Ocena toksyczności substancji chemicznych za pomocą systemu badań przesiewowych reakcji na drgania danio pręgowanego

Podczas badań przesiewowych substancji chemicznych pod kątem toksyczności aktualnym wyzwaniem eksperymentalnym jest określenie skutków toksycznych in vivo, z uwzględnieniem złożoności całego organizmu, i zrobienie tego w sposób szybki i wysokoprzepustowy. Korzystając z odczytu behawioralnego, który monitoruje reakcję ucieczki zarodków danio pręgowanego na bodziec wibracyjny, nasz system pozwala nam zidentyfikować związki, które zakłócają funkcje neuronalne lub mięśniowe. Ponieważ martwe zarodki nie poruszają się, wychwytujemy również związki, które powodują śmiertelność poprzez niespecyficzną toksyczność.

Prezentowany przez nas system może być zbudowany za niewielką cenę i można go dostosować do własnych potrzeb. Jest również łatwy w utrzymaniu, a wszystkie elementy można wymienić. Obecnie korzystamy z systemu testów zaskoczenia w ramach konsorcjum PrecisionTox w celu określenia dawki związku chemicznego do pozyskiwania danych OMICZNYCH.

Dane są generowane na pięciu organizmach modelowych i ludzkich liniach komórkowych. Zostaną one wykorzystane do wyprowadzenia szlaków toksyczności i biomarkerów do przewidywania toksyczności dla ludzi. Na początek zbierz zarodki w fazie rozszczepienia, a konkretnie od stadium dwukomórkowego do ośmiokomórkowego z naturalnego tarła na 10-centymetrowej szalce Petriego.

Usuń niezapłodnione jaja, zanieczyszczenia i łuski z szalki Petriego, aby ją oczyścić. Umieścić 60 zarodków na jednej szalce Petriego zawierającej 15 mililitrów pożywki E3. Umieść wszystkie naczynia zawierające zarodki w wilgotnej komorze przygotowanej z nasączonych wodą ręczników papierowych.

Następnie inkubuj je 72 godziny po zapłodnieniu w inkubatorze ustawionym na 28,5 stopnia Celsjusza. Następnie wyjmij żądane chemiczne roztwory podstawowe z zamrażarki o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i pozwól im się rozmrozić. Przygotować seryjne rozcieńczenia każdej substancji chemicznej w pożywce E3 w szklanej butelce.

Sprawdzić roztwór pod kątem wytrącania się, a jeśli jest obecny, zarejestrować go, a następnie dalej rozcieńczyć, aby osiągnąć następne najwyższe stężenie. Sprawdź i powtarzaj, aż nie będzie opadów. Następnie sprawdź i zapisz pH roztworu ekspozycyjnego.

Jeśli wykracza poza zakres pH od 7,0 do 8,5, dostosuj go do 7,4 za pomocą kwasu solnego lub wodorotlenku sodu. Wszelkie niewykorzystane media ekspozycyjne należy utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami. Na początek zbierz zarodek danio pręgowanego i hoduj go do 72 godzin po zapłodnieniu w inkubatorze w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza.

Jednocześnie przygotuj chemikalia do badania w pożądanym stężeniu. Zbadaj zarodki po 72 godzinach od zapłodnienia. Usuń martwe lub niewyklute zarodki.

Umieść 10 zarodków w każdym sześciocentymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej z dziewięcioma mililitrami pożywki E3. Są to tak zwane płyty naświetlowe. Oznacz każdą płytkę naświetlacyjną nazwą związku, stężeniem narażenia i numerem powtórzenia.

Dodaj jeden mililitr roztworu ekspozycyjnego do każdej płytki, zaczynając od najniższego stężenia, i delikatnie zakręć płytką. W przypadku związków o niskiej rozpuszczalności zastąp całe 10 mililitrów pożywki roztworem ekspozycyjnym. Zapisać kolejność, w jakiej roztwory złożone zostały dodane do zarodków.

Następnie inkubuj płytki w wilgotnej komorze w inkubatorze w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Aby rozpocząć test przestraszenia wibracyjnego, włącz komputer i urządzenie wibracyjne. Utwórz arkusz kalkulacyjny dla pliku konfiguracyjnego.

Dołącz informacje o ekspozycji dla każdej z pięciu pozycji płytki, określając związek, stężenie i kontrpróbę. Otwórz ogólny interfejs użytkownika lub program GUI dla zestawu do testowania rozboju wibracyjnego. Wybierz różne pozycje w programie GUI, aby sprawdzić ruch kamery i obserwować reakcję kamery.

Wyjąć płytki z próbkami z inkubatora. Umieść je w pięciu wyznaczonych pozycjach i pozwól zarodkom osiąść przez kilka minut. W programie GUI kliknij Nagraj, a pojawi się nowe okno.

W tym oknie należy wybrać przygotowany wcześniej plik konfiguracyjny. Sprawdź, czy opis próbki jest zgodny z próbkami w każdej pozycji. Obserwuj, jak dioda LED włącza się, gdy impuls dźwiękowy jest aktywowany przez program.

Po nagraniu kamera powróci do pierwszej pozycji, a oprogramowanie rozpocznie kompresję plików. Zastąp zmierzone próbki następnym zestawem i kontynuuj następny przebieg, jak pokazano. Następnie zebrać roztwory ekspozycyjne ze wszystkich mierzonych płytek za pomocą sita, aby jednocześnie zatrzymać zarodki.

Aby rozpocząć analizę danych, otwórz dane wideo za pomocą VirtualDub lub innego oprogramowania do przeglądania. Wizualnie oceń liczbę zarodków reagujących na impuls dźwiękowy. Zapisz nazwę związku, powtórzoną próbę, stężenie związku i procent nieruchomych zarodków w arkuszu kalkulacyjnym.

Przeprowadź analizę stężenia wzorcowego przy użyciu przepływu pracy KNIME z osadzonymi skryptami języka R. Ocena nieruchliwości w nieleczonych zarodkach typu dzikiego wykazała średnią nieruchliwość wynoszącą 14,33% po poddaniu bodźcowi wibracyjnemu z różnicami w różnych lęgach. Obliczenia stężenia wzorcowego dla wpływu tricainy na ruchliwość wykazały zmniejszenie ruchliwości przy stężeniu 1%, zaprzestając aktywności powyżej 2,5%, przy stężeniu wzorcowym 50 wynoszącym 164,9 mikromola.

Przykład testu suboptymalnego wykazał niespójności w reakcjach zarodka, co sugeruje problemy rozwojowe wpływające na odporność reakcji na zaskoczenie.