Name: Ocena toksyczności substancji chemicznych za pomocą systemu badań przesiewowych reakcji na drgania danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Poznaj metodę oceny toksyczności związków chemicznych za pomocą reakcji na drgania embrionów Danio rerio. System umożliwia szybkie badanie neurotoksyczności i śmiertelności w całym organizmie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za doskonałą pomoc techniczną personelu pomocniczego w obiekcie rybnym IBCS-BIP i centrum przesiewowym. Prace te otrzymały dofinansowanie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 na podstawie umowy o udzielenie dotacji nr 965406 (PrecisionTox). Wynik ten odzwierciedla jedynie pogląd autorów, a Unia Europejska nie ponosi odpowiedzialności za jakiekolwiek wykorzystanie zawartych w nim informacji.

Wszystkie hodowle i obchodzenie się z danio pręgowanym zostały przeprowadzone zgodnie z niemieckimi standardami ochrony zwierząt i zatwierdzone przez rząd Badenii-Wirtembergii, Regierungspräsidium Karlsruhe, Niemcy (Aktenzeichen 35-9185.64/BH KIT).
1. Przygotowanie roztworów podstawowych substancji chemicznych do badania
<ol>
	<li>Oznaczyć szklaną fiolkę (lub podwielokrotność chemiczną) nazwą/skrótem związku, stężeniem podstawowym i datą przygotowania. Na przykład CdCl2_2,5 g·L-1_210813.</li>
	<li>Odwirować podwielokrotność chemiczną przy 2000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Pod wyciągiem zważyć związek (jeśli to konieczne) na wadze czułej na 0,001 g i przenieść go do oznakowanej fiolki. Jeśli związek jest płynny, dodaj go do fiolki za pomocą pipety i plastikowej końcówki do pipety. 
	UWAGA: Na przykład dla zapasu metanosulfonianu trikainy użytego w przykładzie wyników pokazanym w Rysunek 2, 400 mg zostało zważone do oznakowanej fiolki.</li>
	<li>Dodać rozpuszczalnik (np. sterylną czystą wodę lub dimetylosulfotlenek (DMSO), w zależności od właściwości fizykochemicznych związków) za pomocą pipety i plastikowej końcówki do pipety. Jeśli to możliwe, preferowanym rozpuszczalnikiem jest woda. 
	UWAGA: Na przykład dla wywaru z tricainy przygotowano 15,3 mM roztwór w 100 ml wody.</li>
	<li>Zamknąć fiolkę, delikatnie wstrząsnąć i sprawdzić, czy nie ma opadów.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczone roztwory podstawowe (jeśli to konieczne) w szklanych fiolkach za pomocą pipet i plastikowych końcówek do pipet. 
	UWAGA: Na przykład, dalsze rozcieńczanie nie było konieczne w przypadku materiału trikainowego.</li>
	<li>Przechowywać roztwór podstawowy (roztwory) podstawowy (roztwory) podstawowy w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Pozostałą podwielokrotność substancji chemicznej należy przechowywać w tych samych warunkach, co poprzednio.</li>
	<li>Zapisz informacje o podwielokrotnościach zapasów w notatniku laboratoryjnym.</li>
</ol>
2. Zbieranie i hodowla zarodków danio pręgowanego
<ol>
	<li>Zebrać zarodki w fazie rozszczepienia (stadium 2-8 komórek) z naturalnego tarła krzyżówek grupowych w 10 cm szalkach do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Wybierz partię o odpowiedniej jakości: mniej niż 10% niezapłodnionych/martwych jaj.</li>
	<li>Umyj naczynia (usuń niezapłodnione jaja, zanieczyszczenia, łuski itp.).</li>
	<li>Umieść 60 zarodków na 10 cm naczyniu do hodowli tkankowej w 15 ml pożywki E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4)25.</li>
	<li>Umieść naczynia w nawilżonej komorze przygotowanej przez ułożenie ręczników papierowych nasączonych wodą.</li>
	<li>Hodować zarodki do temperatury 72 hpf w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie roboczego rozcieńczenia chemikaliów do testowania
<ol>
	<li>Wyjmij roztwór podstawowy z zamrażarki o temperaturze -20 °C i pozwól mu się rozmrozić.</li>
	<li>Jeżeli rozpuszczalność związku jest wystarczająco wysoka, należy przygotować seryjne rozcieńczenia w pożywce E3 w szklanych butelkach, 1 ml na kontrpróbę na stężenie. Upewnij się, że stężenie jest 10 razy wyższe niż pożądane stężenie ekspozycji. Pozwala to uniknąć konieczności zmiany całego podłoża zarodków na początku ekspozycji. W przypadku niskiej rozpuszczalności należy przygotować seryjne rozcieńczenia bezpośrednio przy pożądanych stężeniach ekspozycji, 10 ml na kontrpróbę na stężenie.</li>
	<li>Sprawdź, czy nie ma opadów (jeśli to konieczne). Jeśli roztwór się wytrącił, zapisz to, a następnie rozcieńcz, aby osiągnąć następne najwyższe stężenie. Sprawdź ponownie, czy nie ma opadów. Powtarzaj, aż nie będzie opadów.</li>
	<li>Sprawdź pH roztworu ekspozycyjnego. Jeśli pH wykracza poza zakres 7,0-8,5, należy to zanotować i przygotować roztwory w E3 zawierające 5 mM HEPES/pH 7,4, dostosowując pH za pomocą HCl lub NaOH.</li>
	<li>Niewykorzystane media ekspozycyjne należy utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami.</li>
</ol>
4. Wystawienie embrionów na działanie substancji chemicznych, które mają być badane
<ol>
	<li>Sprawdź szalki ze starymi zarodkami 72 hpf pod kątem martwych/niewyklutych zarodków i usuń je. Jeśli partia zarodków zawiera więcej niż 5% niewyklutych jaj, należy usunąć partię.</li>
	<li>Umieścić 10 zarodków na 6 cm naczyniu do hodowli tkankowej w 9 ml pożywki E3 (płytka ekspozycyjna).</li>
	<li>Oznacz tabliczki naświetlające nazwą związku, stężeniem narażenia i numerem repliki. Na przykład "CdCl2 1 mg·L-1 01". W razie potrzeby dołączyć wystarczającą ilość płytek zawierających tylko E3 i płytkę kontrolną rozpuszczalnika (patrz punkt 5).</li>
	<li>Dodaj 1 ml roztworu ekspozycyjnego do każdej płytki, zaczynając od najniższego stężenia, i zamieszaj płytkę. W przypadku związków o niskiej rozpuszczalności należy zastąpić całe 10 ml płytki roztworem ekspozycyjnym (patrz krok 3.2).</li>
	<li>Zapisać kolejność czasową, w jakiej roztwory złożone zostały dodane do zarodków.</li>
	<li>Inkubować płytki w wilgotnej komorze w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C przez 48 godzin, aż osiągną 120 hpf.</li>
</ol>
5. Przeprowadzanie testu wibracji przestraszenia
UWAGA: Przeanalizuj płytki w tej samej kolejności, jak w kroku 4.5. Do każdego przejazdu powinna być dołączona tabliczka kontrolna E3.
<ol>
	<li>Włącz komputer i urządzenie wibracyjne (niebieska dioda LED powinna się świecić).</li>
	<li>Przygotuj plik konfiguracyjny w arkuszu kalkulacyjnym, jak pokazano w Rysunek 1D i załączony jako plik uzupełniający 1. Zapisać informacje o ekspozycji dla każdej z 5 pozycji płytki (związek, stężenie, kontrpróba).</li>
	<li>Otwórz program ogólnego interfejsu użytkownika (GUI) (dostępny pod adresem https://git.scc.kit.edu/xk4962/vibration-startle-assay-kit , identyfikator projektu 43215.)</li>
	<li>Sprawdź ruch kamery, wybierając różne pozycje w programie GUI i obserwując ruch kamery.</li>
	<li>Wyjąć z inkubatora płytki z próbkami do pomiaru. Umieść płytki z próbkami w 5 pozycjach (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1A, "głośniki") i pozwól zarodkom osiąść przez kilka minut.</li>
	<li>Kliknij na Nagraj; otworzy się okno, w którym można wybrać plik konfiguracyjny.</li>
	<li>Wybierz odpowiedni plik konfiguracyjny przygotowany w kroku 5.2 dla tego przebiegu.</li>
	<li>Sprawdzić, czy opis próbki odpowiada próbkom w każdej pozycji (1-5).</li>
	<li>Pomiar zostanie przeprowadzony automatycznie (10 s / pozycję). Gdy impuls dźwiękowy zostanie przyłożony przez program, włącza się dioda LED. Zapis przez 10 s/pozycję pozwala na uzyskanie wystarczającej ilości danych, aby oszacować prędkość pływania i przebyty dystans zarówno przed, jak i po zastosowaniu bodźca oraz zapobiega przyzwyczajeniu się do kolejnych bodźców.</li>
	<li>Po zakończeniu nagrywania kamera wraca do pozycji 1, a oprogramowanie rozpoczyna kompresję plików. W tym czasie zastąp próbki następnym zestawem, który należy zmierzyć.</li>
	<li>Przejdź do kroku 5.2, aby nagrać następny przebieg.</li>
	<li>Po zmierzeniu wszystkich płytek zbierz roztwory ekspozycyjne. Użyj sita, aby zatrzymać zarodki.</li>
	<li>Poddaj zarodki eutanazji przez szybkie schłodzenie w kąpieli lodowo-izopropanolowej (5%).</li>
	<li>Roztwory ekspozycyjne i martwe zarodki należy utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Otwórz dane wideo za pomocą VirtualDub (1.10.4).</li>
	<li>Oceń wizualnie liczbę zarodków reagujących na impuls dźwiękowy (gdy świeci się kontrolna dioda LED).</li>
	<li>Wprowadzanie danych do arkusza kalkulacyjnego. Zapisz nazwę związku, kontrpróbę, stężenie związku i procent nieruchomych zarodków zgodnie ze wzorem dostarczonym w pliku uzupełniającym 2, który zawiera przykładowy zestaw danych pokazany w Rysunek 2C. 
	UWAGA: Szablon ma elastyczną strukturę i zasadniczo umożliwia zastosowanie do danych innych organizmów i punktów końcowych. Opisano w nim reakcje dla każdego stężenia, a także przedstawiono opisy punktów końcowych, a także definicje parametrów generowanych w późniejszym modelowaniu stężenie-odpowiedź.</li>
	<li>Przeprowadź analizę stężenia wzorcowego (BMC) przy użyciu przepływu pracy KNIME (KNIME analytics 4.626) z osadzonymi skryptami R (R wersja 3.6., R-packages plotrix, drc i bmd27,28). 
	UWAGA: Zasadniczo ocenę można również przeprowadzić bezpośrednio w R. Jednak dla wygody i umożliwienia oceny jako usługi internetowej, analiza została zorganizowana w przepływie pracy zgodnym z serwerem KNIME. Dane wyjściowe przepływu pracy KNIME znajdują się w pliku uzupełniającym 3. Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat parametrów statystycznych generowanych przez przepływ pracy KNIME, zapoznaj się z tym szablonem. Parametry statystyczne służące do oszacowania stopnia dopasowania oraz progi pozwalające zaakceptować wyznaczone wartości BMC przedstawiono w tabeli 1. Sam przepływ pracy KNIME jest dostępny za pośrednictwem GitHub (https://github.com/precisiontox/range-finding-drc). Stężenie-odpowiedź jest modelowane przy użyciu 4-parametrowego modelu logarytmiczno-logistycznego. Dwa parametry dopasowania krzywej można ustalić. Zazwyczaj w przypadku danych procentowych ustala się maksimum na 100. W przypadku, gdy nie zaobserwuje się żadnych efektów tła, minimum można ustalić na 0%.</li>
</ol>

Startle Assay for Toxicity Evaluation in Zebrafish Embryo

Nie mamy nic do ujawnienia.

Przedstawiamy przepływ pracy i analizę danych do oceny związków chemicznych przy użyciu specjalnie zbudowanego zestawu do badania drgań zarodków zebry danio pręgowanego. Proces pracy generuje wiarygodne dane, które umożliwiają obliczenie typowych parametrów określających toksyczność związku, takich jak stężenie/dawka wzorcowa (BMC/BMD). Modułowość konfiguracji pozwala na dostosowanie do różnych potrzeb w zakresie przepustowości i wymagań przestrzennych. Ponieważ system jest wykonany z tanich komponentów podstawowych, po stosunkowo prostej konfiguracji, stanowi tanią alternatywę dla istniejących systemów komercyjnych, które są zazwyczaj projektowane dla kilku typów testów jednocześnie, opierają się na zastrzeżonym oprogramowaniu i pozostają stosunkowo kosztowne.
Zarówno te systemy komercyjne, jak i inne systemy wykonane na zamówienie pozwalają na ocenę pojedynczych zarodków lub larw na płytkach wielodołkowych (np. 12-dołkowych34, 16-dołkowych32,35, 24-dołkowych 20,33,36, 48-dołkowych37, 96-dołkowych 38,39,40,41,42, a nawet 384-dołkowych [jako 4x96-dołkowych]43), ale ograniczenie przestrzenne w odwiertach sprawia, że analiza niektórych parametrów danych dotyczących reakcji na ucieczkę (np. przebyta odległość) jest trudniejsza. Co więcej, w niektórych z tych konfiguracji obrazowanie jest ograniczone do podzbioru dołków płytki, co zmniejsza przepustowość36,39. Obrazowanie zarodków w szalkach pozwala na lepszą ocenę parametrów reakcji ucieczki i umożliwia rejestrację zachowania kilku zarodków jednocześnie (do 30 w naczyniu o średnicy 6 cm). Zwykle obrazowanie na talerzu ogranicza się do jednej szalki na cykl 44,45,46,47,48 (wyjątki wykonują obrazowanie równolegle na 6 szalkach z jedną larwą na każde49 lub na 4 larwach na 2 podzielone szalki50), wadę, którą można rozwiązać za pomocą równoległych projektów, takich jak w naszym przypadku. Zestawienie niektórych cech systemu zastosowanego w niniejszym opracowaniu oraz innych rozwiązań komercyjnych i niestandardowych znajduje się w tabeli 2 20,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47,48,49,50, 
Lokal mieszkalny 51,52.
Jedną z zalet tej metody jest odczyt rejestrujący zarówno śmiertelność, jak i zmiany w zachowaniu, co może zwiększyć wydajność ocen toksyczności. Na przykład, podczas gdy wykazano, że badanie ostrej toksyczności zarodków ryb danio pręgowanego (FET)5 dość dobrze przewiduje toksyczność w teście ostrej toksyczności dorosłych ryb53 , jego dokładność przewidywania została poprawiona dzięki włączeniu odczytów behawioralnych54. Powodem tego jest słaba śmiertelność wywołana przez związki neuroaktywne obserwowane w zarodkach ryb, prawdopodobnie z powodu braku zespołu niewydolności oddechowej powodującego zwiększoną toksyczność u młodych lub dorosłych ryb. Neuroaktywność można jednak zidentyfikować poprzez ocenę zachowania. Co więcej, odczyty behawioralne mogą również uchwycić efekty miotoksyczne i ototoksyczne, a także inne, bardziej subtelne skutki toksyczne na fizjologię, które są subletalne, ale wpływają na wydajność behawioralną organizmu.
Podczas przeprowadzania testu kluczowe znaczenie ma zapewnienie właściwego obchodzenia się ze związkami, a także wykorzystanie jednorodnie rozwijającej się partii zarodków danio pręgowanego. Tak więc używanie szklanych fiolek do przechowywania związków powinno zminimalizować spadek stężeń chemikaliów, w szczególności związków hydrofobowych, ze względu na absorbancję materiału z tworzywa sztucznego. W przypadku związków o wysokim potencjale absorpcyjnym do "plastycznego" polistyrenu, do inkubacji można również stosować płytki szklane. Czyszczenie komórek jajowych w szalkach do hodowli tkankowych używanych do pobierania i usuwania martwych zarodków jest kluczowym krokiem w celu zapewnienia standardowego rozwoju. Normalna szybkość rozwoju jest ważna, ponieważ opóźnienia rozwojowe mogą wpływać na dojrzałość sieci neuronowych leżących u podstaw ocenianego zachowania14,33. Ponadto, aby umożliwić porównanie efektów złożonych, jaja powinny pochodzić z tego samego szczepu, ponieważ doniesiono, że różne szczepy prezentują różne profile behawioralne 38,55,56,57. Podczas ekspozycji ważne jest, aby inkubować zarodki w wilgotnej komorze, aby uniknąć nadmiernego parowania pożywki E3, co mogłoby zmienić badane stężenia.
Kontrole E3 powinny być włączone do każdej serii w celu określenia wyjściowego poziomu odpowiedzi dla danej partii zarodków wykorzystanych w serii badań. Zazwyczaj uruchamiamy jedną płytę kontrolną wzdłuż każdego zestawu 5 pomiarów. Jak pokazano na rysunku 2D, podejście to pozwala również na wykrycie partii z nieoptymalnymi reakcjami z powodu opóźnionego rozwoju lub z innych powodów, takich jak genetyczne efekty tła. W przypadku nieoczekiwanego braku reakcji na bodziec należy również uważać na potencjalną awarię przetwornika. Zazwyczaj reakcje na zaskoczenie wykazują sigmoidalne zachowanie stężenie-odpowiedź, które pozwala na dopasowanie krzywej przy użyciu modelu logarytmiczno-logistycznego. Jednak w rzadkich przypadkach z odpowiedziami dwufazowymi może być konieczne zastosowanie innych modeli, takich jak modele Gaussa lub Cedergreena. Są one dostępne w pakietach R drc i bdm27,28.
Brak reakcji na bodziec wibracyjny może wskazywać po prostu na śmierć zarodków lub poważne upośledzenie funkcji życiowych z powodu ogólnej cytotoksyczności, ale może również odzwierciedlać bardziej specyficzną toksyczność ukierunkowaną na obwody neuronalne percepcji bodźców, integracji i wyjścia lokomotorycznego. Inne możliwe efekty złożone to zakłócenia w interfejsie nerwowo-mięśniowym lub w strukturze i funkcji mięśni. Aby rozróżnić te możliwości, konieczne są dalsze testy. Na przykład integralność strukturalna mięśni może być oceniona za pomocą testu dwójłomności58,59, a linie transgeniczne są dostępne do oceny perurbancji funkcji mięśniowych i nerwowych60,61. Jednak zarejestrowane dane wideo pozwalają już na bardziej szczegółową analizę morfologii i reakcji behawioralnej zarodków, które mogą dostarczyć pierwszych dodatkowych informacji. Czy upośledzone jest tylko zgięcie w kształcie litery C, czy cała ruchliwość? Czy nadal obecne są pozostałości aktywności nerwowo-mięśniowej, na co wskazują słabe lub drżące ruchy ogona? Czy takie zmienione zachowania idą w parze ze zmianami w morfologii, takimi jak obrzęk lub zwiększona krzywizna ciała? Dodatkowo można ocenić takie parametry, jak czas opóźnienia do zgięcia w kształcie litery C lub odległość przebyta podczas reakcji ucieczki (patrz na przykład Ref. 44).
Opisany tutaj protokół badań przesiewowych pozwala na szybką i solidną ocenę toksyczności związków, z wartością dodaną w postaci specyficznego wykrywania nieśmiertelnych związków neurotoksycznych, ototoksycznych i miotoksycznych. Dostarczony przepływ pracy analizy jest łatwy do wdrożenia i zapewnia solidny odczyt. Modyfikacje protokołów bodźców stosowanych w teście przestraszenia wibracyjnego zostały wykorzystane do zajęcia się złożonymi skutkami również na bardziej złożone aspekty zachowania przestraszenia, takie jak hamowanie przedimpulsowe (PPI)39,44 i habituacja32,33, i mogą być dostosowane do konfiguracji bodźca opartej na przetworniku elektrodynamicznym zastosowanej w tym badaniu.
Głównym zastosowaniem systemów przesiewowych opartych na reakcji na zaskoczenie jest ocena skutków złożonych w chemicznych badaniach przesiewowych, co ma znaczenie zarówno dla oceny toksyczności dla ludzi, jak i dla opracowywania leków 1,4,62. Jednocześnie, dzięki badaniu wczesnych stadiów rozwojowych organizmu wodnego, uzyskane wyniki mają bezpośrednie znaczenie dla oceny ryzyka ekotoksykologicznego63,64. Ponadto systemy reakcji na przerażenie mogą być wykorzystywane do fenotypowania behawioralnego w genetycznych badaniach przesiewowych 65,66,67,68,69. Nasz łatwy do wdrożenia i adaptacji system stanowi przystępną cenowo konfigurację dla mniejszych laboratoriów, które zamierzają prowadzić własne projekty przesiewowe w tych różnych dziedzinach zastosowań.

W ostatnich latach rybki danio (zebrafish) stały się bardzo popularnymi organizmami modelowymi do oceny działania związków chemicznych, obejmując obszary badawcze od opracowywania leków po toksykologię środowiskową1. Jako kręgowce, rybki danio wykazują wiele podobieństw w budowie genetycznej i ogólnej fizjologii do ludzi2,3. W związku z tym wyniki uzyskane w tym modelu są często bezpośrednio istotne dla zdrowia ludzi. W ramach skriningu związków z wykorzystaniem rybek danio zidentyfikowano kilka kandydatów na leki, które obecnie znajdują się w fazie badań klinicznych4.
Ocena toksyczności jest jednym z głównych obszarów zastosowań, w których istotne są testy z wykorzystaniem embrionalnych stadiów ryb danio pręgowanych. Istnieją różne wytyczne testowe Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (OECD) dotyczące wykorzystania ryb danio w badaniach toksyczności środowiskowej5,6. Mały rozmiar i szybki rozwój embrionów ryb danio sprawiają, że są one wysoce odpowiednie do metod przesiewowych na skalę od średniej do wysokiej przepustowości1,3,4. Punkty końcowe toksykologiczne analizowane w takich badaniach przesiewowych obejmują wady rozwojowe embrionów i śmiertelność7, zaburzenia endokrynne8, toksyczność narządową9 oraz oceny behawioralne wskazujące na neurotoksyczność10,11. Testy behawioralne są możliwe, ponieważ embriony ryb danio wykazują różne rodzaje reakcji lokomocyjnych na różne bodźce, w zależności od stadium rozwoju. Na przykład, embriony w 1. dniu po zapłodnieniu (dpf) wykazują spontaniczne zwijanie ogona12 i reagują na sekwencję impulsów świetlnych typową sekwencją ruchów, tzw. odpowiedzią fotomotorową (PMR)10. Po wykluciu, które zazwyczaj następuje około 48–72 godzin po zapłodnieniu (hpf), swobodnie pływające eleuteroembriony13 stopniowo rozwijają reakcje przestrachu i ucieczki na bodźce wibracyjne, zaczynając od około 4 dpf14. Reakcje te charakteryzują się wyraźnym zgięciem w kierunku przeciwnym do kierunku bodźca (tzw. C-bend lub C-start), po którym następuje mniejsze zgięcie przeciwstawne i zachowanie pływackie14,15,16,17. Co istotne, zachowania embrionalne są sterowane przez obwody neuronalne wykorzystujące różne układy neurotransmiterów, co pozwala na badanie efektów związków chemicznych celujących w te układy. Na przykład, test PMR ujawnił wpływ związków zakłócających sygnalizację cholinergiczną, adrenergiczną i dopaminergiczną10, podczas gdy reakcja przestrachu angażuje neurony cholinergiczne, glutaminergiczne i glicynergiczne16,18. Ponadto, związki uszkadzające mięśnie lub złącza nerwowo-mięśniowe również wpłyną na te zachowania, podobnie jak związki toksyczne dla komórek rzęsatych ucha wewnętrznego/linii bocznej19,20. Obserwacja zachowań lokomocyjnych ryb danio w odpowiedzi na bodziec jest zatem odpowiednim środkiem do oceny nie tylko neurotoksyczności, ale w równym stopniu ototoksyczności i miotoksyczności. Ocena zachowań lokomocyjnych służy również jako wskaźnik ogólnej oceny toksyczności/śmiertelności, ponieważ martwe embriony się nie ruszają. W ten sposób embrionalne zachowania lokomocyjne stanowią zintegrowany odczyt dla podejścia do przesiewowej oceny toksyczności pierwszego stopnia, który wskazuje na letalne i neuromięśniowe efekty związków w jednej konfiguracji. Biorąc pod uwagę, że eleuteroembriony są już zdolne do metabolizowania związków, podejście to może również wykrywać efekty produktów transformacji metabolicznej7,21,22. Co ważne, w niektórych ustawodawstwach dotyczących ochrony zwierząt embriony ryb danio nie są uważane za chronione stadium życia aż do etapu swobodnego żerowania po 120 hpf13. Dlatego są one uznawane za alternatywę dla testów toksyczności na zwierzętach.
<img alt="Układ do lewitacji akustycznej z głośnikami, kamerą, sterownikiem; analiza obrazu; wykres danych; szalka Petriego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66153/66153fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Układ systemu odpowiedzi startlowej na wibracje. (A) Przegląd systemu. Płytki z embrionami poddanymi działaniu testowanych związków są umieszczone na matrycy przetworników elektrodynamicznych („głośnikach”). Kamera jest kolejno przemieszczana przez liniowy napęd pasowy do pozycji rejestrującej nad wybranym przetwornikiem. (B) Szczegółowy widok przetwornika/głośnika z włożoną na górze szalką do hodowli tkanek. Płytki są oświetlone od dołu przez LED-ową płaszczyznę światła o natężeniu 4000-5000 lux. Dioda LED obok głośnika zapala się w momencie podawania bodźca. (C) Klatka z filmu nagranego przez kamerę po pobudzeniu embrionów. (D) Zrzut ekranu pliku konfiguracyjnego. (E) Zrzut ekranu interfejsu oprogramowania do rejestracji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/66153fig01large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół badawczy służący do oceny wpływu związków chemicznych na reakcję zaskoczenia wywołaną wibracją, z wykorzystaniem prostego, własnego urządzenia pomiarowego. Urządzenie to opiera się na bodźcach wibracyjnych generowanych przez przetworniki elektrodynamiczne, sprzężonych z automatycznym zapisem wideo kilku swobodnie poruszających się embrionów w naczyniu do hodowli tkankowych.23System jest modułowy i umożliwia sekwencyjną rejestrację z kilku naczyń hodowlanych równolegle. W obecnie stosowanej konfiguracji pięć przetworników elektrodynamicznych dostarcza bodziec wibracyjny (500 Hz, czas trwania 1 ms) do naczyń hodowlanych, na których umieszczono 20 embrionów (Rycina 1). Płytki są oświetlane od dołu światłem z arkuszy LED o natężeniu 4000–5000 luksów. Dioda LED znajdująca się obok każdego przetwornika sygnalizuje okresy podawania bodźca, a oscyloskop wskazuje kształt fal oraz częstotliwość stosowanego bodźca (szczegóły patrz w Ref. 23). Zachowanie embrionów jest rejestrowane za pomocą kamery o wysokiej rozdzielczości czasowej (Tabela materiałów) z częstotliwością 1000 klatek na sekundę (fps), która jest przesuwana nad docelowym mówcą za pomocą liniowego napędu pasowego. Taka prędkość rejestracji jest niezbędna do niezawodnego rozdzielenia odpowiedzi orientacyjnej (startle response). System ten stanowi niedrogą, indywidualnie dostosowywalną alternatywę dla obecnych systemów komercyjnych. Dokładny przebieg procedury opisany poniżej jest obecnie realizowany w ramach inicjatywy Precision Toxicology24 w celu określenia odpowiednich warunków ekspozycji dla pozyskiwania danych omicznych z zarodków ryb zebrafish poddanych działaniu wybranego zestawu substancji toksycznych.

<table><tbody><tr><td>Drobne sita testowe, mosiężna rama, wielkość porów 250 i mu; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z289744-1EA</td><td>Lub porównywalny materiał</td></tr><tr><td>Szybka kamera</td><td>XIMEA&</td><td>nbsp; MQ013MG-ON USB 3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Butelki laboratoryjne, z wąską szyjką, z nakrętką</td><td>VWR</td><td>215-3261</td><td>Numer referencyjny do 50 ml, dostępne do 20 l. Lub porównywalny materiał</td></tr><tr><td>Końcówka do pipet, objętość robocza: 10 &mikro; L</td><td>SARSTEDT</td><td>70.3010.210</td><td>Lub porównywalny materiał</td></tr><tr><td>Końcówka do pipet, objętość robocza: 1000 &mikro; L</td><td>SARSTEDT</td><td>70.3050.100</td><td>Lub porównywalny materiał</td></tr><tr><td>Końcówka do pipet, objętość robocza: 20 &mikro; L</td><td>SARSTEDT</td><td>70.3020.210</td><td>Lub porównywalny materiał</td></tr><tr><td>Końcówka do pipety, objętość robocza: 200 &mikro; L</td><td>SARSTEDT</td><td>70.3030.100</td><td>Lub porównywalny materiał</td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 10 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>86.1254.001</td><td>Lub porównywalny materiał</td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 25 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>86.1685.001</td><td>Lub porównywalny materiał</td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 5 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>86.1253.001</td><td>Lub porównywalny materiał</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych 60,0 mm/15,0 mm wentylowane (Polistyren)</td><td>Greiner bio-one</td><td>628102</td><td>Lub porównywalny materiał</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych 100, zawiesina (Polistyren)</td><td>SARSTEDT</td><td>83.3902.500</td><td>Lub porównywalny materiał</td></tr><tr><td>Pipeta transferowa 6 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>86.1175</td><td>Lub porównywalny materiał</td></tr><tr><td>Rurka 15 ml 120 mm x 17 mm PP</td><td>SARSTEDT</td><td>62.554.502</td><td>Lub porównywalny materiał</td></tr><tr><td>Rurka 50 ml 114 mm x 28 mm PP</td><td>SARSTEDT</td><td>62.5472.54</td><td>Lub porównywalny materiał</td></tr></tbody></table>

ocena toksyczności substancji chemicznych za pomocą systemu badań przesiewowych reakcji na drgania danio pręgowanego

Evaluating Toxicity of Chemicals using a Zebrafish Vibration Startle Response Screening System

Opracowaliśmy prosty system przesiewowy do oceny toksyczności nerwowo-mięśniowej i ogólnej w zarodkach danio pręgowanego. System modułowy składa się z przetworników elektrodynamicznych, nad którymi można umieścić szalki do hodowli tkankowych z zarodkami. Można połączyć wiele takich par naczyń do hodowli tkankowej głośnika. Bodźce wibracyjne generowane przez przetworniki elektrodynamiczne wywołują w zarodkach charakterystyczną reakcję zaskoczenia i ucieczki. Napędzany paskiem napęd liniowy sekwencyjnie umieszcza kamerę nad każdym głośnikiem, aby rejestrować ruch zarodków. W ten sposób można zwizualizować i określić ilościowo zmiany w reakcji na przerażenie spowodowane śmiertelnością lub toksycznością nerwowo-mięśniową związków chemicznych. Przedstawiamy przykładowy przebieg procesu badań przesiewowych związków chemicznych przy użyciu tego systemu, w tym przygotowanie zarodków i roztworów leczniczych, działanie systemu rejestracji oraz analizę danych w celu obliczenia wzorcowych wartości stężeń związków aktywnych w teście. Modułowy montaż oparty na dostępnych na rynku prostych komponentach sprawia, że system ten jest zarówno ekonomiczny, jak i elastycznie dostosowujący się do potrzeb konkretnych konfiguracji laboratoryjnych i celów przesiewowych.

Rysunek 2A przedstawia procent nieaktywnych embrionów w 48ch obsadach niepoddanych traktowaniu embrionów typu dzikiego (szczep AB2O2). Średnio 14,33% niepoddanych traktowaniu embrionów typu dzikiego nie reaguje na bodziec wibracyjny. W 4 obsadach odsetek nieaktywnych larw osiągnął 50%, jednak w 75% obsad odsetek nieaktywnych larw był niższy niż 20%.
Rysunek 2B,C przedstawia przykład typowego obliczenia stężenia/dawki referencyjnej (benchmark concentration/dose, BMC/BMD29,30) dla efektów związków na ruchliwość w ramach procedury testu reakcji na wibracje, zgodnie z aktualną metodologią stosowaną w konsorcjum PrecisionTox24. Wartości BMC10, BMC25 i BMC50 odpowiadają odpowiednio stężeniom, przy których 10%, 25% i 50% embrionów wykazuje poziom braku ruchliwości wyższy niż poziom tła. W obliczeniach tych uwzględniono wyłącznie embriony całkowicie nieruchome, pomijając te, które nadal wykazują odpowiedzi częściowe, takie jak tylko wygięcie w kształt litery C bez późniejszego ucieczkowego pływania lub tylko ruchy ogona (Rysunek 2B). Embriony poddano działaniu 8 stężeń inhibitora kanałów sodowych, trykainometanosulfonianu, który jest często stosowany do znieczulania ryb31. Dane wskazują na poziom tła wynoszący około 25% braku ruchliwości w odpowiedzi na bodziec wibracyjny. Począwszy od stężenia 1% trykainy, ruchliwość ulega zmniejszeniu, a powyżej 2,5% całkowicie ustaje. Procedura KNIME oblicza BMC50 jako 164,9 µM, co odpowiada 1,07% trykainy i poziomowi braku ruchliwości wynoszącemu 75% (Rysunek 2C). Wąskie 95% przedziały ufności (oznaczone szarymi obszarami na krzywej) wskazują na wysoką powtarzalność wartości ruchliwości w tym teście.
Rysunek 2D przedstawia przykład nieoptymalnego przebiegu testu, którego dane nie powinny być wykorzystywane do obliczeń BMC. Pokazano pięć grup kontrolnych traktowanych E3 z różnymi embrionami pochodzącymi z tego samego miotu (AB2O2 [szczep typu dzikiego] powtórzenia 1-5). Tylko pierwsza grupa wykazuje reakcję zbliżoną do normy, z bezruchowością na poziomie około 25%, co jest zgodne z wartościami literaturowymi32 oraz wynikami uzyskanymi w opisanym tutaj teście, jak pokazano na Rysunku 2A, podczas gdy wszystkie pozostałe grupy wykazują osłabione i/lub niepełne reakcje behawioralne (np. jedynie zgięcie w kształcie litery C, po którym nie następuje aktywność pływacka, lub ruchliwość bez wyraźnego zgięcia w kształcie litery C na początku). Taka reakcja może wystąpić, gdy embriony nie rozwijają się prawidłowo i znajdują się w stanie niedojrzałości z powodu opóźnienia rozwojowego, co wpływa na stabilność reakcji zaskoczenia14,33.
<img alt="Wykresy krzywej koncentracja-odpowiedź dla trikainy; procent unieruchomionych embrionów; analiza statystyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66153/66153fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przykład typowego wyniku, obejmujący obliczenie dawki referencyjnej (benchmark dose). (A) Procent embrionów niewykazujących reakcji po impulsie dźwiękowym dla nieleczonych larw typu dzikiego z 48 lęgów (n = 10 na lęg). Średnia (14,33%) i odchylenie standardowe (±16,19%) są zaznaczone na czerwono. (B) Ocena zachowania odpowiedzi alarmowej embrionów (n=20 na warunek) traktowanych wskazanym stężeniem trikainy w medium E3 lub samym medium E3 jako kontrolą. Zachowanie jest klasyfikowane zgodnie ze schematem kolorystycznym i rysunkami wskazanymi po prawej stronie wykresu, przy czym każdy embrion jest przypisany tylko do jednej z następujących klas: „immotile” (unieruchomiony): embrion nie wykazuje żadnego ruchu; „tail moving” (ruch ogona): embrion wykazuje ruch ogona, ale nie wykazuje ani wygięcia w kształt litery C (C-bend), ani zachowania pływania; „motile” (ruchliwy): embrion wykazuje ruch pływania, ale nie wykazuje wygięcia C-bend w odpowiedzi na bodziec wibracyjny; „C-bend only” (tylko C-bend): embrion wykazuje wygięcie C-bend, ale nie pływanie ucieczkowe; „C-bend + motile” (C-bend + ruchliwy): embrion wykazuje typowe zachowanie C-bend, po którym następuje pływanie ucieczkowe (typowy pełny odruch alarmowy). Różne zachowania przedstawiono jako procent całkowitej liczby embrionów dla każdej metody traktowania. (C) Wykres obliczeń BMC generowany przez workflow KNIME, wskazujący procent embrionów „immotile” dla każdego stężenia traktowania. Linie niebieska, czerwona i czarna wskazują wartości BMC10, BMC25 i BMC50, czyli stężenia, przy których odpowiednio 10%, 25% i 50% embrionów wykazuje poziom unieruchomienia wyższy niż tło. (D) Przykład odrzuconej serii testowej. Przedstawiono pięć serii kontrolnych traktowanych E3 z różnymi embrionami typu dzikiego AB2O2 pochodzącymi z tego samego lęgu (powtórzenia 1-5). Tylko powtórzenie 1 wykazuje niemal normalną odpowiedź, podczas gdy embriony w pozostałych seriach nie wykazują typowej odpowiedzi C-bend + pływanie ucieczkowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/66153fig02largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Parametry statystyczne służące do oceny dobroci dopasowania oraz progi akceptacji wyznaczonych wartości BMC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Właściwości wybranych systemów do badania odruchu wzdrygnięcia wywołanego wibracjami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Table%202.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Plik uzupełniający 1: Szablon Excel dla pliku konfiguracyjnego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Szablon wejściowy KNIME z przykładowym zestawem danych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Supplementary%20File%202.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 3: Przykład pliku wyjściowego KNIME. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Supplementary%20File%203.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Opisujemy przebieg pracy systemu badań przesiewowych i analizę danych do oceny toksyczności związków chemicznych na podstawie reakcji na wibracje zarodka danio pręgowanego. System rejestruje ruchy zarodków danio pręgowanego po wystawieniu na bodziec wibracyjny i pozwala na zintegrowaną ocenę ogólnej toksyczności/śmiertelności i toksyczności nerwowo-mięśniowej.

Ocena toksyczności substancji chemicznych za pomocą systemu badań przesiewowych reakcji na drgania danio pręgowanego

We developed a simple screening system for the evaluation of neuromuscular and general toxicity in zebrafish embryos. The modular system consists of ...

Podczas badań przesiewowych substancji chemicznych pod kątem toksyczności aktualnym wyzwaniem eksperymentalnym jest określenie skutków toksycznych in vivo, z uwzględnieniem złożoności całego organizmu, i zrobienie tego w sposób szybki i wysokoprzepustowy. Korzystając z odczytu behawioralnego, który monitoruje reakcję ucieczki zarodków danio pręgowanego na bodziec wibracyjny, nasz system pozwala nam zidentyfikować związki, które zakłócają funkcje neuronalne lub mięśniowe. Ponieważ martwe zarodki nie poruszają się, wychwytujemy również związki, które powodują śmiertelność poprzez niespecyficzną toksyczność.Prezentowany przez nas system może być zbudowany za niewielką cenę i można go dostosować do własnych potrzeb. Jest również łatwy w utrzymaniu, a wszystkie elementy można wymienić. Obecnie korzystamy z systemu testów zaskoczenia w ramach konsorcjum PrecisionTox w celu określenia dawki związku chemicznego do pozyskiwania danych OMICZNYCH.Dane są generowane na pięciu organizmach modelowych i ludzkich liniach komórkowych. Zostaną one wykorzystane do wyprowadzenia szlaków toksyczności i biomarkerów do przewidywania toksyczności dla ludzi. Na początek zbierz zarodki w fazie rozszczepienia, a konkretnie od stadium dwukomórkowego do ośmiokomórkowego z naturalnego tarła na 10-centymetrowej szalce Petriego.Usuń niezapłodnione jaja, zanieczyszczenia i łuski z szalki Petriego, aby ją oczyścić. Umieścić 60 zarodków na jednej szalce Petriego zawierającej 15 mililitrów pożywki E3. Umieść wszystkie naczynia zawierające zarodki w wilgotnej komorze przygotowanej z nasączonych wodą ręczników papierowych.Następnie inkubuj je 72 godziny po zapłodnieniu w inkubatorze ustawionym na 28,5 stopnia Celsjusza. Następnie wyjmij żądane chemiczne roztwory podstawowe z zamrażarki o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i pozwól im się rozmrozić. Przygotować seryjne rozcieńczenia każdej substancji chemicznej w pożywce E3 w szklanej butelce.Sprawdzić roztwór pod kątem wytrącania się, a jeśli jest obecny, zarejestrować go, a następnie dalej rozcieńczyć, aby osiągnąć następne najwyższe stężenie. Sprawdź i powtarzaj, aż nie będzie opadów. Następnie sprawdź i zapisz pH roztworu ekspozycyjnego.Jeśli wykracza poza zakres pH od 7,0 do 8,5, dostosuj go do 7,4 za pomocą kwasu solnego lub wodorotlenku sodu. Wszelkie niewykorzystane media ekspozycyjne należy utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami. Na początek zbierz zarodek danio pręgowanego i hoduj go do 72 godzin po zapłodnieniu w inkubatorze w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza.Jednocześnie przygotuj chemikalia do badania w pożądanym stężeniu. Zbadaj zarodki po 72 godzinach od zapłodnienia. Usuń martwe lub niewyklute zarodki.Umieść 10 zarodków w każdym sześciocentymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej z dziewięcioma mililitrami pożywki E3. Są to tak zwane płyty naświetlowe. Oznacz każdą płytkę naświetlacyjną nazwą związku, stężeniem narażenia i numerem powtórzenia.Dodaj jeden mililitr roztworu ekspozycyjnego do każdej płytki, zaczynając od najniższego stężenia, i delikatnie zakręć płytką. W przypadku związków o niskiej rozpuszczalności zastąp całe 10 mililitrów pożywki roztworem ekspozycyjnym. Zapisać kolejność, w jakiej roztwory złożone zostały dodane do zarodków.Następnie inkubuj płytki w wilgotnej komorze w inkubatorze w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Aby rozpocząć test przestraszenia wibracyjnego, włącz komputer i urządzenie wibracyjne. Utwórz arkusz kalkulacyjny dla pliku konfiguracyjnego.Dołącz informacje o ekspozycji dla każdej z pięciu pozycji płytki, określając związek, stężenie i kontrpróbę. Otwórz ogólny interfejs użytkownika lub program GUI dla zestawu do testowania rozboju wibracyjnego. Wybierz różne pozycje w programie GUI, aby sprawdzić ruch kamery i obserwować reakcję kamery.Wyjąć płytki z próbkami z inkubatora. Umieść je w pięciu wyznaczonych pozycjach i pozwól zarodkom osiąść przez kilka minut. W programie GUI kliknij Nagraj, a pojawi się nowe okno.W tym oknie należy wybrać przygotowany wcześniej plik konfiguracyjny. Sprawdź, czy opis próbki jest zgodny z próbkami w każdej pozycji. Obserwuj, jak dioda LED włącza się, gdy impuls dźwiękowy jest aktywowany przez program.Po nagraniu kamera powróci do pierwszej pozycji, a oprogramowanie rozpocznie kompresję plików. Zastąp zmierzone próbki następnym zestawem i kontynuuj następny przebieg, jak pokazano. Następnie zebrać roztwory ekspozycyjne ze wszystkich mierzonych płytek za pomocą sita, aby jednocześnie zatrzymać zarodki.Aby rozpocząć analizę danych, otwórz dane wideo za pomocą VirtualDub lub innego oprogramowania do przeglądania. Wizualnie oceń liczbę zarodków reagujących na impuls dźwiękowy. Zapisz nazwę związku, powtórzoną próbę, stężenie związku i procent nieruchomych zarodków w arkuszu kalkulacyjnym.Przeprowadź analizę stężenia wzorcowego przy użyciu przepływu pracy KNIME z osadzonymi skryptami języka R. Ocena nieruchliwości w nieleczonych zarodkach typu dzikiego wykazała średnią nieruchliwość wynoszącą 14,33% po poddaniu bodźcowi wibracyjnemu z różnicami w różnych lęgach. Obliczenia stężenia wzorcowego dla wpływu tricainy na ruchliwość wykazały zmniejszenie ruchliwości przy stężeniu 1%, zaprzestając aktywności powyżej 2,5%, przy stężeniu wzorcowym 50 wynoszącym 164,9 mikromola.Przykład testu suboptymalnego wykazał niespójności w reakcjach zarodka, co sugeruje problemy rozwojowe wpływające na odporność reakcji na zaskoczenie.

evaluating-toxicity-chemicals-using-zebrafish-vibration-startle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym artykule, zarodki danio pręgowanego są wykorzystywane do badań przesiewowych toksyczności chemicznej. Toksyczność chemiczna jest skorelowana z odczytami fenotypu. W protokole próbki przedstawiono metodologiczne podejście do przeprowadzania badań przesiewowych toksyczności chemicznej.

Badania przesiewowe toksyczności chemicznej na podstawie zarodków: ocena wpływu na rozwój zarodków danio pręgowanego

Zarodki danio pręgowanego są używane do oceny toksyczności związków chemicznych. Rozwijają się zewnętrznie i są wrażliwe na chemikalia, co pozwala na wykrycie subtelnych zmian fenotypowych. Eksperyment wymaga jedynie niewielkiej ilości związku, który jest bezpośrednio dodawany do płytki zawierającej zarodki, dzięki czemu system testowy jest wydajny i opłacalny.

Szybka ocena toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego

W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny do oceny neurobehawioralnej toksyczności zanieczyszczeń środowiska przy użyciu modelu larw danio pręgowanego, w tym procesu ekspozycji i testów wskaźników neurobehawioralnych.

Badanie neurobehawioralnych skutków zanieczyszczeń środowiska na larwy danio pręgowanego

Ten protokół opisuje procedurę badania przesiewowego leków u larw danio pręgowanego 3-7 dni po zapłodnieniu, po której następuje ocena morfologiczna.

Badania przesiewowe małych cząsteczek i badania toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju

Prezentujemy nasze podejście do wyszukiwania potencjalnych elementów enhansera w genach regulowanych rozwojowo oraz ocenę ich funkcji za pomocą mozaikowej transgenezy u rybek danio pręgowanych.

Mozaikowa transgeneza u danio pręgowanego do oceny sekwencji enhancerów

Reakcja optokinetyczna była szeroko stosowana do oceny funkcji wzrokowych larw danio prążkowanego. Niemniej jednak standardowy protokół dla ryb larwalnych nie jest jeszcze łatwo stosowalny u osobników dorosłych1-5. W niniejszej pracy przedstawiamy sposób pomiaru OKR u dorosłych danio prążkowanych z wykorzystaniem nowego protokołu opracowanego w naszym laboratorium.

Wykorzystanie odpowiedzi optokinetycznej do badania funkcji wzrokowych u rybek danio

Western blotting to technika analityczna stosowana do wykrywania specyficznych białek w danej próbce homogenatu lub ekstraktu tkankowego.

Western blotting: od przygotowania próbki do detekcji

Przedstawiamy metodę wizualizacji kutykuli u żywych C. elegans z wykorzystaniem czerwonego fluorescencyjnego barwnika lipofilowego DiI (perchloran 1,1'-dioctadecylo-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny), który jest powszechnie stosowany u C. elegans do wizualizacji neuronów eksponowanych na działanie czynników zewnętrznych. Dzięki temu zoptymalizowanemu protokołowi alae oraz pierścieniowe struktury kutykularne zostają zabarwione przez DiI i poddane obserwacji przy użyciu mikroskopu złożonego.

Wizualizacja struktur kutykularnych Caenorhabditis elegans z użyciem lipofilowego barwnika witalnego DiI

Opisujemy uwrażliwioną metodę identyfikacji postembrionalnych regulatorów ekspresji i lokalizacji białek w C. elegans, wykorzystującą genomowy screening oparty na RNAi oraz zintegrowany transgen kodujący funkcjonalne białko znakowane fluorescencyjnie.

Przesiewanie RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans

Opisujemy procedurę i analizę danych chemicznego systemu przesiewowego sygnalizacji glikokortykosteroidowego hormonu stresu za pomocą larw danio pręgowanego: test aktywności lucyferazy zebry reagujący na glikokortykosteroidy in vivo (GRIZLY). Test z czułością i swoistością wykrywa wpływ związków wymagających metabolizowania lub wpływających na endogenną produkcję glikokortykosteroidów na sygnalizację glikokortykosteroidów.

Chemiczna procedura przesiewowa sygnalizacji glikokortykosteroidów za pomocą systemu reporterowego lucyferazy larw danio pręgowanego

Poznaj metodę oceny toksyczności związków chemicznych za pomocą reakcji na drgania embrionów Danio rerio. System umożliwia szybkie badanie neurotoksyczności i śmiertelności w całym organizmie.

Ocena toksyczności substancji chemicznych za pomocą systemu badań przesiewowych reakcji na drgania danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów