledzenia.
- Wyniki ilościowe: Generuje mierzalne dane dotyczące lokomocji i fotomotoryki w różnych progach prędkości w celu potwierdzenia trafień.
- Powtarzalność: Standaryzuje protokoły cyklu światło/ciemność, aby zapewnić spójne odczyty behawioralne w różnych eksperymentach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla jednostek chorobowych: Modeluje odpowiedzi neurofarmakologiczne istotne dla oddziaływania na cele terapeutyczne w zaburzeniach OUN.
- Ciągłość translacyjna: Łączy behawioralną ekotoksykologię z badaniami biomedycznymi poprzez zachowane punkty końcowe zachowań.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez wskazanie gatunkowych różnic w wrażliwości na związki neuroaktywne.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesne etapy procesów odkrywania leków, wspierając testowanie hipotez i identyfikację wiodących związków poprzez fenotypowanie behawioralne larw ryb poddanych działaniu związków neuroaktywnych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia wyjaśnienie szlaków sygnałowych poprzez powiązanie ekspozycji na związek ze zmianami w zachowaniach fotomotorycznych i lokomocyjnych.
- Przesiewowość: Dostarcza gotowych do analizy, powtarzalnych odczytów behawioralnych do porównywania efektów działania związków.
- Analityka: Zapewnia ilościowe progi ruchu oraz wskaźniki odpowiedzi fotomotorycznej do analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Łączy ekotoksykologię behawioralną z przedkliniczną neurofarmakologią za pomocą konserwatywnych testów behawioralnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę profilowania behawioralnego z możliwością ponownego wykorzystania, którą można zastosować do różnorodnych bibliotek chemicznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w przesiewie związków neuroaktywnych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i skalowalność testów behawioralnych pomiędzy gatunkami i laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnego ograniczania ryzyka w przypadku związków aktywnych w OUN.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko w oparciu o ilościowe progi efektu behawioralnego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli larw ryb oraz w obsłudze oprogramowania do śledzenia zachowań.
- Zależne od zautomatyzowanych systemów śledzenia wideo i kontrolowanych inkubatorów środowiskowych.
- Wymaga standaryzacji protokołów ekspozycji i definicji punktów końcowych zachowań pomiędzy zespołami.
- Przy planowaniu testów należy uwzględnić dobową zmienność zachowań.
- Ograniczone do punktów końcowych zachowań; nie zastępuje walidacji mechanistycznej ani walidacji celów molekularnych.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) dot. biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
1:46
Exposing Fish to Chemical Treatment
2:53
Calibration of Video-tracking Parameters
5:56
Observation of Larval Fish Locomotor and Photomotor Behavior
7:00
Results: Caffeine Significantly Alters Zebrafish and Fathead Minnow Behavior
7:43
Conclusion
