Ocena toksyczności substancji chemicznych za pomocą systemu badań przesiewowych reakcji na drgania danio pręgowanego
January 12th, 2024
Opisujemy przebieg pracy systemu badań przesiewowych i analizę danych do oceny toksyczności związków chemicznych na podstawie reakcji na wibracje zarodka danio pręgowanego. System rejestruje ruchy zarodków danio pręgowanego po wystawieniu na bodziec wibracyjny i pozwala na zintegrowaną ocenę ogólnej toksyczności/śmiertelności i toksyczności nerwowo-mięśniowej.
Podczas badań przesiewowych substancji chemicznych pod kątem toksyczności aktualnym wyzwaniem eksperymentalnym jest określenie skutków toksycznych in vivo, z uwzględnieniem złożoności całego organizmu, i zrobienie tego w sposób szybki i wysokoprzepustowy. Korzystając z odczytu behawioralnego, który monitoruje reakcję ucieczki zarodków danio pręgowanego na bodziec wibracyjny, nasz system pozwala nam zidentyfikować związki, które zakłócają funkcje neuronalne lub mięśniowe. Ponieważ martwe zarodki nie poruszają się, wychwytujemy również związki, które powodują śmiertelność poprzez niespecyficzną toksyczność.
Prezentowany przez nas system może być zbudowany za niewielką cenę i można go dostosować do własnych potrzeb. Jest również łatwy w utrzymaniu, a wszystkie elementy można wymienić. Obecnie korzystamy z systemu testów zaskoczenia w ramach konsorcjum PrecisionTox w celu określenia dawki związku chemicznego do pozyskiwania danych OMICZNYCH.
Dane są generowane na pięciu organizmach modelowych i ludzkich liniach komórkowych. Zostaną one wykorzystane do wyprowadzenia szlaków toksyczności i biomarkerów do przewidywania toksyczności dla ludzi. Na początek zbierz zarodki w fazie rozszczepienia, a konkretnie od stadium dwukomórkowego do ośmiokomórkowego z naturalnego tarła na 10-centymetrowej szalce Petriego.
Usuń niezapłodnione jaja, zanieczyszczenia i łuski z szalki Petriego, aby ją oczyścić. Umieścić 60 zarodków na jednej szalce Petriego zawierającej 15 mililitrów pożywki E3. Umieść wszystkie naczynia zawierające zarodki w wilgotnej komorze przygotowanej z nasączonych wodą ręczników papierowych.
Następnie inkubuj je 72 godziny po zapłodnieniu w inkubatorze ustawionym na 28,5 stopnia Celsjusza. Następnie wyjmij żądane chemiczne roztwory podstawowe z zamrażarki o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i pozwól im się rozmrozić. Przygotować seryjne rozcieńczenia każdej substancji chemicznej w pożywce E3 w szklanej butelce.
Sprawdzić roztwór pod kątem wytrącania się, a jeśli jest obecny, zarejestrować go, a następnie dalej rozcieńczyć, aby osiągnąć następne najwyższe stężenie. Sprawdź i powtarzaj, aż nie będzie opadów. Następnie sprawdź i zapisz pH roztworu ekspozycyjnego.
Jeśli wykracza poza zakres pH od 7,0 do 8,5, dostosuj go do 7,4 za pomocą kwasu solnego lub wodorotlenku sodu. Wszelkie niewykorzystane media ekspozycyjne należy utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami. Na początek zbierz zarodek danio pręgowanego i hoduj go do 72 godzin po zapłodnieniu w inkubatorze w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza.
Jednocześnie przygotuj chemikalia do badania w pożądanym stężeniu. Zbadaj zarodki po 72 godzinach od zapłodnienia. Usuń martwe lub niewyklute zarodki.
Umieść 10 zarodków w każdym sześciocentymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej z dziewięcioma mililitrami pożywki E3. Są to tak zwane płyty naświetlowe. Oznacz każdą płytkę naświetlacyjną nazwą związku, stężeniem narażenia i numerem powtórzenia.
Dodaj jeden mililitr roztworu ekspozycyjnego do każdej płytki, zaczynając od najniższego stężenia, i delikatnie zakręć płytką. W przypadku związków o niskiej rozpuszczalności zastąp całe 10 mililitrów pożywki roztworem ekspozycyjnym. Zapisać kolejność, w jakiej roztwory złożone zostały dodane do zarodków.
Następnie inkubuj płytki w wilgotnej komorze w inkubatorze w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Aby rozpocząć test przestraszenia wibracyjnego, włącz komputer i urządzenie wibracyjne. Utwórz arkusz kalkulacyjny dla pliku konfiguracyjnego.
Dołącz informacje o ekspozycji dla każdej z pięciu pozycji płytki, określając związek, stężenie i kontrpróbę. Otwórz ogólny interfejs użytkownika lub program GUI dla zestawu do testowania rozboju wibracyjnego. Wybierz różne pozycje w programie GUI, aby sprawdzić ruch kamery i obserwować reakcję kamery.
Wyjąć płytki z próbkami z inkubatora. Umieść je w pięciu wyznaczonych pozycjach i pozwól zarodkom osiąść przez kilka minut. W programie GUI kliknij Nagraj, a pojawi się nowe okno.
W tym oknie należy wybrać przygotowany wcześniej plik konfiguracyjny. Sprawdź, czy opis próbki jest zgodny z próbkami w każdej pozycji. Obserwuj, jak dioda LED włącza się, gdy impuls dźwiękowy jest aktywowany przez program.
Po nagraniu kamera powróci do pierwszej pozycji, a oprogramowanie rozpocznie kompresję plików. Zastąp zmierzone próbki następnym zestawem i kontynuuj następny przebieg, jak pokazano. Następnie zebrać roztwory ekspozycyjne ze wszystkich mierzonych płytek za pomocą sita, aby jednocześnie zatrzymać zarodki.
Aby rozpocząć analizę danych, otwórz dane wideo za pomocą VirtualDub lub innego oprogramowania do przeglądania. Wizualnie oceń liczbę zarodków reagujących na impuls dźwiękowy. Zapisz nazwę związku, powtórzoną próbę, stężenie związku i procent nieruchomych zarodków w arkuszu kalkulacyjnym.
Przeprowadź analizę stężenia wzorcowego przy użyciu przepływu pracy KNIME z osadzonymi skryptami języka R. Ocena nieruchliwości w nieleczonych zarodkach typu dzikiego wykazała średnią nieruchliwość wynoszącą 14,33% po poddaniu bodźcowi wibracyjnemu z różnicami w różnych lęgach. Obliczenia stężenia wzorcowego dla wpływu tricainy na ruchliwość wykazały zmniejszenie ruchliwości przy stężeniu 1%, zaprzestając aktywności powyżej 2,5%, przy stężeniu wzorcowym 50 wynoszącym 164,9 mikromola.
Przykład testu suboptymalnego wykazał niespójności w reakcjach zarodka, co sugeruje problemy rozwojowe wpływające na odporność reakcji na zaskoczenie.
Przegląd
To badanie ocenia toksyczność związków chemicznych za pomocą reakcji zaciekawienia zarodków danio pręgowanego na wibracje. Monitorując ruchy zarodków w odpowiedzi na bodźce wibracyjne, system ocenia toksyczność neuromuskularką i ogólną śmiertelność różnych związków chemicznych.
Kluczowe komponenty badania
Obszar badań
- Przeszukiwanie toksyczności
- Neurotoksykologia
- Biologia rozwoju
Tło
- Przeszukiwanie toksyczności in vivo jest wyzwaniem z powodu złożoności organizmu.
- Zarodki danio pręgowanego stanowią odpowiedni model do oceny efektów chemicznych.
- Praca jest częścią wysiłków na rzecz wyznaczania ścieżek toksyczności dla przewidywania toksyczności u ludzi.
Stosowane metody
- Testy behawioralne do pomiaru reakcji zaciekawienia zarodków danio pręgowanego.
- Zarodki są inkubowane i eksponowane na różne stężenia testowanych chemikaliów.
- Analiza danych poprzez wizualizacje reakcji ruchowych i obliczenia stężenia referencyjnego.
Główne wyniki
- Zidentyfikowano związki, które zmniejszają ruchliwość i powodują śmiertelność.
- Zmierzono stężenie referencyjne dla określonych toksyczności.
- Wykazano, że system jest elastyczny i opłacalny.
Wnioski
- System wydajnie identyfikuje toksyczne związki za pomocą prostego i powtarzalnego testu.
- Przyczynia się do zrozumienia ścieżek toksyczności chemikaliów istotnych zarówno dla danio pręgowanego, jak i ludzi.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-throughput in vivo toxicity screening remains a critical bottleneck in early drug discovery and chemical safety assessment. The zebrafish vibration startle response system enables rapid, quantitative evaluation of neuromuscular and general toxicity, supporting predictive confidence at the target validation and lead triage stages. Its modular, scalable design aligns with enterprise needs for reproducibility, cost efficiency, and translational relevance across diverse compound portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of neuromuscular toxicity and lethality in a whole-organism context.
- Supports biological de-risking by distinguishing specific neuroactive effects from general cytotoxicity.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and off-target safety liabilities.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized behavioral assay for quantitative, reproducible toxicity readouts.
- Delivers scalable throughput via modular assembly and automated video capture.
- Enables robust compound evaluation for both acute and sublethal toxic effects.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with multi-species OMICS workflows for toxicity pathway elucidation.
- Supports biomarker discovery and cross-species translational continuity.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by integrating organism-level toxicity data.
Pipeline & Workflow Integration
This zebrafish-based assay bridges early discovery and preclinical safety workflows, providing actionable toxicity data prior to mammalian studies.
- Discovery Biology: Quantifies behavioral phenotypes to clarify mechanistic toxicity and pathway involvement.
- Screening: Offers reproducible, high-content outputs for compound triage and prioritization.
- Analytics: Generates benchmark concentration values and immotility rates for comparative analysis.
- Translational Research: Integrates with OMICS and multi-model organism pipelines for human toxicity prediction.
- Enterprise Reuse: Modular system design supports adaptation across diverse screening and safety platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in toxicity assessment.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and cost-effective screening capability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage attrition due to unforeseen toxicity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and efficient resource allocation across discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry and behavioral phenotyping.
- Needs basic imaging infrastructure and data analysis tools (e.g., VirtualDub, KNIME with R scripts).
- Demands cross-team standardization for assay setup and scoring criteria.
- Adaptable to various compound classes and exposure paradigms.
- Assay robustness may be affected by embryo quality and developmental variability.
