Eksperymentalny protokół badania profili reakcji behawioralnych u larw ryb: zastosowanie do neurostymulantu kofeiny

Modele ryb mają wiele zalet i w związku z tym są coraz częściej stosowane w naukach biomedycznych. Od rozwoju po odkrywanie leków i badania toksykologiczne. Zachowanie modeli ryb jest również coraz częściej wykorzystywane w badaniach środowiskowych i biomedycznych.

W tym przypadku szczególnie ważne jest wykorzystanie dziesięcioleci doświadczeń badawczych w zakresie toksykologii wodnej i ekologii behawioralnej w celu rozwoju nauk biomedycznych o środowisku. Nasza metoda może być wykorzystana do zrozumienia bioaktywności chemikaliów oraz korzyści i zagrożeń, jakie mogą one stwarzać. Główną zaletą tego protokołu jest to, że zapewnia czułe i szybkie podejście do zrozumienia diagnostycznie działań chemicznych przydatnych dla nauk środowiskowych i biomedycznych.

Implikacje tej techniki mają na celu wsparcie diagnozy komercyjnych bioarativity i efektów behawioralnych. W większości tych substancji chemicznych często brakuje ważnych informacji o toksyczności. Można go jednak również zastosować do zrozumienia wpływu innych chemikaliów, takich jak farmaceutyki i pestycydy.

Ten aspekt jest ważny do rozważenia, ponieważ często brakuje danych porównawczych z zakresu farmakologii środowiskowej i toksykologii w odniesieniu do związków przemysłowych. Oprócz pomiaru aktywności lokomotorycznej larw podczas zmiany jasnych, ciemnych fotoperiodów, protokół ten może być stosowany do pomiaru reakcji fotomotorycznych larw. Które skutecznie badają wielkość różnicy ruchu między przejściami światła do ciemności i ciemności do światła.

Na początek rozpuść kofeinę w odtworzonej twardej wodzie. Następnie wykonaj seryjne rozcieńczenia, aby uzyskać niższy poziom kofeiny. Aby przygotować poszczególne komory ekspozycyjne, wlej 20 mililitrów roztworu do czterech 100-mililitrowych szklanych zlewek dla danio pręgowanego.

Wlej 200 mililitrów roztworu do trzech szklanych zlewek o pojemności 500 mililitrów dla rybek grubogłowych. Następnie za pomocą pipety transferowej umieść 10 zarodków danio pręgowanego w wieku od czterech do sześciu godzin po zapłodnieniu w każdej ze zlewek. Za pomocą zmodyfikowanej pipety transferowej umieścić 10 larw strzebli grubogłowych dojrzewających w ciągu 24 godzin od wyklucia się do każdej z komór ekspozycyjnych.

Umieść komory danio pręgowanego i strzebli grubogłowej w inkubatorze. Po 96 godzinach załaduj pojedyncze ryby do oddzielnych dołków z 48 i 24 dołkami. Umieścić płytkę studzienkową z co najmniej jedną larwą ryby w komorze rejestracyjnej.

Następnie w oprogramowaniu do śledzenia wideo kliknij plik generuj protokół. W polu Liczba lokalizacji w oknie dialogowym wprowadź liczbę pojedynczych studzienek na płycie studziennej. I kliknij OK.At górę ekranu, kliknij wyświetl pełny ekran.

Aby wyświetlić widok z kamery nad głową płyty studzienki. Następnie kliknij ikonę rysowania obszarów. Wybierz ikonę koła w obszarze oznaczonym etykietą.

Za pomocą kursora narysuj okrągły obszar śledzenia wideo w lewym górnym rogu płyty. Wybierz prawy górny znacznik i obrysuj obszar wyświetlania w prawym górnym rogu. Następnie wybierz dolny znak, aby dobrze obrysować prawy dolny róg.

Po zdefiniowaniu obszarów śledzenia odwiertów kliknij przycisk buduj, aby wyświetlić monit o wyznaczenie przez oprogramowanie obszarów wyświetlania pozostałych odwiertów. W obszarze kalibracji kliknij przycisk rysuj skalę i narysuj poziomą linię w poprzek płyty. Po narysowaniu linii pojawi się okno dialogowe oznaczone pomiarem kalibracji.

Wprowadź długość płytki studzienki w tym polu i kliknij przycisk OK. Kliknij przycisk Zastosuj do grupy w obszarze kalibracji. Aby wyjść z menedżera rysunków, kliknij ikonę obszarów rysowania. Następnie kliknij ikonę kafelków.

Za pomocą kursora podświetl wszystkie pola, które pojawiają się na ekranie wyświetlania, tak aby każde pole było zielone. Kliknij Widok i pełny ekran. Następnie w polu Próg wykrywania kliknij bkg i użyj paska regulacji progu, aby ustawić próg wykrywania pikseli.

Po wybraniu odpowiedniego progu kliknij przycisk Zastosuj do grupy. W polu oznaczonym próg ruchu wprowadź żądane parametry śledzenia prędkości ruchu. Po ustawieniu parametrów prędkości kliknij przycisk Zastosuj do grupy.

Następnie kliknij parametry protokołu z menu rozwijanego. W oknie dialogowym wybierz zakładkę czas i wprowadź czasy obserwacji i integracji. Kliknij OK i otwórz okno dialogowe ustawień sterownika światła, wybierając opcję Light Driving z menu rozwijanego parametrów.

Ustaw czasy okresu jasnego, ciemnego zdjęcia i intensywność światła dla każdego okresu zdjęciowego. Następnie kliknij przycisk OK. Następnie zapisz protokół obserwacji.

Najpierw umieść płytkę studzienkową zawierającą ryby doświadczalne w komorze zapisu behawioralnego. Następnie otwórz wcześniej opracowany protokół śledzenia. W przeglądarce śledzenia wideo upewnij się, że wszystkie larwy są widoczne, że w każdej studzience znajduje się tylko jedna larwa i że studzienki są wyrównane ze zdefiniowanymi obszarami obserwacji.

Następnie kliknij eksperyment i wykonaj. Określ nazwę i lokalizację zapisu danych. I kliknij ikonę kilku obrazów na żywo, aby podświetlić wszystkie predefiniowane obszary wyświetlania.

Na koniec zamknij panel komory nagrywania i kliknij tło, a następnie start na monitorze komputera. Po 96 godzinach ekspozycji na kofeinę reakcja fotomotoryczna larw strzebli grubogłowych została zmieniona przez kofeinę na niższych poziomach niż danio pręgowanego. Jednak u danio pręgowanego zainfekowano znacznie większą liczbę punktów końcowych fotomotoryki.

Dodatkowo analizowano jasną i ciemną aktywność lokomotoryczną w trzech progach prędkości dla przebytej odległości, liczby ruchów i czasu trwania ruchów. U obu gatunków kofeina hamowała aktywność w ogóle istotnie wpływając na lokomotoryczne punkty końcowe. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o powiązaniu testów behawioralnych z wąskim określonym przedziałem czasowym.

Ponieważ pora dnia może wpływać na zachowanie larw ryb. Zgodnie z tą procedurą, metody mogą być stosowane do znormalizowanych wytycznych dotyczących innych substancji chemicznych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania związane z zachowaniem ryb. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obserwować zachowania i reakcje fotomotoryczne modeli larw ryb podczas wykonywania testów biologicznych toksyczności ze znormalizowanymi wytycznymi dotyczącymi nauk środowiskowych i biomedycznych.

Nie zapominaj, że praca z niektórymi chemikaliami może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tego protokołu należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.